CN104152469A - 一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因及其编码的蛋白质和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因及其编码的蛋白质和制备方法，所述植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将如SEQ ID NO.1所示的基因序列克隆到原核表达载体pET-32a(+)上，并在重组大肠杆菌中进行了诱导表达，再利用亲和层析纯化得到高纯度的重组蛋白质。利用本发明的方法纯化得到的高纯度的蛋白质可以有效的降解亚硝酸盐，可以生产成酶制剂，能有效降解食品中的亚硝酸盐；还可作为抗原用于植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶抗体的制备，并可以用于对其结构及性质方面的研究。

Description

一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因及其编码的蛋白质和制备方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种含有植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因的重组载体、用该载体转化的宿主以及利用该转化体大量表达亚硝酸盐还原酶、和亚硝酸盐还原酶的高效亲和层析纯化方法。

背景技术

亚硝酸盐是一种潜在的致癌物质，在蔬菜发酵过程中极易积累，给产品带来潜在的食品安全问题，且过量摄入亚硝酸盐可诱发高铁血红蛋白症，因此严格控制食品中亚硝酸盐的含量非常重要。许多研究表明亚硝酸盐是亚硝胺的前体物，亚硝胺是一种强致癌物，可以诱发消化***中的多种癌变，如胃癌、肠癌和肝癌。鉴于食品可能存在超标亚硝酸盐污染和肉制品中含有亚硝酸盐的潜在食品安全问题，寻求有效控制或降解亚硝酸盐的方法势在必行，除了加入食用安全的乳酸菌外，还可利用亚硝酸盐还原酶(Nir)进行亚硝酸盐的生物降解。但是，目前对如何得到大量的食用安全的亚硝酸盐还原酶还没有很好的方法。主要是因为酶蛋白质的分离纯化困难导致生产成本过高而无法实现产业化，与常规蛋白分离技术相比，固定金属离子亲和层析技术(Immobilized metal ion affinity chromatography，简称IMAC)用于酶蛋白之分离，选择性高，能实现高通量、高吸附的分离纯化。分离的原理主要利用蛋白质表面的组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等和固定金属离子发生亲和作用实现酶蛋白质的分离。因此，设计聚组氨酸、色氨酸、半胱氨酸、精氨酸等为亲和标签与目的酶蛋白质融合后再用IMAC进行纯化，可达到预期的分离效果。

国内外从乳酸菌中提取亚硝酸盐还原酶和大量表达报道很少，申请号为201110207974.3的中国发明专利公开了“一种乳酸菌亚硝酸盐还原酶的生产方法”，该法利用简单的机械破碎和离心的方法收集粗酶，由于粗酶液中含有大量的杂蛋白，使得后续的分离和纯化工作复杂，无法大量得到目标产物亚硝酸盐还原酶，另外，该法中用于产酶的培养基成分含有西红柿汁，由于西红柿红色的原因，使得最终亚硝酸盐还原酶中不可避免带有红色素，影响后续的纯化工作。申请号为201210037774.2的中国发明专利公开了“一种植物乳杆菌的亚硝酸盐还原酶基因及其编码的蛋白质和应用”，其中验证亚硝酸盐还原酶是否表达成功主要的依据为重组微生物的全蛋白SDS-PAGE电泳结果，没有进一步深入该重组蛋白的分离纯化、酶活和应用，由于微生物工程菌E.coli BL 21、E.coli DE 3和JM 105在转化前都能表达亚硝酸盐还原酶，通过本发明的方法，无法很好鉴别亚硝酸盐还原酶的表达是否成功。

发明内容

为解决现有亚硝酸盐还原酶的大量表达、提取和纯化等方面的不足，本发明提供了一种亚硝酸盐还原酶编码基因重组方法，并提供了一种亚硝酸盐重组蛋白的大量表达和纯化的方法，主要是利用含组氨酸标签(HIS标签)的原核表达载体pET-32a(+)，进行亚硝酸盐还原酶基因的重组，再将重组载体转化到宿主，并利用转化体进行大量表达亚硝酸盐还原酶，利用亲和层析法进行纯化亚硝酸盐蛋白。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

含有权利要求1所述植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因的重组质粒，该重组质粒中含组氨酸标签。

