CN1069737A

CN1069737A - 胰岛素类似物

Info

Publication number: CN1069737A
Application number: CN92105888A
Authority: CN
Inventors: D·N·布雷姆斯; R·E·钱斯; B·H·弗兰克
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1991-06-21
Filing date: 1992-06-19
Publication date: 1993-03-10
Also published as: NO922376D0; IL102240A0; EP0519750A2; JPH05271283A; NZ243229A; CA2071382A1; MX9202987A; FI922882A; BR9202322A; YU64192A; FI922882A0; HU9202048D0; CZ186492A3; AU1837792A; TW222643B; ZA924448B; NO922376L; HUT61581A; IE921997A1; EP0519750A3

Abstract

在B链位置10上含有Asp残基的人胰岛素类似物，具有B链的平截羧基末端，并且任意地，在其它位置上有修饰，显示出修饰的生理化学和药物代谢动力学的特性。这些类似物有用于治疗高血糖症。

Description

本发明属于人体医学领域，特别是对糖尿病的治疗。更具体地说，本发明涉及人体胰岛素分子的类似物，使用这些类似物的方法以及含有这些胰岛素类似物的药物组合物。

糖尿病症是一种新陈代谢紊乱症，其特征在于人体组织不能以正常速度氧化碳水化合物。在糖尿病症中胰岛素的缺乏是最重要的因素。在过去70年中，糖尿病患者通过接受控制量的胰岛素而大有帮助。直到80年代初期糖尿病所用的胰岛素都是由动物胰腺中分离的，一般是由牛和猪的胰腺。随看重组体DNA技术的引入，就有可能大量生产天然人体胰岛素以及天然地和非天然地产生的人胰岛素类似物。与天然人胰岛素相比，这些胰岛素类似物具有不同的物理和化学性质。

天然人胰岛素在B-链的10位置上含有一组氨酸残基。用天冬氨酸残基代替该组氨酸残基，并除去在B-链29和30位置上的赖氨酸和苏氨酸残基而形成在溶液中聚集的一种类似物ASP（B10）、des（B29-30）人胰岛素。意外的是，将这个类似物28位置上的脯氨酸残基除去而得到的Asp（B10），des（B28-30）人胰岛素会导致成为一种稳定的、快速作用的分子，并且它在溶液中基本上保持单体形式。另外，将Asp（B10），（B28-30）人胰岛素B-链的27位置上的苏氨酸残基除去而生成Asp（B10），des（27-30）人胰岛素，它在溶液中也是稳定的，快速作用并呈单体。

本发明涉及人胰岛素类似物，它通过将天然人胰岛素B-链的氨基酸10由组氨酸变为天冬氨酸，并通过由天然人胰岛素B-链的羧基末端去除三肽或四肽而进行改性。这些分子也可以在天然人胰岛素A-链的21位置上以及在天然人胰岛素B-链的1和3位置上进行改性。所述的胰岛素类似物是更为稳定并更少地进行二聚化和自结合为更高分子量形式，从而具有更快地启动活性同时保持天然人胰岛素的生物活性。

本发明也公开和要求了一种通过给患者施用其所需有效量的所申请类似物以治疗高血糖的方法。另外，公开和要求了含有与一种或多种可药用赋形剂相结合的有效量的本发明胰岛素类似物的药物组合物。

为了本发明作为本文公开和要求的目的，下列术语和缩略语的定义如下：

Asp（B10），des（B28-30）HI-一种人胰岛素类似物，其中，在天然人胰岛素B-链的10位置上的组氨酸残基已变为天冬氨酸残基，而且该天然人胰岛素B-链的氨基酸残基28至30已被去除。

Asp（B10），des（B27-30）HI-一种人胰岛素类似物，其中，在天然人胰岛素B-链的10位置上的组氨酸残基已变为天冬氨酸残基，而且该天然人胰岛素B-链的氨基酸残基27至30已被去除。

BHI-生物合成的人胰岛素。

交联-在半胱氨酸残基间形成二硫键。一种适当交联的天然人胰岛素或胰岛素类似物含有三个二硫桥键。发现第一个二硫桥键是在A链6和11位置上的半胱氨酸残基之间。第二个二硫桥键将在A-链位置7上的半胱氨酸连接到在B-链位置7上的半胱氨酸上。第三个二硫桥键将在A-链位置20的半胱氨酸连接到处于B-链位置19的半胱氨酸上。

SEQIDNo：1-列于顺序表的第一顺序是一种人胰岛素A-链的类似物，其顺序为：

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln

1 5 10 15

Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa

20

其中Xaa是Asn，Asp，Glu，Gln，Ala，Gly或Ser。

SEQIDNo：2-列于顺序表的第二顺序是一种人胰岛素B-链的类似物，其顺序为：

Xaa Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu

1 5 10 15

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr

20 25

其中，在位置1的Xaa是Phe或Asp，而在位置3的Xaa是Asn或Asp。

在本文所用的全部氨基酸的缩略语都采用由美国专利和商标局列于37C.F.R.§1.822（b）（2）（1990）中的那些。

本发明涉及胰岛素类似物，其表达式为：

SEQ ID No：1

(Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr

1 5 10

Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa)

15 20

适当地交联到

SEQ ID NO：2

(Xaa Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala

1 5 10

Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr

15 20 25

或其可药用的盐，其中在SEQ ID NO：1（胰岛素A-链）位置21上的Xaa是Asn，Asp，Glu，Gln，Ala，Gly或Ser;在SEQ ID NO：2（胰岛素B-链）位置1上的Xaa是Phe或Asp;而在SEQ ID NO：2位置3上的Xaa是Asn或Asp。在SEQ ID NO：1的位置21上的Xaa优选的是Gly，Ala，Ser或Asn。在位置21上的最优选的氨基酸是天冬氨酸。在SEQ ID NO：2位置1的优选的氨基酸是Phe，而且在SEQ ID NO：2的位置3的最优选的残基是Asn。本发明的一种特别优选的胰岛素类似物是，其中在SEQ ID NO：1位置21上的Xaa是Asn，在SEQ ID NO：2位置1上的Xaa是Phe和在SEQ ID NO：2位置3上的Xaa是Asn的一个。在本领域技术人员熟知的标准生物化学表示中，所述特别优选的类似物是Asp（B10），des（B28-30）人胰岛素。

