CN115254214B - 一种微流控通道、微流控芯片和生化分子递送方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种微流控通道、微流控芯片和生化分子递送方法。该微流控通道包括入口、细胞挤压区和出口，其中细胞挤压区包括至少一个阵列式细胞挤压单元，阵列式细胞挤压单元包含A列共A×B个独立的微结构，微结构上设置有至少一个尖锐的凸块结构，两个呈镜像设置的尖锐的凸块之间形成细胞挤压通道，细胞流经细胞挤压通道时尖锐的凸块结构对流过的细胞形成撞击和挤压，从而使细胞膜磷脂双分子层在短时形成微细的孔洞，促进生物分子高效扩散至细胞内。本发明的微流控芯片结构简单，易制备，递送生物分子至细胞效率高，处理后的细胞存活率高达80％，在微流控芯片上对细胞的研究可深入到单细胞水平，极大地节省人力、物力和成本，适用范围广。

Description

一种微流控通道、微流控芯片和生化分子递送方法
技术领域
本发明涉及生化分子递送技术领域，具体涉及一种微流控通道、微流控芯片和生化分子递送方法。
背景技术
蛋白质是细胞的主要组成部分，在调节细胞生理功能和维持新陈代谢中起到重要作用。人体的生长、发育、运动、遗传、繁殖和其他生命活动等都与蛋白质密不可分。现在，生物科学研究已经进入后基因时代，对生物大分子，特别是蛋白质的结构、功能及其相互作用的研究已经成为生命科学的工作重点。在细胞中，多糖、蛋白质和核酸等大分子物质占据细胞20％～30％的体积，蛋白质实际上是在拥挤、限域和弱相互作用等并存的非匀相的复杂环境中执行其功能，已经有越来越多的研究表明这种复杂细胞环境会影响蛋白质的结构、稳定性、动力学和功能。将蛋白质输送到活细胞中，可以实现对细胞功能的调节和疾病的治疗，例如：通过细胞内递送核酸酶进行基因编辑、转运抗体进行治疗、或输送转录因子调节基因表达。从某些方面来说，蛋白质的直接传递作用优于核酸的间接表达，例如：避免***片段诱变的风险。但是，蛋白质在细胞内达到相应的效果需要递送足够数量的蛋白质，而质粒DNA却可以通过复制进行扩增达到效果。
最初用于递送核酸的方式也可以用于蛋白质细胞内递送。例如：(1)与转染试剂类似的脂质和高分子化合物，(2)细胞穿透肽(Cell-Penetrating Peptides，CPPs)，(3)细菌毒素和病毒成分和(4)工程化的纳米载体。脂质和高分子化合物，虽然能够递送某些蛋白质，但不适用于大多数情况。因为蛋白质分子在大小，电荷和结构上都存在较大差异，而且蛋白质比核酸更容易变性(例如：热，盐浓度或pH变化)。因此，专为核酸设计的脂质和高分子化合物在多种不同的蛋白质上具有局限性。另外，CPPs可以附着在大多数蛋白质上，但它们也存在易于内吞，细胞毒性高和胞质传递效率低等问题。使用细菌毒素和病毒成分的蛋白质细胞内递送在许多方面与CPPs相似，但递送机制更为明确；细菌毒素和病毒成分的研究的原理是将目标蛋白质靶向特定的内吞途径，然后触发内体逃逸的自然机制，来模拟病原体进入过程。但是这种策略必须针对特定的细胞类型进行研究。在过去的15年中，工程纳米载体的应用引起了人们的极大兴趣，它们可以设计为具有多功能和刺激响应特性的高级结构。此类纳米载体由生物分子、脂质、聚合物和无机材料的组合构建并功能化，但它们尚未转化为商业产品被广泛应用。电穿孔技术通过对脉冲参数的调节可以将大分子物质输送到多种细胞类型中，例如：场强、脉冲持续时间、脉冲数和频率等；此外，细胞膜上孔洞的形成和电压刺激的双重作用更有利于带电货物的输送，例如质粒DNA或mRNA。但是电穿孔技术也存在缺点，尤其是处理后的细胞存活问题。在此基础上，已经开发出具有不同电极设计与微流体或者纳米通道结合的技术创新来克服其中的一些问题，例如：纳米吸管被制成垂直排列的阵列，可以与数千个细胞连接，并将液体从外部储液器直接输送到细胞内空间。纳米吸管与电场等手段结合以递送渗透性不强的物质。纳米吸管的优势在于对递送体积和剂量浓度的时间控制。但是该种技术创新尚未取代传统电穿孔方式，比色皿式电穿孔仍然是最广泛使用的膜破裂介导的细胞内递送平台，通过递送抗体和药物来治疗多种患者的衍生细胞和干细胞体现了电穿孔技术在医疗和临床应用的前景。
