HUT61581A - Process for producing insulin analogs - Google Patents
Process for producing insulin analogs Download PDFInfo
- Publication number
- HUT61581A HUT61581A HU9202048A HU9202048A HUT61581A HU T61581 A HUT61581 A HU T61581A HU 9202048 A HU9202048 A HU 9202048A HU 9202048 A HU9202048 A HU 9202048A HU T61581 A HUT61581 A HU T61581A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- asp
- seq
- des
- chain
- insulin
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Obesity (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány tárgya az emberi gyógyászat körébe tartozik, részletesebben, a diabetes kezelésével kapcsolatos. Részletesebben, a találmány tárgya emberi inzulin molekula analógok, eljárás ezek alkalmazására, és eljárás gyógyszerészeti készítmények előállítására, amelyek aktív hatóanyagként a fenti inzulin analógokat tartalmazzák .
A Diabetes mellitus egy metabolizmus rendellenesség, amely azzal jellemezhető, hogy a testszövetek nem képesek oxidálni a szénhidrátokat a szokásos sebességgel. A cukorbaj (diabetes) legjellemzőbb faktora az inzulinhiány. Az utóbbi 70 év során a diabetesben szenvedő betegek legnagyobb mértékben úgy kezelhetők, hogy szabályozott menynyiségü inzulint adagolnak nekik. Az 1980-as évek elejéig a diabetes kezelésére alkalmazott inzulint az állati hasnyálmirigyből izolálták; általában marha vagy sertés felhasználásával. A rekombinációs DNS tecnhológia kifejlesztése lehetővé tette, hogy nagymennyiségű természetes humán inzulint állítsanak elő, illetve természetes és nem természetes humán inzulin analógokat szintetizáljanak. Ezek az inzulin analógok különféle fizikai és kémiai jellemzőkkel rendelkeznek, amelyek esetenként eltérnek a természetes humán inzulin jellemzőitől.
A természetes humán inzulin a B-lánc 10-es helyzetében hisztidint tartalmaz. Amennyiben ezt a hisztidin egységet aszparaginsavval helyettesítjük, továbbá eltávolítjuk a 29 és 30 B-lánchelyzetből a lizin és a treonin
- 3 egységeket, olyan analógot állíthatunk elő, amely az Asp (BIO) és a des (B29-3O) emberi inzulin analóg, és ez oldatban aggregálódik. Meglepően, amennyiben ebből az analógból a 28-helyzetből eltávolítjuk a prolin egységet, egy Asp (B10), des (B28-3O) humán inzulin analógot nyerünk, amely analóg stabil, gyors hatású és oldatban monomerként van jelen. Továbbá, amennyiben az Asp (B10), des (28-30) humán inzulin analóg B-lánc 27-helyzetéből a treonint eltávolítjuk, egy Asp (B10), des (27-30) humán inzulin analógot nyerünk, amely ugyancsak stabil, gyors hatású, és monomer formájú oldatban.
A találmány tárgya humán inzulin analógok, amelyeket úgy módosítunk, hogy a természetes humán inzulin B-lánc 10-helyzetében a hisztidin egységet aszparaginsav aminosav egységre cseréljük, továbbá a természetes humán inzulin B-láncának karboxil-terminális helyzetéből a tripeptidet vagy tetrapeptidet eltávolítjuk. A találmány szerinti molekulák továbbá módosíthatók a természetes humán inzulin A-lánc 21-helyzetében, illetve a természetes humán inzulin B-lánc 1- és 3-helyzetében ezek közül egyidőben mindkettőben is. Ezek az inzulin analógok stabilabbak, és kevésbé képesek dimerizációra vagy asszociációra, és nagyobb molekulatömegü formák képzésére; ennélfogva viszonylag gyorsabb biológiai aktivitásuak, és ugyanakkor rendelkeznek a természetes humán inzulin aktivitásával.
τ
A találmány tárgya továbbá eljárás magas vércukorszint kezelésére, melynek során az ilyen kezelést igénylő betegnek a fent leirt analógok hatásos mennyiségét adagoljuk.
Továbbá a találmány tárgya eljárás gyógyszerészeti készítmény előállítására, amely a találmány szerinti inzulin analóg hatásos mennyiségét és egy vagy több, gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagot tartalmaz .
A jelen találmány szerinti leírásban és a szabadalmi igénypontokban az alábbi rövidítéseket alkalmazzuk :
Asp (BIO), des (B28-3O) Hl
- humán inzulin analóg vegyület, amelyben a B-láncban a természetes humán inzulinban a 10-helyzetben a hisztidin egységet aszparaginsav egységre cseréltük, és a természetes humán inzulin B-láncban a 28-30 aminosav egységeket elhagytuk.
Asp (BIO), des(B27-3O) Hl
- humán inzulin analóg vegyület, amelyben a természetes humán inzulin B-láncának 10-helyzetében a hisztidin maradékot aszparaginsav maradékra cseréltük, és a természetes humán inzulin B-lánc 27-30-helyzetében található aminosavakat elhagytuk.
ΒΗΙ - bioszintetikus utón előállított humán inzulin.
Keresztkötés - a cisztein-aminosav maradékok között képzett diszulfid-kötések. A megfelelően keresztkötéssel ellátott természetes humán inzulin vagy inzulin analóg három diszulfid~hidat tartalmaz. Az első diszulfid-hid az A-lánc 6- és 11-helyzetében találhatócisztein maradékok között képzett. A második diszulfid-hid az A-lánc 7-helyzetében található ciosztein, és a B-lánc 7-helyzetében található cisztein között létrejött kötés. A harmadik diszulfid-hid az A-lánc 20-helyzetében található ciszteint és a B-lánc 19-helyzetében található ciszteint kapcsolja össze.
SEQ ID NO:1 - az első tag a szekvencia listán, amely analóg a humán inzulin A-lánccal, és amelynek szekvenciája az alábbi:
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin % 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa ahol
Xaa jelentése Asn, Asp, Glu, Gin, Alá, Gly vagy Ser.
SEQ ID NO:2 - a szekvencia listán feltüntetett második szekvencia, amely a humán inzulin B-lánc analóg, és az alábbi szekvenciáju:
Xaa | Val | Xaa | Gin | His | Leu | Cys | Gly | Ser | Asp | Leu | Val Glu Alá Leu |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||
Tyr | Leu | Val | Cys | Gly | Glu | Arg | Gly | Phe | Phe | Tyr | Thr |
20 | 25 |
ahol
Xaa jelentése az 1-es helyzetben Phe vagy Asp, és
Xaa jelentése a 3-as helyzetben Asn vagy Asp.
A leírásban alkalmazott valamennyi aminosav elnevezés rövidítés elfogadott az Amerikai Egyesült Államok Szabadalmi- és Védjegyhivatala által a 37 C.F.R. §
1.822(b) (2) /1990/ leírásnak megfelelően.
A találmány tárgya inzulin analógok, amelyek a
SEQ ID NO:1 (Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu
10 15
Asn Tyr Cys Xaa) képletüek, és megfelelően keresztkötöttek a
SEQ ID NO:2
(Xaa | Val | Xaa | Gin | His | Leu | Cys | Gly | Ser | Asp Leu Val | Glu Alá Leu Tyr Leu |
1 | 5 | 10 | 15 | |||||||
Val | Cys | Gly | Glu | Arg | Gly | Phe | Phe | Tyr | Thr) |
- 7 - |
képletű vegyületté, vagy ezek gyógyszerészetileg elfogadható sói, ahol az általános képletben az
SEQ | ID NO:1 (inzulin A-lánc) 21-helyzetében |
Xaa | jelentése Asn, Asp, Glu, Gin, Alá, Gly vagy Ser; és az |
SEQ | ID NO:2 (inzulin B-lánc) 1-helyzetében |
Xaa | jelentése Phe vagy Asp; továbbá az |
SEQ | ID NO:2 3-helyzetében |
Xaa | jelentése Asn vagy Asp. Az SEQ ID NO:1 21-helyzetében |
Xaa | jelentése előnyösen Gly, Alá, Ser vagy Asn. A 21-es helyzetben legelőnyösebben aszparagin- |
sav | aminosav található. Az SEQ ID NO:2 1-helyzetében talál- |
ható aminosav előnyösen Phe és az SEQ ID NO:2 3-helyzetében található legelőnyösebb aminosav-maradék Asn. Különösen előnyös találmány szerinti inzulin analóg, amelyben az
SEQ | ID NO:1 21-helyzetében |
Xaa | jelentése Asn, az |
SEQ | ID NO:2 1-helyzetében |
Xaa | jelentése Phe és az |
SEQ | ID NO:2 3-helyzetében |
Xaa | jelentése Asn. |
A standard biokémiai elnevezések szerint, amelyet a szakember könnyen értelmez, különösen előnyös analóg az Asp (B10), des (B28-3O) humán inzulin.
A találmány tárgya továbbá inzulin analógok, amelyek
SEQ ID NO:1 megfelelően keresztkötött, az SEQ ID NO:2 1-26 aminosavaihoz vagy gyógyszerészetileg elfogadható sóik, ahol az általános képletben
Xaa jelentése az SEQ ID NO:1 21-helyzetében Asn,
Asp, Glu, Gin, Alá, Gly vagy Ser; az
SEQ ID NO:2 1-helyzetében
Xaa jelentése Phe vagy Asp; és az
SEQ ID NO:2 3-helyzetében
Xaa jelentése Asn vagy Asp.
Előnyös vegyületekben az SEQ ID NO:1 21-helyzetben
Xaa jelentése Gly, Alá, Ser vagy Asn, legelőnyösebben Asn.
