CN106962692A - 一种修复草鱼绿肝病变的预混料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种修复草鱼绿肝病变的预混料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及饲料预混料，尤其涉及一种修复草鱼绿肝病变的预混料，及该预混料的制备方法和其应用，该预混料主要由以下重量份的组分制成：桑叶发酵液10‑15份，杜仲叶发酵液10‑25份，姜黄发酵液1‑5份，豆粕40‑60份、白芍发酵液1‑7份。与现有的草鱼饲料中添加的常规预混料相比，本发明利用独特的发酵方法，使天然植物中有效活性成分充分释放，对草鱼绿肝病变部位胆管的疏通具有显著的调节作用，能有效的修复绿肝病变的症状，对草鱼绿肝病变的修复率可以达到90％以上。

Description

一种修复草鱼绿肝病变的预混料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及饲料预混料，尤其涉及一种修复草鱼绿肝病变的预混料，及该预混料的制备方法和其应用。
背景技术
草鱼是我国重要的淡水经济养殖品种，年养殖产量占我国大宗淡水养殖品种之首。草鱼肝脏属于消化***重要组成部分。草鱼肝脏健康程度与消化***的机能是否达到最佳具有直接的内在联系，如果肝脏健康受损，草鱼的各个阶段料比或饲料转化率都将受到不良的影响。
实践发现，每年农历节气清明与白露前后，往往是服用驱虫用药、消毒用药、化药等操作最为频繁的时段，也是草鱼肝脏健康问题暴露非常明显的时段，草鱼肝脏健康问题其中之一就是以肝脏局部或大部分出现绿染为特征的病变，俗称绿肝，表现为肝脏病变部位的肝组织红润色泽消褪，且逐渐被绿色渐进性取代。
草鱼绿肝病变的发生机理，是在药物、体质等因素的多重影响下，分布于肝组织之间的胆管发生不同程度的堵塞，造成肝脏胆管出现胆绿素淤积性扩张，当肝脏胆管壁细胞间隙疏松时，胆绿素随之向肝组织渗透或进入肝血窦向毛细血管网扩散，并最终呈现肝脏局部或大部绿染的现象。
一般情况下，一旦发生草鱼绿肝病变并持续，如果缺乏有效的修复方案，绿肝不仅会导致草鱼消化机能减退，也会导致草鱼体质抗病力下降，严重时还会成为草鱼老三病的重要诱发因素。
发明内容
在第一方面，本发明提供一种修复草鱼绿肝病变的预混料，主要由以下重量份的组分制成：桑叶发酵液10-15份，杜仲叶发酵液10-25份，姜黄发酵液1-5份，豆粕40-60份、白芍发酵液1-7份。
本发明所述的一种修复草鱼绿肝病变的预混料针对上述发病机理或相似发病机理的养殖鱼类的绿肝病变具有良好的修复效果，特别是针对草鱼绿肝病变。
本发明提供一种上述修复草鱼绿肝病变的预混料，其中，桑叶发酵液、杜仲叶发酵液、姜黄发酵液和白芍发酵液为绿肝修复的关键功能成分；豆粕为液态组分的吸附载体，发挥填充剂功能。
在本发明的预混料中，姜黄发酵液和白芍发酵液对草鱼肝组织中吞噬细胞具有良好的激活作用，一方面可以增强吞噬细胞对绿肝病变部位坏死肝细胞的清除；另一方面可为草鱼肝细胞再生提供营养源，加快坏死肝组织的自我修复和绿肝症状的消除；鲜桑叶发酵液和杜仲叶发酵液对绿肝病变部位胆管细胞壁紧密连接具有良好的修复作用，有效缓解胆绿素外渗的问题，同时增强胆管在胆汁运输过程的通畅性。
优选的，一种修复草鱼绿肝病变的预混料，主要由以下重量份组分制备而成：桑叶发酵液10-15份，杜仲叶发酵液20-25份，姜黄发酵液3-5份，豆粕50-60份、白芍发酵液5-7份。
