CN1187447C

CN1187447C - Mpl配体类似物

Info

Publication number: CN1187447C
Application number: CNB988110547A
Authority: CN
Inventors: S·G·埃利奥特
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1997-09-11
Filing date: 1998-09-09
Publication date: 2005-02-02
Anticipated expiration: 2018-09-09
Also published as: HK1031397A1; TW528761B; CN1278866A; AU727978B2; AU9310398A; JP2001515719A; EP1012284A1; WO1999013076A1; CA2303480A1; US5989538A; KR20010023905A

Abstract

与天然mpl配体序列的对应序号氨基酸相比，本发明公开的mpl配体类似物具有1个或多个变化了的糖基化位点。本发明还涉及编码所述mpl配体类似物的DNA序列，用于类似物表达的重组质粒和宿主细胞，以及包括该类似物的治疗组合物。

Description

MPL配体类似物

发明领域

本发明涉及带有至少1个改变了的O-或N-连接糖基化位点的mpl配体类似物。本发明还涉及编码这些mpl配体类似物的DNA序列，以及重组质粒和表达类似物的宿主细胞。

发明背景

MGDF，或巨核细胞生长发育因子是新近克隆到的一种细胞因子，它似乎是循环***血小板水平的主要调节剂。见，Bartley，T.D.et al.，Cell 77：1117-1124(1994)；Lok，S.et al.，Nature 369：565-568(1994)；desauvage，F.J.et al.，Nature 369：533538(1994)；Miyazake，H.et al.，Exp.Hematol.22：838(1994)l；以及Kuter，D.J.et al.，PNAS USA，91：11104-11108(1994)。在Bartley，T.et al.，Cell 77：1117.1124(1994)的描述中MGDF又称为血小板生成素(TPO)、mpl配体和促巨细胞生成素(megapoietin)。本发明中，术语“mpl配体”一般是指能够活化mpl受体的所有多肽，包括TPO和MGDF。mpl受体是一种细胞表面蛋白，其活化时，能引发巨核细胞和血小板的生成和/或发育。见WO92/07074。

“mpl配体类似物”是不同于天然序列的多肽，能够影响羧基连接位点的数目、定位或类型。这类多肽是本发明的一个方面。成热的天然人mpl配体是一种全长为332个氨基酸的蛋白质。该蛋白的序列(连有一段长21个氨基酸的前导序列)及相应cDNA见本发明的图1(SEQ IDNos：1和2)。

现已发现，用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和大肠杆菌生产的重组mpl配体具有下述生物学活性：在小鼠、大鼠和猴子体内能特异性地激活或增加巨核细胞和/或血小板。见，例如，Hunt，P.et al.，Blood 84(10)：390A(1994)。被截短以致延伸至少151氨基酸的人mpl配体分子(从图1中第22位氨基酸起始)保留了体内生物活性。图2(SEQ ID Nos.：3和4)显示的是截短的mpl配体分子的一个实例，它以成熟形式存在，长174个氨基酸，具有生物活性。图2中，显示的是上述174个氨基酸的蛋白连接到一段长21个氨基酸N-端前导序列上。在下面的实施例中，该分子用来制备几种mpl配体类似物。其他类似物以图1中第1～199位、1～191位以及1～183位氨基酸为基础。去除人mpl配体成熟蛋白序列N-端的前6个氨基酸，仍可保留生物活性。因此，显然生物活性是保留在如图1所示的人mpl配体成熟氨基酸序列第7～151位氨基酸(两端点包括在内)中。

通常，真核细胞产生的许多细胞表面蛋白及分泌蛋白都修饰有1个或多个寡糖基团。这种修饰称为糖基化，它能显著地影响蛋白质的生理特性，而且还能在蛋白质的稳定分泌以及亚细胞定位中发挥重要作用。合适的糖基化对于生物活性是必不可少的。实际上，真核生物的一些基因在缺乏使蛋白糖基化的细胞处理过程的细菌中表达时，生成的蛋白由于没有进行糖基化因而几乎或根本不能恢复任何活性。

糖基化发生在多肽骨架的特定位置或位点上，O-连接寡糖被连接到丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基上，而N-连接的寡糖(侧链)则被连接到作为下列序列一部分的天冬酰胺(Asn)残基：Asn-X-Ser/Thr，其中X是除脯氨酸外的任一氨基酸。X优选是除脯氨酸外的19种天然氨基酸中的一种。发现N-连接和O-连接寡糖以及糖基的结构在每种类型中都是不同的。在两种连接中都常见的一种类型的糖基是N-乙酰神经氨酸(下称唾液酸)。通常，唾液酸是N-连接和O-连接寡糖的末端残基，由于它带有负电荷，所以可以赋予糖蛋白酸性。

本发明中使用的糖基化“位点”是指结构上能够连接糖基的氨基酸残基，尽管这类位点可能实际连接或不连接糖基。如上所述，O-连接位点是Ser或Thr残基，而N-连接位点是Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中的X为除脯氨酸外的任一氨基酸(优选为除脯氨酸外的19种天然氨基酸中的一种)。一个给定位点能否被糖基侧链糖基化取决于表达该分子的宿主细胞、该位点的邻近氨基酸以及其他因素。

如本发明所述，一种给定的mpl配体类似物连接的“侧链”的数目是一种具体宿主细胞表达的给定mpl配体分子所连接碳水化合物(即，糖基)侧链的平均数。值得注意的是，天然mpl配体和相应的重组mpl配体二者的糖基化位点通常是相等的，但是可能会由于用于重组表达的特定宿主细胞是否在同样的位点上连接了糖基侧链，而使侧链的数目与天然形式不同。其中，当在重组及天然mpl配体类似物之间进行对比时，无论天然生成的mpl配体长度如何，都要对相同数目的氨基酸进行比较。因此，“天然”是指具体物种(例如人)中出现的序列，而非该天然来源真正表达的分子的长度。

天然生成的mpl配体是一种糖基化分子。天然mpl配体的糖基化方式涉及mpl配体已发现的两个关键结构域。成熟的人mpl配体的前151个氨基酸序列为该分子的活性部分，与***(EPO)具有显著同源性，EPO是一种能刺激红细胞生成的细胞因子，因而上述序列被称为人mpl配体的“类EPO”结构域。在人mpl配体中，有6个包含在N-连接糖基化结构域中的N-连接糖基化位点。这两种结构域中都包含有O-连接糖基化位点。该分子中估计有12～14个O-连接糖基化侧链。CHO细胞重组表达人mpl配体DNA的实验结果表明，在类EPO结构域中至少有两个O-连接位点被糖基化，即第1位(Ser)和第37位(Thr)。

mpl配体等糖蛋白可以利用等电聚焦(IEF)等技术分离为不同的电荷形式。例如，已经有几个团体报道了粗制的以及特定纯化的***制备物的IEF实验(lukowsky et al.，J.Biochem.50：909(1972)；Shelton et al.，Biochem.Med.12：45(1975)；Fuhr et al.，Biochem.Biophy.Res.Comm.98：930(1981))。

尽管已经获得了上述有关mpl配体的信息，但是仍有需要制备具有不同糖基化形式的mpl配体分子，它们保留了或具有增强的生物活性。

因此，本发明的一个目的是提供称作mpl配体类似物的新型糖基化mpl配体分子。本发明的另一个目的是提供含有所述分子的药用组合物以及用本发明的mpl配体类似物治疗可被mpl配体治疗的疾病的方法。

发明概述

在一个实施方案中，本发明涉及包括一段具有下述特征的氨基酸序列的mpl配体类似物：即与相应的天然序列mpl配体相比，该序列至少增加1个、至少减少了1个以及/或者同时至少增加1个或至少减少1个糖基化位点。糖基化位点的增加或减少可能会导致与相应的天然序列mpl配体相比，具体地是与人mpl配体相比，碳水化合物侧链数目的增多或减少，以及唾液酸含量增大或减小。例如，一种类型的类似物可以涉及在同一或另一位置上删减1个或多个N-或O-连接位点，以及添加1个或多个N-或O-连接位点。

在上述实施方案的另一方面，本发明涉及包括一段具有下述特征的氨基酸序列的mpl配体类似物：即用1个或多个非天然生成位点取代1个或多个N-或O-连接的糖基化位点。因此，一个N-连接位点可以被另一个不同的N-连接位点取代；一种N-连接位点可以被一个O-连接位点取代；一种O-连接位点可以被另一个不同的O-连接位点取代；以及一种O-连接位点可以被一个N-连接位点取代。

本发明进一步还包括上述变化的任一组合。

本发明进一步包括编码所述mpl配体类似物的DNA序列，以及用于表达类似物的重组质粒和宿主细胞。

本发明的一个方面涉及一种mpl配体类似物，其中

(a)所述mpl配体包括一段氨基酸序列，该氨基酸序列为SEQ IDNO：1或其片段，至少由SEQ ID NO：1的7～151位氨基酸组成，至多由SEQ ID NO：1的1-332位氨基酸组成，

(b)所述mpl配体类似物在所述氨基酸序列上具有至少1个附加N-连接糖基化位点，所述的至少1个N-连接糖基化位点选自：

[Asn164]；

[Asn163]；以及

[Asn30，Thr32，Asn56，Asn120，Thr122，Asn164]，和

(c)所述mpl配体类似物具有能特异性刺激或增加巨核细胞及血小板的生物活性。

在上述的所有情况中，所述糖基化位点的变化都会导致得到的mpl配体类似物中糖基侧链数目、量、定位或类型的变化，而仍保留mpl配体的生物活性，即所述类似物还能活化mpl受体。mpl受体的活化意味着巨核细胞生成的加强从而导致体内血小板的增加。

本发明的另一方面涉及一种组合物，该组合物包括治疗有效量的上述任何一方面所述的mpl配体类似物以及药物学上可接受的稀释剂、佐剂或载体。

附图简述

图1显示的是原始的人mpl配体的DNA及氨基酸序列，该配体包括一段信号肽(从第-21～-1位氨基酸)和成熟形式的氨基酸序列(1-332)。

图2显示的是下述操作制备而成的mpl配体的DNA及氨基酸序列：把人成熟mpl配体序列第1-174位氨基酸连接到一段长21个氨基酸的信号肽上。上述序列位于编码区域的两侧，该编码区域中已经分别在5’和3’末端导入了XbaI和SalI克隆位点。

图3显示的是大肠杆菌以及CHO细胞表达的mpl配体的Western印迹结果。MK代表Met-Lys，大肠杆菌表达时它被加到mpl配体的N-末端，可以用组织蛋白酶C等二肽酶将其切去。MK已被去除的分子称为desMK。另外还标明了糖苷酶神经氨酸酶以及聚糖酶处理。

图4给出的是根据血小板量计算，大肠杆菌及CHO细胞表达的mpl配体在正常小鼠体内的生物活性。数据表明糖基化的mpl配体的活性(CHO表达的物质)比非糖基化形式(大肠杆菌表达的物质)强。这可能是由于糖基化物质的半衰期的延长引起的。例如，CHO332代表CHO细胞表达的人mpl配体氨基酸第1-332位(图1)。

图5显示的是对重组人mpl配体以及类似物4、6、7、9、10和11的COS细胞上清液进行Western印迹分析的结果。构建这些类似物的描述见实施例4。类似物4、7、10具有较慢的凝胶迁移率，所以它们具有至少1个附加碳水化合物链。类似物的序号与表1中提供的类似物序号对应(例如，11对应于类似物N11)。对照物是表1中的N1。

图6显示的是对重组人mpl配体以及类似物4、5、13、14和15的COS细胞上清液进行Western印迹分析的结果。构建这些类似物的描述见实施例4。类似物4、13、14和15具有较慢的凝胶迁移率，所以它们具有至少1个附加碳水化合物链。

图7显示的是人mpl配体的COS细胞上清液和标出的mpl配体类似物在N-聚糖酶处理后的Western印迹分析结果。结果表明这些类似物具有不同的糖基化特征。

图8给出的是用mpl配体类似物进行的人巨核细胞生长生物分析的结果。泳道A和D分别为阳性和阴性对照。泳道A显示的孔中接受了37.5pg野生型(即天然序列)mpl配体1-174 COS-1条件培养基，该孔表现出明显的巨核细胞生长。泳道D接受了1.5ul COS-1模拟条件培养基，不表现任何生长。图8中的泳道B和C分别为mpl配体1-174类似物7和10。泳道B接受了9.0pg mpl配体COS-1条件培养基，而泳道C接受了27Pg，而且这两者都表现出极好的巨核细胞生长。

图9显示的是对CHO mpl配体1-174及类似物N4和N15(见表1)进行Western印迹分析的结果。较慢的凝胶迁移表明类似物N4(4B)有1个附加寡糖而类似物N15(15-8)有2个附加寡糖。

图10显示的是对标示出的已用及未用N-聚糖酶处理的CHO细胞表达mpl配体类似物进行Western印迹分析的结果。用N-聚糖酶处理后凝胶迁移减慢表明存在着N-连接寡糖。

图11显示的是用不同剂量的各种形式mpl配体处理小鼠后其体内血小板计数。数据表明N-和/或O-连接碳水化合物量的增加可以导致体内活性的增强。

图12显示的是对COS细胞表达的mpl配体1-174以及类似物N10、N15、N33、N39、N31、N35和N40进行Western印迹分析的结果。添加的N-连接糖基化位点的数目也被标明。该图表明，由于增加N-连接碳水化合物的量，所以增加N-连接位点数目会减小mpl配体的迁移率。

图13显示的是对COS细胞表达的mpl配体1-174以及类似物N15、N29、N30和N38进行Western印迹分析的结果。N-连接糖基链的数目也被标明。

图14显示的是对CHO细胞表达的mpl配体1-174和1-199(N31)以及类似物N40和N43(见表8)进行Western印迹分析的结果。凝胶迁移表明N40和N43有相同数目的附加寡糖。

图15显示的是对CHO细胞表达的mpl配体1-174以及类似物N38、N41和N42进行Western印迹分析的结果。凝胶迁移表明每个类似物都有1个附加寡糖。

发明详述

本发明提供了糖基化位点与具有相应序列的天然mpl配体不同的mpl配体。优选地，得到的分子具有另外的糖基化位点，当在哺乳动物细胞(例如COS、CHO以及人细胞)中表达时，这些位点为糖基侧链所占据。