Előnyös analógok, amelyekben az SEQ ID NO:2 1-helyzetében található aminosav Phe, legelőnyösebben az SEQ ID NO:2
3-helyzetében található aminosav-maradék Asn. Különösen előnyös találmány szerinti analóg, amelyben az SEQ ID NO:1 21-helyzetében
Xaa jelentése Asn;
az SEQ ID NO:2 1-helyzetében
Xaa Phe;
az SEQ ID NO:2 3-helyzetében
Xaa jelentése Asn, és az
SEQ ID NO:2 lánc a 26 aminosav-maradékkal befejeződik.
Standar biokémiai elnevezés szerint különösen előnyös analóg az Asp (BIO), des (B27-3O) humán inzulin.
Más, találmány szerinti analóg az
SEQ ID NO:2 2-27 aminosavaihoz megfelelően keresztkötött
SEQ ID NO:1 vegyület vagy gyógyszerészetileg elfogadható sói, ahol az általános képletben az SEQ ID NO:1 21-helyzetében
Xaa jelentése Asn, Asp, Glu, Gin, Alá, Gly vagy Ser;
és az SEQ ID NO:2 3-helyzetében
Xaa jelentése Asn vagy Asp.
Előnyösen az SEQ ID NO:1 21-helyzetében
Xaa jelentése Asn, és az
SEQ ID NO:2 3-helyzetében
Xaa jelentése ugyancsak Asn.
A fenti, előnyös analóg a szokásos biokémiai elnevezés szerint Asp (BIO), des (Bl), des (B28-3O) humán inzulin.
A találmány szerinti további analóg az a vegyület, amelyben az SEQ ID NO:2 2-26 aminosavához megfelelően keresztkötött SEQ ID NO:1 található, vagy gyógyszerészetileg elfogadható sói, ahol az általános képletben az SEQ ID NO:1 21-helyzetében
Xaa jelentése Asn, Asp, Glu, Gin, Alá, Gly vagy Ser;
és az SEQ ID NO:2 3-helyzetében
Xaa jelentése Asn vagy Asp.
Előnyösen az SEQ ID NO:1 21-helyzetében
Xaa jelentése Asn, és az
SEQ ID NO:2 3-helyzetében
Xaa jelentése ugyancsak Asn.
A fenti, előnyös analóg a standard biokémiai elnevezés szerint Asp (B10), des (Bl), des (B27-3O) humán inzulin.
A találmány szerinti inzulin analógok kevéssé képesek arra, hogy dimerizálódjanak, vagy valamilyen más módon aggregálódjanak magasabb molekulatömegü formákká, akár cink-tartalmú, akár cink-mentes oldatokban. A találmány szerinti analógok oldatban monomerek, és gyorsan kifejtik hatásukat adagolás után.
A fentiek szerint a találmány szerinti vegyületekbe beleértjük a gyógyszerészetileg elfogadható sókat, ame lyeket az inzulin analóg vegyületekből képezünk. Előnyösen alkalmazható ilyen sók a cink, nátrium, kálium, magnézium, kalcium sók vagy ezek kombinációi.
A találmány szerinti inzulin analóg vegyületeket bármely szokásos, peptidszintézis eljárással előállíthatjuk, amely lehet például klasszikus, oldatban végzett eljárás, szilárd fázisú eljárás, félszintetikus eljárás és az újabban kidolgozott rekombinációs DNS eljárás.
Amennyiben szilárd fázisú eljárást alkalmazunk, az aminosav-szekvenciát lépésenként alakítjuk ki egy kezdeti oldhatatlan, gyantához kötött C-terminális aminosavból kiindulva .
A szilárd fázisú eljárást leírták J. Stewart és munkatársai, Solid-Phase Peptide Synthesis, Freeman és Co., San Francisco, 1969 közleményükben.
Általában a szilárd fázisú eljárás során a C-terminális aminosavat, amely a kívánt peptid C-terminális aminosava, egy oldhatatlan gyanta hordozóhoz kötjük, majd ezután a peptidláncot ettől a gyantához kötött C-terminális aminosavtól kiindulva állítjuk elő. Az egyes aminosavakat sorrendben kötjük a lánchoz, amíg a kívánt aminosav-szekvenciát nyerjük. Más eljárás szerint lehetséges, hogy kis méretű peptidfragmenseket állítunk elő előzetesen, és ezeket ezután a peptidláncba, a kívánt sorrendben építjük be. A peptidlánc a szintézis során a gyantához kötött állapotban marad, és amikor a lánc kialakítása befejeződött, ezt a láncot a gyantáról lehasitjuk.
A peptidláncot a polisztirol gyantához észterkötés segítségével kapcsoljuk, amelyet a C-terminális egység karboxilcsoportja és a gyanta mátrixban jelenlevő speciális metiléncsoport között képezünk.
Az aminosavakat a szakirodalomban peptidkötések képzésére alkalmazott, szokásos eljárásokkal kapcsoljuk egymáshoz. Ezek közül az egyik eljárás szerint az aminosavat olyan származékká alakítjuk, amely a karboxilcsoportot reaktívabbá alakítja a szabad N-terminális aminocsoporttal szemben, amely a peptidfragmensben található. Például, az aminosavat vegyes anhidriddé alakíthatjuk úgy, hogy valamely védett aminosavat etil-klór-formiáttal, fenil-klór-formiáttal, szek-butil-klór-formiáttal vagy izobutil-klór-formiáttal reagáltatunk. Más eljárás szerint az aminosavat aktív észter-származékká alakíthatjuk, amely lehet például
2,4,5-triklór-fenil-észter, pentaklór-fenil-észter, p-nitro-fenil-észter, N-hidroxi-szukcinimid-észter vagy 1-hidroxi-benzotriazolból képzett észter.
Más kapcsolási eljárás során kapcsoló reagenst alkalmazunk, amely lehet például N,N'-diciklohexil-karbodiimid (DCC) vagy N,N'-diizopropil-karbodiimid (DIC) . Más, megfelelő kapcsoló reagensek is alkalmazhatók, amelyeket a szakember könnyen felismer. Lásd például a Schroder és Lubke, The Peptides, Academic Press, 1965, III. fejezet, amelyet referenciaként adunk meg.
Nyilvánvaló, hogy bármely peptidszintézisben alkalmazott aminosav alfa-aminocsoportját védőcsoporttal kell ellátni a kapcsolási reakció során, abból a célból, hogy a mellékreakciókat elkerüljük, amelyek a reaktív alfa-aminocsoport révén kialakulhatnak. Ugyancsak nyilvánvaló, hogy bizonyos aminosavak reaktív oldallánc funkciós csoportokat tartalmaznak (például szulfhidril-csoport, epszilon-amino-csoport, béta- és gamma-karboxil-csoport, imidazolcsoport, guanidocsoport és hidroxilcsoport), amelyeket ugyancsak védőcsoporttal kell ellátni a kezdeti és a további kapcsolási reakciók során. Alkalmas védőcsoportok a szakirodalomban ismert csoportok. Lásd például: Protective Groups in Organic Chemistry, M. McOmie, Plenum Press, N. Y., 1973 és a 4,617,149 számú amerikai szabadalmi leírás, amelyeket referenciaként adunk meg.
Az adott védőcsoportok kiválasztása során bizonyos feltételeket figyelembe kell venni. Az alfa-amino-csoport védőcsoport (1) (2) (3)
Valamely alábbiak (1) (2) (3) az alfa-amino-csoportot a kapcsolási reakciókörülmények között inért állapotúvá kell alakítsa;
a védőcsoport könnyen eltávolítható legyen a kapcsolási reakció után anélkül, hogy az oldallánc védőcsoportokat eltávolitanánk, és megváltoztatnánk a peptidfragmens szerkezetét, továbbá a védőcsoport olyan legyen, hogy kizárja az aktiválás során közvetlenül a kapcsolás előtt a racemizációt.
oldallánc védőcsoporttal kapcsolatos feltételek az a védőcsoport a kapcsolási reakció során az olí dalláncon található funkciós csoportokat inért állapotúvá alakítsa;
a védőcsoport stabil legyen a reakciókörülmények között, amelyeket az alfa-amino-csoport védőcsoport eltávolítására alkalmazunk; és a védőcsoport könnyen eltávolítható legyen a kívánt aminosav-szekvencia előállításának befejezése után olyan reakciókörülmények között, amelyek nem változtatják meg a peptidlánc szerkezetét.
- 14 A szakember számára nyilvánvaló, hogy a peptidszintézisben ismerten alkalmazott védőcsoportok változó reaktivitásuk az eltávolításukra alkalmazott reagensekkel szemben. Például, bizonyos védőcsoportok, mint például a trifenil-metil-csoport és a 2-(p-bifenilil)-izopropiloxi-karbonil-csoport igen labilis csoportok, és enyhén savas körülmények között lehasithatók. Más védőcsoportok, mint például a terc-butoxi-karbonil-csoport, a terc-amiloxi-karbonil-csoport, az adamantiloxi-karbonil-csoport és a p-metoxi-benziloxi-karbonil-csoport kevésbé labilis csoportok, és közepesen erős savakat, mint például a trifluor-ecetsavat, sósavat vagy bór-trifluorid/ecetsav-elegyet igényelnek eltávolításukhoz. Más védőcsoportok, mint például a benziloxi-karbonil-csoport, halo-benziloxi-karbonil-csoport, p-nitro-benziloxi-karbonil-csoport, cikloalkiloxi-karbonil-csoport és az izopropiloxi-karbonil-csoport még stabilabbak, és erősebb savakat, mint például hidrogén-fluoridot, hidrogén-bromidot vagy bór-trifluor-acetát/trifluor-ecetsav-elegyet igényelnek eltávolításukhoz.
