KR20230135556A - 레트 증후군의 치료를 위한 세마포린-4d 결합 분자의 용도 - Google Patents

Abstract

본원에는 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는 유효량의 단리된 결합 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 레트 증후군을 가진 대상체의 증상을 완화시키는 방법이 제공된다.

Description

레트 증후군의 치료를 위한 세마포린-4D 결합 분자의 용도

서열 목록

본 출원은 ASCII 방식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며 이로써 전체적으로 참조로 포함된다. 2020년 6월 24일에 생성된 상기 ASCII 사본의 명칭은 8555_039Z_SL.txt이며 크기는 29,049 바이트이다.

레트 증후군(Rett syndrome, RTT)은 대부분 X-연관 유전자 메틸 CpG 결합 단백질 2(MECP2)의 돌연변이에 의해 유발되는 신경발달 장애이다. 레트 증후군은 주로 여자 아이에게 영향을 미치며 1:10,000 정상 출산의 발생률의, 다운 증후군 다음으로 중증 지적 장애의 두 번째로 가장 흔한 요인이다. 환자는 인지 및 신체 장애로 고통받으며, 대부분 휠체어에서 지내고 풀타임 케어를 필요로 한다. 현재까지 치료법은 없지만, 생후 6-18개월의 늦은 발병은 치료적 개입을 위한 귀중한 기회의 창을 제공한다. 실험 모델인 Mecp2 결핍 마우스는 전임상 연구에 이용 가능하다. RTT의 연구에의 상당한 기여는 Mecp2 결핍 마우스에서, 우선적으로 성상세포(astrocytes)에서 MeCP2의 재발현이 전반적으로 널(null) 마우스에 비교하여 보행력 및 불안 수준을 상당히 개선시켰고, 호흡 비정상을 정상 패턴으로 회복시켰으며, 수명을 크게 연장시켰다는 개념의 증거이다. 이들 연구는 뉴런과 마찬가지로 신경아교세포가 RTT의 신경병리학의 통합 구성요소인 것을 보여주었다(Lioy et al., Nature, 475(7357):497-500(2012)). Mecp2 발현이 돌연변이 마우스에서 회복되어 "레트 유사 표현형"으로부터 극적인 회복으로 이어지는 이런 획기적인 성취는 치료법을 찾는 동기를 증가시켰다. 그러나, 장애와 관련된 증상을 완화시키는 레트 증후군에 대한 치료가 여전히 필요하다.

레트 증후군을 가진 대상체에서 증상을 완화하기 위해 세마포린(semaphorin) 4D(SEMA4D) 결합 분자를 사용하는 방법이 본원에 개시된다. 본원에 예시된 개시의 측면에 따르면, SEMA4D에 특이적으로 결합하여 질환 진행에 미치는 SEMA4D의 효과를 억제하거나, 억압하거나, 예방하거나, 반전시키거나 또는 둔화시키는 유효량의 단리된 결합 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 레트 증후군을 가진 대상체에서 증상을 개선시키는 방법이 제공된다.

본원에 예시된 측면에 따르면, SEMA4D에 특이적으로 결합하는 유효량의 단리된 결합 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 레트 증후군을 가진 대상체를 치료하는 방법이 제공되며, SEMA4D에 대한 결합은 장애와 관련된 증상을 개선하는 작용을 한다.

