CN113832132B - 一种烙铁头svmp蛋白特异性短肽、抗烙铁头svmp蛋白抗体和蛇伤检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种烙铁头SVMP蛋白特异性短肽、抗烙铁头SVMP蛋白抗体和蛇伤检测试剂盒，属于抗体及免疫检测技术领域。一种烙铁头SVMP蛋白特异性短肽，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。采用所述短肽筛选得到的抗烙铁头SVMP蛋白单克隆抗体SVMP‑mc18与烙铁头天然SVMP蛋白具有较高的特异性亲和能力。由SVMP蛋白单克隆抗体制成的蛇伤诊断试剂盒，能够用于诊断蛇伤是否被烙铁头咬伤，并且以抗体抗原免疫反应为检测诊断基础，大大提高了蛇伤诊断效率和结果准确性。

Description

一种烙铁头SVMP蛋白特异性短肽、抗烙铁头SVMP蛋白抗体和 蛇伤检测试剂盒
技术领域
本发明属于抗体及免疫检测技术领域，具体涉及一种烙铁头SVMP蛋白特异性短肽、抗烙铁头SVMP蛋白抗体和蛇伤检测试剂盒。
背景技术
烙铁头蛇，学名原矛头蝮(学名:Trimeresurus mucrosquamatus)，是亚洲攻击性最强的蛇类之一，也是中国十大毒蛇之一，具有体型小、毒性强的特点。
目前辨认毒蛇咬伤的方法在现有临床上主要依靠家属或病人对毒蛇图册的指认、临床表现和蛇牙痕等主要方法鉴别，该类方法诊断误差非常大。有大量病例因未能鉴别出咬伤蛇种，延误了宝贵的治疗窗口时间，而死亡。以抗体抗原免疫反应为检测诊断基础，能够大大提高蛇伤诊断效率。目前我国抗蛇毒血清种类较少，抗血清品种无法覆盖所有剧毒蛇种。而蛇毒所含毒性成分十分复杂，主要包括酶、神经毒性多肽、生物活性因子和膜活性多肽。针对烙铁头蛇的蛇毒还没有检测生物标志物的报道，这严重阻滞了烙铁头蛇伤快速检测。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种烙铁头SVMP蛋白特异性短肽，能够用于特异性筛选SVMP蛋白单克隆抗体。
本发明的目的还在于提供一种抗烙铁头SVMP蛋白抗体和蛇伤检测试剂盒，实现烙铁头蛇伤快速诊断。
本发明提供了一种烙铁头SVMP蛋白特异性短肽，所述短肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
本发明提供了一种由所述短肽筛选得到的抗烙铁头SVMP蛋白单克隆抗体SVMP-mc18，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3 所示。
本发明提供了一种烙铁头蛇伤ELISA检测试剂盒，包括包被抗烙铁头 SVMP蛋白的多克隆抗体的固相载体、酶标记的所述抗烙铁头SVMP蛋白单克隆抗体SVMP-mc18。
优选的，所述抗烙铁头SVMP蛋白多克隆抗体是用从烙铁头蛇毒中分离纯化的SVMP蛋白免疫动物制备得到。
优选的，所述烙铁头SVMP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
优选的，所述固相载体中抗烙铁头SVMP蛋白的多克隆抗体的包被浓度为1～100μg/ml。
优选的，所述检测试剂盒还包括洗涤液、样品稀释液、底物、显色液和阳性标准品。
优选的，所述阳性标准品包括分离纯化的SVMP蛋白或所述烙铁头 SVMP蛋白特异性短肽。
本发明提供的烙铁头SVMP蛋白特异性短肽，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。SVMP蛋白在多种蛇毒中均存在，经过比对发现不同来源的蛇毒 SVMP蛋白存在保守区和高变区，本发明提供的SVMP蛋白短肽为烙铁头蛇毒中特异性存在的，采用所述短肽筛选烙铁头SVMP蛋白单克隆抗体能够实现烙铁头蛇伤的特异性检测。
本发明提供的由所述短肽筛选得到的抗烙铁头SVMP蛋白单克隆抗体 SVMP-mc18，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2 所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。所述单克隆抗体 SVMP-mc18具有较强的特异性，将制备的杂交瘤细胞株分泌的抗血清与五种蛇毒(竹叶青、蝰蛇、蝮蛇、眼镜蛇和烙铁头)进行免疫结合反应，仅烙铁头蛇毒能够与抗血清发生强特异性结合。随后将不同杂交瘤细胞株分泌的抗血清与烙铁头SVMP蛋白特异性短肽进行免疫结合反应，SVMP-mc4、 SVMP-mc9和SVMP-mc18能与SVMP短肽抗原结合，且SVMP-mc18与 SVMP短肽抗原亲和性较强，因此SVMP-mc18特异性结合烙铁头SVMP蛋白的特性保证了检测试剂盒的结果准确性。