在一个优选的实施例中，一种修复草鱼绿肝病变的预混料，主要由以下重量份的组分制成：桑叶发酵液15份，杜仲叶发酵液25份，姜黄发酵液5份，豆粕50份、白芍发酵液5份。
在另一个优选的实施例中，一种修复草鱼绿肝病变的预混料，主要由以下重量份的组分制成：桑叶发酵液10份，杜仲叶发酵液20份，姜黄发酵液3份，豆粕60份、白芍发酵液7份。
优选的，所述桑叶发酵液由包含以下步骤的方法制备得到：将桑叶：水：芽孢液态培养基和枯草芽孢杆菌混合，37℃密闭培养至OD值为3-4.5得到培养物，将培养物离心，收集的上清为桑叶发酵液；其中，桑叶(重量)：水(体积)：芽孢液态培养基(体积)的重量体积比1(重量)：4-8(体积)：1-3(体积)，枯草芽孢杆菌的加入量为每重量份桑叶加入1╳105cfu-3╳105cfu。
其中，上述桑叶、水、芽孢液态培养基和枯草芽孢杆菌的混合没有加入顺序的限制，例如采用先将桑叶、水和芽孢液态培养基混合，再加入枯草芽孢杆菌。
进一步的，上述培养物离心优选在3000rpm离心，例如3000rpm离心10分钟。
在一个优选的实施例中，一种桑叶发酵液，由包含以下步骤的方法制备得到：将桑叶：水：芽孢液态培养基按重量体积比1(重量)：4-6(体积)：1-1.5(体积)混合形成混合液，再按每重量份桑叶加入1.5╳105cfu-2.5╳105cfu枯草芽孢杆菌，37℃密闭培养至OD值为3-4.5，将培养物离心去渣，收集的上清为桑叶发酵液。
在一个优选的实施例中，一种桑叶发酵液，由包含以下步骤的方法制备得到：将100重量份的桑叶、400体积份的水和100体积份的芽孢液态培养基混合，再按每重量份桑叶加入2╳105cfu枯草芽孢杆菌，37℃恒温密闭培养至OD值为3-4.5，将培养物3000rpm离心10分钟去渣，收集到上清即为桑叶发酵液。
其中，所述芽孢液态培养基可以为市售的芽孢液态培养基，例如进口的Bacillusmediumbase。
其中，所述枯草芽孢杆菌为兼性厌氧型枯草芽孢杆菌。
其中，所述桑叶为鲜桑叶，例如含水量≥80％的鲜桑叶，确保桑叶的新鲜度。
其中，上述桑叶发酵液制备中的水优选无菌蒸馏水。
优选的，所述杜仲叶发酵液由包含以下步骤的方法制备得到：将杜仲叶、水、芽孢液态培养基和枯草芽孢杆菌混合，37℃密闭培养至OD值为3.3-4.5得到培养物，将培养物离心去渣，收集的上清为杜仲叶发酵液；其中，杜仲叶与水的重量体积比为1：4-12，水和芽孢液态培养基的体积比为1-3：1，枯草芽孢杆菌的加入量为每重量份杜仲叶加入3╳103cfu-4.5╳103cfu。
其中，上述杜仲叶、水、芽孢液态培养基和枯草芽孢杆菌的混合没有加入顺序的限制，例如采用先将杜仲叶、水和芽孢液态培养基混合，再加入枯草芽孢杆菌。
进一步的，上述培养物离心优选在3000rpm离心，例如3000rpm离心10分钟。
在一个优选的实施例中，一种杜仲叶发酵液，由包含以下步骤的方法制备得到：将杜仲叶与水的按重量体积比1：9混合形成混合液，按水和芽孢液态培养基体积比3：1向混合液添加芽孢液态培养基，再按每重量份杜仲叶加入3.3╳103cfu枯草芽孢杆菌，37℃密闭培养至OD值为3.8，将培养物3000rpm离心10分钟，收集的上清为杜仲叶发酵液。
在一个优选的实施例中，一种杜仲叶发酵液，由包含以下步骤的方法制备得到：将杜仲叶与水的按重量体积比1：6混合形成混合液，按无水和芽孢液态培养基体积比2.6：1向混合液添加芽孢液态培养基，再按每重量份杜仲叶加入3╳103cfu枯草芽孢杆菌，37℃密闭培养至OD值为3.5，将培养物3000rpm离心10分钟，收集的上清为杜仲叶发酵液。