SEMA4D에 특이적으로 결합하는 유효량의 단리된 결합 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 레트 증후군을 가진 대상체에서 증상을 완화시키는 방법이 제공된다. 방법의 특정 구현예에서, 결합 분자는 SEMA4D와 이의 수용체 또는 이의 수용체의 일부와의 상호작용을 억제한다. 방법의 특정 구현예에서, 수용체는 플렉신(Plexin)-B1, 플렉신-B2 및 CD72로 이루어지는 군으로부터 선택되는다. 방법의 특정 구현예에서, 결합 분자는 SEMA4D 매개 플렉신-B1 신호 전달을 억제한다. 방법의 특정 구현예에서, 단리된 결합 분자는 VX15/2503, Mab D2517, D2585, 및 MAb 67로 이루어지는 군으로부터 선택되는 참조 단클론성 항체와 동일한 SEMA4D에 특이적으로 결합한다. 방법의 특정 구현예에서, 단리된 결합 분자는 SEMA4D에 대해 특이적으로 결합하는 것으로부터 VX15/2503, Mab D2517, D2585, 및 MAb 67로 이루어지는 군으로부터 선택되는 참조 단클론성 항체를 경쟁적으로 억제한다. 방법의 특정 구현예에서, 단리된 결합 분자는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 방법의 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단클론성 항체 VX15/2503 또는 MAb 67이다. 방법의 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열 번호 3, 4, 및 5를 포함하는 가변 중쇄(VH) CDR 1-3을 포함하는 가변 중쇄, 및 각각 서열 번호 8, 9, 및 10을 포함하는 가변 경쇄(VL) CDR 1-3을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다. 방법의 특정 구현예에서, VH 및 VL은 각각, 서열 번호 6 및 서열 번호 11, 서열 번호 7 및 서열 번호 12, 또는 서열 번호 21 및 서열 번호 25를 포함한다. 방법의 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열 번호 22, 서열 번호 23, 및 서열 번호 24을 포함하는 VHCDR 1-3을 포함하는 가변 중쇄, 및 각각 서열 번호 26, 서열 번호 27, 및 서열 번호 28을 포함하는 VLCDR 1-3을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.

전술한 방법 중 임의의 한 방법의 특정 구현예에서, 치료된 증상은 신경정신병 증상(neuropsychiatric symptom), 인지 증상(cognitive symptom), 운동 기능장애(motor dysfunction), 및 이의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는다. 전술한 방법 중 임의의 방법의 특정 구현예에서, 대상체는 1 단계 레트 증후군을 가지고 있다. 특정 구현예에서, 신경정신병 증상의 완화에는 불안 유사 행동 감소, 수면 장애 감소, 초조 감소, 불안증 감소, 및 이의 임의의 조합이 포함된다. 특정 구현예에서, 완화되는 증상은 신경정신병 증상, 인지 증상, 신체 발달 지연, 의사소통 발달 지연, 의사소통 기능 상실, 운동 기능장애, 수면 장애, 불규칙 심장박동, 반복적인 갑자기 움직이는 동작, 몸 떨림, 및 이의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는다. 특정 구현예에서, 증상을 완화시키는 것은 불안 유사 행동의 방지 또는 감소, 인지력 증가, 조정력 증가, 보행력 증가, 신체 발달 진전, 몸 떨림 감소, 반복적인 동작 감소, 운동 기능 증가, 의사소통 기능 증가, 수면 장애 감소, 초조 감소, 불안증 감소, 및 이의 임의의 조합을 포함한다.

특정 구현예에서, 대상체는 레트 증후군의 2기, 3기, 또는 4기에 있다. 특정 구현예에서, 2기, 3기, 또는 4기 대상체는 신경정신병 증상, 인지 증상, 신체 발달 지연, 운동 기능장애, 불규칙 심장박동 및 호흡, 의사소통 기능의 감소, 척추 측만증(scoliosis), 수면 장애, 발작(seizures), 위장 장애, 반복적인 갑자기 움직이는 동작, 몸 떨림, 및 이의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 증상을 나타낸다. 특정 구현예에서, 증상의 완화에는 불안 유사 행동 감소, 인지력 증가, 조정력 증가, 보행력 증가, 신체 발달 진전, 몸 떨림 감소, 반복적인 동작 감소, 운동 기능 증가, 의사소통 기능 증가, 수면 장애 감소, 초조 감소, 불안증 감소, 및 이의 임의의 조합이 포함된다.