在第一个实施方案中，本发明涉及包括一段具有下述特征的氨基酸序列的mpl配体类似物：即与相应的天然序列mpl配体相比，该序列至少增加1个、至少减少了1个以及/或者同时至少增加1个或至少减少1个糖基化位点。糖基化位点的增加或减少可能会导致与相应的天然序列mpl配体相比，具体地是与人mpl配体相比，碳水化合物侧链数目的增多或减少，以及唾液酸含量增大或减小。同时增加1个和减少1个糖基化位点不会引起位点数目的净变化，而是导致位点的定位和/或类型的变化。这类同时变化的类似物也在本发明的范围之内。

上述实施方案的另一方面中，本发明涉及包括一段具有下述特征的氨基酸序列的mpl配体类似物：即用1个或多个非天然位点取代1个或多个N-或O-连接的糖基化位点。因此，一个N-连接位点可以被另一个不同的N-连接位点取代；一种N-连接位点可以被一个O-连接位点取代；一种O-连接位点可以被另一个不同的O-连接位点取代；以及/或者一种O-连接位点可以被一个N-连接位点取代。在基本同一位置上，用一种位点替代另一种位点可以提高该位点上的糖基化效率，或者其他效果。例如，本发明提供的证据，即用Thr残基取代Ser残基可以提高O-连接位点的糖基化效率。

本发明使用的术语“mpl配体”，包括天然生成的mpl配体、天然生成mpl配体的截短形式以及满足下列条件的非天然生成多肽：该多肽的氨基酸序列和糖基化与天然生成mpl配体之间的充分相同从而使其具有能特异性刺激巨核细胞和/或血小板生长、发育以及/或者产生的生物活性。优选以图1中至少第7～151位氨基酸，以至1～332位氨基酸为基础的mpl配体类似物。

在一个优选实施方案中，mpl配体是转染到真核宿主细胞中的外源DNA序列的表达产物。也就是说，在一个优选实施方案中，所述mpl配体是“重组mpl配体”。优选的真核宿主为哺乳动物，具体优选CHO细胞。根据本发明以及本发明所引用的有关mpl配体克隆和表达的文献中描述的方法，可以方便地生产出重组mpl配体。

另外一些优选的重组mpl配体分子具有下列以本发明图1为基础的氨基酸序列。

mpl配体1-332 氨基酸1-332图1

mpl配体1-199 氨基酸1-199图1

mpl配体1-191 氨基酸1-191图1

mpl配体1-183 氨基酸1-183图1

mpl配体1-174 氨基酸1-174图1

mpl配体1-163 氨基酸1-163图1

mpl配体1-153 氨基酸1-153图1

mpl配体1-152 氨基酸1-152图1

mpl配体1-151 氨基酸1-151图1

mpl配体7-332 氨基酸7-332图1

mpl配体7-199 氨基酸7-199图1

mpl配体7-191 氨基酸7-191图1

mpl配体7-183 氨基酸7-183图1

mpl配体7-174 氨基酸7-174图1

mpl配体7-163 氨基酸7-163图1

mpl配体7-153 氨基酸7-153图1

mpl配体7-152 氨基酸7-152图1

mpl配体7-151 氨基酸7-151图1

应该注意的是，例如，mpl配体1～183、1～191、7～183以及7～191包括C-端的1或2个附加的天然生成的糖基化位点。上述的每一种配体中，它们的N-端可以进一步包括Met-Lys。

本发明中提到的体外特异活性是对体外特异活性的相对测量值，而非体外特异活性的绝对测量值。有鉴于此，特异活性只用于对已用同一实验分析过的mpl配体类似物的相对活性进行比较，使用相同的条件包括同一种内置标准物，对用于计算特异活性的数据进行同样的分析。

本发明使用的“mpl配体的类似物”或“mpl配体类似物”是指具有下述特征的mpl配体：与mpl配体氨基酸序列有1处或多处不同，从而导致碳水化合物连接位点的类型(N-或O-连接，它们可以影响所连接的碳水化合物的量)、数目或定位发生变化。在一个优选实施例中，糖基化位点的变化导致该mpl配体分子上连接的糖基侧链的数目变化。在一个特别优选的实施例中，糖基化位点变化增加了至少1个(通常为1～6个，优选1～5个，特别优选2～4个)糖基侧链，而且最优选这个(或这些)糖基侧链增加的方式为N-连接。在另一个特别优选的实施例中，在用实验测量生物活性时，所述的mpl配体类似物至少保留了与天然序列的mpl配体(例如，人mpl配体)等效的体内生物活性，而且可能具有明显增强的体内活性。这类实验包括对巨核细胞或血小板的生成情况进行检测。

为了制备出这类mpl配体类似物，它们优选通过采用定点诱变引起氨基酸残基的添加、缺失或取代，从而导致糖基化位点的增加、减少或改变。“改变”是指在一个糖基化位点缺失的同时在所缺失位点的同一或另一个位置上添加了另一个位点。然而，本领域技术人员可以理解的是，其他方法也能得到编码同一种氨基酸序列的基因，这类方法也在本发明范围之内。与天然人/重组mpl配体相比，这样得到的类似物可以有更少或更多(优选更多)的被连接的碳水化合物侧链。

向mpl配体上添加1个或多个碳水化合物(即糖基)侧链是本发明的一个重要目的。通过添加糖基化位点但不破坏二级或三级结构，可以制备出碳水化合物侧链比相应的天然氨基酸序列(例如1～332或1～174)更多的mpl配体类似物，二级或三级结构的破坏会明显地减弱生物活性。本发明中使用的“天然生成的”mpl配体是指与相关类似物具有相应数目氨基酸的氨基酸序列，即使这些种类的mpl配体的具体长度实际上在天然物种中是无法表达的。有利的是，mpl配体可以有多达6个的另外的N-糖基化或O-糖基化位点，从而可以添加1～6个另外的N-连接或O-连接糖基化侧链(或其组合)。

例如，第30位上的Pro被Asn取代以及第32位上的Val被Thr取代得到序列Asn-Glu-Thr，该序列可以作为一个新的N-糖基化位点(下面的类似物N4，见表1)。还可以通过组合突变的方式，构建具有2个或多个另外的N-连接侧链的类似物；例如，组合表1中描述的类似物N4和N10可以生产出一种具有两个碳水化合物添加位点的类似物(即，表1中的类似物N15)。可以用类似的方式构建具有3个或多个添加侧链的类似物。本领域技术人员可以理解的是，本发明包括许多其他的具有不同糖基化位点(就位点的数目、类型或定位而言)的mpl配体类似物。所有情况下，本发明中所述的mpl配体类似物都特别优选以具有人氨基酸序列的mpl配体(见图1和2)为基础；但是，以其他物种(例如狗、猪、猴、小鼠或大鼠)的mpl配体序列为基础的类似物也在本发明的考虑范围之内。

***氨基酸制备糖基化位点也被考虑。例如，如同下面显示的那样，第57位上的Glu被Thr取代，在紧靠第55位Met的后面***Asn：

-Gln-Met-Glu-Glu-Thr-

54 55 56 57 58

→

-Gln-Met-Asn-Glu-Thr-Thr-

54 55 55″56 57 58

这样就添加了一个新的糖基化位点(第55’、56和57位氨基酸)。见下述类似物N23。

本发明的类似物还包括从mpl配体的羧基末端向外延伸1个或多个氨基酸得到的类似物，其中羧基末端的延伸可以提供至少1个另外的糖基化位点。mpl配体的羧基末端将随所用的mpl配体具体形式(例如，mpl配体第1～332位氨基酸，或mpl配体第1～163位氨基酸)而发生变化。可以通过向羧基末端添加含有1个或多个N-或O-连接糖基化位点的氨基酸，在mpl配体的羧基末端上添加一个另外的糖基化位点。

表1和6中列出了一些典型的mpl配体类似物，它们具有附加的N-连接碳水化合物侧链连接位点。为了制备N-连接位点，这些类似物具有Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列，该序列被包含在以人氨基酸序列为基础的人mpl配体多肽的各种位置。表4和7列出的是添加了至少1个另外的N-连接碳水化合物侧链的类似物，见这些糖蛋白在SDS凝胶上迁移的实验结果(见，实施例6以及图3、5、6、7、9、10、12和13)。注意这些表中还包括了一些不是本发明所定义的“类似物”的截短形式(即，N1、N16、N17和31)。将它们列于表中是为了显示各种截短形式是如何制备的。

本发明还包括编码本发明公开的mpl配体类似物的DNA序列，优选编码具有另外的N-连接侧链连接位点的类似物的DNA序列。实施例4和14中公开的方法可以用于把变化导入mpl配体DNA序列，从而制备、缺失和/或改变碳水化合物的连接位点。

这些mpl配体类似物可以是外源DNA序列的表达产物，即通过重组DNA技术生产的，它们也可以是化学合成产物或它们可以通过联合方法制备。外源DNA序列包括编码mpl配体类似物的cDNA、基因组DNA或化学合成DNA。另外还提供了用于表达这类类似物的重组DNA质粒和真核宿主细胞。表达载体包括能够在真核宿主细胞中表达克隆的DNA序列的任何载体，具体是那些在COS和CHO细胞中表达时使用的载体。这类载体的实例包括质粒pDSRα和pDSRα2，参见Mol.Cell.Biol.8：466-472(1988)；WO91/13160(1991)；以及WO90/14363(1990)。表达mpl配体类似物的COS及CHO细胞的培养按照本领域技术人员已知的标准方法进行。

改变mpl配体上连接的碳水化合物侧链的数目、类型、定位或量，可以赋予其有利的特性，例如增加稳定性、增强对蛋白质水解的抗性、减弱免疫原性、延长血清半衰期以及增强或改变生物活性。

对来自表达mpl配体类似物N2～N15(N1是人mpl配体1～174)的COS细胞的条件培养基(conditioned media)进行体外生物活性测试，结果见表4。

对来自表达mpl配体类似物/截短形式N15～N40的COS的条件培养基进行体外生物活性测试，结果见表7。

各种形式的体内生物活性的结果列于图11(见实施例11)。本发明的另一个实施方案涉及哺乳动物(例如，中国仓鼠卵巢，CHO)宿主细胞，该宿主细胞优先合成每个分子连接着比特定量更多的唾液酸的mpl配体或mpl配体类似物，例如比真核细胞中天然或重组生成的下列分子中发现的唾液酸含量更大：mpl配体1～332、1～199、1～191、1～183、1～174、1～163、1～153、1～152或1～151。类似物N4及N15的体外活性，与在CHO细胞中表达的全长以及各种截短形式一并显示于表5。

mpl配体分子的唾液酸含量可以影响它的体内生物活性。例如，四触角(4个侧链)N-连接寡糖通常多数会提供4个可能的唾液酸连接位点，而可以在天冬氨酸-连接位点上替换四触角形式的二触角及三触角寡糖，通常几乎只连接有2或3个唾液酸。O-连接位点通常提供2个唾液酸连接位点。因此，如果N-连接寡糖是四触角的，用N-连接碳水化合物替代O-连接碳水化合物的mpl配体分子，则可以在每个侧链上再供给2个另外的唾液酸。从哺乳动物细胞培养物中筛选出具有下述特征的细胞：这些细胞优选向重组mpl配体上添加四触角侧链从而使唾液酸连接位点的数目达到最大。

通常，用二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞作为宿主细胞，用于生产包括重组mpl配体在内的糖蛋白。

本发明进一步还包括组合物，该组合物包括治疗有效量的mpl配体类似物，以及与其配套的有益于mpl配体治疗的一种合适稀释剂、佐剂和/或载体。本发明中使用的“治疗有效量”是指能为特定病症提供治疗效果的用量以及服用方案。

本发明的组合物可以采用肠道外***给药，替代地，该组合物可以静脉内或皮下给药。当***给药时，本发明使用的治疗组合物可以采取无热源肠道外可接受水溶液的形式。这类药用可接受蛋白溶液的制备，并对pH、等渗性、稳定性等因素给予适当考虑，这些都在本领域技术人员掌握的范围之内。选择的特定途径取决于所治疗的病症。mpl配体或mpl配体类似物的施用优选作为制剂的一部分进行，该制剂包括一种合适的载体，例如人血清白蛋白，一种合适的稀释剂，例如缓冲盐溶液，以及/或者一种合适的佐剂。所需剂量为足以能升高患者血小板水平的用量，而且所需剂量要根据所治疗病症的严重程度、选用的用药方法等进行调整。

本发明所述的方法和组合物可用来治疗下述病症，即存在巨核细胞/血小板缺陷或者可以预料到以后会出现巨核细胞/血小板缺陷(例如，由于计划的外科手术)的病症。这些组合物和方法也可以用于增加个体中循环***血小板数目，增加供体可获得血小板的数目。通常，这类病症起因于体内活性mpl配体的缺陷(暂时或长久)。血小板缺陷的通用术语是血小板减少，因此本发明的方法和组合物通常可用于治疗血小板减少。

血小板减少(血小板缺陷)可以有多种起因，包括化疗、骨髓移植、以及其他使用多种药物的治疗、放疗、手术、突发性失血以及其他特定病症。涉及血小板减少并且可以根据本发明进行治疗的疾病有：再生障碍性贫血、自发性血小板减少、会导致血小板减少的转移性肿瘤、全身性红斑狼疮、脾肿大、范科尼综合症、维生素B12缺乏症、叶酸缺乏症、May-Hegglin异常、维一奥二氏综合症、以及阵发性睡眠性血红蛋白尿。另外，对于AIDS的某些治疗也会导致血小板减少(例如，AZT)。某些伤口愈合异常也可受益于血小板数目的增加。

当预先考虑到血小板要减少时，例如由于即将进行的手术或即将进行的能引发血小板减少的治疗，可以在需要血小板前几天至几小时施用本发明中的一种mpl配体类似物。当发生紧急情况时，例如突发性大出血，可以将一种mpl配体类似物与血液或纯化血小板一起施用。

用于治疗上述病症的方法中涉及的给药方案由临床医师考虑各种能改变药物作用的因素后决定，例如，患者的年龄、病情、体重、性别及饮食，感染的严重程度，用药时间以及其他临床因素。通常，mpl配体类似物的日用量应该为0.01～1000mg/kg(体重)，优选0.1～10mg/kg(体重)。