其中，所述杜仲叶为含水量≤10％的杜仲叶，含水量的控制有利于提高发酵转化率。
其中，所述芽孢液态培养基可以为市售的芽孢液态培养基，例如进口的Bacillusmediumbase。
其中，所述枯草芽孢杆菌为兼性厌氧型枯草芽孢杆菌。
其中，上述杜仲叶发酵液制备中的水优选无菌蒸馏水。
优选的，所述姜黄发酵液由包含以下步骤的方法制备得到：将姜黄、水、芽孢液态培养基和枯草芽孢杆菌混合，37℃密闭培养至OD值为3-4.2得到培养物，将培养物离心，收集的上清为姜黄发酵液；其中，姜黄：水：芽孢液态培养基的重量体积比为1(重量)：9-15(体积)：3-5(体积)，枯草芽孢杆菌的加入量为每重量份姜黄加入1╳105cfu-4╳105cfu。
其中，上述姜黄、水、芽孢液态培养基和枯草芽孢杆菌的混合没有加入顺序的限制，例如采用先将姜黄、水和芽孢液态培养基混合，再加入枯草芽孢杆菌。
进一步的，上述培养物离心优选在3000rpm离心，例如3000rpm离心10分钟。
在一个优选的实施例中，一种姜黄发酵液，由包含以下步骤的方法制备得到：水：芽孢液态培养基按重量体积比1(重量)：10-12(体积)：3-4(体积)混合，再按每重量份姜黄加入1╳105-3╳105cfu枯草芽孢杆菌，37℃密闭培养至OD值为3-4.2得到培养物，将培养物3000rpm离心10分钟，收集的上清为姜黄发酵液。
在一个优选的实施例中，一种姜黄发酵液，由包含以下步骤的方法制备得到：将100重量份的姜黄、1000体积份的水和300体积份的芽孢液态培养基混合，再加入105cfu/ml以上的枯草芽孢杆菌300体积份，37℃密闭培养至OD值为3-4.2，将培养物3000rpm离心10分钟去渣，收集到上清即为姜黄发酵液。
其中，所述芽孢液态培养基可以为市售的芽孢液态培养基，例如进口的Bacillusmediumbase。
其中，所述枯草芽孢杆菌为兼性厌氧型枯草芽孢杆菌。
其中，所述姜黄为含水量在8％以下的姜黄，以保障获得较高得量的姜黄素。
其中，上述姜黄发酵液制备中的水优选无菌蒸馏水。
优选的，所述白芍发酵液由包含以下步骤的方法制备得到：将白芍、水、芽孢液态培养基和枯草芽孢杆菌混合，37℃密闭培养至OD值为3.5-4.8得到培养物，将培养物离心，收集的上清为白芍发酵液；其中，白芍：水：芽孢液态培养的重量体积比为1(重量)：3-8(体积)：0.5-5(体积)，枯草芽孢杆菌的加入量为每重量份白芍加入1╳106cfu-4╳106cfu。
其中，上述白芍、水、芽孢液态培养基和枯草芽孢杆菌的混合没有加入顺序的限制，例如采用先将白芍、水和芽孢液态培养基混合，再枯草芽孢杆菌。
进一步的，上述培养物离心优选在3000rpm离心，例如3000rpm离心10分钟。
在一个优选的实施例中，一种白芍发酵液，由包含以下步骤的方法制备得到：将白芍：水：芽孢液态培养基按重量体积比1(重量)：3-5(体积)：0.5-2(体积)混合，再按每重量份白芍加入1╳106cfu-3╳106cfu枯草芽孢杆菌，37℃密闭培养至OD值为3.5-4.2得到培养物，将培养物3000rpm离心10分钟，收集的上清为白芍发酵液。