目前常用于将核酸导入到目标细胞的方法均难以将蛋白质高效导入到人源细胞进行研究；显微注射一般只适合于将蛋白质导入到尺寸较大的细胞(以非洲爪蟾***为例，直径～2mm)，不适合于人源细胞(直径10～20μm)，且微注射方法需要繁琐的人工操作，费时费力。目前常用于将蛋白质导入到人源细胞的手段仍是采用电穿孔技术，通过施加高压电场使细胞膜在短时间内打开一定大小的孔径，从而让外源蛋白质进入到细胞内；虽然电转的方式可以将蛋白质递送到细胞内，但该方式能高效导入的蛋白质种类非常受局限。
综上所述，在细胞内蛋白质递送研究中，电穿孔和显微注射方式还存在较大局限，难以使蛋白质在短时间内递送到足够多的细胞，进而满足细胞内蛋白质结构功能研究。目前还缺少可高效率和高通量实现细胞内蛋白质递送的解决方案。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提供了一种微流控通道、微流控芯片和生化分子递送方法。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明的第一目的在于提供一种微流控通道，所述微流控通道包括入口、细胞挤压区和出口，所述入口和所述出口对称设在在所述细胞挤压区的两侧，所述入口通过第一过渡区域与所述细胞挤压区相连通，所述出口通过第二过渡区域与所述细胞挤压区相连通；所述细胞挤压区包括至少一个阵列式细胞挤压单元，所述阵列式细胞挤压单元包含A列共A×B个独立的微结构，相邻两列所述微结构沿列方向呈错位排布，每列相邻两个所述微结构间隔设置，所述微结构包括两个镜像设置的微档板，所述微档板包括阻隔块和至少一个尖锐的凸块，至少一个所述尖锐的凸块设在所述阻隔块的端部，两个呈镜像设置的尖锐的凸块之间形成细胞挤压通道，细胞流经细胞挤压通道时，细胞膜在挤压作用下受到一定程度的破坏，产生通孔，使得外源物质通过通孔进入到细胞内。
进一步的，所述细胞挤压通道19的宽度为3～8μm。
进一步的，所述微档板包括一个所述尖锐的凸块，所述尖锐的凸块与所述阻隔块的夹角为钝角。
进一步的，所述细胞挤压区包括一个阵列式细胞挤压单元，所述阵列式细胞挤压单元包括10～10,000个所述微结构，每列相邻两个所述微结构之间的间隔间距为25～40μm，每个所述微结构的两个所述阻隔块之间的间距为不小于100μm，所述细胞挤压通道的直径为5～8μm。
进一步的，所述微档板包括两个所述尖锐的凸块，两个所述尖锐的凸块并排设置形成齿形。
进一步的，所述细胞挤压区包括至少两个阵列式细胞挤压单元，所述阵列式细胞挤压单元包括10～10,000个所述微结构，每列相邻两个所述微结构之间的间隔间距为4.5～6.7μm，所述微结构的两个所述阻隔块之间的间距为不小于25μm，所述细胞挤压通道的直径为3.5～5.5μm。
本发明的第二目的在于提供一种微流控芯片，包括盖片和基片，所述盖片设置在基片上，所述盖片上设置有微流控通道，所述微流控通道为上述的微流控通道。
进一步的，所述微流控通道的高度为20～25μm。所述基片选自选自硅片、石英玻璃、聚二甲基硅氧烷PDMS、聚氨酯PU、聚乙烯PE、聚碳酸酯PC-聚苯乙烯PS、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、环氧树脂中的至少一种。
本发明的第三目的在于提供一种生化分子递送方法，利用上述微流控芯片对所述细胞进行处理，将细胞外的生物分子递送至细胞内。
进一步的，所述处理的过程为：使用微量注射泵将细胞悬液按预设流速0.05mL/min～0.1mL/min通过所述微流控芯片的入口注入到所述微流控通道内。
与现有技术比较，本发明提供的技术方案带来的有益效果是：
(1)本发明提供微流控通道包括入口、细胞挤压区和出口，其中细胞挤压区包括至少一个阵列式细胞挤压单元，阵列式细胞挤压单元包含A列共A×B个独立的微结构，微结构上设置有至少一个尖锐的凸块结构，两个呈镜像设置的尖锐的凸块之间形成细胞挤压通道，利用尖锐的凸块结构对流过的细胞形成撞击和挤压，从而使细胞膜磷脂双分子层在短时形成微细的孔洞，促进生物分子高效扩散至细胞内；流过的细胞还会受到后续微结构的进一步挤压作用，而且微结构可以根据细胞大小、硬度及种类等参数进行调整，实现了高效率和高通量处理生物分子扩散至细胞内。