本发明也涉及一种胰岛素类似物，其表达式为：

SEQ ID NO：1适当地交联到SEQ ID NO：2的氨基酸1到26，或其药物可用盐，

其中在SEQ ID NO：1位置21的Xaa是Asn，Asp，Glu，Gln，Ala，Gly或Ser;在SEQ ID NO：2位置1上的Xaa是Phe或Asp;在SEQ ID NO：2位置3上的Xaa是Asn或Asp。在SEQ ID NO：1位置21上的Xaa优选的是Gly，Ala，Ser或Asn，其中Asn最好。在SEQ ID NO：2位置1上的优选氨基酸是Phe，而在SEQ ID NO：2位置3上的最好残基是Asn。本发明特别优选的一种类似物是其中在SEQ ID NO：1位置21上的Xaa是Asn，在SEQ ID NO：2位置1上的Xaa是Phe，在SEQ ID NO：2位置3上的Xaa是Asn而SEQ ID NO：2末端是在残基26上的那一个。在标准的生物化学表示中，所述特别优选的类似物是Asp（B10），des（B27-30）人胰岛素。

本发明的另一个类似物的表达式为：

SEQ ID NO：1适当地交联到SEQ ID NO：2的氨基酸2-27上，或其药物可用盐，

其中在SEQ ID NO：1位置21上的Xaa是Asn，Asp，Glu，Gln，Ala，Gly或Ser;在SEQ ID NO：2位置3上的Xaa是Asn或Asp。在SEQ ID NO：1位置21上的Xaa优选的是Asn，而在SEQ ID NO：2位置3上的Xaa优选的也是Asn。所述优选的类似物对本领域技术人员熟知的称为Asp（B10），des（B1），des（B28-30）人胰岛素。

本发明又一个类似物，其表达式为：

SEQ ID NO：1适当地交联到SEQ ID NO：2的氨基酸2-26上，或其药物可用的盐，

其中，在SEQ ID NO：1位置21上的Xaa是Asn，Asp，Glu，Gln，Ala，Gly或Ser;在SEQ ID NO：2位置3上的Xaa是Asn或Asp。优选地，在SEQ ID NO：1位置21上的Xaa是Asn而在SEQ ID NO：2位置3上的Xaa也是Asn。所述优选类似物在标准生物化学表示中熟知为Asp（B10），des（B1），des（B27-30）人胰岛素。

本发明的胰岛素类似物，既可在含锌溶液也可在不含锌溶液中，具有减少二聚化或自结合为更高分子量形式的倾向。其中，类似物在溶液中一般呈单体的，并在给药时达到快速启动活性。

如上所述，本发明包括该胰岛素类似物的药物可用盐。优选的这种盐有锌盐、钠盐、钾盐、镁盐、钙盐，或这些盐的结合物。

本发明的胰岛素类似物能通过各种已知的肽合成技术中的任一种方法而制备，其中包括经典（溶液）法、固相法、半合成法以及最近使用的重组体DNA方法。

在固相技术中，氨基酸顺序是由一起始的、不溶的、树脂载体上的C-末端氨基酸按顺序地构建的。固相法的技术描述于J.Stewart等人的Solid-Phase Peptide Synthesis，Freeman and Co.，San Francisco，1969中。

通常，在固相技术中，将与所要求的肽的C-末端氨基酸相当的氨基酸固定在一种不溶性的树脂载体上，然后在树脂载体上的C-末端氨基酸上开始形成肽链。单个的氨基酸按顺序引入，直到获得所要求的氨基酸顺序。或者，可以制备小的肽片段，并将其按所要求的顺序引入肽链。在整个合成过程中，肽链保持与树脂相接，在完成链时，将肽由树脂上分开。

通过在C-末端部分的羧基基团和在树脂基体上存在的作为这种连接位点的特定亚甲基基团之间所形成的酯键将肽链连接到聚苯乙烯树脂上。

氨基酸是使用现有技术中熟知的技术进行偶合而形成肽键。一种方法是将氨基酸转化成一种衍生物，该衍生物将使得羧基基团更易于与肽片段的游离N-端氨基基团反应。例如，氨基酸通过用氯甲酸乙酯、氯甲酸苯酯、氯甲酸仲丁酯或氯甲酸异丁酯的保护氨基酸的反应而转化成一种混合的酸酐。或者，氨基酸能转化为一种活性酯，例如一种2，4，5-三氯苯基酯，五氯苯基酯、P-硝基苯基酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯、或一种由1-羟基苯并***形成的酯。

另一种偶合方法是使用一种合适的偶合剂，如N，N′-二环己基碳化二亚胺（DCC）或N，N′-二异丙基碳化二亚胺（DIC）。其它合适的偶合剂对本领域技术人员来说是显而易见的。参阅Schroder and Lubke，The Peptides，Academic Press，1965，第三章，在此引入作为参考。

必须看到，在肽合成中所使用的每个氨基酸的α-氨基基团，在偶合反应过程中必须进行保护，以防止支反应，包括反应的α-氨基功能。也应认识到，某些氨基酸含有反应的侧链功能基团（如，硫氢基、ε-氨基、β-和γ-羧基、咪唑、胍基和羟基），而这些功能性基团在起始和以后的偶合步骤中也都必须进行保护。合适的保护基团在现有技术中是已知的。参阅例如，Protective Groups In Organic Chemistry M.McOmie，Editor，Plenum Press，N.Y.1973和美国专利4617149，在此引入作为参考。