도 1은 행동 테스트에 사용된 가속 로타로드 장치를 도시한다.
도 2는 행동 테스트를 위한 고가 플러스 미로 장치를 도시한다.
도 3은 호흡 패턴을 테스트하기 위한 전신 혈량측정 장치를 도시한다.
도 4A는 0(움켜쥐기 없음) 내지 2(가장 심함)의 척도로 Mecp2 마우스에서 뒷다리 움켜쥐기를 나타낸다. 도 4B는 대조군 항체로 처리된 생후 4주령 야생형 마우스(-●- WT), 대조군 항체로 처리된 생후 4주령(전 증상) Mecp2 마우스(-■- P), 및 항-SEMA4D 항체로 처리된 생후 4주령(전 증상) MeCP2 마우스(-▲- T)에서의 뒷다리 움켜쥐기 정도를 도시한다. * WT 대비 P, ~ WT 대비 T, ^ P 대비 T(WT = 대조군 항체로 처리된 야생형 마우스; P = 대조군 항체로 처리된 레트 마우스; T = 항-SEMA4D 항체로 처리된 레트 마우스). *, ~, 및 ^ p ≤0.05; **, ~~, 및 ^^ p≤0.01; 및 ***, ~~~, 및 ^^^ p≤0.001.
도 5는 대조군 항체로 처리된 연령 매칭 야생형 마우스(-●- WT), 대조군 항체로 처리된 전 증상 Mecp2 마우스(-■- P) 및 항-SEMA4D 항체로 처리된 전 증상 Mecp2 마우스(-▲- T)에 의해 나타낸 전신 떨림을 그래프로 도시한다. * WT 대비 P, ~ WT 대비 T, ^ P 대비 T(WT = 대조군 항체로 처리된 야생형 마우스; P = 대조군 항체로 처리된 레트 마우스; T = 항-SEMA4D 항체로 처리된 레트 마우스). *, ~, 및 ^ p ≤0.05; **, ~~, 및 ^^ p≤0.01; 및 ***, ~~~, 및 ^^^ p≤0.001.
도 6은 10주 기간 동안 가속 로타로드 장치 상에서 연령 매칭 전 증상 및 야생형 마우스의 보행 및 조정 기능 테스트의 결과를 그래프로 도시한다: 대조군 항체로 처리된 생후 4주령 야생형 마우스(-●- WT), 대조군 항체로 처리된 생후 4주령(전 증상) Mecp2 마우스(-■- P), 및 항-SEMA4D 항체로 처리된 생후 4주령(전 증상) MecP2 마우스(-▲- T). * WT 대비 P, ~ WT 대비 T, ^ P 대비 T(WT = 대조군 항체로 처리된 야생형 마우스; P = 대조군 항체로 처리된 레트 마우스; T = 항-SEMA4D 항체로 처리된 레트 마우스). *, ~, 및 ^ p ≤0.05; **, ~~, 및 ^^ p≤0.01; 및 ***, ~~~, 및 ^^^ p≤0.001.
도 7은 10주 기간 동안 고가 플러스 미로(EPM) 장치를 사용하여 연령 매칭 전 증상 Mecp2 및 야생형 마우스의 인지 테스트한 결과를 그래프로 도시한다. 도 7A는 장치의 개방 아암 영역에서 소요된 시간의 백분율을 도시하고; 도 7B는 장치의 개방 아암 영역에 진입하는 백분율을 도시한다: 대조군 항체로 처리된 생후 4주령 야생형 마우스(-●- WT), 대조군 항체로 처리된 생후 4주령(전 증상) Mecp2 마우스(-■- P), 및 항-SEMA4D 항체로 처리된 생후 4주령(전 증상) MecP2 마우스(-▲- T). * WT 대비 P, ~ WT 대비 T, ^ P 대비 T(WT = 대조군 항체로 처리된 야생형 마우스; P = 대조군 항체로 처리된 레트 마우스; T = 항-SEMA4D 항체로 처리된 레트 마우스). *, ~, 및 ^ p ≤0.05; **, ~~, 및 ^^ p≤0.01; 및 ***, ~~~, 및 ^^^ p≤0.001.