(2)本发明的微流控通道内相邻两列所述微结构沿列方向呈错位排布，每列相邻两个所述微结构间隔设置，使得微结构的横向布局上，设计有宽窄不一样的细胞流经通道，可以方便大量细胞流过，不会造成微流控通道堵塞；微结构的纵向布局上，细胞挤压通道是呈周期性设计的，即细胞受到多次挤压后有一个相对宽阔的缓释区域让细胞进行短暂恢复，一方面可以让外源分子进入细胞，另一方面可以让细胞膜进行调整，利于细胞保持活性。
(3)本发明提供的微流控芯片包含本发明的微流控通道，其结构简单，易制备，递送生物分子至细胞效率高，在微流控芯片上对细胞的研究可深入到单细胞水平，极大地节省人力、物力和成本，适用范围广。
(4)本发明提供的生化分子递送方法，利用本发明的微流控芯片对细胞进行处理，将细胞外的生化分子递送至细胞内，处理后的细胞存活率高达80％。整个处理过程，细胞无需受到太强的外界刺激，就能够保持较高的活力。
附图说明
图1A为实施例1的微流控芯片结构示意图，其中箭头为细胞悬液流动的方向；
图1B为细胞挤压区的局部放大图(标尺为50μm)，其中箭头细胞悬液流动的方向；
图1C为实施例1的微流控芯片通过微结构对细胞形成挤压和摩擦将GFP蛋白转运至HeLa细胞的过程示意图，其中标记为挤压后呈现长条状的HeLa细胞；
图2为微流控芯片加工示意图；
图3为实施例1微流控芯片的微结构的宽度对细胞内蛋白递送效率的影响结果图，其中A为不同宽度的微结构作用于细胞的效果图；B为不同宽度的微结构作用于细胞后的细胞活力分析；C不同宽度的微结构作用于细胞的递送效率分析，实验数据之间的差异通过T检验进行统计分析，****P<0.0001，比例尺：50μm；
图4为实施例1微流控芯片使用流速选择和分析结果图，其中A为不同流速对细胞递送效率影响的效果图；B为与A对应的细胞递送效率分析，实验数据之间的差异通过T检验进行统计分析，****P<0.0001；C为与A对应的细胞活力分析，比例尺：50μm；
图5不同类型细胞的递送效果结果图，其中A为K562细胞递送GFP蛋白的效果图；B为HeLa细胞递送GFP蛋白的效果图；C为MDA-MB-231细胞递送GFP蛋白的效果图；D为对应的细胞递送效率分析，比例尺：50μm；
图6A为实施例2的微流控芯片结构示意图，其中箭头为细胞悬液流动的方向；
图6B为细胞挤压区的局部放大图(标尺为50μm)，其中箭头细胞悬液流动的方向；
图6C为实施例2的微流控芯片通过微结构对细胞形成挤压和摩擦将GFP蛋白转运至MDA-MB-231细胞的过程示意图，其中标记为挤压后呈现长条状的MDA-MB-231细胞；
图6D为实施例2的微流控芯片的生化分子递送图，当含细胞的蛋白悬浮液经过微流控芯片的微结构时，所受到的流体压力不同和齿形结构对细胞的挤压与直接刺激，让细胞膜在短时形成纳米级孔洞，从而将蛋白高效递送至细胞；
图7为实施例2微流控芯片的微结构的宽度对MDA-MB-231细胞内蛋白递送效率的影响结果图，其中A为不同宽度的微结构作用于MDA-MB-231细胞的效果图；B不同宽度的微结构作用于细胞后的细胞活力分析；C不同宽度的微结构作用于细胞的递送效率分析，比例尺：50μm；
图8为实施例2微流控芯片的微结构的宽度对Jurkat细胞内蛋白递送效率的影响结果图，其中A为不同宽度的微结构作用于Jurkat细胞的效果图；B不同宽度的微结构作用于细胞后的细胞活力分析；C不同宽度的微结构作用于细胞的递送效率分析，比例尺：50μm；
图9为实施例2微流控芯片使用流速选择和分析结果图，其中A为不同流速对MDA-MB-231细胞递送效率影响的效果图；B不同宽度的微结构作用于细胞后的细胞活力分析；C不同宽度的微结构作用于细胞的递送效率分析，比例尺：50μm；
图10为DNase I作用微流控芯片的入口处的图；
图11为不同的打孔方式对微流控芯片堵塞研究的结果图；其中A为不同打孔方式的微结构作用于细胞的效果图；B不同打孔方式的微结构作用于细胞后的细胞效率分析；C芯片的进样口，比例尺：50μm；
图12为不同的细胞密度对微流控芯片堵塞研究的结果图；其中A为不同细胞密度对MDA-MB-231细胞递送效率影响的效果图；B为与A相对应的细胞效率分析，比例尺：50μm；
图13为实施例2微流控芯片将葡聚糖分子递送至MDA-MB-231细胞结果分析图，A为微结构递送不同大分子物质的效果图；B为与A相对应的细胞效率分析，比例尺：50μm。
