CN112268934B - 一种针对循环肿瘤细胞的检测芯片及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了针对循环肿瘤细胞的检测方法及其检测芯片，这种芯片可实现肿瘤细胞在流道中心的精准定位，进而减少细胞位置波动对电阻抗检测的影响，同时可实现肿瘤细胞多种生物物理特性的联合检测，进而实现对肿瘤细胞的精准鉴别。本发明集成了细胞的精准定位与多参量联合检测的功能，可实现肿瘤细胞的多频电阻抗相应特征、细胞变形性、细胞恢复性等多种电阻抗特性和生物力学特征的表征，进而实现异质性肿瘤细胞和与正常血细胞的精准区分，可广泛应用于循环肿瘤细胞、血细胞等稀有细胞的生物学研究、药理学研究和疾病的早期诊断。

Description

一种针对循环肿瘤细胞的检测芯片及其检测方法

技术领域

本发明涉及癌细胞检测器械领域，具体涉及一种针对循环肿瘤细胞的检测芯片及其检测方法。

背景技术

对于疾病初期的诊断以及对癌细胞本身固有的异质性的表征，除了组织病理学和基于影像的诊断外，基于免疫细胞学的荧光标记和基于从组织样本中分离出诸如DNA，RNA和蛋白质之类的细胞分子以筛查或鉴定癌细胞的方法发展势头也很强劲。但是这些技术不仅需要昂贵复杂的设备还需要具备相当技能的专业人员，从而使得其诊断成本过高。因此降低成本和规模，以及探索基于癌细胞性质表征的新颖方法成为了近年来的热点问题。

近年来，基于微流控技术在微流控芯片内分选和富集循环肿瘤细胞和其相近细胞的技术取得了阶段性的进展从而得到了广泛的关注。但是对于富集后的细胞鉴定和表征通常还是基于癌症的基因组，转录组和蛋白质组织特征学，这些分析方法均以生物分子为分析对象，分析过程不仅操作复杂、检测效率低、检测时间长、检测准确性低而且影响细胞活性，很难对表征过后的细胞进行下一步的分析和研究。

细胞的介电特性是表征细胞生理特性的重要替代标志物，随着细胞的结构和组成变化而变化。微流控单细胞阻抗检测技术是在微流控芯片上通过在微型电极之间施加电势，对细胞悬浮液混合***进行测量，获得细胞在不同频率下的电阻抗信号。逐渐演化发展成微型阻抗分析仪、微型库尔特计数器和阻抗流式细胞仪。现有的阻抗流式细胞仪通常只能测得细胞在单频率下的阻抗信号，获得的细胞阻抗信息并不全面，因此仍然存在部分细胞被误判的情况，需要联合细胞的其他参量进行联合鉴别。

癌细胞在病变和发展过程中，其细胞大小和细胞骨架结构也会随时期不同而发生改变，从而导致细胞机械特性的改变，而这些改变可以从反面为鉴别细胞种类提供重要信息和依据。但是传统的测量细胞机械特性的方法不仅需要昂贵的设备，而且要耗费大量的财力和物力。一些能够分析单细胞的机械性能的微流控试验平台已经研制成功，例如利用不同液体间形成压缩、剪切应力迫使细胞变形，利用介电泳技术诱导细胞的变形，或者通过图像来表征细胞的变形能力等。

这些微流控平台虽能够分析细胞的机械性能，但在实验过程中存在细胞变形不明显，需要对细胞进行长时间的捕捉以及不方便集成等缺点，检测结果不够精确，检测通量难以提高。

发明内容

本发明要解决的技术问题：本发明的目的是为了解决现有技术中的不足，提供一种可以对细胞的多种特性进行表征，实现对细胞的精准检测的针对循环肿瘤细胞的检测方法及其检测芯片。

本发明的技术方案：本发明所述的一种针对循环肿瘤细胞的检测芯片，包括PDMS层和玻璃基底层；所述玻璃基底层上设有平面电极；所述PDMS层上设有流道；所述平面电极包括激励电极和设置在所述激励电极上的平行分布的响应电极；