本发明所述的治疗方法、组合物以及多肽也可以单独使用，或者与其他细胞因子、可溶性mpl(即mpl配体)受体、生血因子、白细胞介素、生长因子或抗体配合使用，治疗以血小板减少以及其他症状为特征的疾病。在预料之中的是，mpl配体类似物分子与IL-3、GM-CSF等通用的血小板减少刺激剂配合使用，证明可以有效地治疗一些形式的血小板减少。其他的巨核细胞刺激因子，即meg-CSF、干细胞生长因子(SCF)、白细胞抑制因子(LIF)、制瘤素M(OSM)或其他具有巨核细胞刺激活性的分子也可以与mpl配体一起使用。其他典型的细胞因子或生血因子包括IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、集落刺激因子-1(CSF-1)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、EPO、干扰素-α(IFN-α)、IFN-β或IFN-γ。另外，同时或随后施用有效量的可溶性哺乳动物mpl受体也有益处，该受体具有下述功效：待巨核细胞一旦成熟，便将其破碎成为血小板。因此，预想在施用mpl配体类似物(增加成熟巨核细胞的数目)后再施用可溶性mpl受体(灭活类似物以及让成熟的巨核细胞生成血小板)是一种特别有效的刺激血小板生成的方式。可以对上面列出的剂量进行调整以补偿所述治疗组合物中的同类的其他成分。可以用常规方法监测接受治疗患者病情的发展情况。

也可以对本发明类似物进行其他修饰，例如，增强活性、稳定性、延长半衰期等。例如，可以通过蛋白质上的氨基或羧基把pegylation(多-或单-)加到mpl配体类似物上。另外，也可以把脂肪酸或其他聚合体连接到蛋白质或糖基上。

提供下面的实施例是为了更充分说明本发明，而非用来限制本发明的范围。实施例中生物分析使用的mpl配体标准物是一种重组的mpl配体标准物，该标准物在大肠杆菌中表达，然后重折叠成一种活性构象并经纯化。因此，测量的只是相对的特异性活性。

实施例1

mpl配体1-174的构建

用聚合酶链反应(PCR)从人胎儿肝细胞cDNA文库中制备出编码图2中第1～174位氨基酸(从S-P-A-P-P-A…)的人mpl配体基因(Bartleyet al.，cell 77：1117-1124(1994))。5’端PCR引物编码人mpl配体的氨基末端、一个Xba I位点以及一段最佳的Kozak序列。3’端引物含有一个终止密码子和一个SalI限制酶切位点。用Xba I和Sal I消化扩增得到的DNA片段，然后将其连接到已经用Xba I和Sal I消化过的pDSRα2中。将得到的质粒，pDSRα2 mpl配体1～174用于哺乳动物细胞的表达。得到的基因的序列(包括信号肽在内)见图2。

用限制性内切酶Xba I和Sal I消化含有mpl配体1～174的质粒DNA，将消化得到的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，用GeneClean^TM试剂盒和厂商提供的方法(BIO 101，INC.)把长为605nt的mpl配体1～174 DNA片段从凝胶中分离出来。再用限制性内切酶Xba I和Sal I消化WO90/14363中描述的质粒pDSRα2，回收载体片段。连接上述两个片段，得到pDSRα2(mpl配体1～174)。

实施例2

mpl配体1～174在CHO细胞中的表达及纯化

用pDSRα2-mpl配体1～174转化二氢叶酸还原酶缺陷(DHFR-)的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在感染的前一天，用生长在CHO D-培养基(DMEM，10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素/谷氨酰胺、1％非必需氨基酸(Gibco)和1％HT添加物)中的1×10⁶CHO DHFR-细胞铺板在100mm组织培养皿中。共进行4组感染。对于每组感染，用Pvu I和缓冲液H(Boehringer Mannheim)把质粒DNA(50μg)消化成线性。然后形成DNA沉淀，按照哺乳动物细胞转染试剂盒(Speciality Media)的说明将其滴加到平板上。在组织培养箱中温育24小时后，用新鲜的CHOD^-培养基替换已用的培养基。24小时后，按每孔100μl CHO选择培养基(D-MEM、5％透析过的胎牛血清、1％青霉素/链霉素/谷氨酰胺、1％非必需氨基酸(Gibco))将细胞分布到96孔组织培养板中，选择转化体。每周更换培养基直至克隆出现。2周后，用下面描述的32D细胞增殖实验(见实施例9)对mpl配体表达进行筛选。将那些表达量超过1×10⁵单位/ml的克隆扩大培养，并低温冻存。将一个克隆转瓶扩大培养，收获大约8升的条件培养基(conditioned medium)。

如上所述，用含有mpl配体1～174 cDNA的质粒pDSRα2转染DHFR-缺陷CHO细胞。从以表达mpl配体1～174的CHO细胞为种子培养物的转瓶中取2升无血清CHO细胞条件培养基(50％ DMEM、50％HAMS-F12，1％青霉素/链霉素/谷氨酸盐、1％非必需氨基酸(Gibco))，用2L Amicon Model 2000型细胞涡旋器以及10,000道尔顿分子量的截留膜(YM10，Amicon)将上述培养基浓缩15倍。然后，取45ml浓缩后的条件培养基，用Pharmacia快速蛋白液相层析(FPLC)以0.4ml/min的流速直接加样到4ml hu-MPL-X亲和柱上。亲和柱通过按照厂商的建议在每毫升Pharmacia CNBr活化的琼脂糖树脂上偶合1.5～2.5mg mpl-X(mpl受体的可溶性胞外结构域)构建而成。加样后，用16ml磷酸盐缓冲液(PBS；10mM Na·PO₄ pH 6.8/150mM NaCl)洗涤柱体，然后再用10mM Tris，pH 8.0/1M NaCl洗涤。用40ml 20mMCAPS(3-[环己基氨基]-1丙磺酸)pH 10.5/1M NaCl/5mM CHAPS(3-[(3-Cholamidopropyl)二甲基胺]-1-丙磺酸盐)将mpl配体(1～174)洗脱到6ml的级分中。第二个级分在14％SDS凝胶上只产生1个条带。浓缩该物质，并用0.9％NaCl盐溶液缓冲置换，使之在体外及体内均具有生物活性。以类似方式纯化表达mpl配体的其他形式的CHO细胞。

实施例3

重组人mpl配体的体内生物活性

对用各种形式mpl配体处理过的小鼠进行血小板计数。生产出CHO-表达的mpl配体1～332、1～174、1～163和1～153，用常规层析技术进行纯化。

图4显示的是用各种形式CHO细胞表达的(实线)或大肠杆菌表达的(虚线)重组人mpl配体处理过的小鼠的血小板计数结果。连续5天用标明浓度的mpl配体皮下注射正常雌性Balb/c小鼠。最后一次注射后24小时，收集取自尾静脉上一个小的侧向切口的血样。用Sysmex电子血细胞分析仪(Baxter Diagnostics，Inc.Irvine，CA)进行血细胞测试。数据表示为4个动物测定数值的平均值±平均标准误差。其他血细胞参数，例如白细胞总数或红细胞总数都末受这些处理的影响(数据未显示)。

结果表明，CHO细胞表达的mpl配体相对于大肠杆菌中表达的同一形式的mpl配体体内活性更强。如实施例6中所述，CHO细胞表达的mpl配体都含有N和/或O-连接碳水化合物，而大肠杆菌表达的mpl配体则不含有。这一结果表明碳水化合物能够增强mpl配体的体内活性。碳水化合物赋予的增强了的体内活性可能是由于循环***半衰期的延长、稳定性的增强或者二者兼而有之引起的。

实施例4

mpl配体类似物N2～N15的构建

下面描述了用于制备mpl配体上附加糖基化位点的方法。

合成下列寡核苷酸引物用于体外诱变制备类似物N2～N14(这些类似物的构建见表1)：

N2-CCCATGTCAATCACAGCAGACT SEQ ID NO.：5

N3-CTTCACAGCAACCTGAGCCAGT SEQ ID NO.：6

N4-CAGTGCAACGAGACCCACCCTTTG SEQ ID NO.：7

N5-GCCTACAAATGTCACGCTGCCTGCT SEQ ID NO.：8

N6-CCCACTTGTAACTCATCCCTC SEQ ID NO.：9

N7-CAACTGAACGCCACTTGTCTCTCA SEQ ID NO.：10

N8-ACTTGTCTCAACTCCACCCTGGGGGA SEQ ID NO.：11

N9-CTCCTGGGGAACCTTTCTGGA SEQ ID NO.：12

N10-GACCACAAATCACACCGATCCCAAT SEQ ID NO.：13

N11-ACCCTTTGTCTACAAATGTCACGCTGCCTGCT SEQ ID NO.：14

N12-TCTCTCAAACCTCACGGGGGAGCTT SEQ ID NO.：15

N13-TGGAAAAATCAGACGGAGGAGAC SEQ ID NO.：16

N14-TGGAGGAGAACAAGACACAGGACAT SEQ ID NO.：17

为了构建m13mp18 mpl配体1～174，将图2中的基因导入到用XbaI和Sal I消化过的m13mp18 DNA中。按照Kunkel et al.，methods inenzymol.154：367(1987)以及Messing，methods in enzymol.101：20(1983)中描述的方法，从被m13mp18(mpl配体1～174)感染过的大肠杆菌RZ1032株的上清液中回收单链DNA。取单链DNA约0.5μg和上述的一种合成引物0.125pM，将其与6μl缓冲液(250mM Tris pH 7.8，50mM MgCl₂，50mM二硫苏糖醇和1％牛血清白蛋白(BSA-Pharmacia))混合用于体外诱变。在加入以前先用ATP和T4多核苷酸激酶对上述引物进行激酶化。用水将反应体积调至10μl，将混合物65℃加热5分钟后再让其冷却至室温，以使引物与模板之间发生退火。在延长反应中，dTTP，dATP，dGTP和dCTP每种各加入2.5μl和1mlATP(浓度都为10uM)，随后加入1μl(1单位)大肠杆菌DNA聚合酶(Klenow片段)和1μl(1单位)T4 DNA连接酶。然后按照文献(Messing，上述)中描述的方法，将混合物在14℃下温育过夜后，用于转化大肠杆菌JM109株(Yanisch-Perron et al.Gene 33，103(1985))。

为了用示差杂交法对突变体克隆进行鉴定，将营养琼脂上的噬斑转移到Gene Screen滤膜(New England Nuclear)上。采用自动交连的模式(Stratagene)用UV Stratalinker Model 1800对它们进行照射，从而使DNA交连到滤膜上。然后将其置于含1％ SDS的6x SSC(0.9MNaCl/0.09M柠檬酸钠)中60℃下温育1小时。在杂交反应中，用T4多核苷酸激酶和γ32p-标记的ATP对上述寡核苷酸引物进行末端标记，然后将其与滤膜一起温育在6x SSC，0.5％ SDS和125ug/ml鲱精DNA中。根据寡核苷酸熔点的估计值，选定杂交温度。通常，杂交温度为比熔点低约10℃。第二天，在杂交温度下用6X SSC/l％ SDS洗涤滤膜两遍，随后再在杂交温度下用6X SSC洗涤两遍，然后进行放射自显影。如有必要，随后再在较高的温度下用6X SSC洗涤滤膜直到具有野生型mpl配体cDNA序列的噬斑上几乎或根本检测不到杂交为止。鉴定出这些情况下呈现阳性杂交信号的克隆，并将其再转染JM109，从而分离出纯的克隆。双脱氧链终止法测序实验的结果表明有突变体存在。

从按照厂商提供的方法用QIAGEN试剂盒(Chatsworth CA.)转染的JM109中回收带有期望变化的双链m13 mpl配体1-174 DNAs。用XbaI和SalI消化上述DNAs，分离得到长为605bp的mpl配体DNA片段。用XbaI和SalI消化pDSRα2。分离载体片段，并将其与上述的mpl配体片段连接。用限制性酶切实验对重组质粒进行鉴定。得到的质粒(命名为mpl配体1-174-NX，其中的NX是类似物的序号)含有编码mpl配体类似物的DNA，该类似物在指定位置上发生了氨基酸残基的变化。对目的质粒再次测序以确定期望突变的存在。

构建的类似物N15在第30位和第120位残基上具有两个附加的N-连接糖基化位点。用XbaI和PstI限制性内切酶消化含有Asn30和Thr32突变的PDSRα2 mpl配体174-N4，分离得到长约385nt的DNA片段。用PstI和SalI消化含有Asn120和Thr122突变的PDSRα2mpl配体174-N10，分离分离得到长约220nt的DNA片段。用XbaI和SalI消化pDSRα2。分离载体片段，并将其与上述的mpl配体片段相连接。在所得到的PDSRα2mpl配体174-N15中含有Asn30、Thr32、Asn120以及Thr122取代。

用常规方法构建表1中所示的mpl配体类似物。每个类似物的DNA序列变化全部列出；同时用于诱变的寡核苷酸引物的序列与人mpl配体的序列互补。

表1类似物/种类No. 氨基酸的取代序列变化

N1 (1-174)；Pro¹⁷⁵→Gly³³²缺失 CCA→TGA(终止密码子)

N2 Leu²²→Asn²² CCT→AAT

N3 Arg²⁵→Asn²⁵ AGA→AAC

N4 Pro³⁰，Val³²→Asn³⁰，Thr³² CCA，GTT→AAC，ACC

N5 Pro³⁸，Leu⁴⁰→Asn³⁸，Thr⁴⁰ CCT，CTG→AAT，ACG

N6 Leu⁸⁶→Asn⁸⁶ CTC→AAC

N7 Gly⁸²，Pro⁸³→Asn⁸²，Ala⁸³ GGA，CCC→AAC，GCC

N8 Ser⁸⁷，Leu⁸⁹→Asn⁸⁷，Thr⁸⁹ TCA，CTC→AAC，ACC

N9 Gln⁹²→Asn⁹² CAG→AAC

N10 Ala¹²⁰，Lys¹²²→Asn¹²⁰，Thr¹²² GCT，AAG→AAT，ACC

N11 Pro³⁶，Pro³⁸，Leu⁴⁰→Ser³⁶，Asn³⁸，Thr⁴⁰ CCT，CCT，CTG→TCT，AAT，A

CG

N12 Ser⁸⁸，Leu⁹⁰→Asn⁸⁸，Thr⁹⁰ TCC，CTG→AAC，ACG

N13 Thr⁵³，Met⁵⁵→Asn⁵³，Thr⁵⁵ ACC，ATG→AAT，ACG

N14 Thr⁵⁸，Ala⁶⁰→Asn⁵⁸，Thr⁶⁰ ACC，GCA→AAC，ACA

N15 Pro³⁰，Val³²，Ala¹²⁰，Lys¹²²→Asn³⁰，Thr³²，As CCA，GTT，GCT，AAG→AAC，

n¹²⁰，Thr¹²² ACC，AAT，ACC

注意：在本发明中类似物N2-N15也可以同义地称为类似物2-15。另外，本发明中使用的，例如，[Asn22]mpl类似物是指所考虑的特定mpl配体的第22位残基被天冬酰胺所取代，所述的mpl配体优选至少含有图1中的第7-151位氨基酸的人序列(包括上述的优选人mpl配体序列)。因此，用天冬酰胺取代mpl配体1-174(人序列)第22位上的亮氨酸生成的mpl配体类似物可被表示为[Asn22]mpl配体1-174。