上述植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因编码的蛋白质。

上述还原酶基因编码的蛋白质的制备方法，包括如下步骤：

(1)以NCBI中植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶编码基因为模板，进行上下游引物设计，设计的酶切位点为EcoRI、XhoI；

(2)收集植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DMDL 9010在37℃培养16h后的菌液，提取其DNA，并以此为模板，通过PCR技术扩增植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因片段(如SEQ ID NO.1所示)；所述植物乳杆菌DMDL的保藏编号为CGMCC NO.5172；

(3)利用EcoRI、XhoI工具酶将扩增片段和质粒pET-32a(+)于4℃下分别切成具有两个粘性末端的片段；采用回收试剂盒回收以上两个片段，并用T4DNA连接酶连接，再转入重组大肠杆菌中，利用抗生素氨苄青霉素进行筛选即可获得阳性工程菌；

(4)将上述工程菌经诱导表达，采用亲和层析法纯化，即得到重组亚硝酸盐还原酶。

所述重组大肠杆菌为E.coli 5α或E.coli BL 21。

步骤(1)中所述上游引物为5’-CCGGAATTCATGAGTCAAAGCTTATGGCA-3’(EcoRI)，下游引物为5’-CCGCTCGAGTTAATTCCGTACACTGTTTG-3’(Xhol)。

所述诱导表达为加入诱导剂IPTG进行诱导。

所述IPTG的浓度为1mmol/L。

所述亲和层析法为Ni sepharose亲和层析法。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

(1)本发明通过亲和层析作用来验证工程菌可以诱导表达亚硝酸盐还原酶(Nir)重组蛋白。

(2)本发明可以通过IPTG诱导表达得到大量的亚硝酸盐还原酶，可以应用到工业中大量生产亚硝酸盐还原酶。

(3)本发明利用亲和层析作用纯化得到纯度较高的Nir重组蛋白，解决了从植物乳杆菌中分离出纯度较高亚硝酸盐还原酶的难题。

(4)本发明得到的工程菌表达的重组蛋白可以有效的降解亚硝酸盐，可以生产成酶制剂，能有效降解食品中的亚硝酸盐；还可作为抗原用于植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶抗体的制备，并可以用于对其结构及性质方面的研究。

植物乳杆菌DMDL 9010的保藏信息：植物乳杆菌DMDL 9010于2011年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称：CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO.5172；该保藏证明已经在中国专利CN103060229A中提交。

附图说明

图1为实施例1中利用植物乳杆菌DMDL 9010基因组DNA为模板进行PCR扩增产物鉴定图，其中M为DNA分子量标准；1，2为阴性对照；3，4为PCR扩增产物。

图2为实施例2中构建的重组质粒进行双酶切鉴定图，其中M为DNA分子量标准；1，2为双酶切重组质粒；3，4为阴性对照。

图3为实施例3中构建的重组质粒进行PCR产物鉴定图，其中M为DNA分子量标准；1为阴性对照；2为PCR扩增产物。

图4为实施例5中诱导含有重组质粒pET-32a(+)-Nir的E.coli DH5α诱导表达后所得到的粗酶液(重组组)、空白质粒pET-32a(+)的E.coli DH5α诱导表达后所得到的粗酶液(空质粒组)和不含质粒的E.coli DH5α诱导表达后所得到的粗酶液(野生型组)通过亲和层析柱的过程中的蛋白含量变化趋势。

图5为纯化后Nir蛋白质的SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白质分子量标准；1为纯化后的蛋白；2为阴性对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但是本发明要求保护范围并不局限于此。

实施例1

植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因组DNA的制备，包括如下步骤：

1、PCR引物设计

以中的DNA设计出PCR引物：上游引物为5’-CCGGAATTCATGAGTCAAAGCTTATGGCA-3’(EcoRI)，如SEQ ID NO.2，下游引物为5’-CCGCTCGAGTTAATTCCGTACACTGTTTG-3’(Xhol)，如SEQ ID NO.3，并人工合成这对上下游引物；