所述流道包括：细胞入口、多频电阻抗检测区和细胞出口；所述多频电阻抗检测区包括小于细胞直径的第一窄缩管和第二窄缩管，所述第一窄缩管和第二窄缩管通过流道管连接；所述第一窄缩管和第二窄缩管上方设有响应电极。

进一步的，所述细胞入口与所述细胞出口间还设有细胞变形检测模块和细胞恢复能力检测模块；

所述细胞恢复能力检测模块内设有第三窄缩管、第四窄缩管、第五窄缩管和第六窄缩管，所述第三窄缩管、第四窄缩管、第五窄缩管和第六窄缩管间距离顺次递增，所述第三窄缩管、第四窄缩管、第五窄缩管和第六窄缩管间管通过流道管连通；

所述细胞变形检测模块包括窄管，所述窄管出口处连接第三窄缩管。

进一步的，所述细胞入口后设有使细胞聚焦于流道中心位置的预聚焦单元。

进一步的，所述窄管内壁设有用于增加细胞在通过所述窄管时所受阻力的波形条纹。

进一步的，所述窄管内壁设有凸起端，所述凸起端沿所述窄管轴线方向，对称设有上凸起和下凸起。

进一步的，所述流道管的直径为10～200μm，所述窄管的流道直径为1～30μm。

本发明还公开了一种针对循环肿瘤细胞的检测芯片的检测方法，用流道管连通若干小于细胞直径的窄缩管，在每个窄缩管上方均设置响应电极；

在检测时，使通入流道管内的细胞通过窄缩管，响应电极上产生的响应离子电流信号经过电流放大装置的放大作用后转换为电压信号，计算机对其进行同步采样并经过计算机处理，得到细胞的响应信号图。

进一步的，包括侵袭能力检测、变形程度检测以及恢复能力检测；

所述窄缩管设有组，顺次排列；在所得响应信号图上得到匹配组窄缩管的组峰值，第一峰与第二峰表征检测细胞的电阻抗特性；

第一峰与第二峰的峰值R₀是检测细胞的原始粒径；

第二峰与第三峰的时间间隔表征检测细胞的侵袭能力；

第二峰的峰值R₀与第三峰的峰值R₁之比表征检测细胞的的变形程度；

将第四峰、第五峰和第六峰值R₂、R₃和R₄与第二峰的峰值R₀进行比较，当峰值恢复至与R₀一样时，我们认为细胞此时已恢复至正常形态，由此可以得出细胞恢复时间的长短，表征检测细胞的恢复能力。

进一步的，所述计算机处理包括计算机对所述电压信号进行同步采样并将所述电压信号存储为txt文本文件，利用MATLAB程序读取所述txt文本文件，对采集到的每个周期内的数字信号作快速傅里叶变换、降噪处理、反向傅里叶变换。

本发明与现有技术相比的有益效果：

1.本发明专利具有成本低、操作简单、易集成微型化的优点，多频电阻抗检测区可以对正常形态下的细胞同时进行多频率电阻抗检测，获得细胞在正常形态下的尺寸大小和电阻抗信息。

2.本发明采取了多级检测设计，实现了对细胞的电学特性、侵袭能力、变形能力和恢复能力的多种特性进行表征，进而实现了多参量联合检测，大大减少实验及检测时间的同时对大大提高了鉴别精度，并且提供可更加令人信服的鉴别依据；细胞变形检测模块，通过窄管内壁面对细胞施加的压力，使得细胞在通过通道时产生形变，窄管管壁内表面的波形条纹可以增大细胞通过变形模块时的阻力；在细胞在通过第三窄缩管时，可以得出细胞通过变形模块的时间，表征其侵袭能力，同时可以得出细胞受挤压后的即时尺寸，表征其变形能力；在通过多个间距不一的窄缩管后，通过对其尺寸的重复测量，可以表征其变形后的恢复能力；此多级结构对细胞的电学特性，侵袭能力，变形能力和恢复能力多种特性进行表征，进而实现对癌细胞和与其相近的血细胞的精准检测。