附图说明
图1为烙铁头SVMP(snake venom metalloproteinase TM-3，access:1kuf) NCBIblast结果，方框标出为特异性序列(SEQ ID NO:1)；
图2为烙铁头SVMP蛋白同源建模结果，黑色标出区为SVMP蛋白高变区(SVMP-pep-1、SVMP-pep-2和SVMP-pep-3)；
图3为烙铁头SVMP蛋白中压液相(阳离子柱)分离纯化(图A)及纯化后各峰WB结果(图B)，11号峰为SVMP蛋白所在峰；
图4为烙铁头粗毒和纯化后烙铁头SVMP蛋白变性SDS-PAGE电泳结果；
图5为用五种天然蛇毒和天然SVMP蛋白筛选SVMP单克隆抗体结果图；
图6为用SVMP-peptide-1对SVMP多克隆抗体进行第二轮筛选结果图；
图7为抗天然SVMP蛋白抗原的单克隆抗体和多克隆抗体的特异性和空间可及性检测结果；其中A分别为抗SVMP单克隆抗体SVMP-mc18的 ELISA和WB检测结果；B则分别为抗SVMP多克隆抗体的ELISA和WB 检测结果；
图8为抗SVMP单克隆抗体与多克隆抗体配对成功后检测五种蛇毒结果 (ELISA法)；
图9为烙铁头蛇毒浓度检测标准曲线，结果显示6.25ng/ml～100ng/ml范围内具有良好线性。
具体实施方式
本发明提供了一种烙铁头SVMP蛋白特异性短肽，氨基酸序列如SEQ ID NO:1(TKYSSNFKKI)所示。
在本发明中，将多种毒蛇的SVMP蛋白序列进行比对，获得一段与其他毒蛇形成的高度变异、而烙铁头蛇种内保守的氨基酸序列，采用该氨基酸序列能够特异性区别烙铁头SVMP蛋白和其他蛇毒SVMP蛋白，为后续筛选抗烙铁头SVMP蛋白抗体提供了工具。
本发明提供了一种由所述短肽筛选得到的抗烙铁头SVMP蛋白单克隆抗体SVMP-mc18，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2 (EIQLQQSGPELMKPGASVKVSCKASGYSFTDYNMYWVKQSHGKSLE WIGYIDPYNGGTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAFMHLNSLTSEDSAVYYCARSPLITTLGKRYFDVWGAGTTVTVSSEIQLQQSGPELMKPGASVKVSCK ASGYSFTDYNMYWVKQSHGKSLEWIGYIDPYNGGTSYNQKFKGKATLT VDKSSSTAFMHLNSLTSEDSAVYYCARSPLITTLGKRYFDVWGAGTTVTVSS)所示，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3 (DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRTSENIYIYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGNYYCQHHYGTPLTFG AGTKLELKDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRTSENIYIYLAWYQQKQGKS PQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGNYYCQHHYGTPLTFGAGTKLELK)所示。
在本发明中，所述抗烙铁头SVMP蛋白单克隆抗体SVMP-mc18是由杂交瘤细胞株分泌得到。以五种天然蛇毒抗原和天然烙铁头SVMP抗原分别包被于固相载体上，将筛选的多种杂交瘤细胞株分泌的抗血清进行间接ELISA 检测，结果表明仅有烙铁头蛇毒和天然烙铁头SVMP抗原能够发生较强的特异性结合。再以烙铁头SVMP蛋白特异性短肽作为包被抗原进行间接ELISA 筛选，SVMP-mc4、SVMP-mc9和SVMP-mc18能与所述SVMP短肽抗原结合，其中SVMP-mc18具有较强的亲和特性。
本发明提供了一种烙铁头蛇伤ELISA检测试剂盒，包括包被抗烙铁头 SVMP蛋白的多克隆抗体的固相载体、酶标记的所述抗烙铁头SVMP蛋白单克隆抗体SVMP-mc18。