通过把mpl配体DNA***到pDSRα2中，构建出被称为pDSRα21-174-NX(其中的NX是类似物的序号)的质粒。表达载体pDSRα2的一般描述见WO90/14363(1990)。用XbaI和SalI消化质粒pDSRα2，制备质粒pDSRα2mpl配体1-174-NX。分离载体片段，并将其与长为605bp的含期望序列的片段相连接。

实施例5

在COS细胞中表达mpl配体和mpl配体N1-N15

通过电穿孔，把表1中描述的人mpl配体以及mpl配体类似物cDNA克隆转化到COS-1细胞(ATCC No.CRL-1650)中。用培养基(含10％胎牛血清和1％L-谷氨酸盐/青霉素/链霉素的Dulbecco改良基本培养基(Irvine Scientific))洗涤半汇合培养皿(semi-confluent dishes)收获COS-1细胞，并将其以6×10⁶细胞/ml的浓度重悬。将0.5ml细胞转移到0.2cm的电穿孔小管(Bio-Rad)中，然后在650uF及130伏的低电压下用BTX电穿孔***E1ectrocell操作仪用50μg编码mpl配体类似物的质粒DNA进行电穿孔。用10ml培养基将电穿孔后的细胞铺板于100mm组织培养皿上。铺板后20～24小时，用10ml新鲜培养基替换上述培养基。电穿孔后3～5天，收集条件培养基。

实施例6

Mpl配体以及Mpl配体N1-N15的特性

A.碳水化合物添加的测定

室温下，用兔抗-mpl配体多克隆抗体免疫沉淀含有约30-60ng mpl配体或mpl配体类似物的大量上清液，所述配体或配体类似物来自按照实施例5中描述的方法用mpl配体类似物cDNAs转染的COS细胞。某些情况下，其中的表达水平较低，所以将约8～9ml的最大体积用于免疫沉淀。制备抗mpl配体1-163的抗体，该配体已在大肠杆菌中表达并纯化。向免疫沉淀反应物中加入含有0.1％叠氮钠的蛋白质A-琼脂糖凝胶1∶1磷酸盐缓冲液(PBS)30μl，室温温育1小时。离心上述样品，用PBS洗涤，然后重悬于SDS样品缓冲液(0.125M Tris-HCl pH6.8/4％SDS/20％甘油/10％ β巯基乙醇/0.001％溴酚蓝)中。用12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对样品进行分析，并将其转移到硝酸纤维素膜上，然后用抗合成mpl配体多肽(例如，对应于图1中所示第47～62位残基的多肽)的鼠抗-mpl配体单克隆抗体按照文献(Burnette et al.，Anal.Biochem.112：195-203(1981)；Elliott et al.，Gene 79：167-180(1989))中描述的方法进行Western分析。用ECL试剂盒(Arnersham)对含mpl配体的条带进行显色。

图5显示，与人序列的mpl配体174(N1)相比，来自用类似物N4、N7和N10 DNA转染细胞的COS细胞上清液中的分子更大。图6表明，来自用类似物N13、N14和N4 DNA转染细胞的COSA细胞上清液中的分子也比人序列的mpl配体更大。这种分子大小的增大表明有附加N-连接碳水化合物链的存在。N15含两个附加N-连接糖基化位点。图6表明这种类似物比只含1个附加N-连接糖基化物的类似物要大。蛋白质的大小是从它们在SDS-PAGE上相对于分子量已知的蛋白标准物的迁移率估算出来的。从图6中计算出来的较大条带的大小估算值显示于表2中。这一结果表明N15中含有2个附加的N-连接链。其他选定类似物的western印迹分析结果也显示于图6中。

表2

N-连接碳水化合物的估算值

Mpl配体类似物分子量分子量变化(Da) 可能的N-连接链的数目(1-174) (Da) (与天然配体比较) (@4 KDa/位点)
	N1(天然) 23500 0 0N4 28700 5200 1N7 27200 3700 1N10 27200 3700 1N13 26700 3200 1N14 28700 5200 1N15 33500 10000 2

进行的实验表明mpl配体类似物大小的增加是由于N-连接碳水化合物的添加引起的。按照上述方法，对含有mpl配体的COS细胞条件培养基进行免疫沉淀，用PBS洗涤。然后，向每个试管中加入0.5％ SDS10μl，并且将所有样品煮沸3分钟。然后，加入下列成分：10.8μl 0.5MNaPO₄ PH 8.6、5ml 7.5％NP40以及3ul 250单位/ml N-聚糖酶(Genzyme)。N-聚糖酶的处理能够除去N-连接碳水化合物。将样品在37℃下温育6小时。加入SDS-PAGE加样缓冲液终止反应，然后按照上述方法，使用抗-mpl配体单克隆抗体和抗-鼠ECL western检测试剂盒(Amersham)来进行SDS-PAGE Western分析(12％丙烯酰胺)。用该方法对人mpl配体和mpl配体类似物进行N-连接链分析的结果见图7。用N-聚糖酶处理后，N4、N7和N10在Western印迹中的迁移率都减小到N1的水平。正如预想的那样，由于N1上没有任何附加的N-连接碳水化合物位点，所以用N-聚糖酶处理N1后对其迁移率没有任何影响。这些结果表明表观分子量的增加是由于N-连接碳水化合物的添加引起的

B.对mpl配体上的O-连接碳水化合物的分析

为了分析O-连接碳水化合物对人mpl配体的影响，用上述方法从CHO细胞条件培养基中纯化出各种形式的蛋白质。每一形式都用O-聚糖酶(糖肽α-N-乙酰半乳糖-aminidase，Oxford GlycoSystems)进行+/-处理。O-聚糖酶从糖蛋白中除去O-连接的碳水化合物。每种形式的大肠杆菌表达产物用作未糖基化对照。为了确定O-连接碳水化合物对分子量的不同影响，需要首先除去N-连接碳水化合物。由于全长形式mpl配体1-332中含有N-连接碳水化合物，所以对CHO细胞表达的全长样品进行N-聚糖酶处理，具体操作除N-聚糖酶处理过夜温育外其他与对上述COS细胞表达的mpl配体类似物的处理相同。

在用O-聚糖酶对全长(1-332)mpl配体处理之前，先用1/15体积的100mM、pH2.2乙酸将样品的范围调至pH6.0～pH7.0。取1毫克蛋白质置于SDS中变性煮沸3分钟，然后在1mM、pH6.8乙酸钙以及20mM、pH6.8磷酸钠中用1U/ml神经氨酸酶(唾液酸酶，来自产脲节杆菌，Boehringer Mannheirn)37℃温育60分钟。

随后，在100μl的终体积中加入5mU的酶进行O-聚糖酶处理，37℃温育过夜。SDS-PAGE(15％丙烯酰胺)分离蛋白质(0.2μg/泳道)。然后将其转移到0.2μm硝酸纤维素膜上，用抗-mpl配体的多克隆抗体过夜温育，用抗-鼠ECL Western检测试剂盒(Arnersham)观察mpl配体蛋白。

图3显示的是4种不同形式的人mpl配体的Western印迹结果。泳道1～3为全长的mpl配体1-332，泳道4～6为mpl配体1-174，泳道7～9为mpl配体1-163，泳道10～12为mpl配体1-153。用神经氨酸酶和O-聚糖酶处理后，泳道2、5、8和11都显示其中的分子量都减小到与泳道3、6、9和12中末糖基化物质相同的水平。所有的情况下，迁移率增加到大肠杆菌表达的非糖基化形式的水平。这些结果表明泳道1、4、7中的条带较大是由于O-连接碳水化合物引起的。每个条带分子量都是通过与分子量已知蛋白质的迁移率比较估算得到的。

从显示不同蛋白质的分子量估算值的表3中的内容可以看出，迁移率的表观变化可以从mpl配体1-332上的14条、mpl配体1-174上的9条、mpl配体1-163上的4条、mpl配体1-153上的2条O-连接碳水化合物链(每条链约为950Da)中得到解释。泳道2中的样品为全长mpl配体1-332。这种蛋白质出现了降解，可能是由于37℃下糖基化酶的过度温育引起的。因此，泳道3中的大肠杆菌表达的非糖基化形式被用来计算添加到CHO细胞表达的mpl配体1-332上的O-连接碳水化合物的近似分子量。

这些结果与被测试的mpl配体的所有CHO细胞表达形式中存在碳水化合物一致。用单糖组成直接分析确证了CHO细胞表达的mpl配体1-332、1-174以及1-163上存在着O-连接碳水化合物。通过酸水解，从糖蛋白中释放出唾液酸、GalNAc和Gal。用高压阴离子交换层析以及脉冲式电流检测法检测上述单糖。对每种形式的mpl配体都进行所有3种单糖的检测。该实验结果表明存在着含O-连接碳水化合物的唾液酸。这一结果与图4中给出的体内实验结果一致，体内实验中mpl配体的CHO细胞表达形式的体内活性都比大肠杆菌表达的对等形式高。因此，碳水化合物的存在能够增强mpl配体的体内活性。

表3

O-连接碳水化合物的计算

Mpl配体形式 O-聚糖酶处理分子量分子量的变化可能的O-连接链数(+/-) (Da) 目(@950 Da/链)
Mpl配体形式 O-聚糖酶处理分子量分子量的变化可能的O-连接链数(+/-) (Da) 目(@950 Da/链)	1-332 - 54200 13600 14″ E.coli Version 406001-174 - 24600 8600 9″ + 160001-163 - 18400 3900 4″ + 145001-153 - 15200 2300 2″ + 12900

实施例7

mpl配体的ELISA分析

多克隆抗体的制备——在3个月的时间段内，用大肠杆菌表达的重组人mpl配体1-163超免疫新西兰大白兔。从6只表现高抗体滴度的大白兔中收集抗血清，亲和纯化特异性抗-mpl配体的抗体。

亲和纯化——按照厂商提供的说明书，将重组人mpl配体1-163共价偶联到Actigel-ALD(Sterogene Bioseparations，Inc.)上。将1等份兔抗血清加到mpl配体亲和凝胶上，将该浆液置于震荡平台上4～8℃轻轻地震荡过夜。用PBS从凝胶床上洗去末结合的血清蛋白，然后用ImrnunoPure Gentle Ag/Ab洗脱缓冲液(Pierce Chemical Co.)把特异性结合的抗-mpl抗体洗脱出来。PBS数次换液透析回收得到抗体，然后用Amicon搅拌细胞超滤装置浓缩抗体溶液，这样得到的抗体浓缩液是随后用于孔包被和酶偶联物制备的特异性抗-mpl配体抗体的来源。

ELISA试剂——用亲和纯化的抗-mpl配体抗体包被Immulon 4Removawell Strips(Dynatech Laboratories，Inc.)。用0.1M碳酸氢钠(新鲜制备的pH约为8.2)将亲和纯化的抗体稀释到2.5ug/ml。每孔中加入100ul抗体，将平板置于密封增湿器内室温继续温育24小时。然后，向每孔中加入200ul由下列成分组成的封闭液：1％胎牛血清5％蔗糖TEN溶液(50mM Tris 7.4/10mM EDTA/150mM NaCl)，再置于密封增湿器内室温继续温育24小时。一并除去孔内的混合包被和封闭液。另外的外包被/封闭步骤包括：向每孔中加入300ul溶解于PBS中的SuperBlock封闭缓冲液(Pierce Chemical Co.)。室温静置5分钟后，除去该溶液，让这些孔室温下空气中晾干24小时。将包被后的多孔板密封保存于塑料袋内4～8℃以备mpl配体ELISA使用。

在来自兔抗血清库的亲和纯化的抗-mpl配体抗体上偶联辣根过氧化物酶(HRPO)用作发生信号的抗体。用iminothiolane HCl(FlukaChemical Corp.)衍生化上述亲和纯化后的抗体。单独地，用N-琥珀酰基6-马来己酸盐(N-succinimidyl 6-maleimidocaproate)(Fluka ChemicalCorp.)让上述两种活化蛋白组合在一起发生共价偶联。然后，将反应混合物通过FPLC Superose 6(Pharmacia)柱层析，分离抗体：具有目的分子量(即约200kD)的HRPO偶联物。混合含有目的偶联物的级分，用Centricon 30(Amicon Division，W.R.Grace & Co.)浓缩，制成50％甘油溶液-20℃保存。将该抗-mpl配体Ab：HRPO浓缩物稀释到2％胎牛血清PBS中，用于ELISA实验。ELISA中使用的偶联物终浓度为250-500ng/ml。

大肠杆菌表达的重组人mpl配体1-163用于制备标准物。将该mpl配体稀释到2％胎牛血清(Sigma Chemical Co.)TEN缓冲液中，该缓冲液中含有0.05％乙基汞硫代水杨酸钠作为防腐剂。制备的标准物中含1.0、0.5、0.25、0.125以及0.062ng/ml mpl配体。

分析—将100ul mpl配体标准物或样品加入孔中，然后置于密封增湿器内室温温育18～24小时。然后，除去孔中内容物和残液，用洗液(0.05％Tween 20 in TEN buffer)洗涤孔1次。向每孔中加入抗-mpl配体Ab：HRPO偶联物溶液(100ul)，然后，置于密封增湿器内室温温育2小时。然后除去孔中内容物，用0.05％Tween20 TEN缓冲液洗涤4次。

显色—加入TMB/过氧化氢底物溶液(Kirkegaard & Perry溶液A& B1∶1混合)，室温温育20分钟。加入100ul终止液(0.5N硫酸)终止反应，用微量滴定板读数器读取450nm下的吸光度。从用曲线拟作程序生成的标准曲线中计算出mpl配体的浓度。