3.本发明在对细胞进行多种特性表征后能够保证细胞的完整性和活性，便于对细胞进行下一步的分析研究。

附图说明

图1为本发明的整体结构示意图；

图2为本发明中聚焦模块选择被动非对称正弦惯性聚焦时的结构示意图；

图3为本发明中聚焦模块中的非对称正弦流道聚焦原理示意；

图4为本发明中聚焦模块中选择主动声学聚焦时的结构图；

图5为本发明中流道中窄缩管的连接示意图；

图6为本发明中检测得到的相应测信号图。

具体实施方式

为了加深本发明的理解，下面我们将结合附图对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

如图1-5示出了本发明针对循环肿瘤细胞的检测芯片的具体组成，包括PDMS层和玻璃基底层；玻璃基底层上设有平面电极；PDMS层上设有流道；平面电极包括激励电极4和设置在激励电极4上的平行分布的响应电极41；

流道包括：细胞入口91、预聚焦单元93、多频电阻抗检测区1、细胞变形检测模块2、细胞恢复能力检测模块3和细胞出口92；多频电阻抗检测区1包括小于细胞直径的第一窄缩管31和第二窄缩管32，第一窄缩管31和第二窄缩管32通过流道管连接；第一窄缩管31和第二窄缩管32上方设有响应电极41。

如图1所示，在第一窄缩管31、第二窄缩管32、第三窄缩管33、第四窄缩管34、第五窄缩管35和第六窄缩管36中，相邻两窄缩管间均设有防干扰电极51，防干扰电极51平行设置在电极板5上。

细胞恢复能力检测模块内设有第三窄缩管33、第四窄缩管34、第五窄缩管35和第六窄缩管36，如图5所示，第三窄缩管33、第四窄缩管34、第五窄缩管35和第六窄缩管36间距离顺次递增；第一流道管71长度小于第二流道管72，第二流道管72长度小于第三流道管73。

第三窄缩管33、第四窄缩管34、第五窄缩管35和第六窄缩管36上均设有响应电极41。细胞变形检测模块包括窄管20，窄管20内壁设有用于增加细胞在通过窄管20时所受阻力的波形条纹。窄管20内壁设有凸起端21，凸起端沿窄管20轴线方向，对称设有上凸起和下凸起；当待检测细胞凸起端21时，细胞会受到凸起端21尖锐结构在两个点上施加额压力而产生局部变形，从变形检测模块流出后进入下一模块进行表征。窄管20出口处连接第三窄缩管33。流道管的直径为10～200μm，窄管20的流道直径为1～30μm。

如图2所示，当细胞预聚焦模块93选用被动非对称正弦惯性聚焦时，为使细胞粒子能够在通过聚焦模块内的非对称正弦流道后实现聚焦，聚焦单元中的非对称正弦流道至少包含了5组S形单元，每个S形单元中均包含有一个大弯管和一个小弯管，尺寸满足流道宽度与流道高度的比值为1～1/2，小弯管的平均曲率半径与大弯管的曲率半径比值为1/3，小弯管宽度与大弯管长度比值为1/2～1/3。

如图3所示，在有限雷诺数Re的牛顿流体中，细胞在非对称正弦流道的侧向聚焦时流道管内惯性迁移效应和弯道内迪恩流作用的耦合结果。当细胞在流道管内随流体作层流流动时，呈抛物线型流速分布的剪切力梯度将在细胞上诱导产生一个指向流道壁面的力，称为剪切诱导惯性升力F_SG；细胞横向运动至流道壁面附近时，因细胞自旋产生的对称尾迹将于流道壁面共同作用在细胞上诱导产生一个指向轴心的力，称为壁面诱导惯性升力F_W；当呈抛物线型流动的流体进入弯流道时，会在垂直于主流动方向的截面上产生两个方向相反的对称涡流，截面迪恩流，对细胞施加一个横向迪恩曳力F_D；于是在入口处随机分散于样品中的细胞，在非对称正弦流道内沿主方向运动时，将受到周期性变化的剪切诱导惯性升力、壁面诱导惯性升力和迪恩曳力耦合作用，最终在聚焦单元出口处稳定聚焦成一束。