A kívánt peptid-szekvencia előállításának befejezésekor a védett peptidet el kell távolítani a gyanta hordozóról, továbbá valamennyi védőcsoportot el kell távolítani. A gyantáról történő lehasitási reakció és a védőcsoportok eltávolítása párhuzamosan vagy lépésenként is történhet. Amennyiben a gyanta hordozó egy klór-metilezett polisztirol gyanta, a peptid kötése a gyantához egy észterkötés, amely a C-terminális egység karboxilcsoportja és a
- 15 gyanta mátrixban található valamely klór-metil-csoport között képződött. Nyilvánvaló, hogy a gyantához kötő kötést olyan reagensekkel hasíthatjuk el, amelyek ismertek arról, hogy észterkötés hasítására alkalmasak, és képesek a gyanta mátrixba behatolni. Egy különösen alkalmas eljárás erre a célra a folyékony, vízmentes hidrogén-fluoriddal történő reakció. Ez a reagens nemcsak a peptidet hasítja le a gyantáról, de egyben valamennyi védőcsoportot is eltávolítja. Ennélfogva, ennek a reagensnek az alkalmazása közvetlenül a teljesen védőcsoport-mentes peptidet szolgáltatja.
Amennyiben olyan peptidet kívánunk előállítani, amelyről nem távolitottuk el a védőcsoportokat, a védett peptid-gyanta komplexet metanolizisnek vethetjük alá, és igy védett peptidet kapunk, amelyben a C-terminális karboxilcsoport metilezett. Ezután a metil-észtert enyhe alkalikus körülmények között hidrolizálhatjuk, és igy olyan peptidet állíthatunk elő, amely szabad C-termináls karboxilcsoporttal rendelkezik. A peptidláncon található védőcsoportokat ezután eltávolíthatjuk valamely erős savval, mint például folyékony hidrogén-fluoriddal történő kezelés segítségével.
A metanolizisre alkalmazható eljárást irt le G. Moore és munkatársai, Peptides, Proc. 5th Amer. Pept. Symp., M. Goodman és J. Meienhofer, Eds., John Wiley, N. Y., 1977, 518 - 521. oldal, közleményében, amelynek során a védett peptid-gyanta komplexet metanollal és kálium-cianiddal reagáltatják koronaéter jelenlétében.
• * ·*<·
- 16 »4 ·« ♦· *· ♦ ·*
4·· vC··
Yás eljárással a védett a peptidet a gyantáról ammonolizis segítségével vagy hidrazinnal történő reagáltatássál távolíthatjuk el. Amennyiben kívánatos, a kapott U-terminális amidot vagy hidrazidot ezután hidrolizálhatjuk, és szabad C-terminális karboxílesöpörtot állíthatunk elő, illetve a védőcsoportokat kívánt módon eltávolithatjuk.
Ugyancsak nyilvánvaló, hogy az N-terminális alfa-amino-csoporton jelenlevő védőésöpört okát előnyösen zz a védett peptid gyanta hordozóról való lehasitása előtt vagy ezzel párhuzamosan távolíthatjuk el.
A találmány szerinti inzulin analógok A és B láncait előállíthatjuk rekombinációs DNS eljárás segítségével is. Az előállítás során az A vagy B lánc kívánt peptidjét kódoló nukleotid szekvenciát rutin techno lógiákkal állíthatjuk elő, amelyeket ilyen szintézisekben alkalmaznak.'Ezek az eljárások általában valamely oligonukleotid előállításból állnak, amely oligonukleotidok mind a fragrnenseket tartalmazzák a kódolt szekvenciának megfeleloen, és ennek komplement szekvenciáját is tartalmazzák. Az oligonukleotidokat úgy tervezik, hogy a kódoló szekvencia egy fragmense átfedjen a komplement szekvencia két fragmensével, és .fordítva. Az oligonukleotidok párosítottak és kapcsoltak, és igy egyértelműen a kívánt gén szekvenciát szolgáltatják.
·· *
- 17 A szekvenciát egy klón vektorba inszertálják olyan helyen, amely lehetővé teszi, hogy a kódolt peptid termék expressziéja megtörténjen.' A proinzulin és proinzulin analógok expresszálására alkalmas plazmidok előál1itását leírták Chance és munkatársai a 0 3E’3 472 számú uró’pfii szabadalmi leírásban, amelyet 1990. augusztus 22· tettek közzé, és amelyet itt referenciaként adunk meg.
A találmány szerinti inzulin analógok A és
B láncait továbbá előállíthatjuk proinzulin-szerü prekurzor molekulán keresztül is, rekombinációs BNS technológiát alkalmazva; lásd: Frank és munkatársai, Peptides: Synthes i s-Struct ure-Funct i on,
Proc . Seventh Am. Pept. Symp., Eds ként adunk meg.
Az egyes és munkatársai, Peptides: Synthesis, ként adunk meg dákon részletesen bemutatjuk. A példák nem jelentik a találmány tárgyának korlátozását
t —’
1, példa
Asp(B10), dez(B27-30) humán inzulin
A) Enzimes .félszintézis
A cim szerinti inzulin analóg vegyületet enzimes félszintézis (reverz proteolizis) segítségével állítjuk elő Asp(B10) dezoktapeptid (B23-3O) humán inzulin és szintetikus Gly-Phe-Phe-Tyr tetrapeptid alkalmazásával. A tetrapeptidet szilárd fázisú peptid szintézis segítségévei. állítjuk elő, az Asp(B10) dez-oktapeptid humán inzulint pedig Asp(B10) humán proinzulinból nyerjük tripszin hidrolízis reakció segítségével, amellyel a 23-65.' .szekvenciát eltávolít juk. Az Asp(BlO) proinzulin analógot rekombinációs DNS eljárás segítségével állítjuk elő. lényegében a C.hance és munkatársa.! 0 383 472 számú európai szabadalmi leírásban (1990. augusztus 22-én közzétett) leírt eljárásának megfelelően, amely közleményt referenciaként adunk meg. Az EPO 0 383 472 számú szabadalmi leírás 35. oldalán leírtak egy nukleotid kapcsoló szekvenciát (ii), amelyet a pRB17’3 plazmid előállítására alkalmaztak, amely plazmid a Met-Tyr~/Asp(B1), Lys(B28), Pro(B29)HPl/ vegyületet kódolja.. A találmány szerinti eljárás kiindulási vegyületének előállítására alkalmazott Asp(B10) plazmid hasonló kapcsolót tartalmaz, mint az (ii) kapcsoló, azzal az eltéréssel, hogy az (ii) szekvenciában az Asp egységet ···« · «· .t ....
- 19 kódoló CGAC szekvencia egy TTTT szekvenciával helyettesitett, amely Phe kódolására alkalmas, és a His kódolására alkalmas GAT szekvenciát GAC szekvenciával helyettesítették, és igy egy olyan plazmidot nyertek, amely az Asp(BiO), Lys(B2S), Pro(B29) humán proinzulin kódolására alkalmas.
A genetikai kódolás nagy variációs lehetősége valamint a szakember ismeretei lehetővé teszik számos szubsztitúció végrehajtását, és igy az Asp(B10) humán proinzulin kódolására alkalmas plazmidok előállítását.
Az Asp(B1O), dez-okta.peptid humán inzulint az alábbi eljárással állítjuk elő: '700 ml (9,8 g) hajtogatott Asp(B10) humán, proinzulin 2,5 pH-értélüi glicin pufoldatának pH-ertékét 25 ml ammóniurn-hidr-ferban készült
értékre állítjuk be Τ’
Ezután a pH-értéket hirtelen 9,10 értékre állítjuk 20 ml tömény sósav adagolásával. Ehhez az oldathoz 7 ml kalcium-klorid vizes oldatát adjuk (14,7 mg/ /ml), majd ezt követően ml 14 mg/ml töménységű sertés tripszin vizes oldatát adjuk, és igy az enzim/szubsztrát arányt körülbelül 1 : 10 értékre állítjuk (tömegarány). A tripszines hidrolízis reakcióelegyet jól elkeverjük, majd 17 órán, át 25°C hőmérsékleten tároljuk, ezt követően a reakciót 160 ml jégecetsav hozzáadásával leállítjuk úgy, hogy a végső pH-érték 3,09 legyen. Ezt követően· az elegyhez 105 ml acetonitrilt adagolunk.
···· 9 «4 ·«·· !
- 20 A kapott Asp(BIO), dez-oktapeptid humán inzulin izolására és tisztítása céljából a tripszines bomlási oldatot 5S5 x 30 cm méretű, C-18 Vydac nagynyomású folyadék-kromatográfiás oszlopra visszük, 25°C hőmérsék leten. A kromatográfiás eljárás céljára két puffért állítunk elő:
A-puffer: 10 rész acetonitril és 90 rész 0,5 %-os triflucr-ecetsav-oldat, és
B-puffer: 50 rész acetonitril és 50 rész 0,5 %-os triflur-ecetsav-oldat.