实施例8

用短期液相培养物巨核细胞实验分析

Mpl配体1-174类似物的生物活性

用上述方法制备mpl配体1-174的类似物，并对它们刺激液体培养物中巨核细胞生长的能力进行分析。从人白细胞除去装置(nichol et al.，stem cells 12：494-505(1994))中分离CD34选择细胞，用培养基(IMDM/1％青霉素-链霉素-谷氨酸盐/1％非必需氨基酸/1％MEM丙酮酸钠/1％MEM维生素/10％去离子BSA/10％正常人AB血浆/10uMα-硫代酰基甘油/20ug/mlL-天冬酰胺)以2×10⁵/ml铺板。此外，向每孔中加入1.5ul含有mpl配体(1-174)或mpl配体1-174类似物的COS-1细胞条件培养基。Terasaki-style微量滴定组织培养板(VangardInternational)中的反应终体积为15ul。将细胞置于装有5％CO₂增湿器中37℃温育8天，用1％戊二醛直接固定到培养孔中，然后用由抗-GPIb，抗-GPIIb，(Biodesign)和抗-GPlb(Dako，Carpinteria，CA)组成的单克隆抗体鸡尾酒温育。用链霉亲和素-β-半乳糖苷酶检测***(HistoMark，Kirkegaard and Perry)显色免疫反应。通过较黑颜色(实际照片中为兰色)鉴定出的巨核细胞见图8。

图8中的泳道A和D分别为阳性和阴性对照。泳道A显示的孔中接受了37.5pg野生型mpl配体1-174 COS-1条件培养基，该孔表现出明显的巨核细胞生长。泳道D接受了1.5ul COS-1模拟条件培养基，不表现任何生长。图8中的泳道B和C分别为mpl配体1-174类似物N7和N10。泳道B接受了9.0pg mpl配体COS-1条件培养基，而泳道C接受了27pg，而且这两者都表现出极好的巨核细胞生长。

该实验表明被测试的mpl配体类似物能够刺激人巨核细胞体外生长。

实施例9

体外细胞增殖实验中Mpl1-174类似物的生物活性

用上述方法制备mpl配体1-174的类似物，并对它们刺激32D-mpl细胞增殖的能力进行分析。为了构建32D-mpl细胞，把人全长mpl受体序列(vigon，I.，et al.，PNAS 89：5640-5644(1992))亚克隆到含莫洛尼氏鼠肉瘤病毒转录启动子的表达载体中。使用CaPO₄哺乳动物转染试剂盒(Stratagene)，把6ug上述构建体和6ug兼嗜性逆转录病毒包装构建体转染到3×10⁶ 293细胞中。2天后对同一细胞进行再转染，4天后再进行1次。最后一次转染293细胞后次日，将其与IL-3依赖性鼠细胞系(32D，克隆23；Greenberger et al.，PNAS 80：2931-2936(1983))共培养。24小时后，拯救32D细胞并用BSA梯度(Path-o-cyte；Miles Inc.)分离。用1ng/ml鼠IL-3扩大培养细胞，然后用20％APK9血清选择培养(Bartley et al.，Cell 77：1117-1124(1994))。储存细胞用于使用多克隆兔抗肽(MPL)血清用荧光激活细胞分选仪(FACS)进行的受体细胞表面表达。这些细胞因子依赖性鼠32D-mpl细胞对mpl配体敏感。用含10％胎牛II系克隆血清(Hyclone Laboratories)以及1.0ng/ml muIL3的MEM培养基培养32D-MPL细胞至细胞密度为1×10⁶细胞/毫升。离心(约500XG)收集细胞，用不含muIL3的生长培养基洗涤2次，以1×10⁵细胞/ml的浓度重悬。

用mpl配体1-163在5000～1pg/ml的范围内制备一个延长的12点的mpl配体标准曲线。向96孔微量滴定组织培养板的适当孔中加入100ul的mpl配体或分析试样的每种稀释液，所述孔中含100ul重悬细胞(10,000细胞/孔)，将加样后的培养板置于增湿温育器中37℃及10％CO₂温育。48小时后，每孔中加入40ul MTS试剂(含水非放射性细胞增殖试剂盒，Promega)，14～18小时后在平板阅读器上490nm处对平板进行读数。从每个试样的剂量应答曲线中计算出样品的体外活性。将每个试样中引起50％最大刺激所需的mpl配体的量定义为1个单位。通过用生物活性单位/ml除以mpl配体ELISA测定的mpl配体浓度，计算出特异性活性。

转染并表达于COS细胞中的mpl配体类似物的特异性生物活性显示于表4。另外还总结了氨基酸取代碳水化合物的效果。用上述方法测定得到的纯化人序列mpl配体的体外活性为200～300单位/ng。从表4中可以明显地看出，含附加N-连接碳水化合物的mpl配体类似物可以同天然序列mpl配体表达的一样好，即使当它们含有附加碳水化合物链，例如N4和N10也同样如此(正如在实施例6的A部分中测定的那样)。上述这两类类似物也都保留了全部的体外生物活性。因此，正常情况下，也可以用哺乳动物细胞表达含N-连接碳水化合物的mpl配体类似物，而且这些类似物具有正常或增强的体外生物活性。

表4

Mpl配体形序列 N-连接 Elisa(ng/ml) 体外活性特异活性(单位/ng)式(氨基酸链的数 (b) (单位/ml) (d)长度) 目(a) (c)

模拟无 0 ＜0.08 ＜10 ＜125N1(174) 天然序列 NA 25 5375 215N1(174) 天然序列 0 31.4 8800 280N1(174) 天然序列 0 31.75 NA NAN2(174) N22 0 NA NA NAN3(174) N25 NA 1.85 636 344N4(174) N30T32 1 38 8830 232N4(174) N30T32 1 24 NA NAN5(174) N38T40 0 1.2 ＜10 ＜8N6(174) N86 0 0.44 ＜10 ＜22N7(174) N82A83 0 to 1 6 2660 443N7(174) N82A83 0 to 1 4.7 3080 655N9(174) N92 0 10.5 1970 188N10(174) N120T122 1 20.4 5943 291N10(174) N120T122 1 33.7 9690 288N11(174) S36N38T40 NA ＜0.625 ＜10 ＜16N11(174) S36N38T40 0 1.3 ＜10 ＜8N13(174) N53T55 0 to 1 67 18000 269N14(174) N58T60 0 to 1 17.9 4850 271N15(174) N30T32N120T122 0 to 2 26 6420 247

注释

(a)根据实施例6中描述的类似物多肽在SDS凝胶中的迁移率估算出的附加N-连接链的数目。

(b)用实施例描述的ELISA实验对CHO细胞上清液中mpl配体类似物的定量测定结果。

(c)通过测量mpl配体依赖性的32D细胞胸腺嘧啶的摄入对生长的刺激测定出的体外活性。

(d)增殖实验测量的mpl配体类似物体外活性与用mpl配体ELISA测量的mpl配体量之间的比值。

N.A.末获得

实施例10

CHO细胞的表达以及Mpl配体1-174、N4和N15的纯化

对实施例2描述的方法进行下列改进后，将含mpl配体1-174、N4和N15 cDNA的pDSRα2转染到DHFR-缺陷的CHO细胞中。

对每种类似物都进行一次转染。转染3周后，用mpl配体ELISA筛选mpl配体表达物。每种形式类似物各取3个表达克隆冻存于低温存储器。将每种类似物的最大表达克隆用转瓶扩大培养。对于N4，制备得到7.4升条件培养基(50％DMEM、50％HAMS-F12、1％青霉素/链霉素//谷氨酸盐、1％非必需氨基酸(Gibco))，对于N15，制备得到4.6升条件培养基。

从以表达mpl配体1-174(2.9L)、N4(7.4L)、N15(4.4L)的CHO细胞为种子培养物的转瓶中取出无血清CHO细胞条件培养基，用SlY10(10,000 Da分子量分离点)Amicon螺旋超滤筒相应地分别浓缩12-、19-和12-倍。然后取150微升浓缩条件培养基以0.3ml/min速度直接加样到3.3ml hu-MPL-X(受体)亲和柱上。该亲和柱是按照厂商提供的方法在每毫升Pharmacia CNBr活化琼脂糖树脂偶联1.0～1.5毫克Mpl-X(Mpl受体的可溶性细胞外结构域)。加样后，用30ml磷酸盐缓冲液(PBS；10mM NaPO₄ pH 6.8/150mM NaCl)洗涤柱体，然后用60ml 10mM Tris，pH 8.0/lM NaCl/1mM CHAPS洗涤。用30ml 20mMCAPS(3-[环己胺]-l丙磺酸)pH 10.5/lM NaCl/1mM CHAPS(3-[(3-Cholamidopropyl)二甲胺]-1-丙磺酸盐)洗脱Mpl配体1-174。

向每种洗脱级分中加入0.6mL lM Tris pH 7.0对级分进行中和。SDS-PAGE分析显示1-174mpl配体在10mM Tris，pH 8.0/1M NaCl 1mM CHAPS洗涤过程中出现明显的“伤流”。用SDS-PAGE分析洗脱级分。收集含mpl配体1-174的级分。然后改进该亲和纯化，做下列改动后重复进行亲和纯化：0.5mL/min加样和洗脱，并省去10mM Tris，pH 8.0/1M NaCl/1mM CHAPS洗脱这一步骤。

取所有含有单个mpl配体条带的级分，在50mL搅拌细胞，转到浓缩装置中用YM10(10,000Da分子量分离点)膜浓缩。取该浓缩液0.5mL以0.25mL/min直接加样到PBS平衡的Pharmacia Superdex 200HR 10/30凝胶过滤柱，收集0.25mL级分。收集所有含单个mpl配体条带的级分(根据SDS-PAGE分析的结果)。

用类似方式对CHO细胞表达的mpl配体的其他形式进行纯化(收集2批亲和纯化产物，并在Superdex 200凝胶过滤柱上过柱)。

实施例11

测定CHO细胞表达的N4和N15上的碳水化合物添加物

为了测定CHO细胞表达的mpl配体形式中是否含有N-连接碳水化合物，对实施例6中描述的方法进行下列改动后，用SDS-PAGE Western印迹法对条件培养基进行分析。

使用从转瓶中取出的CHO D-条件培养基。将样品加入Centricon-10离心浓缩仪(Amicon，Beverly，MA.)中，在Beckman J2-HS离心机中用固定角度转子(JA 20.1)以6000RPM转速离心1小时。将一定体积含约100ng mpl配体类似物的浓缩样品与SDS样品缓冲液(见实施例6的描述)一起上样到SDS PAGE凝胶上。图9显示的是与碳水化合物预期量相关的碳水化合物的迁移率差异。迁移最快的种类为Met--Lys(1-174)大肠杆菌mpl配体，随后依次为mpl配体1-174(CHC)、N4(CHC)、以及N15(CHC)。见图9，与非糖基化mpl配体相比分子变大的最合理解释为，mpl配体1-174(CHO)上有附加O-连接碳水化合物，N4(CHO)上有附加O-连接碳水化合物和1个附加N-连接寡糖，以及N15(CHO)上有附加O-连接碳水化合物和2个附加N-连接寡糖。

为了证实分子量的增加确实是由于N-连接碳水化合物链的添加引起的，按实施例6中描述的方法用N-聚糖酶处理样品除去任一N-连接碳水化合物。从条件培养基中纯化出含约100ng mpl配体类似物的各种样品。

用N-聚糖酶处理后，N4(CHO)和N15(CHO)的迁移率减小到同mpl配体1-174(CHO)一样的水平。用N-聚糖酶处理mpl配体MK1-174(大肠杆菌)或mpl配体1-174(CHO)不影响迁移率，这是因为这两种形式预料都不含N-连接碳水化合物。将用N-聚糖酶处理过的样品与未处理样品相比发现，N4大小的变化对应于1条N-连接碳水化合物链的大小，N15大小的对应于2条碳水化合物链的大小。因此，这两种mpl配体形式上N-连接糖基化位点的添加导致当这些种类的配体在CHO细胞表达时出现了附加N-连接碳水化合物。见图10。

实施例12

CHO细胞中制备的Mpl配体类似物的体外生物活性

除活性是从用CHO细胞表达的mpl配体1-332作标准物制备的曲线中计算出的外，按照实施例9描述的方法，用因子依赖性细胞系32D-MPL，分析从CHO细胞或大肠杆菌中表达和纯化出来的纯化mpl配体及类似物的体外生物活性。表5中列出了各种形式的特异性体外生物活性。从该表中可以明显地看出，用CHO细胞表达的含附加碳水化合物的mpl配体类似物具有体外生物活性。

表5

MPL配体的体外活性

MPL配体形式 N-连接链的数目体外活性

U/mg×10E6

MK174(E.coli) 0 13

1-163(CHO) 0 86

1-174(CHO) 0 85

N4(CHO) 1 60

N15(CHO) 2 92

1-332(CHO) 6 41

实施例13

Mpl配体类似物的体内生物活性

计算用各种形式mpl配体处理过的小鼠的血小板的量，结果见图11。用mpl-受体亲和层析制备和纯化出CHO表达的mpl配体1-332、1-174、N4和N15。用常规层析方法，制备和纯化大肠杆菌表达的Met-Lys-mpl配体1-174。同时给正常、雌性Balb/c小鼠施用规定浓度的每种形式，每天1次，共5天。最后一次注射后，从尾静脉上一个小的侧向切口收取血样。用Sysmex带电血细胞分析仪(Baxter Diagnostics，Inc.Irvine，CA)对血细胞进行分析。数据表示为测定4个动物的平均值±平均值的标准误差。白细胞总数或红细胞总数等其他血细胞指数末受上述这些处理的影响(数据未列出)。

受激的所有形式都可以引起血小板量的增加。但是，不同形式的活性各不相同。相对的体内活性为mpl配体MK1-174(大肠杆菌)＜mpl配体1-174(CHO)＜N4(CHO)＜mpl配体1-332(CHO)＜N15(CHO)。结果表明非天然生成N-连接碳水化合物的添加可以导致体内活性的增高。进一步还表明碳水化合物数目的增大可以导致体内活性成比例的增强。

实施例14

用重叠PCR构建Mpl配体类似物以及截短形式N16-N40

用从Cheng et al.，PNAS 91，5695(1994)改良而来的方法，通过重叠PCR(聚合酶链反应)构建出类似物N16～N40。典型地，向每个构建体中导入1～2处突变。