在本发明中，所述抗烙铁头SVMP蛋白多克隆抗体优选是用从烙铁头蛇毒中分离纯化的SVMP蛋白免疫动物制备得到。所述烙铁头SVMP蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO：4(EQQRFPQRYIKLAIVVDHGMYTKYSSNFKKIRKRVHQMVSNINEMCRPLNIAITLALLDVWSEKDFITVQADAPTTAGLFGDWRERVLLKKKNHDHAQLLTDTNFARNTIGWAYVGRMCDEKYSVAVVKDHSSKVFMVAVTMTHELGHNLGMEHDDKDKCKCDTCIMSAVIS DKQSKLFSDCSKDYYQTFLTNDNPQCILNAP)所示。免疫动物的次数优选包括2次，间隔时间为2周。所述免疫时，优选将分离纯化的SVMP蛋白与佐剂等体积混合后注射动物。免疫后，收集抗血清采用间接ELISA法检测抗体效价。
在本发明中，所述固相载体中抗烙铁头SVMP蛋白的多克隆抗体的包被浓度优选为1～100μg/ml，更优选为5～50μg/ml，最优选为10μg/ml。所述包被用溶剂优选为20mM磷酸盐缓冲液。本发明对所述包被的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的包被方法即可。包被后，优选进行封闭。所述封闭用溶液为1％～10％浓度的BSA溶液。所述固相载体优选包括酶标板、磁性颗粒或塑料管等。
在本发明中，酶标记的所述抗烙铁头SVMP蛋白单克隆抗体 SVMP-mc18中酶优选为辣根过氧化物酶(HRP)。本发明对酶标记的所述抗烙铁头SVMP蛋白单克隆抗体SVMP-mc18的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的酶标记抗体的方法即可。
在本发明中，所述检测试剂盒优选还包括洗涤液、样品稀释液、底物、显色液和阳性标准品。所述阳性标准品优选包括分离纯化的SVMP蛋白或所述烙铁头SVMP蛋白特异性短肽。本发明对所述洗涤液、样品稀释液、底物以及显色液的种类没有特殊限制，采用本领域熟知的ELISA试剂即可。
本发明对所述试剂盒的使用方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的双抗体夹心ELISA检测方法即可。
本发明提供的检测试剂盒，基于双抗体夹心原理检测烙铁头蛇毒，利用本发明提供的抗SVMP蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体高亲和力和强特异性与烙铁头SVMP蛋白结合的能力，实现烙铁头咬伤的快速诊断，大大提高的蛇伤检测效率和检测结果的准确性。
下面结合实施例对本发明提供的一种烙铁头SVMP蛋白特异性短肽、抗烙铁头SVMP蛋白抗体和蛇伤检测试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
术语“抗烙铁头SVMP蛋白和烙铁头SVMP蛋白抗体”、“烙铁头 SVMP蛋白和烙铁头SVMP蛋白抗体”、“抗体”可互换使用，都是指能够与烙铁头SVMP蛋白特异性结合的抗体。
术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。
术语“分离”，是指物质从其原始环境中分离出来，如果是天然的物质，原始环境即是天然环境。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白质是没有分离纯化的，将多聚核苷酸或蛋白质从天然状态中与存在的其他物质中分开，则为分离纯化。
术语“杂交瘤细胞”，是指在制备单克隆抗体过程中，用骨髓瘤细胞和 B淋巴细胞融合而成的细胞。
术语“ELISA”，是指可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。
本发明提供抗烙铁头SVMP蛋白和烙铁头SVMP蛋白抗体，所述抗体能够分别与烙铁头SVMP蛋白和烙铁头SVMP蛋白特异性结合，且所述抗体分别由所述天然纯化的烙铁头SVMP蛋白和烙铁头SVMP蛋白制备而来。
实施例1
从NCBI网站上下载不同蛇种来源的SVMP序列，通过NCBI blast分析和同源建模分析获得烙铁头SVMP蛋白特异性多肽序列(图1和图2)。发现其序列可分为保守区(白色、浅灰色背景)和高变区(灰色、深灰色背景标出)。SVMP蛋白高变区用方框标出，特异性序列(SEQID NO:1， TKYSSNFKKI)，记为SVMP-peptide-1。SVMP-peptide-1抗原多肽由吉尔生化(上海)有限公司通过固相合成法合成。各个短肽抗原合成多肽抗原10mg 且纯度大于95％。
