CN106924718A - B7‑dc突变体在治疗哮喘中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了B7‑DC突变体在制备用于预防或治疗对象的哮喘的药物组合物中的应用，其中所述B7‑DC突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示，或者所述B7‑DC突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1或2的序列具有至少80%的序列同一性并且具有K113S突变。

Description

B7-DC突变体在治疗哮喘中的应用

技术领域

本发明涉及一种预防或治疗哮喘的方法，以及B7-DC突变体在制备用于预防和治疗哮喘的药物组合物中的应用。

背景技术

哮喘是慢性小呼吸道疾病，其特点是呼吸道阻塞、哮鸣、呼吸道超反应性以及同时具有炎症。大多数该病是由暴露于过敏原如花粉、居家尘螨、动物皮屑、真菌、霉菌、空气刺激物或感染物而导致的。不同类型的免疫***参与哮喘的发病机制，包括嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、T细胞、嗜中性粒细胞和肥大细胞。CD4+辅助性T细胞2亚群(Th2)是哮喘发展中一类重要的成分。当过敏原经肺部气道刺激免疫***时，Th2细胞产生高水平的IL-5、IL-3和IL-4，它们随后促进肥大细胞产生过敏原特异性IgE以及气道平滑肌调控因子。IL-5可促进嗜酸性粒细胞发育、活化并招募至肺部气道。IL-13参与气道重塑以及气道超反应性(AHR)从而促成哮喘疾病。但是辅助性T细胞1亚群通常抑制Th2介导的反应，大量证据显示Th1/Th2平衡对于哮喘的发展是至关重要的。Th1可通过产生干扰素γ(IFN-γ)和IL-12介导对Th2反应的抑制。

B7-DC(也称为PD-L2,CD273)已被报道作为PD-1的配体，但其在T细胞反应的调节中的功能尚不明确。虽然几个研究表明B7-DC通过在T细胞上的PD-1结合而抑制T细胞反应，但其他研究显示B7-DC可共刺激T细胞反应并增强免疫反应。利用定点突变法获得了B7-DC的一个突变体(K113S，第113位的亮氨酸被丝氨酸取代)，其丧失了与PD-1的结合能力，但保留了在刺激T细胞反应方面的功能。基于这些发现，推测B7-DC具有新的共刺激受体。

最近，B7-DC被发现能够结合排斥导向分子家族成员b(RGMb，也称DRAGON)。RGMb是一种连接有GPI的膜结合蛋白，其包含位于N端的50个氨基酸的信号肽、位于C端的35个氨基酸的GPI连接信号、RGM N端结构域、RGM C端结构域、以及位于分子中间的von Willebrand因子D型结构域。RGMb mRNA广泛分布于脊髓、脑(中脑、后脑和前脑)、肝、肾、视神经和生殖道。研究显示，RGMb是BMP2/4(骨形成蛋白2和4，BMP2/4)的共受体，增强Smad磷酸化反应。RGMb mRNA也存在于上皮细胞、巨噬细胞和树突状细胞。正常的肺间质巨噬细胞和肺泡上皮细胞也表达高水平的RGMb mRNA。在最近的一项研究中，通过单克隆抗体(mAb)阻断RGMb/PD-L2相互作用会损害呼吸耐受力的发展。但是，RGMb在T细胞反应方面对抗原的作用还不清楚。RGMb敲除(KO)小鼠在出生后约两周内死亡，主要是由于神经发育的需求导致的。这导致无法使用该品系的小鼠作进一步的B7-DC/RGMb功能研究。

发明内容

在本发明中，我们发现K113S(一种B7-DC变体)，其能够选择性地结合至RGMb，而不能结合PD-1。实验显示，K113S引起RGMb共刺激CD4+T细胞增长，其偏向于Th1反应，证据显示在Th1分化状态下IFN-γ生成增加；并且初始T细胞在其细胞表面组成型地表达RGMb。在实验性哮喘模型中，K113S处理小鼠后，BALF中IFN-γ生成增强，并且伴随IL-5和IL-13生成受抑制。最终，我们的结果支持RGMb作为共刺激分子在CD4+Th1反应中的作用。

在本发明的一个方面，本发明提供一种预防或治疗对象的哮喘的方法。该方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的B7-DC突变体，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示，或者该突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1或2的序列具有至少80％的同一性并且具有K113S突变。