在一个优选的实施例中，一种白芍发酵液，由包含以下步骤的方法制备得到：将100重量份的白芍、300体积份的水和50体积份的芽孢液态培养基混合，再每重量份白芍加入106cfu/ml以上的枯草芽孢杆菌100体积份，37℃恒温密闭培养96小时，将培养物3000rpm离心10分钟去渣，收集到上清即为白芍发酵液。
其中，所述芽孢液态培养基可以为市售的芽孢液态培养基，例如进口的Bacillusmediumbase。
其中，所述枯草芽孢杆菌为兼性厌氧型枯草芽孢杆菌。
其中，所述白芍为含水量在8％以下的白芍。
其中，上述白芍发酵液制备中的水优选无菌蒸馏水。
本发明的预混料利用独特的活菌发酵技术，对桑叶、杜仲叶、姜黄和白芍这四种植物进行生物发酵，获得的发酵产物富含多种活性肽、氨基酸、维生素、微量元素，对绿肝病变部位胆管的疏通具有显著的调节作用，能有效的修复绿肝病变的症状；对鱼体和养殖环境不产生残留，具有绿色安全环保的优点。
在第二方面，本发明提供一种制备上述修复草鱼绿肝病变的预混料的方法，所述方法包括以下步骤：将所述组分混合得到混合物，在30-40℃下烘干至混合物的水分含量为8-10％，并可选地粉碎至80-120目筛内，得到预混料。
在一个优选的制备上述修复草鱼绿肝病变的预混料的实施例中，该方法包括以下步骤：将所述组分混合得到混合物，在30-35℃下烘干至混合物的水分含量为8-10％，并粉碎至100-120目筛内，得到预混料。
在一个优选的制备上述修复草鱼绿肝病变的预混料的实施例中，该方法包括以下步骤：将所述组分混合得到混合物，在30℃下烘干至混合物的水分含量为10％，并粉碎至120目筛内，得到预混料。
在第三方面，本发明还提供一种上述修复草鱼绿肝病变的预混料的应用，用于预防性修复草鱼绿肝病变和/或用于治疗性修复草鱼绿肝病变。
其中，所述预混料用于预防性修复草鱼绿肝病变时，按重量百分比1-1.5％添加于饲料中，优选连续使用7-15天为一周期。
其中，所述预混料用于治疗性修复草鱼绿肝病变时，按重量百分比1.5-2.5％添加于饲料中，优选连续使用7-15天为一周期。
与现有的草鱼饲料中添加的常规预混料相比，本发明利用独特的发酵方法，使天然植物中有效活性成分充分释放，对草鱼绿肝病变部位胆管的疏通具有显著的调节作用，能有效的修复绿肝病变的症状，对草鱼绿肝病变的修复率可以达到90％以上。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
一种修复草鱼绿肝病变的预混料，由以下重量份的组分制备得到：桑叶发酵液15份，杜仲叶发酵液25份，姜黄发酵液5份，豆粕50份、白芍发酵液5份。
其中，桑叶发酵液由以下步骤的方法制备得到：将桑叶：无菌蒸馏水：芽孢液态培养基按重量体积比1(重量)：4-6(体积)：1-1.5(体积)混合形成混合液，再按每重量份桑叶加入1.5╳105cfu-2.5╳105cfu枯草芽孢杆菌，37℃密闭培养至OD值为3-4.5，将培养物离心去渣，收集的上清为桑叶发酵液。
其中，杜仲叶发酵液由以下步骤的方法制备得到：将杜仲叶与无菌蒸馏水的按重量体积比1：6混合形成混合液，按无菌蒸馏水和芽孢液态培养基体积比2.6：1向混合液添加芽孢液态培养基，再按每重量份杜仲叶加入3╳103cfu枯草芽孢杆菌，37℃密闭培养至OD值为3.5，将培养物3000rpm离心10分钟，收集的上清为杜仲叶发酵液。
其中，姜黄发酵液由以下步骤的方法制备得到：将100重量份的姜黄、1000体积份的水和300重量份的芽孢液态培养基混合，再加入105cfu/ml以上的枯草芽孢杆菌300体积份，37℃密闭培养至OD值为3-4.2得到培养物，将培养物3000rpm离心10分钟去渣，收集到上清即为姜黄发酵液。