合成下列寡核苷酸引物用于制备类似物N16～N40：

5′F CCCTCTAGACCACCATGGAACTGACTGAATTGCTCCTC SEQ ID NO.：18

3′R(1-174)CCCGTCGACTCAGAGCTCGTTCAGTGTG SEQ ID NO.：19

N16-3′R CCCGTCGACTCACTCCAACAATCCAGAAG SEQ ID NO.：20

N17-3′R CCCGTCGACTTATCTGGCTGAGGCAGTGA SEQ ID NO.：21

N18-F CACGTCCTTAACAGCAGCCTGAGCCAGTG SEQ ID NO.：22

N18-R CACTGGCTCAGGCTGCTGTTAAGGACGTG SEQ ID NO.：23

N19-F CCCTTTGCCTAACGGTTCCCTGCTGCCTGCTGT SEQ ID NO.：24

N19-R ACAGCAGGCAGCAGGGAACCGTTAGGCAAAGGG SEQ ID NO.：25

N20-F TGCCTACACCTAACCTGTCGCCTGCTGTGGA SEQ ID NO.：26

N20-R TCCACAGCAGGCGACAGGTTAGGTGTAGG CA SEQ ID NO.：27

N21-F GGAAAACCAATATGTCGGAGACCAAGGCACA SEQ ID NO.：28

N21-R TGTGCCTTGGTCTCCGACATATTGGTTTTCC SEQ ID NO.：29

N22-F TGGGAGAATGGAACACCACGATGGAGGAGACC SEQ ID NO.：30

N22-R GGTCTCCTCCATCGTGGTGTTCCATTCTCCCA SEQ ID NO.：31

N23-F AAAACCCAGATGAACGAGACGACCAAGGCACA SEQ ID NO.：32

N23-R TGTGCCTTGGTCGTCTCGTTCATCTGGGTTTT SEQ ID NO.：33

N24-F CCCAGATGGAGAACACCTCGGCACAGGACAT SEQ ID NO.：34

N24-R ATGTCCTGTGCCGAGGTGTTCTCCATCTGGG SEQ ID NO.：35

N25-F CACGGGGACAAAACGGAACCACTTGCCTCTCA SEQ ID NO.：36

N25-R TGAGAGGCAAGTGGTTCCGTTTTGTCCCCGTG SEQ ID NO.：37

N26-F CAGGGCAGGAACACATCTCACAAGGATCCCA SEQ ID NO.：38

N26-R TGGGATCCTTGTGAGATGTGTTCCTGCCCTG SEQ ID NO.：39

N27-F GGGCAGGACCAACGCTAGCAAGGATCCCAAT SEQ ID NO.：40

N27-R ATTGGGATCCTTGCTAGCGTTGGTCCTGCCC SEQ ID NO.：41

N29-F Pair 1 CAGTGCAACGAGTCCCACCCTTGG SEQ ID NO.：42

N29-R Pair 1 CAAAGGGTGGGACTCGTTGCACTG SEQ ID NO.：43

N29-F Pair 2 GACCACAAATCACTCCGATCCCAA SEQ ID NO.：44

N29-R Pair 2 TTGGGATCGGAGTGATTTGTGGTC SEQ ID NO.：45

N30-F GTCCCCACCAACACCTCTCTAGTCCTC SEQ ID NO.：46

N30-R GAGGACTAGAGAGGTGTTGGTGGGGAC SEQ ID NO.：47

N31-3′R CCCGTCGACTCACTTCAGAAGCCCAGAGCCAGT SEQ ID NO.：48

N36(1)-F GAAAACCCAGAACGAGACCACCAAGGCACAG SEQ ID NO.：49

N36(1)-R CTGTGCCTTGGTGGTCTCGTTCTGGGTTTTC SEQ ID NO.：50

N36(2)-F CACCAAGGCACAGGACATTCTGGGAG SEQ ID NO.：51

N36(2)-R CTCCCAGAATGTCCTGTGCCTTGGTG SEQ ID NO.：52

N37-F GAAAACCCAGATGAACGAGACCAAGGCACAG SEQ ID NO.：53

N37-R CTGTGCCTTGGTCTCGTTCATCTGGGTTTTC SEQ ID NO.：54

N38-F GTCCCCACCAACACCACTCTAGTCCTC SEQ ID NO.：55

N38-R GAGGACTAGAGTGGTGTTGGTGGGGAC SEQ ID NO.：56

F＝正向引物

R＝反向引物

用两个连续步骤制备出导入1个新糖基化位点的构建体。步骤1中，用4段不同寡核苷酸实施2个反应。这些寡核苷酸包括有一个5’正向引物、一个反向诱变引物、一个正向诱变引物(通常与反向诱变引物互补)和一个反向3‘引物。反向3‘引物中包括这样的序列，其中导入了后跟有Sal I限制酶切位点的终止密码子。导入终止密码子的位置为第175、184、192和200位残基。因此，能够制备出长度为1-174、1-183(N16)、1-191(N17)和1-199(N31)的形式。PCR1使用模板DNA(含mpl配体1-174序列或全长mpl配体1-332序列的pDSRα2)、5’正向引物和反向诱变引物。PCR2使用模板DNA、3’反向引物和正向诱变引物。然后，进行这两个PCR反应，琼脂糖凝胶电泳分离扩增得到的DNA片段。从凝胶中切割出含有大小正确的DNA片段的凝胶块。

合并来自PCR1和PCR2的DNA片段，第3个PCR反应只用5’正向和3’反向引物来完成。因此，扩增到了含***到mpl配体中的目的突变的全长DNA片段。

再次用琼脂糖凝胶电泳分离扩增到的片段，用Geneclean^TM试剂盒和厂商(Bio 101，Inc)提供的方法纯化大小正确的DNA片段。用Xba I和Sal I消化纯化后的DNA，然后用Geneclean^TM试剂盒再次纯化。然后，将片段连接到Xba I和Sal I切割过的pDSRα2中。用2倍体积乙醇将连接后的DNA沉淀在存在载体tRNA的0.3M NaOAc pH 5.2中，然后转化到大肠杆菌中。限制性酶切分析对克隆进行测试，用琼脂糖凝胶电泳鉴定出含有大小正确DNA***片段的克隆。然后制备出纯化质粒DNA，对mpl配体***片段测序确证存在目的突变而且确保没有导入任何另外的氨基酸改变。

在几种情况下，同时结合了2个或多个突变，例如，见N29、N33、N34、N35、N39和N40。这可以通过向已经含有1个变化的DNA中导入一个新的取代来实现。例如，N33就是通过把N23的变化导入到N15中制备而成的。在这种情况下，上述方法的操作可以采用N23诱变引物和N15模板DNA。另一种策略中，是同时把两个变化导入到模板DNA中。该模板DNA可以包含天然序列或者也可以包含编码已含有变化的mpl配体配体形式的序列。这些情况中的第1步涉及3个PCR反应和6段寡核苷酸。这些寡核苷酸中包括一个正向引物、2对正向及反向诱变引物以及一个反向3’引物。每对引物相互间互补，其中含有一段经设计导入了1个新糖基化位点的序列。

PCR1包括模板DNA、5’正向引物以及引物对1中的反向诱变引物。PCR2包括模板DNA、引物对1中的正向诱变引物以及引物对2中的反向诱变引物，其中引物对2的引物是从3’末端到引物对1的引物。PCR3包括模板DNA、引物对2中的正向引物以及反向3’引物。

用琼脂糖凝胶电泳分离每个PCR反应得到的DNA片段，并按照上述方法将其切割出来。然后将这3个DNA片段合并在一起，只用5’正向及3’反向引物再次进行PCR扩增。

按照上述方法，纯化编码因含有2个新糖基化位点的序列的整个目的基因的DNA片段，用Xba I和Sal I切割，然后将其连接到事先用Xba I和Sal I切割过的pDSRα2中。也可以通过采用已含有突变的模板的PCR反应把多个突变结合在一起。例如，N39可以通过把N36和N38的变化导入到N15的模板DNA中来制备。完成其所用的是一套与制备N36(N36(1))所用引物不同的引物(N36(2))。参见上述引物对。这两套引物导入的是同一突变。

也可以制备出较长的mpl配体形式。因此，用类似于N39的方式来制备N40，不同之处是PCR3中使用的3’反向引物(步骤1)以及步骤2中的PCR引物是制备N31所用的引物。该引物可以在SalI限制性酶切位点前的第200位上导入1个终止密码子。此外，用于PCR3的模板DNA中包含有编码全长mpl配体(1-332)的序列。

典型的PCR反应混合物包括：正向及反向引物各4ul(5pm/ul)、1ul模板(50 ng)、10ul of 5X LP缓冲液(100mM Tricine pH8.7/25％甘油/425mM KOAc)、10ul dNTP原液(dATP、dTTP、dCTP、dGTP各1mM)、0.8u1 rtTh聚合酶(Perkin Elmer；2.5U/ul)，and 2ul Vent聚合酶(NEB；用1X LP缓冲液1∶100新鲜稀释后的浓度为0.01U/ul)。加入H₂O使终体积为50ul。所有成分按给出的顺序加入到一起，当第一个循环中的温度高于60℃时加入1ul 50mM MgOAc启动PCR反应。反应条件为：2个循环94℃，10sec/45℃，1min/68℃，5min，随后的25个循环为94℃，10sec/55℃，1min/68℃，5min。

用这些常规方法构建表6中列出的mpl配体类似物以及截短形式N16～N40。每种形式的DNA序列变化也同时给出。

表6

具有连接N-连接碳水化合物链的位点的Mpl配体类似物类似物/种类No. 氨基酸的取代序列变化

N16 (1-183)；Thr¹⁸⁴→Gly³³² ACA→TGA(终止密码子)

缺失

N17 (1-191)；Thr¹⁹²→Gly³³² ACT→TAA(终止密码子)

缺失

N18 His²³，Arg²⁵→Asn²³，Ser²⁵ CAC，AGA→AAC，AGC

N19 Thr³⁷，Pro³⁸，Val³⁹→Asn³⁷，Gly³⁸，Ser³⁹ ACA，CCT，GTC→AAC，GGT，TCC

N20 val³⁹，Leu⁴¹→Asn³⁹，Ser⁴¹ GTC，CTG→AAC，TCG

N21 Gln⁵⁴，Glu⁵⁶→Asn⁵⁴，Ser⁵⁶ CAG，GAG→AAT，TCG

N22 Lys⁵²，Gln⁵⁴→Asn⁵²，Thr⁵⁴ AAA，CAG→AAC，ACG

N23 Glu⁵⁷→Asn^55′(i)，Thr⁵⁷ GAG→AAC(i)，ACG

N24 Glu⁵⁷，Lys⁵⁹→Asn⁵⁷，Ser⁵⁹ GAG，AAG→AAC，TCG

N25 Leu⁸¹，Pro⁸³→Asn⁸¹，Thr⁸³ CTG，CCC→AAC，ACC

N26 Thr¹¹⁸，Ala¹²⁰→Asn¹¹⁸，Ser¹²⁰ ACC，GCT→AAC，TCT

N27 Thr¹¹⁹，His¹²¹→Asn¹¹⁹，Ser¹²¹ ACA，CAC→AAC，AGC

N29 Pro³⁰，Val³²，Ala¹²⁰，Lys¹²²→Asn³⁰，Ser³²，Asrn¹²⁰，Ser¹²² CCA，GTT，GCT，AAG→AAC，TCC，AAT，TCC

N30 Ser¹⁶³ Arg¹⁶⁴→Thr¹⁶³，Asn¹⁶⁴ AGC，AGA→ACC，AAC

N31 (1-199)；Trp²⁰⁰→Gly³³² TGG→TGA(终止密码子)

缺失

N33 Pro³⁰，Val³²，Glu⁵⁷，Ala¹²⁰，Lys¹²²→ CCA，GTT，GAG，GCT，AAG→

Asn³⁰，Thr³²，Asn^55′(i)，Thr⁵⁷，Asn¹²⁰，Thr¹²² AAC，TCC，AAC(i)，ACG，AAT，TCC

N34 Pro³⁰，Val³²，Glu⁵⁷，Ser¹⁶³，Arg¹⁶⁴→ CCA，GTT，GAG，AGC，AGA→

Asn³⁰，Thr³² Asn^55′(i)Thr⁵⁷，Thr¹⁶³，Asn¹⁶⁴ AAC，TCC，AAC(i)，ACG，ACC，AAC

N35 N4+N23+N30+N31(1-199) -

N36 Met⁵⁵，Glu⁵⁷→Asn⁵⁵，Thr⁵⁷ ATG，GAG→AAC，ACC

N37 Glu⁵⁶→Asn⁵⁶ GAG→AAC

N38 Ser¹⁶³，Arg¹⁶⁴，Ser¹⁶⁶→Thr¹⁶³，Asn¹⁶⁴，Thr¹⁶⁶ AGC，AGA，TCT→ACC，AAC，ACT

N39 N4+N10+N36+N38(1-174) -

N40 N4+N10+N36+N38+N31(1-199) -

上表中的符号“(i)”代表已***的参比氨基酸。例如，Glu⁵⁷-＞Asn^55′(i)、Thr⁵⁷(表6中的类似物N23)是指第57位上的Glu已经被Thr所取代，以及紧接第55位Met后已另***1个Asn，将Asn编号为55’以便随后的氨基酸能够保留原来设定的序号。

包括上述实施例中所有变化的实施例用特定类似物序号加上符号“+”。例如N35、N39及N40。用括号给出了这些类似物氨基酸链的长度。因此，类似物N35同时含有制备类似物N4、N23、N30和N31涉及的所有变化。指定为N31的变化是指类似物N35长为199个氨基酸。除标明了不同长度(或者，已经***了氨基酸，使得总长度因***的氨基酸而增大)外，表6中的所有类似物长度都为174个氨基酸。

实施例15

Mpl配体类似物以及截短形式N16～N40的特性

A.Mpl配体类似物表达水平及体外活性的测定。

用电穿孔法(实施例5)或CaPO₄法(哺乳动物细胞转染试剂盒；专用介质)将N16到N40转染进COS细胞。3～4天后，收集无细胞条件培养基，分装并于-70℃储存。用实施例7中描述的ELISA实验测定表达水平。另外，除1处改动外用实施例9描述的方法测定上清液中的生物活性。从用纯化CHO细胞表达的mpl配体1-332作标准物制备的标准曲线中计算活性。

结果见表7。如表7中显示的那样，大部分mpl配体类似物被表达和分泌。一些类似物似乎增加了表达量。这些样品的生物测定表明，大多数类似物的特异性活性也与非修饰形式相仿。一些类似物中含有多条N-连接碳水化合物链(见下表)。这一结果表明碳水化合物的添加可以导致类似物分泌量的增加以及体外活性的正常。