实施例2
抗SVMP特性多肽(SVMP-peptide-1)多克隆抗体制备方法，包括以下步骤：
(1)KLH-多肽复合抗原制备
采用生化合成法合成多肽，并在C端添加一个半胱氨酸(C)残基，并与血蓝蛋白(KLH)结合，制备KLH-多肽复合物抗原。具体方法按试剂盒 (K2039-5，BioVision，USA)说明书进行。
(2)免疫动物
将天然烙铁头KLH-多肽复合抗原溶解于生理盐水中，并通过0.22μm无菌过滤器过滤。用等量的弗氏完全佐剂(F-5881，sigma)乳化0.5ml抗原 (1mg抗原)，并沿雄性新西兰大白兔背部多个部位皮下注射，每个抗原注射两只兔子。间隔2周后，增强免疫则用弗氏不完全佐剂(F-5506，sigma) 与等体积抗原乳化后(0.5ml，含0.5mg抗原)，沿雄性新西兰大白兔背部多个部位皮内注射。时间间隔为2周共进行两次增强免疫。第二次增强免疫 14天后收集兔血清。以各抗原为包被抗原，免疫前血清为阴性对照，采用间接ELISA法检测抗体效价。具体步骤：
1)包被：KLH-多肽复合抗原(5μg/ml)用包被液稀释后按照每孔100μl的量加入96孔板且空白孔加100μl包被液，4℃包被过夜。
2)洗涤：第二天倒掉板孔内包被液，用洗涤液洗涤三次，每孔250μl，每次3-5分钟，尽量拍干。
3)封闭：封闭液每孔250μl，37℃1h。之后洗涤三次，拍干。
4)阳性孔加入100μl梯度稀释后兔免疫血清，阴性孔和空白孔则加入 100μl封闭液，37℃1h。之后洗涤三次，拍干。
5)阳性孔、阴性孔和空白孔加入100μl辣根过氧化物酶(HRP)标记抗兔二抗，37℃避光温箱孵育1h。之后洗涤三次，拍干。
6)显色：洗涤后每孔100μl加入显色液，37℃避光孵育15-30分钟。
7)终止：终止液每孔100μl，用酶标仪进行450/630nm双波长读值。
其中，上述所用到的溶液配方如下：
1、包被液：pH 9.6的0.05M碳酸盐缓冲液；碳酸钠1.59g+碳酸氢钠 2.93g，溶解至1L去离子水里。
2、洗涤液：细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)+0.1％的Tween-20。注：细胞用 PBS：氯化钾，0.2g；磷酸二氢钾，0.2g；氯化钠，8g；12水磷酸二氢钠， 2.16g，去离子水1L。
3、封闭液(抗体稀释液)：洗涤液每100ml+牛血清白蛋白(BSA)1g。
4、显色液：3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)单组份显色液(Solarbio，北京)。
5、终止液：2mol/L的硫酸，178.3ml水+21.7ml浓硫酸，慢慢搅拌混匀。
实施例3
烙铁头SVMP蛋白的分离纯化方法，包括以下步骤：
在FPLC(fast protein liquid chromatography，AKTA pure)仪器上安装Resource S柱，按说明书洗涤柱床后，称取烙铁头粗毒50mg溶于2mlA液，由加样阀上至平衡好的Resource S柱。经过紫外检测器280nm和215nm检测后，收集各个峰，对每个洗脱峰进行分别收集并冻干保存于-20℃备用。具体步骤如下：用A液平衡(流速2ml/min)，上样，用A液洗掉未结合蛋白，用B液进行线性洗脱，收集各峰。其中，上述所用到的溶液配方如下：
A液(KCl：0.2g，KH2PO4：0.2g，Na2HPO4·12H2O:3.47g，pH 7.2)； B液(KCl：0.2g，KH2PO4：0.2g，Na2HPO4·12H2O：3.47g，NaCl：58g， pH 7.2)用0.45μm的滤器(Millipore)将其过滤，并进行超声脱气。
用抗SVMP-peptide-1多肽抗原抗体进行WB检测进而确认目的蛋白所在峰(见图3)。最后对纯化后烙铁头SVMP蛋白进行变性SDS-PAGE电泳检测蛋白纯化，结果见图4。结果表明从蛇毒中分别分离纯化得到天然烙铁头SVMP蛋白(SEQ ID NO:4)。
实施例4
烙铁头SVMP蛋白单克隆抗体的制备方法
1)用天然烙铁头SVMP蛋白抗原免疫小鼠，获得免疫后的小鼠的脾细胞。
利用实施例2制备的天然烙铁头SVMP蛋白分别对5只Balb/c小鼠进行免疫。其中，Balb/c小鼠是白变种实验室老鼠，每只平均完成至少4次免疫与3次采血检测，在经第一、二、三次采血检测后筛选出效价较高(以上述天然抗原进行筛选)的目标小鼠，在本实施例中，从5只小鼠中筛选出2 只小鼠，获得这2只小鼠的脾细胞。