2、植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因组DNA的提取(细菌基因组DNA小量纯化试剂盒TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0，为Takara Biotechnology公司的产品，购自广州瑞真生物技术有限公司)，其中溶液均为试剂盒中的溶液，具体步骤为：(1)植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DMDL 9010培养物3～4mL于12000rp离心1min弃上清液，菌体沉淀置于1.5mL的EP中，加0.6mL浓度为10％的溶菌酶溶液，颠倒混匀5～10次后放37℃保温至少30min；

(2)12,000rpm室温离心10min，小心弃上清液。

(3)加入150μL SP Buffer(含RNase A1)充分悬浮细菌沉淀。

(4)加入20μL的Lysozyme溶液，均匀混合后室温静置5min。

(5)加入30μL的EDTA Buffer，均匀混合后室温静置5min。

(6)加入200μL的Solution A，剧烈震荡后65℃保温10min。

(7)加入400μL的Solution B，剧烈震荡15s。

(8)加入650μL的Solution C，上下颠倒均匀混合。

(9)12,000rpm离心1min。

(10)先弃去上层有机相，然后将水相溶液(无色下层)移入预先置于1.5mL离心管上的Filter Cup中，12,000rpm离心1min。

(11)弃Filter Cup，在滤液中加入450μL的DB Buffer，混合均匀。

(12)将试剂盒中的Spin Column置于Collection Tube上。

(13)将上述(11)的混合液转移至Spin Column中，12,000rpm离心1min，弃滤液。

(14)将500μL的Rinse A加入至Spin Column中，12,000rpm离心1min，弃滤液。

(15)将700μL的Rinse B加入至Spin Column中，12,000rpm离心1min，弃滤液。

(16)重复操作步骤(15)。

(17)将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000rpm离心1min。

(18)将Spin Column安置于新的1.5mL的离心管上，在Spin Column膜的中央加入60μL的灭菌蒸馏水，室温静置1min。

(19)12,000rpm离心1min洗脱DNA。

3、目的基因的扩增

以步骤2中(13)提取的植物乳杆菌基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增目的基因片段，PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环，得PCR扩展的植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因组DNA；同时设立阴性对照，以无菌水作为模板进行上述操作。

用1％琼脂糖电泳检测目的基因PCR产物；电泳检测结果如图1，在1600KD附近有一条明显的DNA条带，该DNA条带为上述所得的植物乳杆菌Nir基因组DNA。

实施例2

含有实施例1所得的PCR扩展的植物乳杆菌Nir的基因组DNA的重组表达载体的构建，步骤如下：

将实施例1所得的PCR扩展的植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的扩增片段DNA与质粒pET-32a(+)(为美国Novagen公司产品，购自上海吉然生物科技有限公司)分别进行EcoRI、XhoI酶切，反应条件于37℃过夜14～16h，接着分别回收片段DNA和质粒DNA。

将上述两个片段进行连接，于4℃冰箱冷藏过夜反应14～16h，即得到连接产物，其中连接反应体系为：回收酶切pET-32a(+)19μL，回收目的基因片段2.5μL，T4DNA连接酶1μL，T4DNA连接酶缓冲液2.5μL；

再将上述的连接产物转化至E.coli DH5α细胞，即获得重组质粒pET-32a(+)-Nir；

获得的重组质粒pET-32a(+)-Nir用PCR和双酶切方法鉴定，阴性对照组为对空白质粒pET-32a(+)进行双酶切，pET-32a(+)-Nir重组载体和空白质粒pET-32a(+)的双酶切鉴定见图2所示，从图中清楚可见重组质粒有两个条带，而空白质粒只有一个条带，说明构建好的载体经EcoRI和XhoI分别在GAATTC、CTCGAG的位点双酶切成两条片断，说明重组质粒pET-32a(+)-Nir构建成功；

重组质粒pET-32a(+)-Nir的PCR时，阴性对照组为空白质粒pET-32a(+)为模板进行PCR，鉴定结果如图3所示，从图中可看出以重组质粒pET-32a(+)-Nir为模板可以扩增出DNA片段，而以空白质粒pET-32a(+)则扩增不出DNA片段，再次说明重组质粒pET-32a(+)-Nir构建成功；