如图4所示，当选用主动声学方法进行聚焦时，利用声源在流道内建立驻波声场，使液体流动方向平行于驻波声波方向，流体内的细胞将被推向具有最小声辐射压力的(压力节点)的区域，由于声场源在流道两侧对称分布，故形成的声场关于流道对称，形成的压力节点就在流道的中心线上，流体内的分散的细胞将因为其位置和大小的不同经受不同的声辐射力，不处在压力节点上的细胞会因为受力不均而向压力节点位置迁移，最终稳定的聚焦成一束从聚焦模块出口处流出。

本发明还公开了一种针对循环肿瘤细胞的检测方法，如图1所述，用流道管连通若干小于细胞直径的窄缩管，在每个窄缩管上方均设置响应电极；在检测时，使通入流道管内的细胞通过窄缩管，响应电极上产生的响应离子电流信号经过电流放大装置的放大作用后转换为电压信号，计算机对其进行同步采样并经过对所述电压信号进行同步采样并将所述电压信号存储为txt文本文件，利用MATLAB程序读取所述txt文本文件，对采集到的每个周期内的数字信号作快速傅里叶变换、降噪处理、反向傅里叶变换，得到细胞的响应信号图。

如图6所示，在所得响应信号图上得到匹配6组窄缩管的6组峰值，第一峰与第二峰表征检测细胞的电阻抗特性；

第一峰与第二峰的峰值R₀是检测细胞的原始粒径；

第二峰与第三峰的时间间隔表征检测细胞的侵袭能力；

第二峰的峰值R₀与第三峰的峰值R₁之比表征检测细胞的的变形程度；

将第四峰、第五峰和第六峰的峰值R₂、R₃和R₄与第二峰的峰值R₀进行比较，当峰值恢复至与R₀一样时，我们认为细胞此时已恢复至正常形态，由此可以得出细胞恢复时间的长短，表征检测细胞的恢复能力。

由于癌细胞的侵袭能力要远大于普通上皮细胞，故而其通过窄缩通道的时间要短于普通上皮细胞；

癌细胞相对于普通上皮细胞要更加的软，故而其变形程度会大于普通上皮细胞，癌细胞通过时的第三峰与第二峰的比值会比普通细胞要小；

癌细胞和普通上皮细胞有益于细胞骨架结构不同，在受压产生形变后，恢复至正常形态的时间较普通上皮细胞会有所区别。

具体鉴别方法：

在进行鉴别之前，通过器件收集癌细胞与其相近血细胞的电阻抗信息；侵袭能力信息；变形性信息；恢复能力信息建立相应的数据库，在实际进行鉴别时，通过将实时测量得到的数据和数据库内的数据进行比对得出其细胞种类，实现多参量联合精准鉴别。

本实施例中，各个流道的制备材质为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，也可选用玻璃、环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)等对电阻抗信号不会产生干扰的材料来制作。原型器件通过软光刻工艺制备，具体制备过程包括软光刻平面电极，光刻SU-8阳模、PDMS浇注以及利用真空氧等离子体键和技术对PDMS-玻璃键进行合封装等步骤。此外，阳模的制备也可借助硅的湿法/深反应离子刻蚀、超精密机加工、金属电镀及感光电路板刻蚀加工等技术实现。

本发明具有可以对细胞的多种特性进行表征，实现对细胞的精准检测的特点。由于设有多频电阻抗检测区可以对正常形态下的细胞同时进行多频率电阻抗检测，获得细胞在正常形态下的尺寸大小和电阻抗信息；其次，本发明采取了多级检测设计，实现了对细胞的电学特性、侵袭能力、变形能力和恢复能力的多种特性进行表征，进而实现了多参量联合检测，大大减少实验及检测时间的同时对大大提高了鉴别精度，并且提供可更加令人信服的鉴别依据；细胞变形检测模块，通过窄管内壁面对细胞施加的压力，使得细胞在通过通道时产生形变，窄管管壁内表面的波形条纹可以增大细胞通过变形模块时的阻力；在细胞在通过第三窄缩管时，可以得出细胞通过变形模块的时间，表征其侵袭能力，同时可以得出细胞受挤压后的即时尺寸，表征其变形能力；在通过多个间距不一的窄缩管后，通过对其尺寸的重复测量，可以表征其变形后的恢复能力；此多级结构对细胞的电学特性，侵袭能力，变形能力和恢复能力多种特性进行表征，进而实现对癌细胞和与其相近的血细胞的精准检测；最后，本发明在对细胞进行多种特性表征后能够保证细胞的完整性和活性，便于对细胞进行下一步的分析研究。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本领域的技术人员应该了解本发明不受上述具体实施例的限制，上述具体实施例和说明书中的描述只是为了进一步说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护的范围由权利要求书及其等效物界定。