在选择特定的保护基团时，必须注意某些条件。一种α-氨基保护基团（1）在偶合反应中所用的条件下必须使α-氨基官能成惰性，（2）在偶合反应后必须易于去除，而且在不会去除支链保护基团和不会改变肽片段结构的条件下，以及（3）在偶合前必须即刻消除在活性作用上可能的外消旋作用。一种支链保护基团（1）在偶合反应所用的条件下，必须使支链官能基团成惰性，（2）在去除α-氨基保护基团中所用的条件下必须是稳定的，以及（3）在完成所要求的氨基酸顺序时必须易于除去，而且在该反应条件下不会改变肽链结构。

对本领域技术人员是显然的，用于肽合成的已知保护基团对其去除所用试剂的反应性是不同的。例如，某些保护基团，如三苯基甲基和2-（P-联苯基）异丙基氧基羰基是非常不稳定的，并在温和的酸性条件下就能裂解。其它的保护基团，如t-丁基氧基羰基，t-戊基氧基羰基，金刚烷基氧基羰基和P-甲氧基苄基氧基羰基，是较稳定的，需要适当的强酸，如三氟乙酸，盐酸或在乙酸中的三氟化硼才能去除它们。还有另一些保护基团，如苄基氧基羰基，卤代苄基氧基羰基、P-硝基苄基氧基羰基、环烷基氧基羰基和异丙基氧基羰基是更稳定，需要更强的酸如氟化氢、溴化氢或在三氟乙酸中的三氟乙酸硼才能将它们除去。

在完成所要求的肽顺序时，保护的肽必须从树脂载体上分离，而且全部保护基团也应除去。分离反应和保护基团的除去可以同时或分步骤进行。当树脂载体是一种氯代甲基化的聚苯乙烯树脂时，将肽固定在树脂上的键是在C-末端部分的游离羧基基团和在树脂基质上所存在的许多氯代甲基基团中的一个之间所形成的酯键。

可以认为，所固定的键能通过试剂进行裂开，该试剂已知具有破坏酯键并渗入树脂基质的能力。一种特别方便的方法是用液体无水氟化氢进行处理。这试剂不仅从树脂中分开肽，而且也能除去全部保护基团。因此，使用这种试剂将会直接得到完全去保护的肽。如果要求分开肽而不去除保护基团，则保护的肽-树脂可进行甲醇分解作用而得到C-末端的羧基基团是甲基化的保护肽。然后使该甲基酯在温和的碱性条件下水解而得到游离的C-末端羧基。然后在肽链上的保护基团可通过用强酸（如液体氟化氢）进行处理而除去。对于甲醇分解的一种特别有用的技术，可参阅G.Moore等人的Peptides，Proc.5th Amer.Pept.Symp.，M.Goodman and J.Meienhofer.Eds.，John Wiley，N.Y.，1977，pp518-521，其中保护的肽-树脂是在冠醚存在下，使用甲醇和***进行处理的。

由树脂中分开保护肽的另一种方法是通过氨解作用或通过用肼处理。若需要，所得的C-末端酰胺或酰肼可以水解为游离C-末端羧基，而方便地去除保护基团。

也可以认为，存在于N-末端的α-氨基基团的保护基团可以在由树脂载体上分开肽之前或同时优选地除去。

本发明的胰岛素类似物的A和B链也能通过重组体DNA方法来制备。在其制备中，使用用于这种合成的现在常规（now-routine）技术制备编码A或B链所要求的肽的核苷酸顺序。这些方法一般是制备编码所要求的编码顺序片段和其互补顺序两者的寡核苷酸。寡核苷酸是设计提供具有互补顺序的两个片段的编码顺序的一个片段的交叠而且反之亦然。该寡核苷酸是成对的并连接的，最终生产出所要求的基团顺序。

将顺序***一克隆载体的一个位置处，该位置可使肽产品以其编码表达。能表达胰岛素原和胰岛素原类似物的质粒结构描述于Chance等人的欧洲专利说明书EP 0383472，公开于1990年8月22日，其全部报导引入本文，作为参考。

本发明的胰岛素类似物的A和B链也可以通过使用重组体DNA技术的一种类胰岛素原前体分子而进行制备。参阅Frank等人，Peptides.Synthesis-Structure-Function，Proc.Seventh Am.Pept.Sym.，Eds.D.Rich and E.Gross（1981），该文在此引入以作参考。

然而，所生产单个A和B链的组合步骤可以通过Chance等人（Peptides：Synthesis Structure and Function：Proc of Seventh American Peptide Symposium（1981））的方法来实现，在此引入该文作为参考。

提出以下实施例作为本发明的说明，而不认为是对其限制。

实施例1

Asp（B10），des（B27-30）人胰岛素

A、酶促半合成法

标题胰岛素类似物是通过使用Asp（B10）脱八肽（B23-30）人胰岛素和合成的四肽Gly-Phe-Phe-Tyr的酶促半合成（逆蛋白水解）而制备的。四肽是通过固相肽合成而制备的而Asp（B10）脱一八肽人胰岛素是通过胰蛋白酶水解反应除去顺序23-65而从Asp（B10）人胰岛素原中衍生而得的。Asp（B10）胰岛素原类似物是通过基本上按照Chance等人的报导，（欧洲专利EP 0383472，公开于1990年8月22日，其全部报导在此引入作为参考）重组体DNA工艺来制备的。EP0383472第35页公开了核苷酸衔接物顺序（ⅱ），它是用于构建编码Met-Tyr-[Asp（B1），Lys（B28），Pro（B29）HPI]的质粒PRB176。用于产生本发明起始材料的Asp（B10）质粒包括一种与衔接物（ⅱ）相类似的衔接物，只是在顺序（ⅱ）中编码Asp的顺序CGAC是用编码Phe的顺序TTTT所代替，而编码His的顺序CAT用顺序GAC代替而形成一种编码Asp（B10），Lys（B28），Pro（B29）人胰岛素原的质粒。基因编码的重复和本技术领域技术人员的知识能够进行许多取代，而构建编码一种Asp（B10）人胰岛素原的质粒。