表7

Mpl配体形式序列 N-连接链的 Elisa(ng/ml) 体外活性(单位特异活性(单位(氨基酸长度) 数目(a) (b) /ml)(c) /ng)(d)

N1(174) 天然 0 28 3991 143N15(174) N30T32N120T122 0-2 45 7003 156N16(183) 1-183 0 85 9276 NAN17(191) 1-191 NA ＜0.3 11 NAN18(174) N23S25 0 2 5 2.5N19(174) N37G38S39 NA ＜0.3 NA NAN20(174) N39S41 NA ＜0.3 ＜10 NAN21(174) N54S56 0-1 30 4380 146N22(174) N52T54 0-1 2 856 428N23(174) N55′(i)T57 1 11 1059 96N24(174) N57S59 0 5.3 458 86N25(174) N81T83 NA 0.22 123 559N26(174) N118S120 NA 0.9 96 106N27(174) N119S121 0 4.5 338 75N29(174) N30S32N120S122 0-2 15 1627 108N30(174) T163N164 0-1 128 15592 122N31(199) 1-199 至少为1 156 19000 122N33(174) 4+10+23 3 78 10057 129N34(174) 4+23+30 至少为2 112 13536 120N35(199) 34+31 4或更多 172 13112 76N36(174) N55T57 0-1 48 5808 121N37(174) N56 1 32 4504 141N38(174) T163N164T166 0-1 25 3904 156N39(174) N4+N10+N36+N38 3 to 4 127 17661 139N40(199) N4+N10+N36+N38+N31 至少为5 134 19735 147

注释

(a)根据类似物多肽在SDS凝胶上的迁移率估算出附加N-连接链的数目。

(b)EIA测定COS细胞上清液中mpl配体类似物的量。

(c)通过测量32D-MPL细胞的增殖测定体外活性，该细胞的生长依赖于mpl配体。

i-***片段

NA未获得

B.碳水化合物添加物的测定。

用实施例6描述的方法，测定表6中列出的类似物是否添加了N-连接碳水化合物。

还用改良法对一些类似物(N21、N22、N30、N33和N36)进行了测试。这之所以必要是因为用于Western印迹显色的单克隆抗体是针对包括第47～62位残基的多肽，并且表6中描述的一些类似物包括的取代影响了与该抗体之间的免疫反应能力，例如N21。因此，为了分析这些类似物，使用用小鼠制备的抗大肠杆菌表达的mpl配体的单克隆抗体来对上清液进行免疫沉淀。

典型地，15ug的抗体用于免疫沉淀50ng的mpl配体类似物。除使用与兔抗-mpl配体多克隆抗体(典型地为1ug/ml；抗大肠杆菌细胞表达的mpl配体1-163)温育以及抗兔ECL试剂盒(Amersham)使免疫沉淀的条带显色外，按照实施例6描述的方法对免疫沉淀物质进行Western印迹分析。各种实验结果列于表7。一些类似物的大小增大表明存在着N-连接碳水化合物(N21，N22，N23，N29，N30，N31，N33，N34，N35，N36，N38，N39，N40)。这些类似物中的一部分具有多于1条的N-连接链，例如，N29、N33、N34、N35、N39和N40。这些类似物以正常或更高的水平分泌，体外生物活性与mpl配体1-174相仿。这一结果表明，可以向mpl配体中导入多个有功能的N-连接糖基化位点，而不会对表达或生物活性造成不利影响。

为了说明可以向mpl配体加入多个寡糖链，用实施例6中描述的方法对COS细胞表达的各种类似物进行Western印迹分析。图12显示类似物迁移率随附加N-连接糖基化位点的数目增加而减小。给出的N39和N40是具有4个新位点的类似物。N-连接位点最多的类似物迁移得最慢。这一结果从mpl配体的1-174和1-199这两种形式都可以观察到。这表明可以用多个N-连接碳水化合物链把至少4个类似物合并在一起生成新的类似物。

实施例16

含Asn-X-Ser与含Asn-X-Thr的糖基化位点的比较

N-连接糖基化位点包括Asn-X-Thr或Asn-X-Ser，其中X是除脯氨酸外20种天然氨基酸中任意一种。我们想要测定第3位上是否优选Ser或Thr。因此，对具有以下特征的两套类似物进行测定看是否会对N-连接糖基化位点的占据百分比产生影响：每套引物包括一个在密码子序列(sequon)第3位是Ser或Thr的mpl配体糖基化类似物。N15包括2个Asn-X-Thr位点，而N29在完全相同的位置上包括2个Asn-X-Ser。类似地，N30包括1个Asn-X-Ser，而N38在同样位置上包括1个Asn-X-Thr。

为了比较这两套类似物，用COS细胞表达它们，并用实施例6描述的方法对分泌的mpl配体进行Western印迹分析。图13给出了这些结果。与N29相比，N15具有的糖基化mpl配体的比例明显增加。相反地，对N30和N38进行比较时，糖基化和非糖基化mpl配体之间的比例几乎没有任何差别。这些结果表明Asn-X-Ser和Asn-X-Thr这两者都可以导入mpl配体，而且二者都可以作为N-连接碳水化合物附加物的位点。此外，一些情况下可能优选Asn-X-Thr密码子序列(即，它可能被更有效地糖基化)。

实施例17

用重叠PCR构建mpl配体类似物以及截短形式N41～N43

用从Cheng et al PNAS 91，5695(1994)改进而来的方法，通过重叠PCR(聚合酶链反应)构建类似物N41、N42和N43(这些类似物的结构见表8)。

合成下列寡核苷酸引物用于制备类似物N41～N43：

5′F CCCTCTAGACCACCATGGAACTGACTGAATTGCTCCTC SEQ ID NO.：18

3′R (1-174)CCCGTCGACTCAGAGCTCGTTCAGTGTG SEQ ID NO.：19

3′R (1-199)CCCGTCGACTCACTTCAGAAGCCCAGAGCCAGT SEQ ID NO.：57

N41-F TCCCCAGCAACACCTCTCTAGTC SEQ ID NO.：58

N41-R AGGTGTTGCTGGGGACAGCTGTG SEQ ID NO.：59

N42-F TCCCCAACAGAACCTCTCTAGTC SEQ ID NO.：60

N42-R AGGTTCTGTTGGGGACAGCTGTG SEQ ID NO.：61

N37-F GAAAACCCAGATGAACGAGACCAAGGCACAG SEQ ID NO.：53

N37-R CTGTGCCTTGGTCTCGTTCATCTGGGTTTTC SEQ ID NO.：54

F＝正向

R＝反向

按照实施例14中描述的2-步PCR法，用上述相应的PCR引物对以及SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19外部引物构建mpl配体N41和N42。每个构建体的步骤2使用了能够产生1-174这种形式的5’引物(SEQ ID NO.18)和3’引物(SEQ ID NO.19)。

同时用实施例14中描述的2步法，通过PCR把2个N-连接位点导入到已包括有其他N-连接糖基化位点的模板中，构建出N43。在3个单独PCR反应的第1步骤中使用的是3种不同的DNA模板(N15、N10和1-332)。PCR反应1使用的是模板N15以及SEQ ID NO.18和SEQID NO.54所示引物。该反应把N37的取代导入到已含有N4中取代的DNA区段中。PCR反应2使用的是模板N10以及SEQ ID NO.53和SEQID NO.59所示引物。该反应把N37和N41中的突变导入到已含有N10中取代的DNA区段中。PCR反应3使用的是模板1-332以及SEQ IDNO.58和SEQ ID NO.57所示引物。该反应把N41中的取代导入到已含有1-199C末端的DNA片段中。用琼脂糖凝胶电泳纯化每个DNA片段。然后把上述3个DNA片段合并在1个试管中，并通过PCR反应用SEQID NO.18和SEQ ID NO.57所示引物把它们连接在一起。这就制备出了一段在mpl配体1-199形式中含有N4、N37、N10和N41取代的DNA片段。然后，用实施例14描述的方法把该DNA片段克隆到PDSRa2中。

N41、N42以及对于N43步骤1中的前3个反应所需的重叠PCR反应条件是：1循环94℃，4min；25循环94℃，10sec/68℃，2min；1循环68℃，5min。

N43最后的PCR反应的条件为：1循环94℃，4min；5循环94℃10sec/44℃，30sec；25循环94℃，10sec/68℃，2min；1循环68℃，5min。

首先，用集落(colony)PCR对mpl配体类似物克隆N41-N43进行筛选，鉴定出含大小和类型正确的DNA***片段的克隆。用一个灭菌接种环挑取转化细菌(大肠杆菌)的克隆，并将其重悬于1×Tag缓冲液(Boehringer Mannheim)中。在含下列成分的50ul反应体积中加入1.25U Tag聚合酶：终浓度为0.2mM dNTP混合物和终浓度为0.2uM的2种载体引物。该集落PCR的反应条件为：1循环95℃；35循环94℃，30sec/52℃，30sec/72℃；30sec；1循环72℃，5min。用凝胶电泳和测序分析PCR产物。

表8

具有N-连接碳水化合物链连接位点的mpl配体类似物

类似物/种类氨基酸取代序列变化

N41 Arg¹⁶⁴→Asn¹⁶⁴ AGA→AAC

N42 Ser¹⁶³→Asn¹⁶³ AGC→AAC

N43 N4+N10+N37+N41+N31 -

(1-199)

实施例18

Mpl配体类似物以及截短形式N41～N43的特性

A.Mpl配体类似物表达水平及体外生物活性的测定。

对实施例5描述的电穿孔法作如下改动后，利用其把N41～N43转染到COS细胞中。使用了25ug编码mpl配体类似物的质粒DNA。用7ml培养基将电穿孔后的细胞在100mm组织培养皿上铺板。电穿孔3天后，收集条件培养基，分装并储存于-70℃。

用实施例7描述的ELESA实验测定表达水平。另外，还对实施例9描述的方法做了1处改动后，利用其测定上清液的生物活性。从用纯化CHO细胞表达的mpl配体1-332作标准物制备的标准曲线中计算活性。

结果见表9

表9

Mpl配体形式序列 N-连接 Elisa(mg/ml) 体外活性特异活性(氨基酸长度) 链的数 (b) (单位/ml) (单位/ng)目(a) (c) (d)
	N1(174) 天然 0 28 5400 193N31(199) 天然至少1 156 15000 96N38(174) T163N164T166 0-1 55 6080 110N40(199) N4+N10+N36+N38+N31 至少5 134 18100 135N41(174) N164 0-1 109 17500 161N42(174) N163 0-1 51 9300 182N43(199) N4+N10+N37+N41+N31 至少5 153 30500 199

注释

(b)EIA测定COS细胞上清液中mpl配体类似物的量。

(4)增殖实验测量的mpl配体类似物体外活性与用mpl配体ELISA测量的mpl配体量之间的比值。

B.碳水化合物添加物的测定。

测定表8中列出的类似物是否附加了N-连接碳水化合物。将来自用类似物cDNA转染的COS细胞的约0.5ng mpl配体或mpl配体类似物与含β-巯基乙醇的SDS样品缓冲液混合，并煮沸。用12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，转移到硝酸纤维素膜上并进行Western印迹分析。通过与兔抗-mpl配体多克隆抗体(典型地为1ug/ml；抗大肠杆菌细胞表达的mpl配体1-163)以及抗兔ECL试剂盒(Amersham)温育，显色免疫沉淀的条带。

图15显示的是mpl配体的3种不同突变体，即使他们在糖基化位点周围的位置和序列上不同，但是它们都能被糖基化。N38含T163、N164和T166突变。N41只含有N164突变。由于在第166位上存在的Ser导致产生序列Asn-X-Ser，所以该类似物具有1个N-连接位点。类似物N38和N41以类似的方式糖基化。这表明mpl配体的一些位置上可以耐受序列真实变化但仍能被有效糖基化。如表9所示，这两种都保留了类似的体外生物活性。相反，N42具有Asn163取代。由于在第165位上存在的Thr导致产生序列Asn-X-Thr，所以该类似物包括1个N-连接糖基化位点。它也被糖基化但效率不及N38和N41。

图14显示的是对N40和N43的比较。这两个mpl配体类似物都含有6个糖基化位点。它们在用于导入N-连接位点时所改变的氨基酸数目(N43改变了6个氨基酸而N40改变了9个)以及位点定位上不同。N43的凝胶迁移率与N40相同。这表明这两种mpl配体糖基化的程度相似。如图9所示，这两种类似物的体外活性也是相近的。这表明可以将不同的类似物联合在一起生成新的mpl配体，生成的新mpl配体具有类似的N-连接链数目等性能以及近似的体外生物活性。

本发明已经描述的内容应该理解为是本发明的优选实施方案，而并非限制对本发明公开的实施方案，相反，这些内容是用来涵盖属于所附权利要求实质和范围之内的各种改良或等效方案，所附权利要求的范围应做最广泛的理解，从而把所有改良或等效方案都包括于其中。

序列表

(1)一般资料：

(i)申请人：Amgen Inc.

(ii)发明题目：mpl配体类似物

(iii)序列数：61

(iv)通信地址：

(A)收信人：Amgen Inc.