在本发明的另一个方面，本发明提供上述B7-DC突变体在制备用于预防或治疗对象的哮喘的药物组合物中的用途。

在本发明的一些实施方式中，所述哮喘是Th2介导的哮喘。在本发明的一些实施方式中，所述施用是通过静脉内进行的。在本发明的一些实施方式中，所述B7-DC突变体被包括在载体中，所述载体优选是质粒。在本发明的一些实施方式中，B7-DC突变体与人IgG Fc片段融合，例如与人IgG1Fc片段融合。

本发明证实重组K113S蛋白能够以类似于野生型B7-DC那样的亲和力与RGMb相互作用。更重要的是，K113S通过RGMb共刺激CD4+T细胞反应，并且促进Th1极化。RGMb在初始小鼠T细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突状细胞的表面表达。而且，K113S/RGMb共刺激在实验性小鼠模型中抑制Th2介导的哮喘并且缓解小气道炎症以及肺部病变。

附图说明

图1.B7-DC突变体与PD-1或RGMb的结合。(A)经转染以过表达小鼠PD-1的CHO细胞系(PD-1+CHO)以所示浓度的对照Ig(Flag-hIg)、B7-DC-hIg或其变体染色，随后通过流式细胞仪分析。(B)经转染以过表达小鼠RGMb的293细胞系(RGMb+293T)以所示浓度的对照Ig(Flag-hIg)、B7-DC-hIg或其变体染色，随后通过流式细胞仪分析。用于染色的二抗是鼠抗人IgG Fc-_{Alexa Fluor 647}。所有数据为三次或更多次独立实验的代表值。

图2.B7-DC及其变体与RGMb的结合亲和性。(A/B)小鼠RGMb以不同浓度(3.906-500nM)涂布于CM5生物传感器芯片上，Biacore分析B7-DC-hIg(A)或K113S-hIg(B)与小鼠RGMb相互作用的表面等离子体共振。(C/D)小鼠RGMb以不同浓度(0.1094-7μM)涂布于芯片上，Biacore分析R56S-hIg(C)或E71S-hIg(D)与小鼠RGMb相互作用的表面等离子体共振。(E)RGMb在10μM时与I105A-hIg、D111S-hIg、R101S-hIg和对照Flag-hIg相互作用的表面等离子体共振分析的反应单位。(F)经转染过表达小鼠RGMb的293T细胞系以所示浓度的抗-mRGMb-生物素(二抗SA-APC)和1μg B7-DC-hIg或K113S-hIg(二抗为羊抗人Fc-PE)染色，随后通过流式细胞仪分析。所有数据为三次或更多次独立实验的代表值。

图3.RGMb和B7-DC在小鼠骨髓细胞和淋巴细胞上的表达。(A)通过特异性多克隆抗体(Minneapolis,MN)经流式细胞分析术分析在肺泡巨噬细胞(AM)、腹膜巨噬细胞(pMф)、骨髓来源的树突细胞(BMDC,未成熟DC,蓝线和成熟DC，红线)、巨噬细胞细胞系RAW264.7和新鲜分离的脾嗜中性粒细胞(PMN)、T细胞、B细胞和NK细胞上的RGMb细胞表面表达。(B)通过流式细胞分析术分析在肺泡巨噬细胞(AM)、腹膜巨噬细胞(pMф)、骨髓来源的树突细胞(在成熟和未成熟DC中的BMDC，分别为蓝线和红线)以及巨噬细胞细胞系RAW264.7上的RGMb细胞表面表达。所有数据为三次或更多次独立实验的代表值。

图4.K113S变体在OVA诱导的小鼠哮喘模型中的作用。(A)OVA-诱导哮喘的敏化和激发以及治疗。在第0天和第5天腹腔内(i.p.)注射接种BALB/c小鼠10μg V级OVA和1mg在PBS中的明矾凝胶。随后，在第11-13天，吸入在PBS中的1％OVA 30分钟以激发小鼠。在进行第一次OVA免疫之前的一天，经尾静脉在5-10秒内静脉(i.v.)注射在2ml PBS中的20ug/小鼠的质粒(Flag-hIg和K113S-hIg)。(B)用Flag-hIg和K113S-hIg处理而诱导哮喘的小鼠中BALF中总细胞数和嗜酸性粒细胞数。(C)Flag-hIg或K113S-hIg处理的小鼠的BALF中细胞经Diff-Quick染液染色。(D)以Flag-hIg或K113S-hIg处理的小鼠的肺部组织学。小鼠在第14天处死，处理肺部组织，用染色以显示小气道周围的细胞浸润。(E)气道对乙酰甲胆碱激发的超反应性。小鼠用Flag-hIg和K113S-hIg处理，并测定气道阻力和肺部Penh。数据以均值±SEM显示并代表三次独立实验，每组5只小鼠。NS，无明显差异；＊:p<0.05；＊＊:p<0.01；＊＊＊:p<0.001。