1、微流控通道；11、入口；12、细胞挤压区；13、出口；14、第一过渡区；15、第二过渡区域；16、细胞挤压单元；17、微结构；18、微档板；181、阻隔块；182、尖锐的凸块；19、细胞挤压通道。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例和附图，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明提供的一种微流控通所述微流控通道1包括入口11、细胞挤压区12、出口13、第一过渡区域14和第二过渡区域15，入口11和出口13对称设在在细胞挤压区12的两侧，入口11通过第一过渡区域14与细胞挤压区12相连通，出口13通过第二过渡区域15与细胞挤压区12相连通；细胞挤压区12包括阵列式细胞挤压单元16，所述阵列式细胞挤压单元16包含A列共A×B个独立的微结构17，相邻两列所述微结构17之沿列方向呈错位排布，每列相邻两个所述微结构17间隔设置，所述微结构17包括两个镜像设置的微档板18，所述微档板18包括阻隔块181和至少一个尖锐的凸块182，所述尖锐的凸块182设在所述阻隔块181的端部，两个呈镜像设置的尖锐的凸块182之间形成细胞挤压通道19，细胞流经细胞挤压通道19时，细胞膜在挤压作用下受到一定程度的破坏，产生通孔，使得外源物质通过通孔进入到细胞内。利用尖锐的凸块结构对流过的细胞形成撞击和挤压，从而使细胞膜磷脂双分子层在短时形成微细的孔洞，促进生物分子高效扩散至细胞内；流过的细胞还会受到后续微结构的进一步挤压作用，而且微结构可以根据细胞大小、硬度及种类等参数进行调整，实现了高效率和高通量处理生物分子扩散至细胞内。微流控通道内相邻两列所述微结构沿列方向呈错位排布，每列相邻两个所述微结构间隔设置，使得微结构的横向布局上，设计有宽窄不一样的细胞流经通道，可以方便大量细胞流过，不会造成微流控通道堵塞；微结构的纵向布局上，细胞挤压通道是呈周期性设计的，即细胞受到多次挤压后有一个相对宽阔的缓释区域让细胞进行短暂恢复，一方面可以让外源分子进入细胞，另一方面可以让细胞膜进行调整，利于细胞保持活性。
实施例中细胞悬浮溶液的配制、智能全自动荧光显微成像***及实验操作均为本领域公知常识，荧光显微成像***的型号为Thermo Fisher EVOSTM FL Auto 2。
实施例1
本实施例提供了一种微流控芯片，其包括盖片和基片，盖片设置在基片上，盖片上设置有微流控通道，所提供的微流控通道如图1A所示：微流控通道包括入口11、细胞挤压区12、出口13、第一过渡区域14和第二过渡区域15，入口11和出口13对称设在在细胞挤压区12的两侧，入口11通过第一过渡区域14与细胞挤压区12相连通，出口13通过第二过渡区域15与细胞挤压区12相连通；细胞挤压区12包括阵列式细胞挤压单元16，所述阵列式细胞挤压单元16包含A列共A×B个独立的微结构17，相邻两列所述微结构17沿列方向呈错位排布，每列相邻两个所述微结构17间隔设置，所述微结构17包括两个镜像设置的微档板18，所述微档板18包括阻隔块181和一个尖锐的凸块182，所述尖锐的凸块182设置在所述阻隔块181的端部，所述尖锐的凸块182与所述阻隔块181的夹角为钝角，两个呈镜像设置的尖锐的凸块182之间形成细胞挤压通道19，每列相邻两个微结构17之间的间隔间距为25～40μm，每个微结构17的两个阻隔块181之间的间距为不小于100μm，细胞挤压通道19的宽度为5～8μm。
如图2所示为微流控芯片加工示意图，本实施例的微流控芯片的制备方法包括如下步骤：
(1)掩膜的制作
首先使用绘图软件AutoCAD绘制微通道的图案，将图案转移至镀铬玻璃板上，而后在紫外光照射下，将掩模上的图案转移至光刻胶上。
(2)硅片表面处理
为确保光刻胶能均匀且牢固地结合在硅片上，在涂SU8光刻胶前必须保证硅片表面的洁净以及干燥。将所用到的新硅片(100mm)放置在150℃的热平板上加热20min，并冷却至室温。
(3)匀胶
在干净的硅片中心倒入适量SU-8 3025光刻胶，手动倾斜并旋转硅片，将硅片放在平整表面静止一段时间，方便光刻胶在硅片表面平整地铺开，再将硅片放置在匀胶机上。对于高度为20μm的通道，设置参数为：低速800rpm/min，运行时间40s；高速3800rpm/min，运行时间60s。