Az oszlopot rövid ideig az A-pufferral mossuk, majd ezután 16 órán át 2,4 ml/perc áramlási sebességgel lineáris gradiens módon 0 - 20 % B-pu.ffert alkalmazunk. Ezt követően 8 órán át 8 ml/perc áramlási sebességgel, lineáris gradiens 20 -- 7’0 % B-puffert alkalmazunk. A legnagyobb Asp(B10) , dez-oktapeptid humán inzulint tartalmazó csúcsot körülbelül 50 % B-puffér-értéknél izoláljuk. A kívánt anyagot tartalmazó frakciókat, amelyeket reverz fázisú analitikai nagynyomású folyadék-kromatográfia segítségével azonosítunk, egyesitjük, és liofilizáljuk. A végső visszanyert tömeg
5,5 amelynek nagynyomású folyadék-kromatográfia szerinti tisztasága 93 %, Az Asp(.B10), dez-oktapeptid (B23-30) humán inzulin azonosítását aminosav-analizissel, tömegspektroszkópia segítségével és NHg-terrninál analízissel végeztük.
A óim szerinti inzulin analóg előállítása cél- jából 545 mg Asp(B1O), dez-oktapeptid humán inzulint és det elegyítünk ml oldatban, amely egy rész dimetil-szulfoxidot, 2 rész
1,4 ~bután-dióit fért tartalmaz
Az elegyítést és egy rész 0,35 m tris puf37°C hőmérsékleten végezzük, és a pH-értéket nem változtatjuk. Az elegyhez 85 mg sertés tripszint adagolunk. Az oldatot ezután jól elkeverjük, és 360 percen át 37°C hőmérsékleten tartjuk, időnkénti keverés alkalmazásával. A fehérjéket hideg aceton segítségével kicsapjuk, majd diéti-éterrel mossuk, és nitrogén áramban megszáritjuk. Végül a fehérjéket 75 ml 6 m guanidin-HCl-oldatban oldjuk (0,01 n HC1).
Ezt a tiszta minta-oldatot gélszűrésnek vetjük alá 5 x 200 cm oszlopon (Sephadex &-50, Superfine), és m ecetsavval eluáljuk 4°G hőmérsékleten.'’ A kifolyó oldatot
276 nm értéken vizsgáljuk,, reverz fázisú nagynyomású folyadék-krómatográfia segítségével is analizáljuk.' A óim szerinti vegyületet tartalmazó frakciókat egyesítjük (körülbelül 275 ml), majd vízzel 500 ml térfogatra hígítjuk. Ezután ezt az oldatot 21 x 2.50 mm 0-8 Zorbax oszlopra visszük, és a termékeket acetíonitril gradiens elucióval, amelyet 0,1 m nátrium-foszfátban képezünk (pH -- 2 puffer) eluáljuk /
Meghatározzuk, hogy mely frakciók tartalmazzák a cim szerinti inzulin analóg vegyületet, amely meghatározást analitikai nagynyomású folyadék-kromatográfia segítségével végzünk. Ezeket a frakciókat egyesitjük, majd,, négyszeres térfogatra higitjuk, víz segítségével. Az oldatot 25 x 300 mm C-18 Vydac oszlopra visszük. A sómentes fehérjét gradiens acetonitril 0,5 % trifluor-ecetsavban készült eluensével eluáljuk. A tisztított .inzulin analógot tartalmazó frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk, igy 22 mg terméket kapunk. A termék szerkezetét gyorsatom-ütköztetéses tömegspektroszkópia segítségével (PAB/MS) és aminosav-analizissel igazoljuk. A EAB/MS spektroszkópia szerint a molekulatömeg 5358,3 (számított: 5358,0). Az aminosav-ös s zet étel aszparaginsav mólegységre számítva
az alábbi (a; | í elméleti aminosav-arányokat zárójelben ad- |
juk meg): Asp, 4,00(4), Thr, 1,00(1), Ser, 2,50(3),
Glu, 6,90(7), | Gly, 3,92(4), Alá, 1,01(1), 1/2 Cys, |
4,92(6), Val, | 3,55(4), Ile, 1,73(2), Leu, 6,03(6), |
Tyr, 3,70(4), | Phe, 2,86(3), His, 1,31(1), Arg, |
1,00(1).
B) Láncegyesités . Asp(BlO), dez(B27-30) humán inzulin B-lánc előállítása
Applied BioSystems 43θΑ pepiid, szintetizátort alkalmazunk (a software helyesbítés 1.4 egységgel együtt) a nyers peptidil-gyanta előállítására. 0,5 mmól kiindulási szilárd fázisú gyantát (t-BOC-Thr /Bzl/ OCHg Pam gyanta) alkalmazunk (0,61 mmól/g x 0,91 g)
Valamennyi alkalmazott aminosav BOC védőcsoporttal ellátott, és a glutaminsav, az aszparaginsav és a hisztidin.
kivételével olyan állapotban, alkalmazzuk, ahogy vásároltuk (azaz az Applied Biosystems, Inc. csomagolásában; valamennyi ampulla körülbelül 2 mmól védett aminosavat tartalmaz). A glutaminsavat, az aszparaginsavat és a hisztidint kereskedelmi forrásból szereztük be és ampullákba helyeztük úgy, hogy az egyes ampullák körülbelül 2 mmól kívánt, védett aminosavat tartalmazzon. A nyers peptidil-gyantát szobahőmérsékleten 5 órán, át vákuumban s z á-
gel, hogy megbizonyosodjunk arról, hogy megfelelő tömegnövekedés történt minta kis részét aminosav-analizisnek vetjük alá, hogy megbizonyosodjunk arról, hogy as adott aminosavak a kívánt arányban épültek be.
A pepiidet ex peptidil-gyantáról lehasitjuk, és az oldalláncról a védőcsoportokat eltávolítjuk úgy, hogy körülbelül 1 órán át 0°C hőmérsékleten 10 rész (tér f ogat/tömeg) hidrogén-fluoriddal (amely 5 /t ér fogat/t ér tartalmaz) keverjük, amelyet 1 rész peptidil-gyantára szá mit va alkalmazunk, λ hidrogen-flucrid nagy részét vákuumban eltávolítjuk, majd a pepiidet etiléter segítségével, csapadékként leválasztjuk. A pepiidet többször etil-éter rel mossuk, majd vákuumban leszűrjük, és végül körülbelül
200 ml 8 m guanidin-HCl-oldatban oldjuk, amelynek pH-értéke és 0,1 m tris-tartalmu, továbbá 35 mg/ml NaoS'0·-, L- >
rng/ral Na?S^Og tartalmú. Az oldat pH-értékét 5 n nátrium-hidrcxid segítségével 8,8 értékre állítjuk be, majd.
órán át szobahőmérsékleten erősen keverjük.
A kapott S-szulfonált peptid.-cld.atot x 215 cm Sephadex G-25 (Coarse) oszlopra visszük szobahőmérsékleten. A mintát 21 ml/perc áramlási sebességgel, szobahőmérsékleten 50 mmól NH^HCO^ eluenssel eluáljuk.
A kifolyó oldatot 276 nm értéknél vizsgáljuk, és a kívánt lyeket fagyasztunk és liofilizálunk.
2.
Az Asp(B10) dez(E27-3O) humán inzulin
és a humán inzulin A-lánc kombinlása
Az A- és B-j.áncok kombinációját Chance és munkatársai által leírt eljárással végezzük, lásd a fent idézett irodalmat, és ennek során a fent idézett EPO 0 383 472 számú szabadalmi leírásban leirt rekombinációs eljárással előállított A-láncot alkalmazunk
2,2'7 g· rekombinációs DNS eljárással előállít ott
A-lánc S-szulfonátot és 511 mg szintetikus Asp(BlO) dez(27-30) B-lánc S-szulfonátot elegyítünk egy lombikban, és szobahőmérsékleten
245 ml 0,1 m glicin-oldatbán oldjuk? Az oldat pH-ért ék ét n NaOH segítségével 10,5 értékre állítjuk be, majd 4°C hőmérsékletre hütjük. Az elegyhez 0,1 m glicin-pufferban készített, 15,5 mg/ml ditio-treitol (DTT) oldatot adago lunk, majd a pH-értéket 5 n NaOH oldattal 10,5 értékre állítjuk be, majd az elegyet 4°C hőmérsékletre hütjük?
Az egyesitett A-lánc és B-lánc S-szulfonáto.k (SH/SSO“7 ~ 1,0) oldathoz gyorsan 18,5 ml T)TT-oldatot adunk. A reakció-oldatot 4°C hőmérsékleten keverjük 26 órán át, 500 ml térfogatú Erlenmeyer lombikban. Ezután 3S7 ml foszforsavat adagolunk hozzá, és igy a pH„értéket 2,9 érk téré állítjuk be.
viz és acetonitril eleggyel hígítjuk, majd reverz fázisú, nagvnyomású folyadék-kromatográfia (ennek során 50 x 300 mm Vydac ?zobahőmérs éklétén végezzük, és lineáris gradiens növekvő
O' acetonitril halmazunk) .
tartalmú, 0,1 m NaHgPO^ (pH ~ 2,3) eluenst al
A kifolyó oldatot 280 nm érték mellett analizáljuk. A vá lasztott frakciókat analitikai nagynyomású folyadék-kro tar talmazó frakciókat egyesitjük (405 ml), majd. '100 ml milli-Q vízzel hígítjuk, és 1,2 g Na^S^O^ anyagot adunk hozzá, majd a pH-értéket 5 n NaOH segítségével 7-re állítjuk be. Az elegyet tovább tisztítjuk reverz fázisú nagynyomású folyadék-ki· ómat ográfia segítségével (amelynek során 21 x 250 mm Dupont Zorbax C-8 oszlopot alkalmazunk, az eluciót szobahőmérsékleten végezzük
2,0 ml/perc áramlási sebességgel, és lineáris gradiens növekvő acetonitril-tartalmn, 0,1 m (NH^)οΗΡ0^ eluenst alkalmazunk)
A kifolyó oldatot 280 ntn érték mellett analizáljuk, A választott frakciókat analitikai nagynyomású folyadék-krómatográfia segítségével analizáljuk. A kívánt frakciókat egyesítjük, majd pH-értéküket H^PO^ segítségével 2,3 értékre állítjuk be. Ezután az elegyet Vydac C-18 nagynyomású folyadék-kromatográfiás oszlopra visszük (21 x 250 mm), majd lineáris gradiens növekvő acetonitriltartalrnu 0,5 %-os, vizes trifluor-ecetsav eluenssel eluáljuk. A kifolyó anyagot 280 nm érték mellett analizáljuk.'