图5.K113S在CD4+T细胞共刺激以及Th1/Th2细胞因子生成方面的作用。(A/B)使用CFSE标记纯化自首次接受试验的BALB/c小鼠的CD4⁺T细胞，并且在Th1分化条件下(IL-210ng/ml、IL-12 10ng/ml、IL-4抗体10μg/ml)，使用2.5μg/ml的CD3抗体和1μg/ml的可溶性CD28抗体，分别在存在(A)或不存在(B)预先包覆在平板上的pMф的情况下刺激该CD4⁺T细胞3天。通过流式细胞仪评估CFSE稀释液和IFN-γ胞内染色。(C)使用流式细胞仪通过特异性mAb分析OVA诱导的哮喘期间经Flag-hIg或K113S-hIg处理后BALF中CD4细胞的胞内IL-2、IFN-γ和IL-4。哮喘诱导后第14天，用PMA/离子霉素/布雷菲德菌素A刺激来自BALF的细胞4-6h并收集细胞进行流式细胞分析。(D/E)使用流式细胞仪通过特异性mAb分析OVA诱导的哮喘期间经Flag-hIg或K113S-hIg处理后BALF中CD4细胞的胞内IL-5(D)和IL-13(E)。所有数据为三次或更多次独立实验的代表值。每组5只小鼠。NS，无明显差异；＊:p<0.05。

图6.流体力学注射后BALF和血清中K113S-hIg蛋白水平。(A)免疫后第14天BALF中Flag-hIg和K113S-hIg水平。(B)流体力学注射后在所示天数时血清中Flag-hIg和K113S-hIg水平。数据以均值±SEM显示，样品来自每组5只小鼠。数据为三次或更多次独立实验的代表值。

图7.K113S处理后BALF中IL-4的水平以及血清中OVA特异性IgE的水平。用Flag-hIg/K113S或hIg处理的哮喘模型，(A)通过特异性ELISA测定BALF中IL-4的水平，(B)分析血清中OVA特异性IgE。数据以均值±SEM显示并且代表3次独立试验。NS，无明显差异。每组5只小鼠。

具体实施方式

定义

在本发明中，术语“治疗”是指疗法上的以及预防性的措施，其阻止或减缓对象发生不期望的生理学改变或病症，例如哮喘发作。有利或期望的临床效果包括，但不限于，症状的缓解、疾病程度的降低、疾病状态的稳定化(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的减轻或缓和以及疾病的部分或全部治愈，不论上述效果是否可检测到。“治疗”也可指与不治疗相比生存期延长。需要治疗的对象包括已患有该疾病或病症的对象，以及有可能患有该疾病或病症的对象，或要预防该疾病或病症的对象。

“对象”或“患者”、“个体”是指任何期望进行诊断、预后或治疗的对象，特别是哺乳动物对象。哺乳动物包括人、家畜、农畜、动物园动物、竞技动物或宠物，例如狗、猫、几内亚猪、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。本文所称的对象优选是人。

本文所用的术语“有治疗需要的患者”或“有治疗需要的对象”包括因施用本发明用于例如检测、诊断和/或治疗用途的多肽或其组合物而受益的对象，如哺乳动物对象。

方法和治疗

本发明的一个方面提供一种预防或治疗对象的哮喘的方法，包括向有此需要的对象施用治疗有效量的B7-DC突变体或包含B7-DC突变体的药物组合物，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示，或者所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1或2所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性并且具有K113S突变。本发明还提供上述B7-DC突变体在治疗或缓解与哮喘有关的症状的方法中应用。

在一些实施方式中，该B7-DC突变体或其药物组合物以肠胃外方式给药，例如静脉内、肌内、经皮或皮内给药。

在一些实施方式中，将本发明的B7-DC突变体与其他对治疗哮喘有效的药物联合使用会是期望的。例如，可使用B7-DC突变体与其他例如市场上可购买的β2受体激动剂等哮喘治疗剂一起来治疗哮喘。