Asp（B10）脱一八肽人胰岛素制备如下：将700ml（9.8g）在pH2.5甘氨酸缓冲液中的折叠Asp（B10）人胰岛素原，通过在搅拌下加入25ml氢氧化铵而调PH至10.2。然后加入20ml浓盐酸将PH值快速调到9.10。在这溶液中加入7ml氯化钙水溶液（14.7mg/ml），接着加入70ml 14mg/ml的豕胰蛋白酶的水溶液，得到以重量计酶与基质之比为约1∶10。将胰蛋白酶的水解反应物充分混合，然后贮于25℃下17小时，这时，通过加入160ml冰乙酸得到最后PH为3.09而停止反应。然后加入105ml乙腈。

为分离和纯化所得Asp（B10）脱一八肽人胰岛素，将胰岛蛋白酶的消化溶液在25℃下泵入到一个5.5×30cm C-18Vydac HPLC柱上。用于这色谱步骤制备两种缓冲液：缓冲液A，包括10份乙腈和90份0.5%TFA（三氟乙酸）溶液，而缓冲液B，包括50份乙腈和50份0.5%TFA。在简单地用缓冲液A洗涤后，将由0-20%缓冲液B的线性梯度液，按2.4ml/min的速率泵经柱16小时，接着以8ml/min的速率将20-70%缓冲液B的线性梯度液淋洗8小时。含有Asp（B10）脱一八肽人胰岛素的主峰在约50%缓冲液B时洗脱，将含有本材料（基于分析的反相HPLC）的馏份合并并冷冻干燥，最后回收的重量为5.5g，其HPLC纯度为93%。通过氨基酸分析，质谱分析法，和NH₂-末端分析证实Asp（B10）脱一八肽（B23-30）人胰岛素的可靠性。

为制备标题胰岛素类似物，将545mgAsp（B10）脱一八肽人胰岛素和300mg合成的四肽Gly-Phe-Phe-Tyr，在37℃下，在15ml含有1份二甲基亚砜，2份1.4-丁二醇和1份0.35Mtris缓冲液（不调节PH）的溶液中合并。加入猪的胰蛋白酶（85mg）。充分混和该溶液，并在37℃下不时地搅拌360分钟。蛋白质用冷的丙酮沉淀，用二***洗涤，氮气流干燥，最后溶于75ml 6M胍-HCl（0.01HCl中）中。

在5×200cm的Sephadex G-50（超细）柱上凝胶过滤清彻的样品溶液，并在4℃下用1M乙酸洗脱。流出液在276nm处并通过反相HPLC而监测。集中含有标题产品的馏份（～275ml），用水稀释到500ml，泵到21×250mm C-8 Zorbax柱上，在0.1M磷酸钠PH2的缓冲液中的乙腈梯度液中洗脱产品。

收集含有标题胰岛素类似物的适当馏份（由分析HPLC测定），用水稀释四倍，且泵到25×300mmC-18Vydac柱上。脱盐的蛋白质用在0.5%三氟乙酸中的乙腈梯度液洗脱。收集含有纯化的胰岛素类似物的馏份并冷冻干燥，而得到22mg。通过快原子轰击质谱法（FAB/MS）和氨基酸分析证实其结构。FAB/MS的结果得到分子量为5358.3（理论值：5358.0）。氨基酸组成如下，基于天冬氨酸作为摩尔单位（理论的氨基酸比在括弧中）：

Asp，4.00（4）;Thr，1.00（1）;Ser

2.50（3）;Glu，6.90（7）;Gly，3.92（4）;Ala，1.01（1）;1/2Cys，

4.92（6）;Val，3.55（4）;Ile，1.73（2）;Leu，6.03（6）;Tyr，

3.70（4）;Phe，2.86（3）;His，1.31（1）;Arg，1.00（1）.

B、链结合

1、制备Asp（B10），des（B27-30）人胰岛素B-链

使用Applied Biosystems 430A肽合成器（包括软件修订版1.4）以制备粗制的肽基树脂。使用0.5毫摩尔（mMol）的起始固相树脂（t-BOC-Thr（Bzl）OCH₂Pam树）（0.61mMol/g×0.91g）.所用的全部氨基酸是BOC保护的，除了谷氨酸、天冬氨酸、和组氨酸，全部都是按得到的直接使用（即，由Applied Biosystems，Inc的柱筒中，每个柱筒含有约2mMol保护的氨基酸）。谷氨酸、天冬氨酸和组氨酸得自市售源，转移到柱筒，以使每个柱筒含有约2mMol所要求保护的氨基酸。粗制的肽基树脂在室温真空下干燥5小时，其重量与起始重量相比较，以保证适当的重量增益。将小部分样品进行氨基酸分析，以确保所要求的氨基酸是按正确的比例加入。

通过在一种按10份（V/W）HF（含5%V/V p-甲苯硫酚和5%V/v m-甲苯酚）对1份肽基树脂的溶液中在0℃搅拌约1小时，将肽由肽基树脂上分开并支链脱保护。通过真空去除大部分HF后，在***中沉淀肽。在用***洗涤几次后，接着真空过滤，将肽溶于约200ml含有0.1Mtris，35mg/ml Na₂SO₃和25mg/ml Na₂S₄O₆的8M胍-HCl，PH11，的溶液中。用5N NaOH调节溶液PH到8.8，并在室温剧烈搅拌3小时。

将得到的S-磺化的肽溶液在室温装载到5×215cm Sephadex G-25（粗）柱上。样品在室温用50mM NH₄HCO₃以21ml/m流速洗脱。流出液在276nm处监测，收集所要求的流出液，1000ml，冷却并冷冻干燥。

2、Asp（B10）des（B27-30）人胰岛素B-链与人胰岛素A-链的结合。

A和B链的结合是通过按描述于EPO 0383472（同上）的，使用重组体的生产A-链的上述Chance等人的方法来进行的。将2.27g重组体DNA-衍生的A-链S-磺酸盐和511mg合成的Asp（B10）des（27-30）B-链S-磺酸盐合并于一烧瓶中，并在室温溶于245ml0.1M甘氨酸。溶液的PH值用5N NaOH调节到10.5并冷却至4℃。在室温制备一种15.5mg/ml二硫代苏糖醇（DTT）在0.1M甘氨酸缓冲液中的溶液，用5N NaOH调节到PH10.5，然后冷却至4℃。