A választott frakciókat analitikai nagynyomású folyadék-kromatográfia segítségével analizáljuk, A megfelelő frakciókat egyesitjük, majd liofilizáljuk, és így 135 mg inzulin analógot kapunk, amely reverz fázisú nagynyomású folyadék-krómatográfia szerinti analízisnek megfelelően %-nál nagyobb tisztaságú.' Az anyagszerkezetét gyorstom-ütlcöztetéses tömegspektroszkópia (FAB/I6S) segítség vei, és aminosav-analízis segítségével igazoljuk. A PAB/.MS spektroszkópia mérése szerint a molekulatömeg 5358,5 (számított: 5358,0)
Az, amiηosav öss zétét elét as zparáginsav mólegységre számítva mérjük (az elméleti aminosav arányt zárójelben adjuk meg): Asp, 4,00(4), Thr,
0,98(1), Ser, | 2,72(3), Glu, 7,14(7), Gly, 3,93(4), |
Alá, 0,98 (1) , | 1/2 Cys , 5,44(6), Val, 3,44(4), Ile, |
1,51(2), Leu, | 6,14(6), Tyr, 3,86(4), Phe, 2,88(3), |
His, 1,09(1), Arg, 0,97(1).
példa
Asp(B10), dez(B28-30) humán inzulin
A cim szerinti inzulin analóg vegyületet enzime,3 félszint ézis segítségével állítjuk elő, az 1 példa szerinti élj ár ás nak me gf e ?i e 3. ő e n:
Asp(BíO) dez-oktapeptid (B2.3-3O) humán inzulin és szintetikus Glv-Phe-Phe-Tyr-Thr pentapeptid alkalmazásával. Az alkalmazott pentapeptidet szilárd fázisú peptid-szintézissel állítjuk elő, az Asp(BlO) dez-oktapeptid humán inzulint pedig az Asp(BlO) humán proinzulinból tripszin hidrolízis
765 mg Asp(BlO) dez-oktapeptid humán inzulint és 500 mg szintetikus Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr pentapeptidet elegyítünk 21 ml oldatban, amely oldat 1 rész dimetil
-szulfoxidot, 2 rész 1,4-bután-diolt és 1 rész 0,35 m tris-puffert tartalmaz, 37°C hőmérsékleten (a pH-érték nem módosított). Sertés tripszint (127 mg) adagolunk az oldathoz, majd alaposan elkeverjük, és 240 percen át 37°C hőmérsékleten időnként keverés közben állni hagyjuk.
A fehérjéket hideg acetonnal lecsapjuk, majd dietil-éter rel mossuk, nitrogén áramban megszorítjuk, és végül 50 ml 6 m guanidin-HCl oldatban oldjuk (amelyet 0,01 n HC1 segítségével készítünk). Ezt az áttetsző minta-oldatot x 200 cm Sephadex G-50 (Superfine) oszlopon gélszürésnek vetjük alá, ahol eluensként 1 m ecetsavat alkalmazunk 4°C hőmérsékleten. A kifolyó oldatot 276 nm értéknél, továbbá reverz fázisú nagynyomású folyadék-kromatográfia segitségével analizáljuk. A cim szerinti termeket tartalmazó frakciókat egyesitjük (körülbelül 250 ml), majd vizzel 500 ml térfogatra higitjuk. Ezután ezt az oldatot 21 x 250 mm C-8 Zorbax oszlopra visszük, és a terméket gradiens acetonitril-tartalmu, 0,1 m nátrium-foszfát, pH = 2 puffer, eluenssel eluáljuk,' A megfelelő, cim szerinti inzulin analógvegyületet tartalmazó frakciókat, amelyeket analitikai nagynyomású folyadék-krómatográfia segítségével határozunk meg, összegyűjtjük, majd ezeket a frakciókat vizzel ötszörös térfogatra higitjuk (400 ml). A kapott elegyet 25 x 300 mm C-18 Vydac oszlopra visszük. A sótalanitott proteint acetonitril gradiens eluenssel, amelyet 0,5 %-os trifluor-ecetsavban képezünk, eluáljuk. A tisztított inzulin analóg vegyületet tartalmazó frakciókat egyesitjük, és liofilizáljuk, igy 47 mg terméket kapunk. A termék szerkezetét gyorsatom-ütköztetéses tömegspektroszkópia (FAB/MS) és aminosav-analizis segítségével igazoljuk. A FAB/MS spektrum szerinti molekulatömeg 5459,2 (számított: 5459,1), az aminosav-összetétélt az aszparaginsav mólegység alapján számítjuk (az elméleti aminosav arányokat zárójelben adjuk meg):
Asp, 4,00 (4),
Gly, 4,01 (4) ,
3,77(4), Ile,
2,94(3), His,
Thr, 1,86(2),
Alá, 1,07(1),
1,85 (2) , Leu,
1,15 (1), Arg,
Ser, 2,56(3), 1/2 Cys, 5,38 6,14(6), Tyr,
0,96 (1) .
Glu, 7,03(7), (6), Val,
3,80(4), Phe,
3? példa
Oldat-stabilitás
A lebomlási analízis vizsgálatokat az inzulin vagy inzulin analóg mintákkal 50°C hőmérsékleten végezzük, és körülbelül 3»5 mg/ml koncentrációjú oldatokat alkalmazunk, amelyeket 0,1 m nátrium-foszfát, pH = 7,4 (hacsak másképp nem jelezzük), 0,25 % krezol és 1,6 % glicerol-oldatban készítünk. Különböző időpontokban az inkubációs elegy mintáit 10-szeres felesleg 6 m guanidin-HCl, 0,1 m nátrium-foszfát, pH = 3,0 oldattal megbontjuk, 23°C hőmérsékleten, majd a tárolt mintákból nagynyomású folyadék-kromatográfiás mintákat veszünk, analízis céljára. A leállított reakcióju inkubációs mintákat 5°C hőmérsékleten tárolhatjuk 2 héten át anélkül, hogy a nagynyomású folyadék-krómatográfia méretű mintában változást, eltérést tapasztalnánk. A nagynyomású folyadék-krómatográfia minta méretű analízist DuPont Zorbax 01^-250 oszlopon végezzük (50 yul injektálás) 6 m GdnHCl, 0,1 m nátrium-foszfát eluens oldat alkalmazásával (áramlási sebesség = 1 ml/perc, 23°C, detektálás 278 nm érték mellett). A monomer degradálódás sebességét a monomer csúcs logaritmus-idő görbe meredekségéből számítjuk, és a lebomlás fél-élettartam (t 1/2) f
V
- 30 időt a t 1/2 = 0,693 “ sebesség-értékből határozzuk meg.1
Az eredményeket az 1. táblázatban mutatjuk be.
1? TÁBLÁZAT
Oldat-stabilitás
Molekula t 1/2 monomer /50 C (+/- 10 %)^hőmérsékleten napok száma/ pH 6,1
BHI + CÍnk | 94 |
Asp(BlO), des(B27-30)Hl | 89 |
dés(B29-30)HI | 49 |
Asp(BlO), des(B30)HI | 49 |
des (B27-30)HI | 46 |
Asp(BlO), des(B28-30)Hl | 37 |
Asp (B10)HI | 33 |
des(B28-30)HI | 32 |
des(B30)Hl | 24 |
BHI (Zinc-free) | 12 |
des(B26-3 0)Hl | INa |
Asp (BIO), des(B26-30)Hl | INa |
= A vegyületek nem maradnak oldott állapotban a kísérlet teljes időtartama alatt .’ • · · ·
4. példa
Egyensúlyi denaturálás
Az egyensúlyi denaturálás kísérleteket a
Brems és munkatársai (1990), Biochemistry 29:9289-9293 közlemény szerinti eljárással végezzük, amelyet referenciaként adunk meg. Fehérjetárolt oldatokat képezünk körülbelül 10 mg/ml inzulin vagy analóg tartalommal, 20 mmól HEPES pH = 7,5, 20 % (térfogat/térfogat) etanol és .1 mmól EDTA oldatban, GdnHCl adagolásával, vagy enélkül. A denaturálódó tárolt oldatot körülbelül 7 m GdnHCl 20 mmól HEPES pH - 7,5, 20 % (térfogat/térfogat) etanol és 1 mmól EDTA alkalmazásával készítjük. A denaturálási mintákat úgy készítjük, hogy elkeverjük a fehérje különféle arányú menynyiségét, és a denaturálási tároló oldatokat továbbá egy 20 mmól HEPES, pH = 7,5, 20 % (térfogat/térfogat) etanol és 1 mmól EDTA oldatot abból a célból, hogy a megfelelő denaturálási koncentrációt nyerjük.’A GdnHCl koncentrációkat törésmutató méréssel, Abbe-3L refraktométer segítségével mérjük.
A fehérjetárolt oldatot legutolsóként adagoljuk a denaturálási minták elkészítése után, majd a teljes mintát enyhe keverés segítségével elegyítjük. A GdnHCl maximális oldhatósága 20 %-os, vizes etanolban körülbelül 7 m, ennélfogva olyan mintákat készítünk a tárolt GdnHCl oldatokból, amelyek körülbelül 8 m értékűek, és nem tartalmaznak etanolt, amelyek nagyobb mint 7 m koncentrációjuak.