2)融合脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞，筛选出能够与天然烙铁头SVMP蛋白抗原结合的杂交瘤细胞株。
将来自于Balb/c小鼠的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞与筛选出的2只小鼠的脾细胞进行细胞融合，融合后经培养、观察、检测及阴阳性对照试验，获得能够产生抗烙铁头SVMP蛋白抗体的杂交瘤细胞株，并对其继续培养与选择。
3)将杂交瘤细胞接种至小鼠腹腔内诱生培养，培养后得到细胞培养液，从所述细胞培养液中纯化得到能够与烙铁头SVMP蛋白发生免疫反应的烙铁头SVMP蛋白单抗。
在接种杂交瘤细胞前，先给小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，一周后在小鼠腹腔注射采用上述方法制备的杂交瘤细胞悬液2×106/mL，每只小鼠注射0.5mL杂交瘤细胞悬液。
在接种杂交瘤细胞后约7～10天后，无菌条件下采集腹部明显膨胀的小鼠的腹水，12000g离心处理10min，除去脂质、细胞等杂质，取离心处理得到的上清并56℃灭活30min，得到SVMP蛋白单克隆抗体。
4)以间接ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，酶联免疫吸附测定)方法检测抗烙铁头SVMP蛋白抗体效价(包被抗原为天然抗原)。具体的，用五种天然蛇毒、天然SVMP蛋白作为包被抗原筛选单克隆抗体，其中五种天然蛇毒抗原见图5中A所示，每孔100μl，浓度为10μg/ml蛇毒抗原包被于96孔板上，BSA封闭并洗涤，加上述制备的杂交瘤细胞株分泌的抗体稀释好单克隆抗体孵育，洗涤后加入抗鼠HRP标记二抗孵育，洗涤后进行显示和OD450读数。具体结果如图5所示。仅烙铁头能够与单克隆抗体发生特异性亲和反应，并且不同种类的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体均能与天然SVMP蛋白发生亲和反应。
用SVMP-peptide-1对多克隆抗体进行第二轮筛选。以SVMP-peptide-1 多肽作为包被抗原，筛选抗体效价高的单克隆细胞株及抗体。SVMP-peptide 抗原(每孔100μl，浓度为10μg/ml)包被于96孔板上，BSA封闭并洗涤，加稀释好单克隆抗体孵育，洗涤后加入抗鼠HRP标记二抗孵育，洗涤后进行显示和OD450读数。结果显示，SVMP-mc4、SVMP-mc9和SVMP-mc18能与SVMP-peptide多肽抗原结合(图6)。单克隆抗体SVMP-mc18委托由苏州金唯智生物科技有限公司测定轻链可变区和重链可变区，具体序列见SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，可变区分析结果见表1。
表1单克隆抗体SVMP-mc18可变区各区域
Figure SMS_1
Figure SMS_2
可见，本实施例采用腹腔接种动物体内诱生法制备单克隆抗体，在杂交瘤细胞克隆化成功后，将杂交瘤接种于小鼠腹腔中可以诱导产生大量腹水，同时分泌大量抗体于腹水中，其浓度较高，方便筛选出效价较高抗烙铁头 SVMP蛋白抗体。
实施例5
抗天然烙铁头SVMP蛋白多克隆抗体的制备方法，具体步骤：
将天然烙铁头SVMP蛋白溶解于生理盐水中，并通过0.22μm无菌过滤器过滤。用等量的弗氏完全佐剂(F-5881，sigma)乳化0.5ml抗原(1mg抗原)，并沿雄性新西兰大白兔背部多个部位皮下注射，每个抗原注射两只兔子。间隔2周后，增强免疫则用弗氏不完全佐剂(F-5506，sigma)与等体积抗原乳化后(0.5ml，含0.5mg抗原)，沿雄性新西兰大白兔背部多个部位皮内注射。时间间隔为2周共进行两次增强免疫。第二次增强免疫14天后收集兔血清。
实施例6
将上述制备的抗烙铁头SVMP蛋白单克隆抗体、抗烙铁头SVMP蛋白多克隆抗体分别与烙铁头SVMP抗原和五种蛇毒(竹叶青、蝰蛇、蝮蛇、眼镜蛇和烙铁头)结合情况检测，具体步骤同实施例4中‘间接ELISA法’检测抗体效价的步骤一致。同时还采用蛋白印迹法(WB)检测抗体的特异性和空间可及性。
结果见图7。其中A为抗SVMP单克隆抗体SVMP-mc18的ELISA和 WB检测结果。ELISA和WB结果表明，抗SVMP单克隆抗体SVMP-mc18 均具有良好的特异性。B为抗SVMP多克隆抗体的ELISA和WB检测结果。 ELISA和WB结果表明，抗SVMP多克隆抗体的特异性较低，与竹叶青、蝰蛇和蝮蛇有明显交叉反应。