도 8은 9주 기간 동안 연령 매칭 야생형 및 Mecp2 마우스의 전신 혈량측정 테스트의 결과를 그래프로 도시한다. 도 8A는 흡기 기간을 도시하고; 도 8B는 호기 기간을 도시한다: 대조군 항체로 처리된 생후 4주령 야생형 마우스(-●- WT), 대조군 항체로 처리된 생후 4주령(전 증상) Mecp2 마우스(-■- P), 및 항-SEMA4D 항체로 처리된 생후 4주령(전 증상) MecP2 마우스(-▲- T). * WT 대비 P, ~ WT 대비 T, ^ P 대비 T(WT = 대조군 항체로 처리된 야생형 마우스; P = 대조군 항체로 처리된 레트 마우스; T = 항-SEMA4D 항체로 처리된 레트 마우스). *, ~, 및 ^ p ≤0.05; **, ~~, 및 ^^ p≤0.01; 및 ***, ~~~, 및 ^^^ p≤0.001.
도 9는 대조군 항체로 처리된 생후 8주령 야생형 마우스(-●- WT), 대조군 항체로 처리된 생후 8주령(전 증상) Mecp2 마우스(-■- P), 및 항-SEMA4D 항체로 처리된 생후 8주령(전 증상) MecP2 마우스(-▲- T)에서의 뒷다리 움켜쥐기를 그래프로 도시한다. * WT 대비 P, ~ WT 대비 T, ^ P 대비 T(WT = 대조군 항체로 처리된 야생형 마우스; P = 대조군 항체로 처리된 레트 마우스; T = 항-SEMA4D 항체로 처리된 레트 마우스). *, ~, 및 ^ p ≤0.05; **, ~~, 및 ^^ p≤0.01; 및 ***, ~~~, 및 ^^^ p≤0.001.
도 10은 대조군 항체로 처리된 연령 매칭 야생형 마우스(-●- WT), 대조군 항체로 처리된 생후 8주령 증상이 있는 Mecp2 마우스(-■- P), 및 항-SEMA4D 항체로 처리된 증상이 있는 MecP2 마우스(-▲- T)에 의해 나타난 전신 떨림을 그래프로 도시한다. * WT 대비 P, ~ WT 대비 T, ^ P 대비 T(WT = 대조군 항체로 처리된 야생형 마우스; P = 대조군 항체로 처리된 레트 마우스; T = 항-SEMA4D 항체로 처리된 레트 마우스). *, ~, 및 ^ p ≤0.05; **, ~~, 및 ^^ p≤0.01; 및 ***, ~~~, 및 ^^^ p≤0.001.