(4)前烘
将匀胶后的硅片先放置在65℃的热平板上加热10min，后放置在95℃的热平板上加热25min，并冷却至室温。将升温速度统一设置为240℃/h。此步骤目的是为了增强光刻胶与硅片的结合能力。
(5)曝光
为了让掩模上的图案转移至光刻胶，将硅片与印有通道的掩模分别固定在光刻机上，对于高度为20μm的通道，本实验室采用曝光时间为5s。
(6)后烘
将曝光后的硅片先放置在65℃的热平板上加热2min，后放置在95℃的热平板上加热8min，并冷却至室温。升温速度与前烘一致。
(7)显影
本实验分别采用PGMEA和异丙醇作为显影液和定影液，将冷却至室温的硅片浸没于盛有PGMEA的培养皿中，不断摇晃培养皿，观察目标区域的光刻胶变化，当出现明显的纹路变化时，取出硅片并用异丙醇淋洗，用显微镜观察图案。
(8)坚膜
将显影后的硅片放置在135℃的热平板上加热2h，并冷却至室温。
(9)PDMS固化以及键合
为了使PDMS更容易从硅片剥离而不损伤阳模，用锡纸包裹硅片后并用三甲基氯硅烷进行表面处理；同时，将PDMS和固化剂按照质量比为10:1于一次性塑料杯中混合，放置于真空干燥箱中抽气，待气泡完全消失后，将其浇筑于含有阳模的硅片上，然后置于65℃烘箱中加热2h。然后，将含有目标区域的PDMS用手术刀切割并剥离，选择合适的打孔器(内径为1mm)打孔待用。
将切好的PDMS和干净的载玻片放入离子体清洗器中进行表面处理(电压900V，氧气量700，处理时间2min)，然后将处理好的两者键合在一起并放入65℃烘箱中加热处理2h后方可使用。
按照上述方法制备好的微流控芯片的局部微流控通道的实物放大图(标尺为50μm)如图1B所示，其中箭头细胞悬液流动的方向，图1C为实施例1的微流控芯片通过微结构对细胞形成挤压和摩擦将GFP蛋白转运至HeLa细胞的过程示意图，其中标记为挤压后呈现长条状的HeLa细胞。
采用实施例1的微流控芯片进行生物分子递送至细胞的研究：
(1)微结构的细胞挤压通道的宽度对细胞内蛋白递送效率的影响
本申请人设计了两种宽度的细胞挤压通道进行研究，分别为：8μm(Structure#1)和5μm(Structure#2)，将含有GFP蛋白的HeLa细胞样品以0.05mL/min的流速进样，分析其递送效果，Control代表：细胞不经过芯片处理。如图3A所示，5μm宽度的芯片递送效果要比8μm的芯片递送效果相对来说更好一点，结合图3B的细胞活力分析和图3C的递送效率分析，也说明了5μm宽度的芯片对细胞的作用更好一点。如图3B和3C所示，和对照组相比，这两种不同尺寸的微结构处理后的细胞活力都达到了80％以上，说明：基于芯片微结构的细胞内递送方式对细胞的安全和活力影响不大，而且5μm尺寸的芯片GFP递送效果相对较好，效率达到了20％以上，而经8μm的芯片微结构处理的数据与对照组差异较小，推测可能是8μm尺寸的芯片微结构对于HeLa细胞来说，细胞受到的流体压力并没有发生改变进而没有对HeLa细胞产生较大的影响，也就导致递送蛋白质效率过低。基于以上分析数据，本研究将以5μm尺寸的芯片微结构为实验对象，优化实验效果。
(2)微流控芯片使用流速选择和分析
本实施例的微流控结构的递送机制是：当细胞在快速挤过尖锐的微结构时会受到较大的机械力而导致细胞膜结构发生变形，进而使蛋白高效扩散至细胞中。不同的流速就能使细胞在经过这种尖尖的微结构时所受到的流体压力不同。
本申请人分别以0.01mL/min，0.05mL/min，0.1mL/min和0.15mL/min的速度将GFP蛋白递送至HeLa细胞，观察并分析其递送效果。
结果如图4所示，可以看出：0.05mL/min的流速更有利于进行细胞内蛋白递送，进而对图4A的细胞进行活力和效率分析，0.05mL/min至0.1mL/min这个区间范围内的流速在能保证细胞大部分存活的基础上，能够对细胞产生刺激，递送蛋白；而0.15mL/min的速度的细胞递送效率并不理想，且在实验过程中，不到2min的时间，芯片出现漏液现象，而且芯片上的微结构大部分发生变形，出现黏状物质，猜测可能是因为细胞在快速挤过尖锐的微结构时会受到较大的机械力而导致细胞膜发生破裂，堵塞尖尖的微结构，降低细胞的碰撞概率，进而表现出低递送效率和低存活率。