其中，白芍发酵液由以下步骤的方法制备得到：将白芍：无菌蒸馏水：芽孢液态培养基按重量体积比1(重量)：3-5(体积)：0.5-2(体积)混合，再按每重量份白芍加入1╳106cfu-3╳106cfu枯草芽孢杆菌，37℃密闭培养至OD值为3.5-4.2得到培养物，将培养物3000rpm离心10分钟，收集的上清为白芍发酵液。
制备该预混料的方法为：将各组分进行充分混合，接着置于30℃持续烘干至混合物水份含量≤10％时，将混合物过120目粉碎机进行粉碎，获得的粉碎物即为预混料。
实施例2
一种修复草鱼绿肝病变的预混料，由以下重量份的组分制备得到：桑叶发酵液10份，杜仲叶发酵液20份，姜黄发酵液3份，豆粕60份、白芍发酵液7份。
其中，桑叶发酵液由以下步骤的方法制备得到：将100重量份的桑叶、400体积份的水和100体积份的芽孢液态培养基混合，再按每重量份桑叶加入2╳105cfu枯草芽孢杆菌，37℃恒温密闭培养至OD值为3-4.5，将培养物3000rpm离心10分钟去渣，收集到上清即为桑叶发酵液。
其中，杜仲叶发酵液由以下步骤的方法制备得到：将杜仲叶与无菌蒸馏水的按重量体积比1：9混合形成混合液，按无菌蒸馏水和芽孢液态培养基体积比3：1向混合液添加芽孢液态培养基，再按每重量份杜仲叶加入3.3╳103cfu枯草芽孢杆菌，37℃密闭培养至OD值为3.8，将培养物3000rpm离心10分钟，收集的上清为杜仲叶发酵液。
其中，姜黄发酵液由以下步骤的方法制备得到：无菌蒸馏水：芽孢液态培养基按重量体积比1(重量)：10-12(体积)：3-4(体积)混合，再按每重量份姜黄加入1╳105-3╳105cfu枯草芽孢杆菌，37℃密闭培养至OD值为3-4.2得到培养物，将培养物3000rpm离心10分钟，收集的上清为姜黄发酵液。
其中，白芍发酵液，由以下步骤的方法制备得到：将100重量份的白芍、300体积份的水和50体积份的芽孢液态培养基混合，再每重量份白芍加入106cfu/ml以上的枯草芽孢杆菌100体积份，37℃恒温密闭培养96小时，将培养物3000rpm离心10分钟去渣，收集到上清即为白芍发酵液。
制备该预混料的方法为：将各组分进行充分混合，接着置于30℃持续烘干至混合物水份含量≤10％时，将混合物过120目粉碎机进行粉碎，获得的粉碎物即为预混料。
试验例1本发明预混料对草鱼绿肝病变的预防性修复效果评估
市售的草鱼膨化颗粒饲料产品，作为本实验例的基础饲料，基础饲料产品营养成分主要：蛋白30％、脂肪8％、粗纤维12％、粗灰分16％、赖氨酸2.8％。
(1)预混料添加剂量组设定
以市售饲料产品为基础载体，分别向基础载体添加不同量的实施例1制备的预混料的组作为试验组，同时分别设定预混料中桑叶发酵液、杜仲叶发酵液、姜黄发酵液和白芍发酵液单独缺失时的预混料按不同量添加作为平行对照组，其中以不添加预混料为空白对照组。试验组设置详细信息见表1：
表1：不同试验组设置信息表
注：组别中所对应的缺成分预混料配方以实施例1制备的预混料配方为基础配方，所缺成分的配比量以等重量面粉进行替换。
(2)试验分组与管理
选择63g±5g的健康草鱼，从5500尾草鱼中随机挑选4800尾，随机分为16组，其中每组下设3个平行，各组分别投喂上述16种饲料。试验周期24天。试验期间，各组草鱼均按2-2.5％的日均投饵率进行投喂，一日三餐定时定点投喂。
(3)绿肝病变的预防性修复效果评估