将18.5ml DTT溶液快速加入到合并的A-链和B-链S-磺酸盐溶液（SH/ssO^-3＝1.0）中。反应溶液在500mlEhrlenmeyer烧瓶中，在4℃下搅拌26小时。加入磷酸（3.7ml），反应液的PH值降低到2.9。

所得的沉淀混合物用milli-Q水和乙腈稀释，并通过反相HPLC（使用-50×300mmVgdac c-18柱，在室温下，用在0.1M NaH₂PO₄中的增加乙腈的线性梯度液（PH2.3），按2.6ml/min速率洗脱而纯化。流出液在280nm处进行监测。所选择的馏份通过分析HPLC进行测定。收集所要求的馏份（405ml）。用400mlmilli-Q水稀释，与1.2g Na₂S₄O₆结合，用5N NaOH调节到PH7，并且通过反相HPLC（使用21×250mm Dupont Zorbax C-8柱，在室温，用在0.1M（NH₄）₂HPO₄中的增加乙腈的线性梯度液，按2.0ml/min速率洗脱）而再纯化。流出液在280nm监测。所选择的馏份通过分析的HPLC测定。收集所要求的馏份，用H₃PO₄调节到PH2.3，并装到-Vydac C-18 HPLC柱（21×250mm）上，并用在0.5%TFA水液中的增加乙腈的线性梯度液洗脱。流出液在280nm监测。所选择的馏份通过分析HPLC测定。收集适宜的馏份并冷冻干燥而得到135mg胰岛素类似物产品，通过反相PHLC其纯度大于91%。结构通过快原子轰击质谱法（FAB/MS）和氨基酸分析进行验证。FAB/MS的结果得到的分子量为5358.5（理论值：5358.0）。氨基酸组成如下，基于天冬氨酸作为摩尔单位（理论的氨基酸比例在括弧中）：Asp，4.00（4）;Thr，0.98

（1）;Ser，2.72（3）;Glu，7.14（7）;Gly，3.93（4）;Ala，

0.98（1）;1/2 Cys，5.44（6）;Val，3.44（4）;Ile，1.51（2）;

Leu，6.14（6）;Tyr，3.86（4）;Phe，2.88（3）;His，1.09（1）;

Arg，0.97（1）.

实施例2

Asp（B10），des（B28-30）人胰岛素

标题胰岛素类似物通过按实施例1的使用Asp（B10）脱-八肽（B23-30）人胰岛素和合成的五肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr的酶促半合成法（逆蛋白水解）而进行制备的。五肽是通过固相肽合成而制备的，而Asp（B10）脱-八肽人胰岛素通过按实施例1中所述，以胰蛋白酶水解反应而除去顺序23-65，而从Asp（B10）人胰岛素原中衍生出来。

为制备标题胰岛素类似物，将765mgAsp（B10）脱-八肽胰岛素和500mg合成的五肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr在21ml含有1份二甲基亚砜、2份1，4-丁二醇和1份0.35Mtris缓冲液的溶液中（不调PH）在37℃下合并。加入猪胰蛋白酶（127mg）。充分混和溶液并在37℃下不时地搅拌240分钟。用冷的丙酮沉淀蛋白质，用二***洗涤，用氮气流干燥，最后溶于50ml6M胍-HCl（用0.01N HCl制备）中。将清彻的样品溶液在50×200cm的Sephadex G-50（超细）柱上进行凝胶过滤并在4℃用1M乙酸洗脱。流出液在276nm并通过反相HPLC进行监测。收集含有标题产品的馏份（～250ml），用水稀释到500ml，泵入到21×250mm C-8 Zorbax柱上，而产品洗脱在0.1M磷酸钠PH2缓冲液中的乙腈梯度液中。收集含有标题胰岛素类似物的适宜馏份，该馏份通过分析HPLC测定，用水（400ml）稀释5倍，并泵到25×300mm C-18 Vydac柱上。脱盐的蛋白质用在0.5%三氟乙酸中的乙腈梯度液进行洗脱。收集含有纯化胰岛素类似物的馏份并冷冻干燥而产生47mg。结构通过快速原子轰击质谱法（FAB/MS）和氨基酸分析进行验证。FAB/MS的结果给出的分子量为5459.2（理论值：5459.1）。氨基酸组成如下，基于以天冬氨酸作为摩尔单位（在括弧中的是理论的氨基酸比率）：Asp，

4.00（4）;Thr，1.86（2）;Ser，2.56（3）;Glu，7.03（7）;Gly，

4.01（4）;Ala，1.07（1）;1/2 Cys，5.38（6）;Val，3.76（4）;Ile，

1.85（2）;Leu，6.14（6）;Tyr，3.80（4）;Phe，2.94（3）;His，

1.15（1）;Arg，0.96（1）.

实施例3

溶液的稳定性

降解分析是通过将约3.5mg/ml.浓度的胰岛素或胰岛素类似物样品在50℃下在0.1M磷酸钠，PH7.4（除另有说明），0.25%甲苯酚和1.6%甘油中进行培养而实施的。在不同的时间，取部分培养混合物，用过量10倍的6M胍-HCl，0.1M磷酸钠，PH3.0的溶液在23℃停止反应，直至用HPLC筛析色谱（size exclusion）进行分析为止。所淬火的培养反应物在5℃下贮存可达二星期而在HPLC筛析性质方面不会变化。HPLC筛析分析是使用DuPont Zorbax GF-250柱（50μl注入量），用6MGdnHCl，0.1M磷酸钠作为洗脱溶液（流速＝1ml/min，23℃并在278nm监测）。单体降解率是由单体峰面积的对数随时间关系的斜率来确定的，而降解的半衰期（t1/2）是根据：t1/2＝0.693÷速率来测定的。结果示于表1。

表1

溶液稳定性

t 1/2单体

在50℃下的天数(+/- 10%)