도 11은 10주 기간 동안 가속 로타로드 장치 상에서 연령 매칭 증상이 있는 마우스 및 야생형 마우스의 보행 및 조정 기능 테스트의 결과를 그래프로 도시한다: 대조군 항체로 처리된 생후 8주령 야생형 마우스(-●- WT), 대조군 항체로 처리된 생후 8주령(증상) Mecp2 마우스(-■- P), 및 항-SEMA4D 항체로 처리된 생후 8주령(증상) MecP2 마우스(-▲- T). * WT 대비 P, ~ WT 대비 T, ^ P 대비 T(WT = 대조군 항체로 처리된 야생형 마우스; P = 대조군 항체로 처리된 레트 마우스; T = 항-SEMA4D 항체로 처리된 레트 마우스). *, ~, 및 ^ p ≤0.05; **, ~~, 및 ^^ p≤0.01; 및 ***, ~~~, 및 ^^^ p≤0.001.
도 12는 10주 기간 동안 고가 플러스 미로(EPM) 장치를 사용하여 연령 매칭 증상이 있는 MeCP2 및 야생형 마우스를 인지 테스트한 결과를 그래프로 도시한다. 도 12A는 장치의 개방 아암 영역에서 소요된 시간의 백분율을 도시하고; 도 12B는 장치의 개방 아암 영역에 진입하는 백분율을 도시한다: 대조군 항체로 처리된 생후 8주령 야생형 마우스(-●- WT), 대조군 항체로 처리된 생후 8주령(증상) MeCP2 마우스(-■- P), 및 항-SEMA4D 항체로 처리된 생후 8주령(전 증상) MeCP2 마우스(-▲- T). * WT 대비 P, ~ WT 대비 T, ^ P 대비 T(WT = 대조군 항체로 처리된 야생형 마우스; P = 대조군 항체로 처리된 레트 마우스; T = 항-SEMA4D 항체로 처리된 레트 마우스). *, ~, 및 ^ p ≤0.05; **, ~~, 및 ^^ p≤0.01; 및 ***, ~~~, 및 ^^^ p≤0.001.
도 13은 9주 기간 동안 연령 매칭 야생형 마우스 및 Mecp2 마우스의 전신 혈량측정 테스트의 결과를 그래프로 도시한다. 도 13A는 흡기 기간을 도시하고; 도 13B는 호기 기간을 도시한다: 대조군 항체로 처리된 생후 8주령 야생형 마우스(-●- WT), 대조군 항체로 처리된 생후 8주령(전 증상) Mecp2 마우스(-■- P), 및 항-SEMA4D 항체로 처리된 생후 8주령(전 증상) Mecp2 마우스(-▲- T). * WT 대비 P, ~ WT 대비 T, ^ P 대비 T(WT = 대조군 항체로 처리된 야생형 마우스; P = 대조군 항체로 처리된 레트 마우스; T = 항-SEMA4D 항체로 처리된 레트 마우스). *, ~, 및 ^ p ≤0.05; **, ~~, 및 ^^ p≤0.01; 및 ***, ~~~, 및 ^^^ p≤0.001.
도 14는 SEMA4D(CD100 다클론성 항체-　Invitrogen-PA5-47711) 및 뉴런 마커 HuC/HuD(HuC/HuD 단클론성 항체(16A11)- Invitrogen:　A-21271)에 대해 염색된 생후 약 8개월 암컷 마우스(Mecp2^T158A 및 야생형 한배새끼 대조군 C57/BL6)로부터의 뇌의 포르말린 고정 파라핀 삽입된 섹션을 도시한다. 해마 영역의 대표적 이미지가 도시된다. 도 14 A: SEMA4D에 대해 염색된 C57/BL6마우스; 도 14B: HuC/HuD에 대해 염색된 C57/BL6마우스; 도 14 C: SEMA4D에 대해 염색된 Mecp2^T158A 마우스; 및 도 14 D: HuC/HuD에 대해 염색된 Mecp2^T158A 마우스.