在一些实施方式中，本发明的治疗哮喘的方法阻止了哮喘的进展或由哮喘导致的疾病的发作。因此，在一些实施方式中，本发明提供一种阻止哮喘的进展和/或由哮喘导致的疾病的发作的方法，该方法包括向有此需要的对象施用有效量的B7-DC突变体。在一些实施方式中，这些治疗哮喘的方法阻止了与哮喘有关的症状的发作、进展和/或复发。因此，在一些实施方式中，本发明提供了预防与哮喘有关的症状的方法，该方法包括向有此需要的对象施用有效量的B7-DC突变体。

组合物

本发明的一个方面提供包含治疗有效量的B7-DC突变体以及药学上可接受的载体的药物组合物。该药物组合物可用于预防或治疗对象的哮喘。该B7-DC突变体可存在于合适的药学上可接受的载体或赋形剂中。

本文使用的术语“载体”包括任何或所有的溶剂、分散介质、载体、包衣、稀释剂、抗菌剂、抗真菌剂、等渗剂、吸附延缓剂、缓冲液、载体溶液、悬浮液、胶体等。这些用于药物活性成分的介质和试剂的使用在本领域是已知的。除非已知任何常规介质或试剂不能与该活性成分配伍，否则本发明预期可在组合物中使用任何上述载体。

“药学上可接受的”是指当施用至人体时不会产生过敏反应或类似的不期望的反应的分子和成分。本领域已知如何制备包含作为活性组分的蛋白的水性组合物。通常，这些组合物被制备成注射剂，例如液态溶液或悬浮液；也可以制备成适于在注射之前配制成溶液或悬浮液的固体形式。

实施例

材料和方法

小鼠：从中山大学实验动物中心购买BALB/c雌鼠并饲养于该中心的SPF设备中。所有小鼠实验都根据中山大学实验动物中心指南进行并经动物伦理委员会批准。

细胞系：表达鼠PD-1的CHO细胞系培养于含1％FBS的Ham F12培养基(GIBCO)中。293T细胞系(ATCC)培养于含10％FBS的DMEM(Cellgro)中，并用lipofectamine 3000和在peGFP-N3表达载体中的小鼠RGMb cDNA转染。RGMb的细胞表面表达经RGMb抗体(Minneapolis,MN)和eGFP荧光染料染色确认。

重组融合蛋白、抗体和细胞因子：编码小鼠B7-DC-人IgG1Fc(B7-DC-hIg)及其变体的质粒在Wang,S.,et al.Molecular modeling and functional mapping of B7-H1andB7-DC uncouple costimulatory function from PD-1interaction.J Exp Med 197,1083-1091(2003)中已有描述。重组蛋白经293T细胞转染而产生，并经蛋白A亲和柱(GE)纯化。hlg抗体购自Jackson ImmunoResearch(West Grove,PA)，带His标签的重组小鼠RGMb和抗鼠RGMb生物素购自链霉亲和素-PE购自BioLegend(San Diego,CA)。抗CD3e-PE、抗CD4-PE、抗CD8-PE、抗CD11c-PE、抗Gr1-PE、抗B220-PE、抗CD49b-PE、抗F4/80-PE、抗mB7-DC-APC、抗IL-2-FITC、抗IFN-γ-PE、抗IL-4-APC单抗(mAb)以及小鼠IL-4,IL-5,IL-13ELISA试剂盒购自eBioscience(San Diego,CA)。Fisher HealthCare^TMPROTOCOL^TMHema 3^TMFixativeand Solutions,Inject Alum及Carboxyfluorescein succinimidyl ester(CFSE)染色液购自Thermo Scientific(Waltham,MA)。鸡卵清蛋白V级(OVA)和乙酰甲胆碱购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。抗IgE-生物素、Cytofix-CytoPerm Golgiplug试剂盒以及抗CD4-BV421购自BD(Franklin Lakes,NJ)。

表面等离子体共振(SPR)分析：按之前描述在Biacore T100仪器上分析鼠RGMb与B7-DC及其突变体的亲和性(Wang,S.,et al.Molecular modeling and functionalmapping of B7-H1and B7-DC uncouple costimulatory function from PD-1interaction.J Exp Med 197,1083-1091(2003))。简言之，带His标签的RGMb以2000RU固定至CM5传感器芯片(GE healthcare)上，并且以类似方式制备对照流动细胞。在HEPES缓冲液中按所述浓度稀释纯化的Flag-hIg、mB7-DC-hIg和突变融合蛋白(mB7-DC-hIg及K113S-hIg:3.9nM至500nM,R56S-hIg及E71S-hIg：109.4nM至7μm,I105A-hIg、D111S-hIg、R101S-hIg和Flag-hIg:10μM)。蛋白以20μl/min的流速注射3min，将缓冲液在表面流动5min以进行脱离。使用Biacore T100软件分析数据。