(3)微流控芯片对不同细胞的作用影响
将GFP以0.05mL/min的流速递送至MDA-MB-231，K562，HeLa三种不同的细胞内，分析其递送效果。
结果如图5所示，与对照组相比，可明显增加GFP蛋白导入至细胞的效率，初步验证了该芯片的效果，尤其MDA-MB-231和HeLa细胞的递送效率与对照组相比，该芯片的作用效果明显，而K562的递送效率不高可能与细胞的状态和细胞的性质有关。
综上所述，本实施例的微流控芯片借助微结构上尖锐的凸块对细胞形成机械撞击与挤压，让细胞膜受到机械力的剧烈作用，诱导细胞进行磷脂双分子重排，在短时形成纳米级孔洞，从而允许蛋白高效扩散进入细胞。通过利用GFP蛋白递送到HeLa细胞的实验验证了该微流控芯片对蛋白的递送效果；且表明经过处理后的细胞存活率可达80％以上。而且细胞挤压通道为5μm宽的芯片GFP递送效果相对更好；细胞悬液的流速为0.05mL/min到0.1mL/min这个范围内可以同时保证细胞递送效果和细胞活力。本发明还测试了该芯片对K562细胞、HeLa和MDA-MB-231细胞的适用性，证明了本发明的微流控芯片可处理不同细胞，适用范围广。
实施例2
本实施例提供了一种微流控芯片，其包括盖片和基片，盖片设置在基片上，盖片上设置有微流控通道，所提供的微流控通道如图6A所示：微流控通道包括入口11、细胞挤压区12、出口13、第一过渡区域14和第二过渡区域15，入口11和出口13对称设在在细胞挤压区12的两侧，入口11通过第一过渡区域14与细胞挤压区12相连通，出口13通过第二过渡区域15与细胞挤压区12相连通；细胞挤压区12包括至少一个阵列式细胞挤压单元16，所述阵列式细胞挤压单元16包含A列共A×B个独立的微结构17，相邻两列所述微结构17沿列方向呈错位排布，每列相邻两个所述微结构17间隔设置，所述微结构17包括两个镜像设置的微档板18，所述微档板18包括阻隔块181和两个个尖锐的凸块182，所述尖锐的凸块182设置在所述阻隔块181的端部，两个所述尖锐的凸块182并排设置形成齿形，两个呈镜像设置的尖锐的凸块182之间形成细胞挤压通道19，每列相邻两个微结构17之间的间隔间距为4.5～6.7μm，微结构17的两个阻隔块181之间的间距为不小于25μm，细胞挤压通道19的宽度为3.5～5.5μm。
本实施例的微流控芯片制备方法同实施例1。
按照上述方法制备好的微流控芯片的局部微流控通道的实物放大图(标尺为50μm)如图6A所示，其中箭头细胞悬液流动的方向；图6C为实施例2的微流控芯片通过微结构对细胞形成挤压和摩擦将GFP蛋白转运至MDA-MB-231细胞的过程示意图，其中标记为挤压后呈现长条状的MDA-MB-231细胞；图6D为实施例2的微流控芯片的生化分子递送图，当含细胞的蛋白悬浮液经过微流控芯片的微结构时，所受到的流体压力不同和齿形结构对细胞的挤压与直接刺激，让细胞膜在短时形成纳米级孔洞，从而将蛋白高效递送至细胞。
采用实施例2的微流控芯片进行生物分子递送至细胞的研究：
(1)微结构的细胞挤压通道的宽度对细胞内蛋白递送效率的影响
本实施例的微流控芯片结构如图6A所示，当含细胞的蛋白悬浮液经过齿形芯片的微结构时，所受到的流体压力不同和齿形的微结构对细胞的挤压与直接刺激，让细胞膜在短时形成纳米级孔洞，从而将蛋白高效递送至细胞。
影响蛋白递送效果最关键的因素是齿形的微结构的宽度，为了得到递送效果好的细胞样品，本申请人设计了不同宽度的齿形的微结构对其进行研究，微结构之间的宽度为6.7μm，细胞挤压通道之间的宽度为5.5μm，将其称为5.5-6.7，不同宽度的芯片分别为：5.5-6.7，4.8-5.8，4-5，3.5-4.5。将含有GFP蛋白的MDA-MB-231细胞样品以0.05mL/min的流速进样，分析其递送效果。如图7A所示，4-5类型的芯片递送效果相对来说更好一点，结合图7B的细胞活力分析和图7C的递送效率分析，也说明了这一点，细胞效率达到了40％以上，而3.5-4.5类型的芯片微结构处理的数据与对照组差异较小，推测可能是3.5-4.5尺寸的芯片微结构对于MDA-MB-231细胞来说，细胞受到的流体压力使细胞在通过更窄的结构时产生损伤，也就导致递送蛋白效率过低。