I. 정의

"하나의(a 또는 an)" 실체를 나타내는 용어는 그 실체의 하나 이상을 지칭하는 것이 주지되어야 한다; 예를 들어, "항-SEMA4D 항체"는 하나 이상의 항-SEMA4D 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "하나(a 또는 an)", "하나 이상", 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.

나아가, "및/또는"은 본원에서 사용되는 경우 다른 것이 있거나 없이 2개의 명시된 특징 또는 구성요소의 각각의 구체적인 개시로서 간주되어야 한다. 그러므로, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같이 구절에서 사용되는 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독), 및 "B"(단독)을 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같이 구절에서 이용되는 용어 "및/또는"는 다음의 구현의 각각을 포함하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).

다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 기술적이고 과학적인 용어는 본 개시가 관련된 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 사람에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 예를 들어, 문헌[Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]는 숙련된 사람에게 본 개시에서 사용된 많은 용어의 일반적인 사전을 제공한다.

단위, 접두사, 및 기호는 그것들의 국제 단위계(SI) 허용 형식으로 표시된다. 수치 범위는 범위를 규정하는 숫자를 포함한다. 다르게 표시되지 않는 한, 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시쪽 방향으로 좌측에서 우측으로 기재된다. 본원에 제공된 제목은 명세서 전체를 참조함으로써 가질 수 있는 개시의 다양한 측면 또는 측면의 제한이 아니다. 따라서, 바로 아래에서 정의되는 용어는 본 명세서 전체를 참조함으로써 보다 완전하게 정의된다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "비자연적으로 발생하는" 물질, 조성물, 실체, 및/또는 물질, 조성물, 또는 실체의 임의의 조합, 또는 그것의 임의의 문법적 변이체는 물질, 조성물, 실체, 및/또는 물질, 조성물, 또는 실체의 임의의 조합의 그러한 형태, 또는 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에 의해 "자연적으로 발생하는" 것으로서 잘 이해되는 실체, 또는 판사나 행정 또는 사법 기관에 의해 "자연적으로 발생하는" 것으로 결정하거나 해석되는, 또는 언제든지 결정 또는 해석될 실체를 분명히 배제하는, 그러나 단지 배제하는 조건부 용어이다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "신경발달 장애"는 뇌 또는 중추신경계의 성장 및 발달에 대한 손상을 지칭한다. 용어는 감정, 학습 능력, 자기 통제, 운동 제어 및 기억에 영향을 미치고 개인이 성장함에 따라 전개되는, 즉 시간이 지남에 따라 장애의 과정이 변화하는 뇌 기능 장애를 지칭한다. 레트 증후군은 뇌가 발달하는 방식에 영향을 미쳐서 운동 능력 및 언어의 점진적 상실을 유발하는 희귀한 유전적 신경학적 및 발달 장애(X 연관 신경발달 장애)이다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "레트 증후군"(RTT)은 인간에서 생후 약 6 내지 18개월에 처음 나타나며 이후에는 처음에 침체 기간을 거친 후 운동 및 언어 능력이 급속히 퇴행하는 진행성 질환을 지칭한다. 레트 증후군은 아동의 삶의 거의 모든 측면: 말하고, 걷고, 먹고, 심지어 쉽게 호흡하는 능력에 영향을 미친다. 증상에는 언어, 조정력, 및 반복적인 동작과 관련된 문제가 포함된다. 종종 더 느린 성장, 정상적인 동작 및 조정력의 상실, 의사소통 능력의 상실, 비정상적인 눈의 움직임, 예컨대, 강렬한 응시, 깜박임, 사팔눈 또는 한 번에 한쪽 눈 감기, 호흡 문제, 짜증, 인지 장애, 불규칙 심장박동, 및 정상적인 머리 크기보다 작은 머리 크기가 있다. 합병증에는 발작, 척추 측만증, 및 수면 문제뿐만 아니라, 호흡 문제가 포함될 수 있다. 레트 증후군의 특징은 거의 일정한 반복적인 손 동작이다. 그러나, 영향을 받는 사람들은 상이한 정도로 영향을 받을 수 있다. 일반적으로, 장애는 장애가 진행됨에 따라 대상체의 특정 변화를 함축하는 네 가지 "단계"의 순서로 전개된다. 고전적 RTT가 있는 대상체(주로 여자 아이)는 외관상 정상적인 정상 발달 기간이 있으며, 약 6-18개월에 장애의 초기 징후가 나타난다. 장애의 1 단계에서는 발달의 정체 및/또는 지연이 발생하며, 대상체는 예상되는 발달 이정표를 충족시키지 못한다. 그 다음에는 1세에서 4세 사이의 대상체가 의사소통 및 사회화와 같은 습득한 기술을 상실할뿐만 아니라, 미세하고 총체적인 운동 능력을 상실하는 급속한 퇴행 기간인 2 단계가 이어진다. 더불어, 머리 성장의 감속이 일어날 수 있다. RTT의 특징인 정형화된 손 동작이 나타나는 것도 이 기간 중이다(Temudo, et al.(2007) Abnormal movements in Rett syndrome are present before the regression period: a case study. Mov. Disord. 22, 2284-2287; Einspieler et al.(2005) Is the early development of girls with Rett disorder really normal? Pediatr. Res. 57, 696-700.) 3 단계는 표현형이 안정화되는 퇴행 후 단계이다. 이 기간 동안 많은 대상체가 강렬한 시선과 사회적 인식 증가를 발달시킨다. 그들은 또한 부분적으로 2 단계 중에 상실한 능력의 일부를 다시 획득할 수 있다. 마지막 단계인 4 단계는 후기 운동 저하 단계이며 수년에서 수십년까지 지속될 수 있다. 이 단계는 감소된 이동성 감소, 근육 약화, 경직 및 경련이 특징이며, 대상체가 나이가 들어감에 따라 근긴장이상 및 손발 기형이 발생한다. 걷기는 중단될 수 있지만 시선은 일반적으로 개선되고, 반복적인 손 동작은 감소할 수 있으며, 인지, 의사소통, 또는 손 기술은 일반적으로 감소하지 않는다.