实施例7
单克隆抗体与多克隆抗体配对，即双抗夹心法ELISA方法建立
抗体配对具体方法如下。包被：包被液将天然SVMP多克隆抗体稀释成 10μg/ml，每孔100μl，4℃包被过夜；封闭：弃去包被液，PBST洗涤3次，每次5min，每孔200μl的封闭液37℃孵育1h；孵育样品：弃去封闭液，PBST 洗涤3次，每次5min,PBS稀释五种粗毒(竹叶青、蝰蛇、蝮蛇、眼镜蛇和烙铁头)，浓度为500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、 15.625ng/ml、7.8125ng/ml，每孔加入100μl。37℃孵育1h；孵育抗SVMP 单克隆抗体：弃去样品，PBST清洗3次，每次5min，孵育带有HRP的单克隆抗体稀释比为1：3000(抗体原液浓度为1mg/ml)，每孔加入100μl， 37℃孵育1h；显影：弃去单克隆抗体，PBST洗涤3次，加入100μl TMB 显色液，37℃下避光孵育10min；终止：每孔加入100μl终止液，测定在 450nm下每孔的吸光值。
结果显示，以多克隆抗体为包被抗体和以单克隆抗体为检测抗体配对方式为最优配对方式。
实施例8
烙铁头蛇毒检测标准曲线建立
PBS稀释抗烙铁头SVMP蛋白多克隆抗体(10μg/ml)后按照每孔100μl 的量加入96孔板且空白孔加100μl包被液，37℃包被1小时；倒掉板孔内包被液，用洗涤液洗涤三次，每孔250μl，每次5分钟，尽量拍干；封闭液每孔250μl，37℃封闭1小时，之后洗涤三次，拍干；阳性孔加入100μl稀释后蛇毒，阴性孔和空白孔则加入100μl封闭液，37℃孵育1小时，洗涤三次且拍干；阳性孔、阴性孔和空白孔加入100μl辣根过氧化物酶(HRP)标记抗烙铁头SVMP蛋白单克隆抗体(抗体原液浓度为1mg/ml，按1：3000稀释)，37℃避光温箱孵育1h，之后洗涤三次且拍干；洗涤后每孔100μl加入显色液，37℃避光孵育25分钟；终止液每孔100μl，用酶标仪进行450/630nm 双波长读值。
烙铁头蛇毒检测标准曲线见图9。回归方程为y＝0.00343x+0.07938，其中R2＝0.994。结果显示6.25ng/ml～100ng/ml范围内具有良好线性。
实施例9
一种双抗夹心ELISA检测烙铁头蛇毒的试剂盒，包括以下组分：
包被有抗烙铁头SVMP蛋白多克隆抗体的固相载体；包被浓度为10 μg/ml；
辣根过氧化物酶标记抗烙铁头SVMP蛋白单克隆抗体；
稀释液、显色底物、终止液、封膜及阳性标准品，其中阳性标准品为烙铁头天然SVMP蛋白溶液，制备方法如下：
1、制备粗毒溶液，具体地，分别取出适量的实验室保存的烙铁头的冻干粉，用适量体积的超纯水溶解得到粗毒溶液。
2、粗毒溶液样品用磷酸盐缓冲液稀释5倍，其中磷酸盐缓冲液同上文 (A液)。再用0.22μm滤膜过滤，并上样于Resource S柱，用0～1mol/L 的NaCl溶液线性梯度进行洗脱。然后，在280nm和215nm波长下检测并收集各洗脱峰，冻干，直至得到纯度大于95％的天然SVMP蛋白标准品为止。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院昆明动物研究所
<120> 一种烙铁头SVMP蛋白特异性短肽、抗烙铁头SVMP蛋白抗体和蛇伤检测试剂盒
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Thr Lys Tyr Ser Ser Asn Phe Lys Lys Ile
1 5 10
<210> 2
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe
65 70 75 80
Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Leu Ile Thr Thr Leu Gly Lys Arg Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Glu Ile Gln Leu Gln
115 120 125
Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser
130 135 140
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Asn Met Tyr Trp Val
145 150 155 160
Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asp Pro
165 170 175
Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr
180 185 190
Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe Met His Leu Asn Ser
195 200 205
Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Pro Leu
210 215 220
Ile Thr Thr Leu Gly Lys Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr
225 230 235 240
Thr Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 3
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ile Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Asp Ile Gln Met Thr
100 105 110
Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile
115 120 125
Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ile Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln
130 135 140
Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr
145 150 155 160
Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
165 170 175
Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Asn
180 185 190
Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly
195 200 205
Thr Lys Leu Glu Leu Lys
210
<210> 4
<211> 203
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Gln Gln Arg Phe Pro Gln Arg Tyr Ile Lys Leu Ala Ile Val Val
1 5 10 15
Asp His Gly Met Tyr Thr Lys Tyr Ser Ser Asn Phe Lys Lys Ile Arg
20 25 30
Lys Arg Val His Gln Met Val Ser Asn Ile Asn Glu Met Cys Arg Pro
35 40 45
Leu Asn Ile Ala Ile Thr Leu Ala Leu Leu Asp Val Trp Ser Glu Lys
50 55 60
Asp Phe Ile Thr Val Gln Ala Asp Ala Pro Thr Thr Ala Gly Leu Phe
65 70 75 80
Gly Asp Trp Arg Glu Arg Val Leu Leu Lys Lys Lys Asn His Asp His
85 90 95
Ala Gln Leu Leu Thr Asp Thr Asn Phe Ala Arg Asn Thr Ile Gly Trp
100 105 110
Ala Tyr Val Gly Arg Met Cys Asp Glu Lys Tyr Ser Val Ala Val Val
115 120 125
Lys Asp His Ser Ser Lys Val Phe Met Val Ala Val Thr Met Thr His
130 135 140
Glu Leu Gly His Asn Leu Gly Met Glu His Asp Asp Lys Asp Lys Cys
145 150 155 160
Lys Cys Asp Thr Cys Ile Met Ser Ala Val Ile Ser Asp Lys Gln Ser
165 170 175