当试验第1-7天，各组连续投喂对应的试验料。试验第8-12天通过拌饲内服的方法，向各试验组投喂饲料中按35mg/kg鱼体重·每天，将有效含量2％的吡喹酮与市售饲料充分混合，阴干保存，按饱食投喂连续给药5天，停止给药。试验第13-15天连续三天不投料，对养殖草鱼形成饥饿胁迫。上述试验操作是基于生产实践经验，模拟多因素叠加诱发草鱼绿肝病变的。试验第16-23天，连续8天投喂各试验组对应的试验料。试验第24天时，对各个试验组进行同步剖解，暴露肝脏并拍照，若肝脏出现局部性轻微绿染的形态，则认定为轻度绿肝病变；若肝脏出现局部性较深绿染的形态，则认定为中度绿肝病变；若肝脏出现大部或全部绿染的形态，则认定为重度绿肝病变。根据各组试验结束时草鱼绿肝数量的多少统计绿肝病变发生率和修复率，其计算公式如下。
绿肝病变发生率(％)＝认定符合绿肝病变的草鱼数量/同组试验草鱼总数量╳100
试验第24天时，各组草鱼经同步剖解现场确认，以对照组草鱼轻度绿肝病变、中度绿肝病变和重度绿肝病变发生率为基准，统计的各组草鱼不同程度的绿肝病变发生率和修复率如表2。
表2：
从表2可以看出，当作为空白对照的市售基础饲料中没有添加本发明的预混料时，内服药物与饥饿胁迫诱发的草鱼绿肝病变发生率有所不同，轻度、中度和重度绿肝病变分别达到54％、4％、3％。当基础饲料中添加实施例1制备的预混料时，首先，0.5％、1.0％、1.5％三个添加剂量组草鱼轻度、中度和重度绿肝病变预防性修复率与预混料添加剂量高低呈正相关；其次，与空白对照组相比，本发明预混料添加0.5％时，对草鱼绿肝病变发生率具有良好预防性修复效果，且当预混料添加剂量增加至1.5％时，其对草鱼绿肝病变的预防性修复效果更显著；由此说明，随着实施例1制备的预混料在推荐剂量范围内使用剂量的上升，高添加剂量组草鱼不同程度绿肝病变的预防性修复率均具有良好的使用效果；以空白对照组草鱼不同程度绿肝病变发生率为参照，本预混料的使用对轻度绿肝病变预防性修复率为72-96％，对中度和重度的绿肝病变预防性修复率最高分别为100％与100％。
当基础饲料中分别添加缺失桑叶发酵液、缺失杜仲叶发酵液、缺失姜黄发酵液和缺失白芍发酵液的本发明预混料时，对应组分缺失的0.5％、1.0％和1.5％三个剂量组草鱼绿肝修复率与添加剂量呈正相关，即随着添加剂量的上升，绿肝发生率呈相关性下降变化，且三个剂量组草鱼绿肝发生率明显较空白对照组的降低，但其发生率仍明显高于对应组分零缺失的本发明预混料。由此说明，当本发明预混料中对应组分缺失时，虽然通过调整添加剂量可以提高对应组分缺失的预混料的绿肝预防性修复效果，但其预防性修复效果仍然达不到本发明预混料对应用使用剂量的绿肝修复效果。可见，桑叶发酵液、杜仲叶发酵液、姜黄发酵液和白芍发酵液任一组分对本发明中其他成分在预防性修复草鱼绿肝病变时具有协同增效作用，并且，桑叶发酵液、杜仲叶发酵液、姜黄发酵液和白芍发酵液是预防性修复草鱼绿肝病变的关键功能成分。
试验例2本发明预混料对草鱼绿肝病变的治疗性修复效果评估
市售的草鱼膨化颗粒饲料产品，作为本实验例的基础饲料，基础饲料产品营养成分主要为：蛋白30％、脂肪8％、粗纤维12％、粗灰分16％、赖氨酸2.8％。
(1)预混料添加剂量组设定
以市售饲料产品为基础载体，分别向载体添加不同量的实施例2制备的预混料的组作为试验组，同时分别设定预混料中桑叶发酵液、杜仲叶发酵液、姜黄发酵液和白芍发酵液单独缺失时的预混料按不同量添加作为平行对照组，其中以不添加预混料的组作为空白对照组。试验组设置详细信息见表3：