Jurkat细胞，一种悬浮细胞，是细胞电转常用的细胞之一；将含有GFP蛋白的Jurkat细胞样品以0.05mL/min的流速进样，分析其递送效果。如图8A所示，4-5类型的芯片递送效果相对来说更好一点，结合图8B的细胞活力分析和图8C的递送效率分析，也说明了这一点，细胞效率达到了20％左右，同一种芯片在进行不同细胞的实验后，得到的效果有较大差异，推测可能与细胞的状态有关，细胞状态不好时，细胞受到的流体压力使细胞在通过更窄的结构时产生损伤，也就导致在递送蛋白效率出现差异。
(2)微流控芯片使用流速选择和分析
本实施例的微流控结构的递送机制是：当细胞在快速挤过尖锐的齿形的微结构时会受到较大的机械力而导致细胞膜结构发生变形，进而使蛋白高效扩散至细胞中。不同的流速就能使细胞在经过这种尖尖的微结构时所受到的流体压力不同。
本申请人分别以0.01mL/min，0.03mL/min，0.07mL/min和0.09mL/min的速度将GFP蛋白递送至MDA-MB-231细胞中，观察并分析其递送效果。
结果如图9A中，可以看出：0.05mL/min的流速更有利于进行细胞内蛋白递送，进而对图9A的细胞进行活力和效率分析，如图9B和9C所示，0.05mL/min至0.07mL/min这个区间范围内的流速在能保证细胞大部分存活的基础上，能够对细胞产生刺激，进而达到递送蛋白的目的；而0.09mL/min的速度的细胞递送效率并不理想，猜测可能是因为细胞在快速挤过狭窄的微结构时会受到较大的机械力而导致细胞膜发生破裂，堵塞尖尖的微结构，降低细胞的碰撞概率，进而表现出低递送效率和低存活率。
(3)微流控芯片堵塞的研究
为了使本实施例的微流控芯片对细胞的作用最大化，本申请人将实施例1的微流空芯片处理细胞，残留在该芯片上的黏状物质堵塞细胞进样，猜测这种黏状物质是细胞的DNA，本申请人收集了处理过MDA-MB-231细胞的实施例1微流控芯片，加入DNase I溶液进行孵育，实时观察芯片，如图10所示，在15min左右，芯片上的黏状物质已大部分消失，证实了细胞在进样时，受到了很强的压力进而导致细胞损伤；在芯片作用于细胞的实验中，进样1min左右，芯片的进样入口处和齿形的微结构的前端处就开始出现DNA堆积，不到5min，芯片的齿形微结构处就被DNA完全堵塞，严重影响细胞样品进样。为了降低细胞在进样之初所受到的压力，本申请人采取了两种方式，一种方式将芯片的进样入口更靠近芯片的微结构处，减少因为细胞从进样口到微结构之间所受到的剪切力影响，如图11C所示，入口设计多个细小的微流道有效分散细胞悬液，使得细胞悬液较均匀的流入到细胞挤压区；另一种方式降低细胞密度，大大提高微结构对每个细胞的作用概率。
将含有GFP蛋白的MDA-MB-231细胞样品以0.05mL/min的流速进样，分析其递送效果。如图11A所示，更靠近芯片的微结构处的进样方式递送效果相对来说更好一点，结合图11B的递送效率分析，也说明了这一点。按照之前的打孔方式，细胞从进样入口到齿形微结构处有一定的距离，含有细胞的液体从狭窄的前端流向芯片作用处的过程中，也会受到剪切力的影响，细胞容易损伤，进而导致芯片堵塞，无法进样。
将MDA-MB-231细胞密度降低为-10^4个/mL，细胞样品以0.05mL/min的流速进样，分析其递送效果。如图12A和12B所示，细胞密度的降低并没有达到预期的结果，更说明了造成芯片堵塞的最大因素就是来自于芯片前端的剪切力，而非细胞密度。
(4)用微流控芯片递送葡聚糖的研究
将葡聚糖以0.05mL/min的流速递送至MDA-MB-231细胞内，分析其递送效果。
结果如图13所示，A为微流控芯片递送不同大分子物质蛋白质GFP和葡萄糖分子的效果图；B为与A相对应的细胞效率分析图。与对照组Control相比，本实施例的微流控芯片可明显增加葡聚糖导入至细胞的效率，进一步验证了本发明的微流控芯片的递生物分子送效果。