实验性哮喘小鼠模型：OVA诱导小鼠哮喘模型之前已有描述。简言之，在第0天和第5天腹腔注射6-8周龄BALB/c小鼠混合有4mg氢氧化铝凝胶(Inject Alum,Thermo)的10μgOVA蛋白(Sigma-Aldrich)。在第11至13天，使用喷雾器(Yuwell402AI,江苏，中国)鼻内给予小鼠1％在PBS中的OVA。小鼠在第14天麻醉。收集下腔静脉血液，制备血清用于OVA特异性IgE检测。肺用气管插管以0.5ml温PBS灌洗三次，总共使用1ml PBS。支气管肺泡灌洗液(BALF)经离心，收集上清用于细胞因子实验(见下文)。使用库尔特计数器(BeckmanCoulter,San Diego,CA)对细胞总数进行计数。肺固定于10％***，组织切片经H/E染色用于组织学评价。对于体内流体动力学质粒注射，如文献所述，经尾静脉在5至10秒内注射20μg在2ml PBS中的对照Flag-hIg质粒或K113S-hIg质粒。在所示时间点经特异性夹心ELISA检测流体动力学注射后血清和BALF中人IgG蛋白水平(图6)。

气道超反应性(AHR)实验：乙酰甲胆碱引起的AHR在最后一次1％OVA激发后24h通过侵入性和非侵入性实验进行评价。侵入性实验由FinePointe Resistance andCompliance System(Buxco Electronics,NY)确定。简言之，麻醉小鼠并进行气管切开术。给予乙酰甲胆碱(12.5,25mg/ml)后，喷雾PBS使其流入小鼠器官30秒。直接测定小鼠呼吸气流和肺压。气道阻力(R_L)被定义为驱动呼吸的压力除以气流，用Buxco FinePointe软件计算。非侵入性实验使用用于Whole Body Plethysmography System的FinePointe来确定(Buxco Electronics,NY,其依赖于4个设计的腔室以连接至灵敏的压力传感器，从而测定压力变化以及腔室内的气流，并将信息传输至Buxco FinePointe软件)。该软件计算几个气流相关参数，包括呼吸速率、肺活量、峰值流速和时间间隔。软件以“enhanced pause”(Penh)形式输出数据。Penh＝(PEP/PIP)x((Te-Tr)/Tr)。Te，呼吸时间(s)；Tr，休息时间(s)；PEP，峰值呼气压力(ml/s)；PIP，峰值吸气压力(ml/s)。小鼠逐个放入每个腔室中并让其适应几分钟以记录腔室的基线。基线测量后，在主腔室中经入口喷入增加浓度(0,3.125,6.25,12.5,25,50mg/ml)的乙酰甲胆碱PBS溶液1min。随后，记录气道反应5min。计算增加的浓度的每个组的Penh。

体外Th1极化试验：对于Th1生成，使用2μM CFSE(Thermo Fisher Scientific,MA)标记CD4⁺T细胞，并且在存在10μg/ml抗IL-4和10ng/ml IL-12的情况下，用涂覆在板上的2.5μg/ml抗CD3抗体和5μg/ml的所示融合蛋白刺激3天。在最后6h，向培养基中加入10ng/ml12-豆蔻酸13-乙酸佛波酯(PMA)、1μg/ml离子霉素和10μg/ml布雷菲德菌素A，细胞用抗CD4mAb染色。使用Cytofix/Cytoperm Kit(BD Bioscience,NJ)固定和透化后，细胞用抗IFN-γ单抗染色并进行流式细胞术分析。使用相似方法检测BALF中的IFN-γ、IL-2和IL-4阳性细胞。BALF中的细胞因子也使用ELISA试剂盒(eBioscience,CA)按照说明书测定。

数据分析：本发明中每个实验重复至少三次，动物数量见附图说明。数据以均值±SEM显示，并使用双尾student t-检验或方差分析(ANOVA)检验来确定显著差异。＊:P<0.05，＊＊:P<0.01，＊＊＊:P<0.001。