表3：不同试验组设置信息表
注：组别中所对应的缺成分预混料配方以实施例2制备的预混料配方为基础配方，所缺成分的配比量以等重量面粉进行替换。
(2)试验分组与管理
选择63g±5g的健康草鱼，从5500尾草鱼中随机挑选4800尾，随机分为16组，其中每组下设3个平行，各组分别投喂上述16种饲料。试验周期22天。试验期间，各组草鱼均按2.0-2.5％的日均投饵率进行投喂，一日三餐定时定点投喂。
(3)绿肝病变病理模型的构建
基于生产实践经验，模拟多因素叠加诱发草鱼绿肝病变的。当试验第1-8天，连续8天不投喂饲料，对养殖草鱼形成饥饿胁迫。试验第9-13天，以拌饲内服的方式，将有效含量2％的吡喹酮与市售饲料充分混合制成药饵，确保所投药饵中药物摄入剂量达到35mg/kg鱼体重·每天。试验第14-21天连续8天投喂各试验组对应的试验料。
(4)绿肝病变的治疗性修复效果评估
试验第22天时，对各个试验组进行同步剖解，暴露肝脏并拍照，若肝脏出现局部性轻微绿染的形态，则认定为轻度绿肝病变；若肝脏出现局部性较深绿染的形态，则认定为中度绿肝病变；若肝脏出现大部或全部绿染的形态，则认定为重度绿肝病变。根据各组试验结束时草鱼绿肝数量的多少统计绿肝病变发生率和修复率，其计算公式如下。
绿肝病变发生率(％)＝认定符合绿肝病变的草鱼数量/同组试验草鱼总数量╳100
试验第22天时，各组草鱼经同步剖解现场确认，各组草鱼不同程度的绿肝病变发生率和修复率如表4。
表4：
从表4可以看出，当作为空白对照的市售基础饲料中没有添加本发明的预混料时，内服药物与饥饿胁迫诱发的草鱼绿肝病变发生率有所不同，轻度、中度和重度绿肝病变分别达到64％、5％、7％。当基础饲料中添加实施例2制备的预混料时，首先，1.5％、2.0％、2.5％三个添加剂量组草鱼轻度、中度和重度绿肝病变治疗性修复率与预混料添加剂量高低呈正相关；其次，与空白对照组相比，本发明预混料添加1.5％时，对草鱼绿肝病变发生率具有良好治疗性修复效果，且当预混料添加剂量增加至2.5％时，其对草鱼绿肝病变的治疗性修复效果更显著；由此说明，随着实施例2制备的预混料在推荐剂量范围内使用剂量的上升，高添加剂量组草鱼不同程度绿肝病变的治疗性修复率均具有良好的使用效果；以空白对照组草鱼不同程度绿肝病变发生率为参照，本预混料的使用对轻度绿肝病变修复率为61-94％，对中度和重度的绿肝病变治疗性修复率最高分别为100％与100％。
当基础饲料中分别添加缺失桑叶发酵液、缺失杜仲叶发酵液、缺失姜黄发酵液和缺失白芍发酵液的本发明预混料时，对应组分缺失的1.5％、2.0％和2.5％三个剂量组草鱼绿肝修复率与添加剂量呈正相关，即随着添加剂量的上升，绿肝发生率呈相关性下降变化，且三个剂量组草鱼绿肝发生率明显较空白对照组的降低，但其发生率仍明显高于对应组分零缺失的本发明预混料。由此说明，当本发明预混料中对应组分缺失时，虽然通过调整添加剂量可以提高对应组分缺失的预混料的绿肝治疗性修复效果，但其治疗性修复效果仍然达不到本发明预混料对应用使用剂量的绿肝治疗性修复效果。可见，桑叶发酵液、杜仲叶发酵液、姜黄发酵液和白芍发酵液任一组分对本发明中其他成分在治疗性修复草鱼绿肝病变时具有协同增效作用，并且，桑叶发酵液、杜仲叶发酵液、姜黄发酵液和白芍发酵液是治疗性修复草鱼绿肝病变的关键功能成分。