分子 PH7.4 PH6.1

BHI+锌 94

Asp(B10),des(B27-30)HI 89

des(B29-30)HI 49

Asp(B10),des(B30)HI 49

des(B27-30)HI 46

Asp(B10),des(B28-30)HI 37 193

Asp(B10)HI 33

des(B28-30)HI 32

des(B30)HI 24

BHI(无锌) 12

des(B26-30)HI IN^a

Asp(B10),des(B26-30)HI IN^a

a在整个实验时间过程中，化合物将不保持可溶性。

实施例4

平衡变性

平衡变性实验是按照Brems等人（Biochemistry29：9289-9293）的报导而进行的，该文献的全部报导在此引入作为参考。制备蛋白质的储液，其浓度为约10mg/ml胰岛素或类似物，20mM HEPES，PH7.5，20%（V/V）乙醇和1mM EDTA，有或没有GdnHCl.变性储液制备成约7MGdnHCl，20mM Hepes，PH7.5，20%（v/v）乙醇和1mMEDTA。变性样品是通过不同比例的蛋白质和变性储液以及一种含20mM HEPES，PH7.5，20%（V/V）乙醇和1mM EDTA的溶液相混合而制备，以得到所要求的变性浓度。GdnHCl浓度是通过使用Abbe-3L折射仪的折射法来测定。

当制备变性样品时，蛋白质储液是最后加入，然后通过旋转而轻轻混和整个样品。GdnHCl在20%乙醇水溶液中的最大溶解度约7M，因而具有大于7M的样品要由不含乙醇的约8M的GdnHCl储液来制备。园二色性的测量是用一种Aviv620分光光度计在23℃下进行的。其结果示于表Ⅱ和表Ⅲ。

表Ⅱ

平衡变性

Delta G

(+/- 6%)

1. Asp(B10),des(B27-30)HI 6.2

2. Asp(B10),des(B29-30)HI 6.0

3. Asp(B10),des(B26-30)HI 5.8

4. Asp(B10),des(B30)HI 5.5

5. Asp(B10),des(B28-30)HI 5.4

6. Asp(B10)HI 5.1

7. BHI(无锌) 5.1

8. Asp(B10) des(B23-30)HI 5.1

9. des(B28-30)HI 5.0

10. des(B30)HI 4.6

11. des(B26-30)HI 4.5

12. des(B27-30)HI 4.3

13. des(B29-30)HI 4.3

14. des(B23-30)HI 3.8

表Ⅲ

平衡变性

中点

(+/- 2%)

1. Asp(B10),des(B27-30)HI 5.8

2. Asp(B10),des(B26-30)HI 5.7

3. Asp(B10),des(B30)HI 5.6

4. Asp(B10),des(B23-30)HI 5.6

5. Asp(B10),des(B29-30)HI 5.5

6. Asp(B10),des(B28-30)HI 5.5

7. Asp(B10)HI 5.3

8. des(B29-30)HI 5.2

9. des(B27-30)HI 5.1

10. des(B26-30)HI 5.1

11. des(B30)HI 5.0

12. des(B28-30)HI 5.0

13. des(B23-30)HI 4.7

14. BHI(无锌) 4.5

实施例5

平衡超离心作用

胰岛素的凝聚性质是通过沉降平衡超离心来进行测定的。每个类似物的结合态是使用描述于Pekar，A.H.和Frank，B.H.（1872）Biochemistry，11;4013-4016中的技术来测量的。其全文在此引入，作为参考。表Ⅳ中列出的结果是对胰岛素和有关化合物，在其蛋白质浓度为3.5mg/ml和PH7.2 0.05M NaCl-0.05M磷酸钠和22℃条件下。所给出值是平均分子量的观测重量除以化合物的单体分子量。所以这个比值是该胰岛素类似物聚集程度的指数。对于无锌的BHI也给出了结果，显然，在与人胰岛素相比，本化合物具有很弱的自结合性质。

表Ⅳ

平衡超离心作用

化合物 Mw/M1

1. Asp(B10),des(B27-30)HI 1.06

2. Asp(B10),des(B28-30)HI 1.20

3. des(B27-30)HI 1.80

4. Asp(B10),des(B29-30)HI 2.0

5. Asp(B10)HI 2.3

6. des(B28-30)HI 2.3

7. des(B29-30)HI 4.6

8. BHI(无锌) 6.6

实施例6

受体结合

本发明的胰岛素类似物的生理作用示于下列体外胰岛素受体结合试验。微粒体膜是通过已公开的方法（如，Marshall等人（1974）Characterization of the Insulin and somatomedin-c Receptors in Human Placental Cell Membranes，J.Clin.Endocrin.Metab.39：283-292）从足月的人胎盘中制得的。约30μg蛋白质用45000～50000 cpm的¹²⁵I[A14]-人胰岛素和冷的竞争配位体的增加剂量在0.5ml 100mM Hepes，PH7.8，120mM NaCl，5mM KCl，1.2mM MgSO₄，8mM葡萄糖和0.25%BSA中进行培养。在4℃24小时后，用Skatron细胞收集器在玻璃纤维滤器上收集膜。并测定结合¹²⁵I。为将各种胰岛素类似物与一种人胰岛素标准相比较（参阅表Ⅴ的数据），作出竞争结合曲线以测定125_I胰岛素的50%置换的有效激素浓度（ED₅₀）。Asp（B10），des（B27-30）人胰岛素和Asp（B10），des（B28-30）人胰岛素在这些受体结合研究中是极有效的。

表Ⅴ

对人胰岛素受体^a的相对结合效力

化合物平均值±S.E.M.