Lys Leu Phe Ser Asp Cys Ser Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Phe Leu Thr
180 185 190
Asn Asp Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Ala Pro
195 200
<210> 5
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Asn
1 5
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Tyr
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr
1 5
<210> 9
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys
1 5 10 15
Ser Ser Ser Thr Ala Phe Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp
20 25 30
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Ala Arg Ser Pro Leu Ile Thr Thr Leu Gly Lys Arg Tyr Phe Asp Val
1 5 10 15
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 12
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser
20 25
<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Glu Asn Ile Tyr Ile Tyr
1 5
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
1 5 10 15
Tyr
<210> 15
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly
20 25 30
Asn Tyr Tyr Cys
35
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gln His His Tyr Gly Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
1 5 10

Claims (8)

1.一种烙铁头SVMP蛋白特异性短肽，其特征在于，所述短肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
2.一种由权利要求1所述短肽筛选得到的抗烙铁头SVMP蛋白单克隆抗体SVMP-mc18，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
3.一种烙铁头蛇伤ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括包被抗烙铁头SVMP蛋白的多克隆抗体的固相载体和酶标记的权利要求2所述抗烙铁头SVMP蛋白单克隆抗体SVMP-mc18。
4.根据权利要求3所述检测试剂盒，其特征在于，所述抗烙铁头SVMP蛋白的多克隆抗体是用从烙铁头蛇毒中分离纯化的SVMP蛋白免疫动物制备得到。
5.根据权利要求4所述检测试剂盒，其特征在于，所述烙铁头SVMP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
6.根据权利要求3所述检测试剂盒，其特征在于，所述固相载体中抗烙铁头SVMP蛋白的多克隆抗体的包被浓度为1～100μg/ml。
7.根据权利要求3～6中任意一项所述检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括洗涤液、样品稀释液、底物、显色液和阳性标准品。
8.根据权利要求7所述检测试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品为分离纯化的烙铁头SVMP蛋白或权利要求1所述烙铁头SVMP蛋白特异性短肽。
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