A cirkuláris dikroizmus méréseket Aviv 62D spektrofotométerrel mérjük 23°C hőmérsékleten. Az eredményeket a 2. és
3. táblázatokban adjuk meg.
2. TÁBLÁZAT
Egyensúlyi denaturálás
Delta G ( + /- 6%)
1. | Asp(BlO), des(B27-30)Hl | 6.2 |
2 . | Asp(BlO), des(B29-30)Hl | 6.0 |
3 . | Asp(BlO), des(B26-30)Hl | 5.8 |
4 . | Asp(BlO), des(B30)HI | 5.5 |
5. | Asp(BlO), des(B28-30)Hl | 5.4 |
6. | Asp(BIO)Hl | 5.1 |
7 . | BHI (cink mentes) | 5.1 |
8. | Asp(BlO) des(B23-30)HI | 5.1 |
9. | des(B28-30)HI | 5.0 |
10. | des(B30)HI | 4.6 |
11. | des(B26-30)Hl | 4.5 |
12. | des(B27-30)Hl | 4.3 |
13 . | des(B29-30)HI | 4.3 |
14. | des(B23-30)HI | 3.8 |
• · ·
3? TÁBLÁZAT
Egyensúlyi denaturalás
Középért ék (+/- 2
1. | Asp(BlO), des(B27-30)Hl | 5.8 |
2. | Asp(BlO), des(B26-30)Hl | 5.7 |
3 . | Asp(BlO), des(B30)HI | 5.6 |
4. | Asp(BlO) des(B23-30)HI | 5.6 |
5. | Asp(BlO), des(B29-30)Hl | 5.5 |
6. | Asp(BlO), des(B28-30)Hl | 5.5 |
7 . | Asp(B10)Hl | 5.3 |
8. | des(B29-30)HI | 5.2 |
9. | des(B27-30HI | 5.1 |
10. | des(B26-30)Hl | 5.1 |
11. | des(B30)HI | 5.0 |
12 . | des(B28-30)HI | 5.0 |
13 . | des(B23-30)HI | 4.7 |
14 . | BHI (cink mentes) | 4.5 |
5. példa
Egyensúlyi ultracentrifugálás
Az inzulin aggregációs viselkedését egyensúlyi ultracentrifugálás során mért szedimentáció segítségével határozzuk meg. Az egyes analóg vegyületek asszociációs állapotát a Pékár, A.H. és Frank, B.H. (1972) Biochemistry 11:4013-4016 közleménye szerinti eljárással
- 34 határoztuk meg, amelyet referenciaként adunk meg. Az eredményeket a 4. táblázatban adjuk meg az inzulinra és a hasonló vegyületekre, amelyeket 3,5 mg/ml fehérje-koncentrációban alkalmazunk, pH = 7,2, 0,05 m NaCl - 0,05 m nátrium-foszfát-oldatban, 22°C hőmérsékleten. Az adott értékek a megfigyelt molekulatömeg átlaga, osztva a monomer molekula tömegével, amely a vegyületre érvényes. Ennélfogva ez az arányszám az aggregációt jelző érték az egyes inzulin analógok esetében. Az eredményeket megadtuk a cink-mentes BHI vegyületre is. Nyilvánvalóan az érdeklődésre számottartó vegyületek igen kis mértékű ön-asszociációs jellemzőjüek, a humán inzulinnal összehasonlítva.
4. TÁBLÁZAT
Egyensúlyi ultracentrifugálás
Vegyület Mw/M1
1; Asp(BlO), Des(B27-30)Hl
2. Asp(BlO), Des(B28-30)Hl
3. Des(B27-30)HI
1.06
1.20
1.80
4. Asp(BlO), Des(B29-30)Hl
5. Asp(B10)HI
2.3
6. Des(B28-30)HI
2.3
7. Des(B29-30)Hl
4.6
8. BHI (cink mentes)
6.6
· f
6. példa
Receptor kötődés
A találmány szerinti inzulin analógok fiziológiai hatását az alábbi in vitro inzulin receptor kötődési tesztvizsgálattal mutatjuk ki. Mikroszóma membránokat nyerünk kifejlett humán placentából, ismert eljárás szerint (lásd: Marshall és munkatársai /1974/, Characterization of the Insulin and Somátomedin-C Recept őrs in Humán Placental Cell Membranes, J. Clin. Endocrin, Metab., 39:283-292). Ezt követően körülbelül 30 /ug fehérjét inkubálunk 45.000 - 50.000 cpm^^^l[A14]-humán inzulinnal együtt, és növekvő mennyiségű, hideg, kompétitiv ligandummal egy 0,5 ml térfogatú, 100 mmól HEPES, pH = 7,8, 120 mmól NaCl, 5 mmól KC1, 1,2 mmól MgSO^, 8 mmól glükóz és 0,25 % BSA tartalmú oldatban. Az elegyet 4°C hőmérsékleten 24 órán át inkubáljuk, majd a membránokat üvegszürőn izoláljuk egy Skatron sejtgyüjtó segítségével, és a kötött I-tartalmat meghatározzuk. Hogy a humán inzulinnal a különféle inzulin analógokat összehasonlíthassuk (lásd az 5. táblázatot), kompetitiv kötési görbéket határoztunk meg abból a célból, hogy meghatározzuk azokat a hatásos hormon-koncentrációkat (ED^0) j amelyek a ^^^I-inzulin 50 %-os helyettesítését biztosítják. Az Asp(B10), dez(B27-3O) humán inzulin és az Asp(B10), dez(B28-30) humán inzulin különösen hatásosnak bizonyultak ebben a receptor-kötődési vizsgálatban.
5. TÁBLÁZAT
Humán inzulin receptorhoz mutatott relatív kötési képesség8
Vegyület Átlagérték + S.fí.M.
humán inzulin | 100% | (n - | 2) |
Asp(BIO) Hl | 175 ± | 17% | (n = 2) |
des(B28-30) Hl | 69 ± : | 2% (n = 3) | |
des(B27-30)HI | 125 ± | 14% | (n = 2) |
Asp(BlO), des(B28-30)Hl | 309 ± | 19% | (n = 2) |
Asp (BIO), des(B27-30)HI | 275 ± | 15% | (n = 2) |
Asp (BIO), des(B26-30)Hl | 172 ± | 95 | (n = 2) |
humán inzulinra 0,29
7. példa
Patkányokon végzett tesztvizsgálat
A találmány szerinti inzulin analógok fiziológiai hatását az alábbi, in vivő tesztvizsgálatban mutatjuk ki .
A tesztvizsgálatban átlagos hím Sprague Dawley patkányokat alkalmazunk, amelyeket a Charles River Laboratoris (Portage, MI) cégtől szereztünk be. Az állatok 160 - 180 g tömegüek, és egy héten át 75°P hőmérsékletű ketrecben tartjuk őket, szabályozott megvilágítási ciklus alkalmazásával (fényadagolás reggel 7,OO-tól délután 7,00-ig, fénylekapcsolás délután 7,OO-tól reggel 7,OO-ig)7 ··»* • ·*< « «· * • * ·»
- 37 Az állatokat Purina patkány-tápanyag 5001 táplálékkal tápláltuk, kívánság szerint. Az egyes patkányokat a felhasználás előtt 16 órán át éheztettük. Az állatok körülbelül 200 g tömegnek voltak az első felhasználás során.’ Amenynyiben éheztetett tömegként 275 g körüli tömeget értünk el (körülbelül 3 hét periódus során), az állatokat a továbbiakban nem alkalmaztuk. Minden egyes napon, minden egyes tesztvizsgálati vegyület céljára egy csoport 10 him patkányból álló tesztvizsgálati állat csoportot alkalmaztunk (azaz a bioszintetikus humán inzulin, a sertés inzulin és a humán inzulin analóg vizsgálatára). Minden csoportot csak egyszer alkalmaztunk egy hét elteltével. Ezt követően a 10 patkányt két csoportba osztottuk, amelyek 5-5 állatot tartalmaztak.’ Az egyik csoport kontroll csoportként szolgált, és csak szubkután módon adagoltuk a hordozóanyagot részükre . A másik 5 patkányból álló csoport a tesztvizsgálati vegyületet kaptad A fehérjéket 0,05 n HC1 (pH = 1,6) oldatban oldottuk, és igy egy 100 /ug/ml tárolt oldatot képeztünk. Ebből az alap-oldatból számos hígítást készítettünk, szokásos fiziológiás só-oldat segítségével, amelyet ezután szubkután módon a patkányokba injektáltunk. A hatóanyag beadagolása után az egyes tesztvizsgálati patkányok farokvénájából 100 yul vérmintát vettünk, az adagolás után 0 és 30 perc, 1 óra, 2 óra, 3 óra és 4 óra időtartam elteltével. A minta glükóz-tartalmát glükóz-oxidáz eljárással (Sigma Chemical Co.), kolorimetria segítségével meghatároztuk.' A vér glükóz-koncentrációjának %-os változását a 0 időtartamtól kezdődően
444· 4 «I számítottuk, minden, egyes patkány esetében; és a végeredményt a tesztvizsgálati csoportra vonatkozó átlag % változás + SEM értékben fejezzük ki, amelyet korrigálunk az azon a napon tapasztalt, kontroll csoportban mért átlagos változással?