用DNA测序仪常规方法测定重组质粒的序列，测序结果表明该重组质粒构建成功，并命名为pET-32a(+)-Nir；

将重组质粒pET-32a(+)-Nir经双酶EcoRI和XhoI分别在5’-GAATTC-3’、5’-CTCGAG-3’位点切割，获得5.9kb的载体片段和与目的片段大小相符的基因片段，如图2所示，从图中可看出重组质粒pET-32a(+)-Nir构建成功。

实施例3

将实施例2构建好的表达载体pET-32a(+)-Nir质粒，转入E.coli DH5α感受态细胞中，获得重组大肠杆菌，其具体步骤如下:

(1)连接产物5μL，加到200μL的E.coli DH5α感受态细胞悬液中，轻轻混匀，冰上放置30min；

(2)42℃水浴热激90s，迅速取出置冰上冷却30min；

(3)加入400μL的LB液体培养基，混匀后37℃水浴1h，使细菌恢复正常生长状态；

(4)4000rpm离心10min，弃400μL上清液，取剩余200μL菌液均匀涂布于LB固体培养基上，37℃正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养8～12h；

(5)挑取单克隆培养后用PCR鉴定，阳性克隆培养物即为构建成功的含有Nir基因转化的pET-32a(+)-Nir质粒的重组大肠杆菌E.coli DH5α。

将重组成功的E.coli DH5α接种到LB液体培养基中(含50mg/mL氨苄青霉素和50μg/mL的NaNO₂)(重组组)，于37℃和180rpm摇床培养12h后，取1mL菌液12000rpm离心1min后取上清液100μL，测NaNO₂含量，其NaNO₂测定方法为：取样品100μL于25mL的比色管中，加入蒸馏水20mL，再加入2mL对氨基苯磺酸，混匀后避光反应3min，然后加入1mL盐酸萘乙二胺，加水定容至25mL后混匀，避光反应15min后，在540nm处测吸光值。

对照组为：将不含质粒的E.coli DH5α接种于LB液体培养基(50μg/mL的NaNO₂)中(无质粒组)和不接种的LB液体培养基(50μg/mL的NaNO₂)(不加菌组)中，于37℃和180rpm摇床培养12h后，取1mL菌液于12,000rpm离心1min后取上清液100μL，按照上述的方法测NaNO₂含量，其吸光值如表1，从中可以看出加入了重组工程菌(重组组)的NaNO₂被降解了90％，而无质粒组和不加菌组的两组对照组中，NaNO₂含量无降解。

表1检测未被降解的NaNO₂在540nm处的吸光值结果

表1中的1、2、3指实验的三组平行。

所述的LB液体培养基为：按如下配方称取蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，然后用蒸馏水定容至1L，在121℃下灭菌20min冷却后即得用。

所述的LB固体培养基为：指在LB液体培养基中加入15g琼脂，然后用蒸馏水定容至至1L，在121℃下灭菌20min冷却后即得。

实施例4

利用实施例3所得的重组E.coli DH5α进行植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的诱导表达，具体如下：

将实施例3所得的阳性克隆菌种涂平板于LB固体培养基(含50mg/mL氨苄青霉素)上，于37℃恒温箱中过夜培养，然后从固体培养基(含50mg/mL氨苄青霉素)上挑取单菌落接种到液体培养基(含50mg/mL氨苄青霉素)中，于37℃和200rpm下过夜培养；然后以2％接种量接种LB液体培养基(含50mg/mL氨苄青霉素)，于37℃和200rpm下培养至对数生长期(OD₆₀₀＝0.5)时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导，于37℃和200rpm下诱导培养4h后，得培养液，离心收集培养液菌体，提取Nir，其具体步骤如下：

将培养液用8000rpm离心收集菌体，用无菌水清洗两次，每100mL培养液加入10mL于4℃预冷的缓冲液A，冰浴超声波破碎菌体10min，每超声2s停2s，超声后取出，静置于4℃冰箱12h后，在4℃、9000rpm离心15min，取其上清液为Nir的粗蛋白液，于4℃保存备用。

其中缓冲液A配制方法：0.2mol/L的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液配制，0.2mol/L的Na₂HPO₄的配制，称取71.6g Na₂HPO₄.12H₂O溶于1000mL水；0.2mol/L的NaH₂PO₄的配制，称取31.2g NaH₂PO₄.2H₂O溶于1000mL水；取0.2mol/L的Na₂HPO₄溶液81mL和0.2mol/L的NaH₂PO₄溶液19mL，混合均匀为0.2mol/L的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄溶液。取上述的0.2mol/L的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄溶液100mL，在其中加入29.22g的NaCl，480g尿素，调pH为7.4，定容至1000mL，为缓冲液A。