(B)街道：One Amgen Center Drive

(C)城市：Thousand Oaks

(D)州：CA

(E)国家：USA

(F)邮政编码：91320-1799

(V)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容

(C)操作***：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30

(vi)目前的申请资料：

(A)申请号：US08/927,855

(B)申请日：1997年9月11日

(C)分类号：

(viii)律师/代理人信息：

(A)姓名：COOK，ROBERT R

(B)注册号：31,602

(C)资料/文档号：A-337C

(2)SEQ ID NO：1的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：1342个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：36...1094

(ix)特征：

(A)名称/关键词：mat-peptide

(B)位置：99...1094

(ix)特征：

(A)名称/关键词：sig-peptide

(B)位置：36...98

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGA ATG GAG CTG ACT GAA TTG 53

Met Glu Leu Thr Glu Leu

CTC CTC GTG GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA AGG CTA ACG CTG TCC AGC 101

Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser

-15 -10 -5 1

CCG GCT CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT 149

Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg

5 10 15

GAC TCC CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC 197

Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His

20 25 30

CCT TTG CCT ACA CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA 245

Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly

35 40 45

GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA 293

Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly

50 55 60 65

GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG 341

Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu

70 75 80

GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC 389

Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val

85 90 95

CGT CTC CTC CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT 437

Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro

100 105 110

CCA CAG GGC AGG ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG 485

Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu

115 120 125

AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA 533

Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val

130 135 140 145

GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC 581

Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val

150 155 160

CCC AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC CCA AAC AGG 629

Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg

165 170 175

ACT TCT GGA TTG TTG GAG ACA AAC TTC ACT GCC TCA GCC AGA ACT ACT 677

Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr Thr

180 185 190

GGC TCT GGG CTT CTG AAG TGG CAG CAG GGA TTC AGA GCC AAG ATT CCT 725

Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile Pro

195 200 205

GGT CTG CTG AAC CAA ACC TCC AGG TCC CTG GAC CAA ATC CCC GGA TAC 773

Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly Tyr

210 215 220 225

CTG AAC AGG ATA CAC GAA CTC TTG AAT GGA ACT CGT GGA CTC TTT CCT 821

Leu Ash Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro

230 235 240

GGA CCC TCA CGC AGG ACC CTA GGA GCC CCG GAC ATT TCC TCA GGA ACA 869

Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly Thr

245 250 255

TCA GAC ACA GGC TCC CTG CCA CCC AAC CTC CAG CCT GGA TAT TCT CCT 917

Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser Pro

260 265 270

TCC CCA ACC CAT CCT CCT ACT GGA CAG TAT ACG CTC TTC CCT CTT CCA 965

Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu Pro

275 280 285

CCC ACC TTG CCC ACC CCT GTG GTC CAG CTC CAC CCC CTG CTT CCT GAC 1013

Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro Asp

290 295 300 305

CCT TCT GCT CCA ACG CCC ACC CCT ACC AGC CCT CTT CTA AAC ACA TCC 1061

Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr Ser

310 315 320

TAC ACC CAC TCC CAG AAT CTG TCT CAG GAA GGG TAAGGTTCTC AGACACTGCC 1114

Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly

325 330

GACATCAGCA TTGTCTCGTG TACAGCTCCC TTCCCTGCAG GGCGCCCCTG GGAGACAACT 1174

GGACAAGATT TCCTACTTTC TCCTGAAACC CAAAGCCCTG GTAAAAGGGA TACACAGGAC 1234

TGAAAAGGGA ATCATTTTTC ACTGTACATT ATAAACCTTC AGAAGCTATT TTTTTAAGCT 1294

ATCAGCAATA CTCATCAGAG CAGCTAGCTC TTTGGTCTAT TTTCTGCA 1342

(2)SEQ ID NO：2的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：353个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala

-21 -20 -15 -10

Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val

-5 1 5 10

Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser

15 20 25

Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala

30 35 40

Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys

45 50 55

Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met

60 65 70 75

Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly

80 85 90

Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu

95 100 105

Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp

110 115 120

Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val

125 130 135

Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala

140 145 150 155

Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu

160 165 170

Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr

175 180 185

Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly

190 195 200

Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu

205 210 215

Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly

220 225 230 235

Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro

240 245 250

Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu

255 260 265

Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr

270 275 280

Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu

285 290 295

His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser

300 305 310 315

Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu

320 325 330

Gly

(2)SEQ ID NO：3的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：605个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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(A)名称/关键词：CDS

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(ix)特征：

(A)名称/关键词：mat-peptide

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(ix)特征：

(A)名称/关键词：sig-peptide

(B)位置：12...74

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

TCTAGACCAC C ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG GTC ATG CTT CTC 50

Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu

-21 -20 -15 -10

CTA ACT GCA AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT TGT GAC 98

Leu Thr Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp

-5 1 5

CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAC GTC CTT CAC AGC 146

Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser

10 15 20

AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT GTC CTG 194

Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu

25 30 35 40

CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAG 242

Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu

45 50 55

GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG 290

Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu

60 65 70

GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC 338

Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser

75 80 85

CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT GGG GCC CTG 386

Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu

90 95 100

CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC ACA GCT 434

Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala

105 110 115 120

CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA 482

His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg

125 130 135

GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC 530

Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val

140 145 150

AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC TCT CTA GTC 578

Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val

155 160 165

CTC ACA CTG AAC GAG CTC TAGGTCGAC 605

Leu Thr Leu Asn Glu Leu

170

(2)SEQ ID NO：4的资料：

(i)序列特征：

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(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

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(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala

-21 -20 -15 -10

Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val

-5 1 5 10

Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser

15 20 25

Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala

30 35 40

Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys

45 50 55

Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met

60 65 70 75

Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly

80 85 90

Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu

95 100 105

Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp

110 115 120

Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val

125 130 135

Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala

140 145 150 155

Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu

160 165 170

Asn Glu Leu

(2)SEQ ID NO：5的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：22个碱基对

(B)类型：核酸

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(ii)分子类型：其他核酸

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CCCATGTCAA TCACAGCAGA CT

(2)SEQ ID NO：6的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：22个碱基对

(B)类型：核酸

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(ii)分子类型：其他核酸

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(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

CTTCACAGCA ACCTGAGCCA GT

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(A)长度：24个碱基对

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(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

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CAGTGCAACG AGACCCACCC TTTG

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(A)长度：25个碱基对

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(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

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GCCTACAAAT GTCACGCTGC CTGCT

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(A)长度：24个碱基对

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(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：

CCCACTTGTA ACTCATCCCT C

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(i)序列特征：

(A)长度：24个碱基对

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CAACTGAACG CCACTTGTCT CTCA

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(A)描述：/desc＝“核酸”

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ACTTGTCTCA ACTCCACCCT GGGGGA

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(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

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CTCCTGGGGA ACCTTTCTGG A

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(i)序列特征：

(A)长度：25个碱基对

(B)类型：核酸

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(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

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GACCACAAAT CACACCGATC CCAAT

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(A)长度：32个碱基对

(B)类型：核酸

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(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：

ACCCTTTGTC TACAAATGTC ACGCTGCCTG CT

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(i)序列特征：

(A)长度：25个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

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TCTCTCAAAC CTCACGGGGG AGCTT

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(i)序列特征：

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(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

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TGGAAAAATC AGACGGAGGA GAC

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(B)类型：核酸

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(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

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TGGAGGAGAA CAAGACACAG GACAT

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(A)长度：38个碱基对

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(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

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CCCTCTAGAC CACCATGGAA CTGACTGAAT TGCTCCTC

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(i)序列特征：

(A)长度：28个碱基对

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(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：

(B)位置：互补(1...28)

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GTGTGACTTG CTCGAGACTC AGCTGCCC

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(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：

(B)位置：互补(1...29)

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GAAGACCTAA CAACCTCACT CAGCTGCCC

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(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：

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AGTGACGGAG TCGGTCTATT CAGCTGCCC

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(A)长度：29个碱基对

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(ii)分子类型：其他核酸

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CACGTCCTTA ACAGCAGCCT GAGCCAGTG

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(i)序列特征：

(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核酸

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(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：

(B)位置：互补(1...29)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：

GTGCAGGAAT TGTCGTCGGA CTCGGTCAC

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(i)序列特征：

(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：

CCCTTTGCCT AACGGTTCCC TGCTGCCTGC TGT

(2)SEQ ID NO：25的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核酸

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(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：

(B)位置：互补(1...33)

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GGGAAACGGA TTGCCAAGGG ACGACGGACG ACA

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(A)长度：31个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：

TGCCTACACC TAACCTGTCG CCTGCTGTGG A

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(i)序列特征：

(A)长度：31个碱基对

(B)类型：核酸

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(C)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：

(B)位置：互补(1...31)

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ACGGATGTGG ATTGGACAGC GGACGACACC T

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(i)序列特征：

(A)长度：31个碱基对

(B)类型：核酸

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(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：

GGAAAACCAA TATGTCGGAG ACCAAGGCAC A

(2)SEQ ID NO：29的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：31个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：

(B)位置：互补(1...31)

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CCTTTTGGTT ATACAGCCTC TGGTTCCGTG T

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(A)长度：32个碱基对

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(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

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TGGGAGAATG GAACACCACG ATGGAGGAGA CC

(2)SEQ ID NO：31的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：32个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：

(B)位置：互补(1...32)

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ACCCTCTTAC CTTGTGGTGC TACCTCCTCT GG

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(i)序列特征：

(A)长度：32个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：32：

AAAACCCAGA TGAACGAGAC GACCAAGGCA CA

(2)SEQ ID NO：33的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：32个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：

(B)位置：互补(1...32)

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TTTTGGGTCT ACTTGCTCTG CTGGTTCCGT GT

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(A)长度：31个碱基对

(B)类型：核酸

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(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

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CCCAGATGGA GAACACCTCG GCACAGGACA T

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(i)序列特征：

(A)长度：31个碱基对

(B)类型：核酸

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(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：

(B)位置：互补(1...31)

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GGGTCTACCT CTTGTGGAGC CGTGTCCTGT A

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(A)长度：32个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

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CACGGGGACA AAACGGAACC ACTTGCCTCT CA

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(i)序列特征：

(A)长度：32个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：

(B)位置：互补(1...32)

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GTGCCCCTGT TTTGCCTTGG TGAACGGAGA GT

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(i)序列特征：

(A)长度：31个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

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CAGGGCAGGA ACACATCTCA CAAGGATCCC A

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(i)序列特征：

(A)长度：31个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：

(B)位置：互补(1...31)

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GTCCCGTCCT TGTGTAGAGT GTTCCTAGGG T

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(i)序列特征：

(A)长度：31个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：40：

GGGCAGGACC AACGCTAGCA AGGATCCCAA T

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(i)序列特征：

(A)长度：31个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：

(B)位置：互补(1...31)

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CCCGTCCTGG TTGCGATCGT TCCTAGGGTT A

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(i)序列特征：

(A)长度：24个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

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CAGTGCAACG AGTCCCACCC TTGG

(2)SEQ ID NO：43的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：24个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：

(B)位置：互补(1...24)

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GTCACGTTGC TCAGGGTGGG AAAC

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(i)序列特征：

(A)长度：24个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

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GACCACAAAT CACTCCGATC CCAA

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(i)序列特征：

(A)长度：24个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：

(B)位置：互补(1...24)

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CTGGTGTTTA GTGAGGCTAG GGTT

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(i)序列特征：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

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GTCCCCACCA ACACCTCTCT AGTCCTC

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(i)序列特征：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：

(B)位置：互补(1...27)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：47：

CAGGGGTGGT TGTGGAGAGA TCAGGAG

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(i)序列特征：

(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：

(B)位置：互补(1...33)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：48：

TGACCGAGAC CCGAAGACTT CACTCAGCTG CCC

(2)SEQ ID NO：49的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：31个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：49：

GAAAACCCAG AACGAGACCA CCAAGGCACA G

(2)SEQ ID NO：50的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：31个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：

(B)位置：互补(1...31)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：50：

CTTTTGGGTC TTGCTCTGGT GGTTCCGTGT C

(2)SEQ ID NO：51的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：26个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：51：

CACCAAGGCA CAGGACATTC TGGGAG

(2)SEQ ID NO：52的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：26个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：

(B)位置：互补(1...26)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：52：

GTGGTTCCGT GTCCTGTAAG ACCCTC

(2)SEQ ID NO：53的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：31个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：53：

GAAAACCCAG ATGAACGAGA CCAAGGCACA G

(2)SEQ ID NO：54的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：31个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：

(B)位置：互补(1...31)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：54：

CTTTTGGGTC TACTTGCTCT GGTTCCGTGT C

(2)SEQ ID NO：55的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：55：

GTCCCCACCA ACACCACTCT AGTCCTC

(2)SEQ ID NO：56的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：

(B)位置：互补(1...27)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：56：

CAGGGGTGGT TGTGGTGAGA TCAGGAG

(2)SEQ ID NO：57的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：

(B)位置：互补(1...33)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：57：

TGACCGAGAC CCGAAGACTT CACTCAGCTG CCC

(2)SEQ ID NO：58的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：58：

TCCCCAGCAA CACCTCTCTA GTC

(2)SEQ ID NO：59的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：59：

GTGTCGACAG GGGTCGTTGT GGA

(2)SEQ ID NO：60的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：60：

TCCCCAACAG AACCTCTCTA GTC

(2)SEQ ID NO：61的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc＝“核酸”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：

(B)位置：互补(1...23)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：61：

GTGTCGACAG GGGTTGTCTT GGA

Claims

1.一种mpl配体类似物，其中

(a)所述mpl配体包括一段氨基酸序列，该氨基酸序列为SEQ IDNO：1或其片段，该片段至少由SEQ ID NO：1的7～151位氨基酸组成，至多由SEQ ID NO：1的1-332位氨基酸组成，

[Asn164]；

[Asn163]；以及

[Asn30，Thr32，Asn56，Asn120，Thr122，Asn164]，和

2.权利要求1的mpl配体类似物，其中所述的mpl配体具有一段选自下列序列的氨基酸序列：

mpl配体1-332 SEQ ID NO：1中的第1～332位氨基酸；

mpl配体1-199 SEQ ID NO：1中的第1～199位氨基酸；

mpl配体1-191 SEQ ID NO：1中的第1～191位氨基酸；

mpl配体1-183 SEQ ID NO：1中的第1～183位氨基酸；

mpl配体1-174 SEQ ID NO：1中的第1～174位氨基酸；

mpl配体7-332 SEQ ID NO：1中的第7～332位氨基酸；

mpl配体7-191 SEQ ID NO：1中的第7～191位氨基酸；

mpl配体7-199 SEQ ID NO：1中的第7～199位氨基酸；

mpl配体7-183 SEQ ID NO：1中的第7～183位氨基酸；

以及

mpl配体7-174 SEQ ID NO：1中的第7～174位氨基酸。

3.权利要求2的mpl配体类似物，其中所述的mpl配体具有一段由SEQ ID NO：1中的第1～174位氨基酸组成的氨基酸序列。

4.权利要求2的mpl配体类似物，其中所述的mpl配体具有一段由SEQ ID NO：1中的第1～199位氨基酸组成的氨基酸序列。

5.根据权利要求2的mpl配体类似物，该类似物为：

[Asn30，Thr32，Asn56，Asn120，Thr122，Asn164]1-199。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的mpl配体类似物，该类似物是外源DNA序列在真核细胞中的表达产物。

7.根据权利要求6的mpl配体类似物，其中所述的真核细胞是哺乳动物细胞。

8.根据权利要求7的mpl配体类似物，其中所述的哺乳动物细胞是CHO细胞。

9.一种组合物，该组合物包括治疗有效量的权利要求1～5中任一项所述的mpl配体类似物以及药物学上可接受的稀释剂、佐剂或载体。