Claims (7)

1.一种针对循环肿瘤细胞的检测芯片，其特征在于：包括PDMS层和玻璃基底层；所述玻璃基底层上设有平面电极；所述PDMS层上设有流道；所述平面电极包括激励电极（4）和设置在所述激励电极（4）上的平行分布的响应电极（41）；

所述流道包括：细胞入口（91）、多频电阻抗检测区（1）和细胞出口（92）；所述多频电阻抗检测区（1）包括小于细胞直径的第一窄缩管（31）和第二窄缩管（32），所述第一窄缩管（31）和第二窄缩管（32）通过流道管连接；所述第一窄缩管（31）和第二窄缩管（32）上方设有响应电极（41）；

所述细胞入口（91）与所述细胞出口（92）间还设有细胞变形检测模块（2）和细胞恢复能力检测模块（3）；

所述细胞恢复能力检测模块内设有第三窄缩管（33）、第四窄缩管（34）、第五窄缩管（35）和第六窄缩管（36），所述第三窄缩管（33）、第四窄缩管（34）、第五窄缩管（35）和第六窄缩管（36）间距离顺次递增，所述第三窄缩管（33）、第四窄缩管（34）、第五窄缩管（35）和第六窄缩管（36）间管通过流道管连通；

所述细胞变形检测模块（2）包括窄管（20），所述窄管（20）出口处连接第三窄缩管（33）。

2.根据权利要求1所述的针对循环肿瘤细胞的检测芯片，其特征在于：所述细胞入口（91）后设有使细胞聚焦于流道中心位置的预聚焦单元（93）。

3.根据权利要求1所述的针对循环肿瘤细胞的检测芯片，其特征在于：所述窄管（20）内壁设有用于增加细胞在通过所述窄管（20）时所受阻力的波形条纹。

4.根据权利要求1所述的针对循环肿瘤细胞的检测芯片，其特征在于：所述窄管（20）内壁设有凸起端（21），所述凸起端（21）沿所述窄管（20）轴线方向，对称设有上凸起和下凸起。

5.根据权利要求1-4中任一所述的针对循环肿瘤细胞的检测芯片，其特征在于：所述流道管的直径为10~200µm，所述窄管（20）的流道直径为1~30µm。

6.一种针对循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于：包括：基于权利要求1-4中任一所述的针对循环肿瘤细胞的检测芯片，用流道管连通若干小于细胞直径的窄缩管，在每个窄缩管上方均设置响应电极；

在检测时，使通入流道管内的细胞通过窄缩管，响应电极上产生的响应离子电流信号经过电流放大装置的放大作用后转换为电压信号，计算机对其进行同步采样并经过计算机处理，得到细胞的响应信号图；

包括侵袭能力检测、变形程度检测以及恢复能力检测；

所述窄缩管设有6组，顺次排列；在所得响应信号图上得到匹配6组窄缩管的6组峰值，第一峰与第二峰表征检测细胞的电阻抗特性；

第一峰与第二峰的峰值R₀是检测细胞的原始粒径；

第二峰与第三峰的时间间隔t₁表征检测细胞的侵袭能力；

第二峰的峰值R₀与第三峰的峰值R₁之比表征检测细胞的变形程度；

将第四峰、第五峰和第六峰的峰值R₂、R₃和R₄与第二峰的峰值R₀进行比较，当峰值恢复至与R₀一样时，可断定细胞此时已恢复至正常形态，由此可以得出细胞恢复时间的长短，表征检测细胞的恢复能力。

7.根据权利要求6所述的针对循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于：所述计算机处理包括计算机对所述电压信号进行同步采样并将所述电压信号存储为txt文本文件，利用MATLAB程序读取所述txt文本文件，对采集到的每个周期内的数字信号作快速傅里叶变换、降噪处理、反向傅里叶变换。

Images