Egy dózis-válasz görbét szerkesztettünk, a centráció alkalmazásával, amelyben a vizsgálandó vegyületet használtuk úgy, hogy egy adott időpontban a maximális válaszfüggvényt használtuk fel (általában a protein adagolása után 1 vagy 2 óra elteltével). Ebből a görbéből az
ED^Q-értéket határoztuk meg, mint szubkután dózist ( /Ug/kg) az adott proteinre vonatkoztatva, amely a maxi mális vércukorszint-csökkentő hatás félértékét mutatja.
Az eredményeket a 6. táblázatban mutatjuk be.
- 39 6a TÁBLÁZAT ···· β ·β • > · : ♦···
V egyület
ED
Relatív vércukorszint csökkentő aktivitás (%)C
Humán inzulin (HI)d | 7.75 |
Asp(BIO) Hl | 9.8 |
des(B28-30) Hl | 8.1 |
des(B27-30)HI | 12.7 |
Asp(B10), des(B28-30) Hl | 7.7 |
Asp(BlO), des(B27-30) Hl | 11.9 |
Asp(BlO), des(B26-30) Hl | 11.0 |
100
101 = Valamennyi bemutatott érték olyan vérmintákra vonatkozik, amelyeket a tesztvizsgálati vegyűlet adagolása után 1 órával nyertünk.' = yug/kg értékben kifejezve, szubkután.
c _ A humán inzulinhoz viszonyított érték.
ö· = Bioszintetikus humán inzulin.
Mint korábban leírtuk, a találmány szerinti inzulin analógok kevésbé hajlamosak dimerizációra vagy más asszociációra, és magasabb molekulátömegü formák képzésére. Ennélfogva egy vagy több fenti analóg adagolása során az aktivitás gyors megvalósulása várható.
»··· · ν· «*·♦· • · · · • « · · · « •·· · ··» ··· ·
- 40 A találmány szerinti inzulin analógok adagolása hatásos magas vércukorszint kezelésére, amennyiben olyan betegeknek adagolják, amelyek ilyen kezelést igényelnek, és amennyiben az (I) általános képletű analóg megfelelő mennyiségét adagolják. A leírásban a hatásos mennyiség elnevezés alatt a találmány szerinti egy vagy több inzulin analóg olyan mennyiségét értjük, amely eredményesen csökkenti vagy fenntartja a vércukorszint-értéket terápiás vagy megelőző kezelés során. Ez az adagolt mennyiség általában lehet körülbelül 10 egység - körülbelül 60 egység vagy több közötti, naponta (vagy körülbelül 0,3 - körülbelül 2 mg,. feltéve, hogy 29 egység található 1 mg mennyiségben). Természetesen a leírásba beleértendő, hogy a találmány szerinti inzulin analóg vagy analógok adagolt mennyiségét az orvos határozza meg annak függvényében, hogy milyen körülményket tapasztal a betegnél (azaz a magas vércukorszint okainak ismeretében) . Továbbá, figyelembe veszi az adott analóg típusát, az adagoló parenterális ut formáját, a beteg életkorát, tömegét és az adott beteg válaszfüggvényét; továbbá a beteg szimptómáinak súlyosságátEnnélfogva a fent megadott dózishatárok nem limitálják a találmány tárgykörét .
A találmány szerinti inzulin analóg vegyületeket az ilyen kezelést igénylő betegnek (azaz olyan betegnek, amely magas vércukorszinttel rendelkezik) adagolhatjuk, gyógyszerészeti készítmény formájában, amely legalább egy (I) általános képletű inzulin analóg vegyület hatásos mennyiségét tartalmazza, és ezenkívül egy vagy több, gyógyszerészetileg elfogadható hordozóvagy higitóanyagot tartalmaz. Ilyen célra az alkalmazott gyógyszerészeti készítmények formálhatók úgy, hogy körülbelül 100 egység/ml vagy hasonló koncentrációjú, hatásos mennyiségű inzulin analógot vagy analógokat tartalmazzanak? Ezek a készítmények nem szükségszerűen, de jellemzően parenterális adagolásuak, és bármely szakirodalomban ismert, szokásos hordozó- vagy higitóanyagokat alkalmazó parenterális készítmény előállítására alkalmas eljárással előállíthatok . Lásd például: Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17, Ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, USA ( 1985), amelyet referenciaként adunk meg.’ Például a parenterális adagolás céljára alkalmas dózist úgy állíthatjuk elő, hogy az (I) általános képletű inzulin analóg kívánt mennyiségét szuszpendáljuk vagy oldjuk valamely nem-toxikus, folyékony hordozóanyagban, mint például vizes közegben, majd sterilizáljuk a szuszpenziót vagy oldatot, és igy injektálásra alkalmassá tesszük. Megfelelő ampullát vagy hordozóanyagot biztosíthatunk abból a célból, hogy az adagolást megvalósítsukA parenterális adagolás céljára készült gyógyszerészeti készítmények hígító-, hordozó- és töltőanyagokat tartalmazhatnak, amelyek lehetnek például víz, vízzel keverhető szerves oldószer, mint például glicerin, szezám olaj, földimogyoró olaj, vizes propilén-glikol,
-42N,N’-dimetil-fórmamid és hasonló oldószerek. Ilyen gyógyszerészeti készítmények lehetnek például steril izotóniás, vizes só-oldat formák, amelyeket az (I) általános képletű inzulin analógokból készítünk, és amelyek pufferolhatók gyógyszerészetileg elfogadható pufferral, amely pirogénmentes. Továbbá, a gyógyszerészetileg elfogadható parenterális formált alak tartalmazhat tartósitóanyagokat, mint például fenolt vagy meta-krezolt. A végtermék pH-értékét befolyásoló szerek, mint például a nátriurn-hidroxid vagy a sósav, ugyancsak alkalmazhatók.
A találmány szerinti inzulin analóg vegyületek továbbá átalakíthatok olyan gyógyszerészeti készítményekké, amelyek intranazális adagolásra alkalmasak. Ilyen készítményeket írtak le a 0 200 383 A3 számú európai szabadalmi bejelentésben, amelyet referenciaként adunk meg. Az ilyen készítmények úgy állíthatók elő, hogy egy vagy több gyógyszerészetileg elfogadható higitóanyagot, gyógyszerészetileg elfogadható mennyiségű alkálifém-sót, ammónium-sót vagy szabad savat alkalmazunk, egy lényegében cink-mentes inzulinból, továbbá - kívánt esetben - abszorpciót elősegítő mennyiségű, legalább egy abszorpciót elősegítő anyagot alkalmazunk., amely lehet (1) olajsav vagy ennek észtere vagy sója, (2) folyékony formájú szorbitán-zsirsav-észter, (3) folyékony formájú polioxi-etilén-származék, amelyet szorbitán-zsirsav-észterből képezünk, és (4) folyékony formájú hidroxi-polioxi-etilén-polioxi-propilén-polioxi-etíLén-kopolimer.
8. példa
Kutyákon végzett tesztvizsgálat
Az Asp(BlO), dez(B27-30) humán inzulin és az Asp(B10), dez(B28-30) humán inzulin szokásosan alkalmazott, oldható humán inzulinnal szemben (Humulin R) hatásosságát és gyors hatását, amennyiben szubkután módon adagoljuk, az alábbi tesztvizsgálattal mutatjuk ki. Hím, 10 - 17 kg tömegű vadászkopókat kiváló fizikai állapotban tartunk a vizsgálat előtt, és annak során. A vizsgálat előtt a kutyákat 16 órán át éheztetjük, azonban megfelelő módon vízhez juttatjuk abból a célból, hogy az inzulin-koncentráció ne változzék. A teljes vizsgálat során az állatokat nátrium-pentobarbitol segítségével érzéstelenítjük, és testhőmérsékletüket fütőlapok segítségével állandó értéken tartjuk, hogy a glükóz-változást minimálisra csökkentsük. Az inzulin tesztvizsgálati mintákat (azaz az Asp(BlO), dez(B27-30) humán inzulin és Asp(B10), dez(B28-3O) humán inzulint) 3,5 mg/ml koncentrációban ugyanolyan higitóanyagban hígítjuk, amelyet a Humulin R számára alkalmazunk.' A vizsgálatokban az egyes inzulin analógok vércukorszint-csökkentő hatásosságát azonosnak tekintettük tömegarányban az inzulinnal. Ennélfogva a tesztvizsgálati oldatokat úgy tekintjük, mintha 100 egység/ml tartalmúak lennének. Valamennyi inzulin tesztvizsgálati oldatot szubkután módon injektálunk 0,1 egység/kg dózisban, az epidermisz alá, az oldal külső felületére, a 8 vagy 10 kutyából álló csoportokba,
- 44 amely kutyaszám a mintától függő.’ A kutyákból vérmintát veszünk az adagolás előtt 30, 15 és 0 perccel, majd az adagolás után 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 180 és 240 percben. A glükóz-tartálmát glükóz-oxidáz eljárással, kolorimetria segítségével határozzuk meg. Az eredményeket az összehasonlító vizsgálatra vonatkozóan a 7. táblázatban adjuk meg.