结果

选择性结合RGMb而不结合PD-1的B7-DC K113S突变体的识别

我们之前在B7-DC与PD-1的结合域中进行了突变而得到多个B7-DC突变体。K113S突变体，其113位的氨基酸赖氨酸被丝氨酸取代，它完全丧失了与PD-1的结合能力。我们发现，K113S在体外仍维持淋巴细胞的共刺激作用。这个发现表明B7-DC可经由非PD-1的受体发挥其共刺激作用。为确定K113S是否与RGMb相互作用，我们制备了编码一系列突变体的重组融合蛋白(R56S-hIg,E71S-hIg,R101S-hIg,I105A-hIg,D111S-hIg,K113S-hIg)并测试了它们与RGMb的结合能力。使用流式细胞术，我们发现I105A、D111S、K113S突变体在所有所测试浓度下都不结合PD-1+CHO细胞，而R56S、E71S和R101S突变体以及野生型B7-DC与PD-1明显结合(图1A)。令人感兴趣的是，K113S-hIg以类似于野生型B7-DC-hIg的亲和性结合RGMb+293T细胞(图1B)，而R101S、I105A和D111S完全丧失了与RGMb的结合能力。R56S和E71S与RGMb在高蛋白浓度下显得具有弱结合性。上述数据确认了B7-DC与RGMb和PD-1都有相互作用，而作为一个新发现，K113S选择性地结合RGMb，而不结合PD-1。

K113S以类似于野生型B7-DC的亲和性结合RGMb

我们使用SPR分析基于Biacore仪器测定了K113S的结合亲和性，并利用BiacoreT100软件计算出亲和力。K113S以类似于B7-DC的亲和性以nM水平结合至RGMb(B7-DC KD＝1.82E-07M,K113S KD＝1.28E-07)(表1,图2A,2B)；而R56S、E71S、I105A和D111S以μM水平结合RGMb(图2C,2D和2E)，R101S以类似Flag-hIg对照的水平结合RGMb(图2E)。

表1.B7-DC突变体的亲和力测定

亲和力(KD)基于Biacore T100软件由“ka”(结合)和“kd”(解离)计算得出。

为进一步验证K113S和RGMb相互作用，我们测试了RMGb抗体与K113S和B7-DC竞争性结合RGMb的能力。培养基中包含不同浓度的RGMb抗体(最高为625ng/ml)，用于通过流式细胞仪分析与1μg/ml的B7-DC或K113S融合蛋白结合RGMb+293T细胞的能力。与Biocore分析的结果一致，在大多数所测试的浓度下，RGMb抗体与K113S-hIg竞争结合RGMb+293T细胞的效率稍微低于与B7-DC-hIg竞争结合的效率(图2F)。因此，第113位的氨基酸，虽然在PD-1结合中是至关重要的，但在与RGMb的相互作用中扮演不太重要的角色。我们的研究发现了无PD-1干扰的高度选择性RGMb配体。

RGMb在鼠淋巴细胞和骨髓细胞上的组成型表达

使用RGMb抗体，我们分析了RGMb蛋白在不同免疫细胞上的蛋白表达。RGMb显得在骨髓细胞上高水平地组成型表达，包括新鲜分离的肺泡巨噬细胞(AMs)、腹膜巨噬细胞(pMфs)、骨髓树突状细胞(BMDCs)和嗜中性粒细胞(PMNs)及巨噬细胞样细胞系RAW264.7，在pMф上表达量最高(图3A)。令人感兴趣的是，RGMb也可在脾细胞的休眠期CD3⁺,CD4⁺,CD8⁺T细胞和B细胞的表面低水平表达，而NK细胞上是阴性的(图3A)。但是，B7-DC的表达仅限于骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)，其在AM和RAW264.7上的表达水平很低(图3B)，这与之前的结果类似。

结合RGMb抑制肺部感染和气道过敏

利用K113S与RGMb的特异性结合，我们在OVA诱导的哮喘模型中评价了RGMb的功能，该模型中，小鼠使用OVA初免并在之后用OVA强化(图4A)。在该模型中，小鼠具有Th2样炎症反应，并伴随严重的嗜酸性粒细胞浸润。免疫之前的一天，小鼠在高压下静脉注射(流体动力学注射)K113S-hIg质粒以进行质粒表达，主要在肝脏中表达。如预期的一样，BALF中的总浸润细胞数量在OVA强化后急剧增加。相反，K113S-hlg处理的小鼠的总细胞数量明显降低(图4B)。嗜酸性粒细胞(OVA诱导的哮喘期间主要的细胞类型)数量也被K113S-hlg显著抑制(图4B和4C)。肺部的组织学分析显示K113S-hIg处理的小鼠与用对照质粒处理的小鼠相比在小气道周围具有明显较低的炎症性浸润(图4D)。