용어 "치료적 유효량"은 대상체 또는 포유류에서 질환 또는 장애를 "치료"하는 데 효과적인 항체, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 작은 유기 분자, 또는 다른 약물의 양을 지칭한다. 신경발달 장애의 경우에, 약물의 치료적 유효량은 장애의 증상을 완화시킬 수 있거나; 증상의 발생을 감소, 축소, 지연 또는 중단시킬 수 있거나; 증상의 중증도를 감소, 축소, 지연시킬 수 있거나; 증상의 발현을 억제, 예컨대, 억압, 지연, 방지, 중단, 또는 반전시킬 수 있거나; 장애와 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화시킬 수 있거나; 이병률 및 사망률을 감소시킬 수 있거나; 삶의 질은 개선할 수 있거나; 또는 그러한 효과들의 조합일 수 있다.

본원에서 언급되는 용어 "증상"은 예컨대, 1) 신경정신병 증상, 2) 인지 증상, 및 3) 운동 기능장애를 지칭한다. 신경정신병 증상의 예에는, 예를 들면 불안 유사 행동, 수면 장애, 및 짜증이 포함된다. 인지 증상의 예에는, 예를 들면 학습 및 기억 결핍이 포함된다. 운동 기능장애의 예에는, 예를 들면 보행 또는 조정의 어려움 또는 반복 동작, 예컨대, 손 비틀기(wringing)와 같은 손 동작이 포함된다.

"치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하기 위한" 또는 "완화시키는" 또는 "완화시키기 위한" 또는 "개선하는" 또는 "개선하기 위한"과 같은 용어는 1) 진단된 병리학적 상태 또는 장애의 진행을 치유, 감속, 증상을 경감, 반전, 및/도는 정지시키는 치료적 조치 및 2) 표적화된 병리학적 상태 또는 장애의 발달을 예방 및/또는 둔화시키는 예방적 또는 예방 조치를 모두 지칭한다. 그러므로, 치료를 필요로 하는 대상에는 이미 장애를 가진 대상; 장애를 갖기 쉬운 대상; 및 장애가 예방되어야 하는 대상이 포함된다. 유익한 또는 원하는 임상 결과로는, 한정하는 것은 아니지만, 검출 가능하거나 검출할 수 없거나 간에 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화(즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 차도(부분적이거나 전체적인)를 들 수 있다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는다면 예상되는 생존율과 비교하여 연장된 생존율을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 대상에는 이미 병태 또는 장애의 증상을 나타내는 대상뿐만 아니라 무증상 대상도 포함된다.

CD100으로도 알려져 있는 세마포린 4D(SEMA4D)는 세마포린 유전자 패밀리에 속하는 경막 단백질(예컨대, 서열 번호 1(인간); 서열 번호 2(쥐과))이다. SEMA4D는 세포 표면에서 단일 이량체로서 발현되지만, 세포 활성화시 SEMA4D는 단백질 가수분해성 절단을 통해 세포 표면으로부터 방출되어 단백질의 가용성 형태인 sSEMA4D를 생성하며, 이것 또한 생물학적으로 활성이다. [Suzuki et al., Nature Rev. Immunol. 3:159-167(2003); Kikutani et al., Nature Immunol. 9:17-23(2008)] 참고. SEMA4D는 비장, 흉선, 및 림프절을 포함한 림프 기관, 및 비림프 기관, 예컨대 뇌, 심장, 및 신장에서 고수준으로 발현된다. SEMA4D는 신경계 발달에서 축삭 유도 단백질로서 중요한 역할을 하며 신경퇴행성 장애, 자가면역 질환, 탈수초성 질환, 및 특정 암의 발달에 연루되었다. 그러나, 뇌 및 척수를 포함한 중추신경계(CNS)의 조직화 및 기능 및 CNS에 의해 제어되는 행동에 미치는 SEMA4D 신호전달 차단의 영향은 여전히 설명되어야 할 것이다. 이것은 CNS의 변화가 대상체의 행동 및 삶의 질에 현저한 영향을 미치기 때문에 중요하다. 특히, 그러한 변화는 대상체의 신경정신과적 행동, 인지 행동, 및 운동 능력에 영향을 미칠 수 있다.