人胰岛素 (HI) 100%(n=2)

Asp(B10)HI 175±17%(n=2)

des(B28-30)HI 69±2%(n=3)

des(B27-30)HI 125±14%(n=2)

Asp(B10),des(B28-30)HI 309±19%(n=2)

Asp(B10),des(B27-30)HI 275±15%(n=2)

Asp(B10),des(B26-30)HI 172±95(n=2)

a对人胰岛素的ED₅₀是0.29nM

实施例7

鼠的研究

本发明胰岛素类似物的生理作用示于下面体内试验组。

使用从Charles River Laboratories（Portage，MI）得到的正常的Sprague Dawley雄鼠作为试验动物。它们的体重范围在160-180gms之间，并在有控制光照循环（在上午7：00-下午7：00开灯，在下午7：00-上午7：00关灯）的动物室中在75°F下维持一星期。动物喂以任意的Purina鼠食品5001₀对每个测试所用的鼠在使用前禁食16小时。当第一次使用时，它们的体重约200克。当禁食后的体重达到约275克（超过三星期），则该动物不再使用。对于每一个试验化合物（即生物合成人胰岛素，猪胰岛素和人胰岛素类似物）每天使用一组十只雄鼠。在一星期期间每组仅使用一次。十只鼠分成每五只的二组。一组作为对照组，仅以皮下给予载体。而另5只鼠的组则给以要试验的化合物。将蛋白质溶于0.05N HCl（pH 1.6）而提供每毫升100μgm的储液。由此，在常用的盐水中制备成许多稀释液，以皮下注射入鼠体。在施药后的0小时和30分钟，1小时、2小时、3小时和4小时的时候从每个鼠的尾静脉采取100μl血样品。通过葡萄糖氧化酶法（Sigma Chemical Co.）比色测定葡萄糖。计算每只鼠的血中葡萄糖对0小时值的百分比变化，而且其最终结果是以那天对照组的平均变化校正的实验组的平均百分比的变化±SEM表示。

剂量一应答曲线是使用在给定时间最大应答（通常是给药后1或2小时）的，由4-7个不同浓度的测试化合物的试验中所画出来的。由该曲线测定ED₅₀值以给出最大低血糖应答的一半的蛋白质的的皮下给药剂量（μg/kg）。结果示于下面表Ⅵ。

表Ⅵ^a

相对的

低血糖

化合物 EDb₅₀活性(%)^c

人胰岛素(HI)^d7.75 100

Asp(B10)HI 9.8 79

des(B28-30)HI 8.1 96

des(B27-30)HI 12.7 61

Asp(B10),des(B28-30)HI 7.7 101

Asp(B10),des(B27-30)HI 11.9 65

Asp(B10),des(B26-30)HI 11.0 70

a列出的全部数值是指化合物的给药1小时后所取的血样。

b以μg/kg表示，皮下给药。

c相对于人胰岛素

d生物合成的人胰岛素

如上所述，本发明的胰岛素类似物具有降低二聚化或自结合为更高分子量形式的趋势。因此，在施药一种或多种所述类似物时，可达到一种快速的启动活性。本发明的胰岛素类似物，通过对病人以所需有效量的表达式Ⅰ的胰岛素类似物给药，可有效地处置高血糖。在此所用的“有效量”术语，是指本发明的一种或多种胰岛素类似物用于治疗性地或预防性地降低或保持血糖水平所必要的剂量。通常这种剂量可以是每天从约10单位至高达约60单位或更高（或假定每毫克约29单位的，约0.3至约2mg）。但是，要明白，该胰岛素类似物的实际给药量应由医生按照有关的情况而决定，该情况包括要处置的条件（即，高血糖的起因），要给药的特定类似物，选择肠胃外的给药途径，年令，各个病人的体重和应答以及病人症状的严重程度。所以上述剂量范围不认为是以任何方式限制本发明的范围。

本发明胰岛素类似物是通过将含有至少一种表达式Ⅰ的胰岛素类似物的有效剂量与一种或多种可药用的赋形剂或载体相结合的药物组合物对病人以其所需剂量（即，患有高血糖的病人）给药。为此，药物组合物可以通常地制剂，以便含有每毫升约100单位或含有有效量胰岛素类似物的相似浓度。这些组合物通常实际是非肠道（虽然不是必须是）的，并可以通过现有技术中熟知的用于非肠道产品的普通赋形剂或载体所用的任何各种技术进行制备。例如，参见Remingtons Pharmaceutical Sciences，17th Edition，Mack Publishing Company，Easton，PA，USA（1985），在此引入该文作为参考。例如，非肠道给药的配剂可以通过将至少一种表达式Ⅰ的胰岛素类似物的要求量悬浮或溶解在一种适宜注射的无毒液态载体中，如一种含水介质，并消毒悬浮液或溶液。在给药前为混合的目的，可以提供附有小玻瓶或载体。对于非肠道所采用的药物组合物使用稀释剂，赋形剂，和载体，如水和水-可混的有机溶剂如甘油，芝麻油，花生油，含水的丙二醇，N，N′-二甲基甲酰胺等等。这些药物组合物的实例包括表达式Ⅰ胰岛素类似物的无菌的、等渗压的、盐水溶液，它可以用可药用的缓冲液缓冲而且是无热原的。另外，非肠道药物制剂可含有防腐剂，如，苯酚，或间-甲酚。也可以使用试剂，如氢氧化钠或盐酸，以调节最终产品的PH值。

本发明的胰岛素类似物也可以制备成为适宜于鼻内给药（intranasal administration）的药物组合物，这类组合物详细地公开于欧洲专利说明书EP 0200383 A3，该文在此引入作为参考。简单地说，这类组合物的配制是用一种或多种可药用的稀释剂，一种可药用量的碱金属盐，胺盐，或一种基本上无锌的胰岛素的游离酸，以及任选地至少一种吸收增强剂的吸收增强量，该增强剂选自下列试剂：（1）油酸或其酯或盐，（2）一种液态山梨聚糖脂肪酸酯，（3）一种液态山梨聚糖脂肪酸酯的聚氧乙烯衍生物，和（4）一种液态羟基聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物。