综上所述，当细胞快速挤过本实施例微流控芯片的齿形微结构的狭窄区域时，齿形结构的正面可以直接挤压细胞，而背面可以形成对细胞的有效摩擦，通过两种作用的联合，使得细胞在流经多组齿形结构之间的微小空隙也之后，发生细胞膜变形，诱导细胞进行膜表面磷脂双分子层重排，从而使蛋白高效进入细胞。本发明利用GFP蛋白递送到MDA-MB-231细胞和Jurkat细胞的实验初步验证了该微流控芯片对蛋白的递送效果，且表明细胞经过处理后的存活率较高(>70％)，证明该微流控芯片可以用于蛋白递送的研究。而且4-5尺寸的芯片可获得更好的GFP递送效果；细胞悬液的流速为0.05mL/min到0.07mL/min这个范围内对细胞递送效果和细胞活力较为有利。本发明还测试了该微结构芯片对不同大分子物质递送至细胞的效果，证明了本发明的微流控芯片可递送不同种类的生物分子。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种微流控通道，其特征在于：所述微流控通道（1）包括入口（11）、细胞挤压区（12）、出口（13）、第一过渡区域（14）和第二过渡区域（15），
所述入口（11）和所述出口（13）对称设在所述细胞挤压区（12）的两侧，
所述入口（11）通过第一过渡区域（14）与所述细胞挤压区（12）相连通，所述出口（13）通过第二过渡区域（15）与所述细胞挤压区（12）相连通；
所述细胞挤压区（12）包括至少一个阵列式细胞挤压单元（16），相邻两个所述阵列式细胞挤压单元（16）间隔设置，所述阵列式细胞挤压单元（16）包含A列共A×B个独立的微结构（17），相邻两列所述微结构（17）沿列方向呈错位排布，每列相邻两个所述微结构（17）间隔设置，所述微结构（17）包括两个镜像设置的微档板（18），所述微档板（18）包括阻隔块（181）和至少一个尖锐的凸块（182），至少一个所述尖锐的凸块（182）设在所述阻隔块（181）的端部，两个呈镜像设置的尖锐的凸块（182）之间形成细胞挤压通道（19），细胞流经细胞挤压通道（19）时，细胞膜在挤压作用下受到一定程度的破坏，产生通孔，使得外源物质通过通孔进入到细胞内；所述微结构（17）的纵向布局上，所述细胞挤压通道（19）是呈周期性设计的，即细胞受到多次挤压后有一个相对宽阔的缓释区域让细胞进行短暂恢复，所述微结构（17）上的两个所述阻隔块（181）之间的间距大于所述细胞挤压通道（19）的直径，每列相邻两个所述微结构（17）之间的间距大于所述细胞挤压通道（19）的直径；
所述细胞挤压通道（19）的宽度为3~8 µm；
所述微档板（18）包括一个所述尖锐的凸块（182），所述尖锐的凸块（182）与所述阻隔块（181）的夹角为钝角；
或者所述微档板（18）包括两个所述尖锐的凸块（182），两个所述尖锐的凸块（182）并排设置形成齿形。
2.如权利要求1所述的一种微流控通道，其特征在于，所述细胞挤压区（12）包括一个阵列式细胞挤压单元（16），所述阵列式细胞挤压单元（16）包括10~10,000个所述微结构（17），每列相邻两个所述微结构（17）之间的间隔间距为25~40 µm，每个所述微结构（17）的两个所述阻隔块（181）之间的间距为不小于100 µm，所述细胞挤压通道（19）的宽度为5~8 µm。
3.如权利要求1所述的一种微流控通道，其特征在于，所述细胞挤压区（12）包括至少两个阵列式细胞挤压单元（16），所述阵列式细胞挤压单元（16）包括10~10,000个所述微结构（17），每列相邻两个所述微结构（17）之间的间隔间距为4.5~6.7 µm，所述微结构（17）的两个所述阻隔块（181）之间的间距为不小于25 µm，所述细胞挤压通道（19）的宽度为3.5~5.5µm。
4.一种微流控芯片，其特征在于，包括盖片和基片，所述盖片设置在基片上，所述盖片上设置有微流控通道，所述微流控通道为权利要求1-3中任一项所述的微流控通道。
5.如权利要求4所述的一种微流控芯片，其特征在于，所述微流控通道的高度为20~25µm。
6.一种生化分子递送方法，其特征在于，利用如权利要求4-5中任一项所述的微流控芯片对所述细胞进行处理，将细胞外的生化分子递送至细胞内。
7.如权利要求6所述的一种生化分子递送方法，其特征在于，所述处理的过程为：将细胞制备细胞悬液，装入无菌注射器中；使用微量注射泵将细胞悬液按预设流速0.05mL/min~0.1mL/min通过所述微流控芯片的入口注入到所述微流控通道内。
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