以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种修复草鱼绿肝病变的预混料，其特征在于，主要由以下重量份的组分制成：桑叶发酵液10-15份，杜仲叶发酵液10-25份，姜黄发酵液1-5份，豆粕40-60份、白芍发酵液1-7份。
2.根据权利要求1所述的一种修复草鱼绿肝病变的预混料，其特征在于，主要由以下重量份的组分制成：桑叶发酵液10-15份，杜仲叶发酵液20-25份，姜黄发酵液3-5份，豆粕50-60份、白芍发酵液5-7份。
3.根据权利要求2所述的一种修复草鱼绿肝病变的预混料，其特征在于，主要由以下重量份的组分制成：桑叶发酵液15份，杜仲叶发酵液25份，姜黄发酵液5份，豆粕50份、白芍发酵液5份。
4.根据权利要求2所述的一种修复草鱼绿肝病变的预混料，其特征在于，主要由以下重量份的组分制成：桑叶发酵液10份，杜仲叶发酵液20份，姜黄发酵液3份，豆粕60份、白芍发酵液7份。
5.根据权利要求1至4中任一所述的一种修复草鱼绿肝病变的预混料，其特征在于，所述桑叶发酵液由包含以下步骤的方法制备得到：将桑叶：水：芽孢液态培养基和枯草芽孢杆菌混合，37℃密闭培养至OD值为3-4.5得到培养物，将培养物离心，收集的上清为桑叶发酵液；其中，桑叶：水：芽孢液态培养基的重量体积比1：4-8：1-3，枯草芽孢杆菌的加入量为每重量份桑叶加入1╳105cfu-3╳105cfu。
6.根据权利要求1至4中任一所述的一种修复草鱼绿肝病变的预混料，其特征在于，所述杜仲叶发酵液由包含以下步骤的方法制备得到：将杜仲叶、水、芽孢液态培养基和枯草芽孢杆菌混合，37℃密闭培养至OD值为3.3-4.5得到培养物，将培养物离心去渣，收集的上清为杜仲叶发酵液；其中，杜仲叶与水的重量体积比为1：4-12，水和芽孢液态培养基的体积比为1-3：1，枯草芽孢杆菌的加入量为每重量份杜仲叶加入3╳103cfu-4.5╳103cfu。
7.根据权利要求1至4中任一所述的一种修复草鱼绿肝病变的预混料，其特征在于，所述姜黄发酵液由包含以下步骤的方法制备得到：将姜黄、水、芽孢液态培养基和枯草芽孢杆菌混合，37℃密闭培养至OD值为3-4.2得到培养物，将培养物离心，收集的上清为姜黄发酵液；其中，姜黄：水：芽孢液态培养基的重量体积比为1：9-15：3-5，枯草芽孢杆菌的加入量为每重量份姜黄加入1╳105cfu-4╳105cfu。
8.根据权利要求1至4中任一所述的一种修复草鱼绿肝病变的预混料，其特征在于，所述白芍发酵液由包含以下步骤的方法制备得到：将白芍、水、芽孢液态培养基和枯草芽孢杆菌混合，37℃密闭培养至OD值为3.5-4.8得到培养物，将培养物离心，收集的上清为白芍发酵液；其中，白芍：水：芽孢液态培养的重量体积比为1：3-8：0.5-5，枯草芽孢杆菌的加入量为每重量份白芍加入1╳106cfu-4╳106cfu。
9.一种制备根据权利要求1至8中任一所述的修复草鱼绿肝病变的预混料的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将所述组分混合得到混合物，在30-40℃下烘干至混合物的水分含量为8-10％，并可选地粉碎至80-120目筛内，得到预混料。
10.一种应用根据权利要求1至8中任一所述的修复草鱼绿肝病变的预混料的方法，其特征在于，所述预混料用于预防性修复草鱼绿肝病变和/或用于治疗性修复草鱼绿肝病变。
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