实施例Ⅷ

狗的研究

为了说明与常规的可溶性人胰岛素制剂（Humulin R ）相比较，胰岛素类似物Asp（B10），des（B27-30）人胰岛素和Asp（B10），des（B28-30）人胰岛素的皮下给药的效能以及快速作用，进行了以下研究。将体重10-12kg的雄性猎犬在研究之前和整个研究过程中保持其良好身体条件。将犬禁食16小时，但可饮水，以确保在胰岛素水平上防止所不希望的波动。在整个研究过程中，将犬用戊巴比妥钠麻醉，并加热铺垫保持其体温以使葡萄糖波动减至最小。将胰岛素试验样品（即，Asp（B10）des（B27-30）人胰岛素和Asp（B10）des（B28-30）人胰岛素配制成在Humulin R

所用的相同稀释剂中浓度为3.5mg/ml的制剂。在这些研究中基于重量，假定每个胰岛素类似物的低血糖能力相当于胰岛素，所以考虑这些试验溶液含有100单位/毫升。全部胰岛素测试溶液，取决于样品，都以每公斤0.1单位向每8只或10只狗的胁部外侧的表皮下面皮下注射给药。血样是在给药前的30、15、和0分钟时，以及在给药后的10，20，30，45，60，90，120，180和240分钟时进行采取。通过葡萄糖氧化酶法比色测定葡萄糖。对比研究的结果示于表Ⅶ。

表Ⅶ

血中的葡萄糖量：0时的%^（a）

时间 Asp(B10) Asp(B10)

(Min) Humulin R

des(B27-30)HI des(B28-30)HI

(n=8) (n=8) (n=10)

-30 102±1.6 92±2.1 103±2.9

-15 101±1.6 99±1.2 101±2.0

0 100 100 100

10 100±1.3 93±1.5 98±1.8

20 99±1.9 80±3.3 93±2.0

30 97±2.1 63±3.1 81±2.9

45 86±4.1 47±4.1 67±4.4

60 79±4.9 43±3.4 60±4.8

90 67±4.6 48±2.9 67±5.7

120 64±4.8 58±4.1 73±4.9

180 62±5.0 87±2.6 89±1.9

240 77±4.9 89±2.0 90±2.2

a血中葡萄糖量：平均值±S.E.M.

顺序表

(1)综合信息:

(ⅰ)申请人: Eli Lilly and Company

(ⅱ)发明名称: 胰岛素类似物

(ⅲ)顺序数: 2

(ⅳ)通讯地址:

(A)收件人: Mr. C. Mark Hudson

(B)街道: Erl Wood Manor

(C)市: Windlesham

(D)州: Surrey GU20 6PH

(E)国: Grande Bretagne

(F)ZIP:

(ⅴ)计算机可读方式:

(a)设备型号: Diskette, 3.50英寸, 1.0Mb贮存

(B)计算机: Macintosh

(c)操作***: Macintosh

(D)软件: Microsoft word

(ⅵ)本申请数据

(A)申请号:

(B)申请日:

(C)分类:

(ⅶ)优先申请数据:

(A)申请号

(B)申请日

(ⅷ)代理人信息

(A)姓名: Mr.C.Mark Hudson

(B)登记号: 307

(C)参考/索引号: x8620 EPO

(ⅸ)通讯信息:

(A)电话: 027678441

(B)传真: 858177

(C)电传:

(2)SEQ ID No:1 的信息:

(ⅰ)顺序特征:

(A)长度: 21个氨基酸

(B)类型: 氨基酸

(C)链型:

(D)拓朴结构: 线型

(ⅱ)分子类型: 多肽

(ⅸ)特性:

(A)名称/索引:各种位点

(B)位置:21

(C)鉴定方法:

(D)其它信息:"本氨基酸可以是Asn, Asp, Glu, Gln, Ala,

Gly 或Ser."

(ⅹⅰ)顺序描述: SEQ ID No:1

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln

1 5 10 15

Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa

20

(3)SEQ IDNo:2的信息:

(ⅰ)顺序特征:

(A)长度: 27个氨基酸

(B)类型: 氨基酸

(C)链型:

(D)拓朴结构: 线型

(ⅱ)分子类型: 多肽

(ⅸ)特性:

(A)名称/索引: 各种位点

(B)位置:1

(C)鉴定方法:

(D)其它信息:"本氨基酸是Phe或Asp"

(C)特性:

(C)名称/索引:各种位点

(C)位置:3

(C)鉴定方法:

(D)其它信息:"本氨基酸是Asn或Asp"

(ⅹⅰ)顺序描述: SEQ ID No:2:

Xaa Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu

1 5 10 15

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr

20 25

Claims

1、一种制备胰岛素类似物的方法，它包括将SEQ ID No：1适当交联到SEQ ID No：2上，其中，在SEQ ID No：1的位置21的Xaa选自Asn，Asp，Glu，Gln，Ala，Gly或Ser，在SEQ ID No：2的位置1的Xaa选自Asp或Phe，而在SEQ ID No：2的位置3的Xaa选自Asp或Asn。

2、按照权利要求1的方法，其中在SEQ ID No：1的位置21的Xaa是Asn.

3、按照权利要求2的方法，其中在SEQ ID No：2的位置1的Xaa是Phe.

4、按照权利要求3的方法，其中在SEQ ID No：2的位置3的Xaa是Asn.

5、一种制备胰岛素类似物的方法，它包括将SEQ ID No：1适当地交联到SEQ ID No：2的氨基酸残基1-26上，其中，在SEQ ID No：1的位置21的Xaa是选自Asn，Asp，Glu，Gln，Ala，Gly或Ser，在SEQ ID No：2的位置1的Xaa是选自Asp或Phe，而在SEQ ID No：2的位置3的Xaa是选自Asp或Asn.

6、按照权利要求5的方法，其中在SEQ ID No：1的位置21的Xaa是Asn.

7、按照权利要求6的方法，其中SEQ ID No：2的位置1的Xaa是Phe.

8、按照权利要求7的方法，其中SEQ ID No：2的位置3的Xaa是Asn.

9、一种制备药物制剂的方法，它包括将权利要求1-8的任一种胰岛素类似物与一种或多种可药用的载体、稀释剂或其赋形剂相混合。