同时设立对照组，即将非重组载体pET-32a(+)按实施例3的方法，转入E.coli DH5α的细胞中获得对照组菌株(空质粒组)，同时按本实施例的诱导表达过程进行诱导表达。对空质粒组和重组菌的菌体蛋白进行相同条件的超声破碎和离心收集后收集粗酶液。

实施例5

利用实施例4所得的重组大肠杆菌诱导表达的粗蛋白液进行纯化，得到高纯度的亚硝酸盐还原酶，具体如下：

先利用亲和层析柱Ni Sepharose 6Fast Flow(GE公司)纯化蛋白，操作如下：

(1)装柱，用5倍柱体积的蒸馏水冲洗，速度约2mL/min。

(2)用5～10倍柱体积的结合缓冲液B平衡柱，速度约2mL/min。

(3)上粗酶液，用结合缓冲液B冲洗，速度约1mL/min，用2mL离心管收集冲洗后的溶液，每管1.5mL；同时用酶标仪检测每管溶液在280nm处的吸光值，直至吸光值达到基线。

(4)用洗脱缓冲液C洗脱，速度约1mL/min，用2mL离心管收集冲洗后的溶液，每管1.5mL；同时用酶标仪检测每管溶液在280nm处的吸光值，直至吸光值达到基线。

其中结合缓冲液B配制方法：取上述的0.2mol/L的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液100mL，在其中加入29.22g的NaCl，480g尿素，1.36g的咪唑，调pH为7.4，定容至1000mL，为结合缓冲液B。

其中洗脱缓冲液C配制方法：取上述的0.2mol/L的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液100mL，在其中加入29.22g的NaCl，480g尿素，34g的咪唑，调pH为7.4，定容至1000mL，为洗脱缓冲液C。

对照组分别为将空白质粒pET-32a(+)的E.coli DH5α(空质粒组)和不含质粒的E.coliDH5α(野生型组)按实施例4的诱导表达方法进行诱导表达，并进行蛋白纯化。这三组试验洗脱得到的蛋白含量变化表如图4所示，从图中可以看出，不含质粒的E.coli DH5α(野生型组)洗脱液中不含有蛋白，说明E.coli DH5α表达的蛋白不能粘附在亲和层析柱NiSepharose 6Fast Flow上，而含重组质粒pET-32a(+)-Nir的E.coli DH5α(重组组)和含空白质粒pET-32a(+)的E.coli DH5α(野生型组)能洗脱得到蛋白，说明质粒能在E.coli DH5α中成功表达，即工程菌E.coli DH5α能够成功表达重组蛋白，同时该蛋白能吸附到亲和层析柱Ni Sepharose 6Fast Flow上，并能利用咪唑溶液洗脱下来。对纯化后的重组蛋白经12.5％分离胶的SDS-PAGE检测，其电泳图见图5，从图中可见，得到纯度较高的重组菌中目的蛋白植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶。

Claims (10)

1.一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.含有权利要求1所述植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因的重组质粒。

3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，该重组质粒中含组氨酸标签。

4.权利要求1所述植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因编码的蛋白质。

5.权利要求4所述还原酶基因编码的蛋白质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)利用EcoRI、XhoI工具酶将如SEQ ID NO.1所示的基因片段和质粒pET-32a(+)于4℃下分别切成具有两个粘性末端的片段；采用回收试剂盒回收以上两个片段，并用T4DNA连接酶连接，再转入重组大肠杆菌中，利用抗生素氨苄青霉素进行筛选即可获得阳性工程菌；

(2)将上述工程菌经诱导表达，采用亲和层析法纯化，即得到植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌为E.coli5α或E.coli BL21。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述诱导表达为加入诱导剂IPTG进行诱导。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述IPTG的浓度为1mmol/L。

9.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述亲和层析法为Ni sepharose亲和层析法。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述亲和层析法为Ni sepharose亲和层析法。