气道过敏(AHR)通过肺部阻力(R_L)和Penh来评价，如材料和方法中所述，Penh在该模型中作为气道过敏性的指标。用对照或K113S质粒处理的小鼠之间的基线R_L没有明显差异。但是，12.5mg/ml乙酰甲胆碱激发后，K113S-hIg处理的小鼠的R_L相对Flag-hIg处理的小鼠来说降低(图4E)。而且，K113S-hIg处理的小鼠的Penh显著低于Flag-hIg处理的小鼠(图4E)。这些结果表明，经K113S-hIg激发RGMb可抑制OVA诱导的哮喘验证并且改善该实验性哮喘模型的肺功能。

K113S经RGMb共刺激Th1反应

我们推测，K113S抑制哮喘炎症的作用是由Th1T细胞反应的共刺激随后抑制Th2样炎症导致的。为验证该推测，我们首先测试了K113S在初始CD4⁺T细胞体外分化为Th1期间刺激Th1反应的能力。在该***中，纯化的初始T细胞培养于Th1极化条件(抗CD3+IL-12/抗IL-4)下3天；Th1CD4+T细胞通过胞内染色被识别为产IFN-γ细胞。在该培养***中，还加入pMф以精确模仿体内肺部环境。在存在K113S-hIg的情况下，与对照Ig相比，IFN-γ⁺T细胞明显增加(图5A-5B)。为确认该发现，利用特异性ELISA测定OVA诱导哮喘的小鼠的BALF中的细胞因子。K113S处理明显降低了BALF IFN-γ水平，而IL-2和IL-4的变化可忽略(图5C)。在OVA诱导哮喘模型中，IL-5和IL-13在启动和维持气道炎症反应中是必需的。因此，我们还在该模型中测定了BALF中的这些细胞因子。K113S-hIg质粒处理的小鼠具有明显降低的IL-5和IL-13，而IL-4的生成不明显(图5D-E,图7)。过敏原特异性IgE在哮喘发病机制中也具有重要作用。但是，在我们的模型中，OVA特异性IgE在K113S处理小鼠和对照质粒处理小鼠之间没有差异(图7)。我们的结果表明K113S结合RGMb选择性地刺激产IFN-γTh1T细胞，并且伴随降低的IL-5和IL-13以抑制该模型的哮喘症状。

B7-DC在T细胞响应中的作用一直都有争议，因为在不同体内、体外试验中，共刺激作用和共抑制作用都有报道。除了与共抑制受体PD-1相互作用之外，B7-DC还结合排斥引导分子b(RGMb)。我们的发现为B7-DC研究上相互矛盾的数据提供了一种解释。在初始阶段，树突状细胞上的B7-DC可经RGMb共刺激初始CD4+T细胞，有利于Th1T细胞增殖和分化。当共刺激和激活之后，T细胞被诱导而表达PD-1，当其与B7-DC结合后，PD-1将抑制性信号传送给T细胞。在树突状细胞组成型表达B7-DC的情形下，B7-DC的共刺激作用因其与PD-1结合而被快速弱化，这可提供一种安全性机制而防止T细胞的进一步扩展和过度活化。因此，B7-DC根据RGMb和PD-1受体的时间安排和水平而在T细胞反应上显示出不同的、甚至有时相反的作用。虽然还要测试人RGMb是否具有类似表达模式，并且更重要的是要测试人RGMb是否也因B7-DC的结合而被共刺激，但是我们的研究提供了研究这种可能性的基本依据。