»
7. TÁBLÁZAT
Vér glükóz koncentráció: 0 időpont %-aa
Idő (perc) | Humulin R® (n = 8) | Asp(BIO) des(B27-30) Hl (n = 8) | Asp(BIO) des(B28-30) Hl (n = 10) |
-30 | 102 ± 1.6 | 92 ± 2.1 | 103 ± 2.9 |
-15 | 101 ± 1.6 | 99 ± 1.2 | 101 ±2.0 |
0 | 100 | 100 | 100 |
10 | 100 ±1.3 | 93 ± 1.5 | 98 ± 1.8 |
20 | 99 ± 1.9 | 80 ± 3.3 | 93 ± 2.0 |
30 | 97 ± 2.1 | 63 ± 3.1 | 81 ± 2.9 |
45 | 86 ± 4.1 | 47 ± 4.1 | 67 ± 4.4 |
60 | 79 ± 4.9 | 43 ± 3.4 | 60 ± 4.8 |
90 | 67 ± 4.6 | 48 ± 2.9 | 67 ± 5.7 |
120 | 64 ± 4.8 | 58 ± 4.1 | 73 ± 4.9 |
180 | 62 ± 5.0 | 87 ± 2.6 | 89 ± 1.9 |
240 | 77 ± 4.9 | 89 ± 2.0 | 90 ± 2.2 |
- Vér glükóz koncentráció: átlagérték
Claims (9)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1? Eljárás inzulin analóg előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő SEQ ID N0:1 láncot a megfelelő SEQ ID NO:2 lánchoz keresztkötésekkel kapcsoljuk, ahol a SEQ ID NO:1 láncban a 21-helyzetben Xaa jelentése Asn, Asp, Glu, Gin, Alá, Gly vagy Ser, és a SEQ ID NO:2 láncban Xaa jelentése az 1-helyzetben Asp vagy Phe, és a 3-helyzetben Asp vagy Asn.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a SEQ ID N0:1 lánc 21-helyzetében Asn található .
- 3. A 2. igénypont ssrinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a SEQ ID NO:2 láncban az 1-helyzetben Phe található.
- 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a SEQ ID NO:2 lánc 3“helyzetében Asn találhat ó.
- 5. Eljárás inzulin analóg előállítására, azzal jellemezve, hogy a SEQ ID N0:1 láncban a SEQ ID NO:2 lánc megfelelő 1-26 számú aminosav maradékaihoz keresztkötéssel kötjük, ahol a SEQ ID N0:1 lánc 21-helyzetében található Xaa aminosav-maradék Asn, Asp, Glu, Gin, Alá, Gly vagy Ser csoport és a SEQ ID NO:2 lánc 1-helyzetébenXaa található/aminosav-maradék Asp vagy Phe és és a 3-helyzetében található Xaa csoport Asp vagy Asn?» ·· *
- 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a SEQ ID N0:1 lánc 21-helyzetében található Xaa csoport jelentése Asn.
- 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a SEQ ID N0:2 lánc 1-helyzetében található Xaa csoport jelentése Phe .
- 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a SEQ ID NO:2 lánc 3-helyzetében található Xaa csoport jelentése Asn.
- 9. Eljárás gyógyszerészeti készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti inzulin analóg hatóanyagot egy vagy több gyógyszerészetileg elfogadható hordozó- vagy higitóanyaggal gyógyszerkészítménnyé feldolgozunk.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US71857491A | 1991-06-21 | 1991-06-21 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU9202048D0 HU9202048D0 (en) | 1992-09-28 |
HUT61581A true HUT61581A (en) | 1993-01-28 |
Family
ID=24886590
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU9202048A HUT61581A (en) | 1991-06-21 | 1992-06-18 | Process for producing insulin analogs |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0519750A3 (hu) |
JP (1) | JPH05271283A (hu) |
CN (1) | CN1069737A (hu) |
AU (1) | AU1837792A (hu) |
BR (1) | BR9202322A (hu) |
CA (1) | CA2071382A1 (hu) |
CZ (1) | CZ186492A3 (hu) |
FI (1) | FI922882A (hu) |
HU (1) | HUT61581A (hu) |
IE (1) | IE921997A1 (hu) |
IL (1) | IL102240A0 (hu) |
MX (1) | MX9202987A (hu) |
NO (1) | NO922376L (hu) |
NZ (1) | NZ243229A (hu) |
TW (1) | TW222643B (hu) |
YU (1) | YU64192A (hu) |
ZA (1) | ZA924448B (hu) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CZ158895A3 (en) * | 1992-12-18 | 1995-12-13 | Lilly Co Eli | Insulin analog, process of its preparation and pharmaceutical composition containing thereof |
US20020111461A1 (en) | 1999-05-21 | 2002-08-15 | Todd C. Somers | Low molecular weight peptidomimetic growth hormone secretagogues |
DK1265630T3 (da) | 2000-03-24 | 2006-10-09 | Genentech Inc | Anvendelse af insulin til behandling af brusksygdomme |
WO2006093222A1 (ja) * | 2005-03-02 | 2006-09-08 | Ajinomoto Co., Inc. | インスリンの多量体形成阻害剤 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PH25772A (en) * | 1985-08-30 | 1991-10-18 | Novo Industri As | Insulin analogues, process for their preparation |
CA1339416C (en) * | 1987-02-25 | 1997-09-02 | Liselotte Langkjaer | Insulin derivatives |
US4992418A (en) * | 1987-07-17 | 1991-02-12 | Mount Sinai School Of Medicine | Superactive human insulin analogue-[10-Aspartic Acid-B]Human Insulin |
NZ232375A (en) * | 1989-02-09 | 1992-04-28 | Lilly Co Eli | Insulin analogues modified at b29 |
-
1992
- 1992-06-17 CA CA002071382A patent/CA2071382A1/en not_active Abandoned
- 1992-06-17 IL IL102240A patent/IL102240A0/xx unknown
- 1992-06-17 CZ CS921864A patent/CZ186492A3/cs unknown
- 1992-06-17 ZA ZA924448A patent/ZA924448B/xx unknown
- 1992-06-17 TW TW081104742A patent/TW222643B/zh active
- 1992-06-17 NO NO92922376A patent/NO922376L/no unknown
- 1992-06-18 HU HU9202048A patent/HUT61581A/hu unknown
- 1992-06-18 MX MX9202987A patent/MX9202987A/es unknown
- 1992-06-18 AU AU18377/92A patent/AU1837792A/en not_active Abandoned
- 1992-06-18 FI FI922882A patent/FI922882A/fi unknown
- 1992-06-19 BR BR929202322A patent/BR9202322A/pt not_active Application Discontinuation
- 1992-06-19 EP EP19920305678 patent/EP0519750A3/en not_active Withdrawn
- 1992-06-19 JP JP4160813A patent/JPH05271283A/ja not_active Withdrawn
- 1992-06-19 CN CN92105888A patent/CN1069737A/zh active Pending
- 1992-06-19 NZ NZ243229A patent/NZ243229A/en unknown
- 1992-06-19 YU YU64192A patent/YU64192A/sh unknown
- 1992-07-01 IE IE199792A patent/IE921997A1/en not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO922376D0 (no) | 1992-06-17 |
IL102240A0 (en) | 1993-01-14 |
EP0519750A2 (en) | 1992-12-23 |
JPH05271283A (ja) | 1993-10-19 |
NZ243229A (en) | 1994-09-27 |
CA2071382A1 (en) | 1992-12-22 |
MX9202987A (es) | 1993-01-01 |
FI922882A (fi) | 1992-12-22 |
CN1069737A (zh) | 1993-03-10 |
BR9202322A (pt) | 1993-01-19 |
YU64192A (sh) | 1994-06-10 |
FI922882A0 (fi) | 1992-06-18 |
HU9202048D0 (en) | 1992-09-28 |
CZ186492A3 (en) | 1993-01-13 |
AU1837792A (en) | 1992-12-24 |
TW222643B (hu) | 1994-04-21 |
ZA924448B (en) | 1993-12-17 |
NO922376L (no) | 1992-12-22 |
IE921997A1 (en) | 1992-12-30 |
EP0519750A3 (en) | 1993-06-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO179587B (no) | Analogifremgangsmåte for fremstilling av en terapeutisk aktiv insulinanalog og mellomprodukt | |
US6908897B2 (en) | Covalently bridged insulin dimers | |
US6221837B1 (en) | Insulin derivatives with increased zinc binding | |
JPS60155196A (ja) | 成長ホルモン放出因子類似物 | |
EP0544466A1 (en) | Tri-arginine insulins | |
IE921121A1 (en) | GRF-Analogs II | |
HU217684B (hu) | Acilezett inzulinszármazékok és azokat tartalmazó gyógyszerkészítmények és előállításuk | |
JP2001524505A (ja) | ポリエチレングリコール−grf結合体の部位特異的調製方法 | |
OA11453A (en) | Methods for treatment of diabetes using peptide analogues of insulin. | |
HU191263B (en) | Process for producing factor for promoting letting out growth hormone of human pancreatic origine | |
WO1996004307A1 (en) | Aspb1 insulin analogs | |
AU680462B2 (en) | Insulin analogs | |
JPH0273100A (ja) | 医薬用化合物 | |
AU616131B2 (en) | Superactive human insulin analogues | |
HU199508B (en) | Process for producing grf analogues and pharmaceutical compositions comprising same as active ingredient | |
AU757275B2 (en) | Novel insulin analogs with enhanced zinc binding | |
CA2196308C (en) | Peptide, bronchodilator and blood flow ameliorant | |
HUT61581A (en) | Process for producing insulin analogs | |
IE53488B1 (en) | Crf and analogues | |
Marriq et al. | Hormone synthesis in human thyroglobulin: possible cleavage of the polypeptide chain at the tyrosine donor site | |
Martinat et al. | Determination of the primary and secondary structures of the dromedary (Camelus dromedarius) prolactin and comparison with prolactins from other species | |
KR920005659B1 (ko) | 인슐린 유도체의 제조방법 | |
JP2002293799A (ja) | 新規ペプチド及びそれを含有する消化管運動抑制剤 | |
JPS636560B2 (hu) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
DFC4 | Cancellation of temporary protection due to refusal |