虽然RGMb介导的共刺激作用的机制还不完全清楚，但是我们在OVA诱导的哮喘模型中的发现表明，K113S可减弱哮喘反应并且通过降低呼吸道炎症和阻力而改善肺功能。BALF中的总炎症细胞数量和嗜酸性粒细胞数量在K113S处理后都降低。而且，肺中小气道周围的病理学炎症也通过这种处理而被减轻。虽然激发RGMb可能直接抑制Th2反应，包括IL-5和IL-13生成、嗜酸性粒细胞浸润和哮喘进展期间的气道重塑；但是在BALF中检测到IFN-γ增加。这些发现支持Th1反应的共刺激作用。Th1反应在抑制Th2介导的哮喘中的作用已有很多报道。因此，很可能的情况是，经RGMb的共刺激作用改变了Th1/Th2的平衡，导致Th2反应的抑制。值得提到的是，RGMb的作用某种程度上来说是独特的，因而不能被认为是典型的Th1样反应。在我们的研究中，虽然IFN-γ生成明显增加，但IL-2(另一种重要的Th1细胞因子)的水平变化很小。另一方面，如前所示，RGMb对Th2样反应的抑制作用某种程度上来说是部分的，主要抑制IL-5和IL-13，而不抑制IL-4。此外，RGMb在OVA特异性IgE的抑制方面的作用也很微弱(图5)。因此，RGMb在Th1极化中的作用可能是独特的且仅具有部分作用。

目前，还没有RGMb的特异性激动剂(无论是抗体或小分子)，而且RGMb KO小鼠是致死性的，这限制了RGMb功能的进一步探究。K113S对RGMb的选择性结合而不结合PD-1，这代表了进行这种研究的新的机会。这种激动剂的开发对于人类疾病(如哮喘)的潜在治疗是有用的。

本发明虽然已针对具体实施方式做详细的描述，但应当理解的是，本领域技术人员可在所公开的实施例的基础上对本发明做出修改和改进而不违背本发明的精神，而这些改进和修改仍属于本发明的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> B7-DC突变体在治疗哮喘中的应用

<130> 17711CN

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 247

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Met Leu Leu Leu Leu Pro Ile Leu Asn Leu Ser Leu Gln Leu His Pro

1 5 10 15

Val Ala Ala Leu Phe Thr Val Thr Ala Pro Lys Glu Val Tyr Thr Val

20 25 30

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35 40 45

Cys Thr Glu Leu Glu Gly Ile Arg Ala Ser Leu Gln Lys Val Glu Asn

50 55 60

Asp Thr Ser Leu Gln Ser Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu

65 70 75 80

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85 90 95

Ser Gly Gln Tyr Arg Cys Leu Val Ile Cys Gly Ala Ala Trp Asp Tyr

100 105 110

Ser Tyr Leu Thr Val Lys Val Lys Ala Ser Tyr Met Arg Ile Asp Thr

115 120 125

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130 135 140

Ala Arg Gly Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Gln Asn Val Ser Val

145 150 155 160

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210 215 220

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225 230 235 240

Ile Ile Gln Arg Lys Arg Ile

245

<210> 2

<211> 273

<212> PRT

<213> Homo sapiens (human)

<400> 2

Met Ile Phe Leu Leu Leu Met Leu Ser Leu Glu Leu Gln Leu His Gln

1 5 10 15

Ile Ala Ala Leu Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Glu Leu Tyr Ile Ile

20 25 30

Glu His Gly Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Asn Phe Asp Thr Gly Ser

35 40 45

His Val Asn Leu Gly Ala Ile Thr Ala Ser Leu Gln Lys Val Glu Asn

50 55 60

Asp Thr Ser Pro His Arg Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu

65 70 75 80

Pro Leu Gly Lys Ala Ser Phe His Ile Pro Gln Val Gln Val Arg Asp

85 90 95

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100 105 110

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Ile Ala Leu Arg Lys Gln Leu Cys Gln Lys Leu Tyr Ser Ser Lys Asp

245 250 255

Thr Thr Lys Arg Pro Val Thr Thr Thr Lys Arg Glu Val Asn Ser Ala

260 265 270

Ile

Claims (6)

1.B7-DC突变体在制备用于预防或治疗对象的哮喘的药物组合物中的应用，其中所述B7-DC突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1或2所示，或者所述B7-DC突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO. 1或2的序列具有至少80%的序列同一性并且具有K113S突变。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述哮喘是Th2介导的哮喘。

3.根据权利要求1所述的应用，其中所述B7-DC突变体被包含在载体中。

4.根据权利要求3所述的应用，其中所述载体是质粒。

5.根据权利要求1所述的应用，其中所述B7-DC突变体与人IgG Fc片段融合。

6.根据权利要求5所述的应用，其中所述人IgG Fc片段是人IgG1 Fc片段.

根据权利要求1所述的应用，其中所述对象是人。