"대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유류"는 진단, 예측, 또는 치료법이 요구되는 임의의 대상체, 특히 포유류 대상체, 예컨대 인간을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "항-SEMA4D 항체의 투여로 이익을 얻을 수 있는 대상체" 및 "치료를 필요로 하는 동물"과 같은 구절은 SEMA4D 폴리펩타이드의 검출(예컨대, 진단 과정을 위해)을 위해 사용된 항-SEMA4D 항체 또는 다른 SEMA4D 결합 분자의 투여로부터, 및/또는 치료, 즉 레트 증후군의 증상의 발병의 일시적 완화 또는 예방으로부터 이익을 얻을 수 있는 대상체, 예컨대 포유류 대상체를 포함한다.

본 개시의 "결합 분자" 또는 "항원 결합 분자"는 그것의 가장 넓은 의미로 항원 결정기에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 한 구현예에서, 결합 분자는 SEMA4D, 예컨대, 약 150 kDa의 경막 SEMA4D 폴리펩타이드 또는 약 120 kDa의 가용성 SEMA4D 폴리펩타이드(일반적으로 sSEMA4D로서 지칭됨)에 특이적으로 결합한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 또 다른 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 항체 분자의 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 2개의 CDR을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 3개의 CDR을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 4개의 CDR을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 5개의 CDR을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 6개의 CDR을 포함한다.

본 개시는 항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 레트 증후군으로서 알려져 있는 신경발달 장애를 가진 대상체의 증상을 완화시키는 방법에 관한 것이다. 자연 발생적인 항체와 같은 전체 크기의 항체를 구체적으로 언급하지 않는 한, 용어 "항-SEMA4D 항체"는 전체 크기의 항체뿐만 아니라 그러한 항체의 항원 결합 단편, 변이체, 유사체, 또는 유도체, 예컨대, 자연 발생적인 항체 또는 항체 분자와 유사한 방식으로 항원에 결합하는 면역글로불린 분자 또는 조작된 항체 분자 또는 단편을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "인간" 또는 "완전 인간" 항체는 아래에서, 그리고 예를 들어, Kucherlapati 등의 미국 특허 제 5,939,598호에서 기술된 것과 같이, 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 가지는 항체를 포함하며 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대핸 유전자도입된 동물로부터 단리되고 내인성 면역글로불린을 발현하지 않는 항체를 포함한다. "인간" 또는 "완전 인간" 항체는 또한 중쇄의 적어도 가변 도메인, 또는 중쇄 및 경쇄의 적어도 가변 도메인을 포함하는 항체를 포함하며, 여기서 가변 도메인(들)은 인간 면역글로불린 가변 도메인(들)의 아미노산 서열을 가진다.

"인간" 또는 "완전 인간" 항체는 또한 위에서 기술된 것과 같이, 본원에 기술된 항체 분자(예컨대, VH 영역 및/또는 VL 영역)의 변이체(유도체 포함)를 포함하는, 또는 그것으로 본질적으로 이루어지는, 또는 이루어지는 "인간" 또는 "완전 인간" 항체를 포함하며, 항체 또는 이의 단편은 SEMA4D 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체에 면역특이적으로 결합한다. 인간 항-SEMA4D 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 돌연변이를 도입하기 위해, 한정하는 것은 아니지만, 아미노산 치환을 초래하는 부위 지정 돌연변이생성 및 PCR 매개 돌연변이생성을 포함한, 기술분야에 숙련된 사람들에게 알려져 있는 표준 기법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체(유도체 포함)는 참조 VH 영역, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VL 영역, VLCDR1, VLCDR2, 또는 VLCDR3에 비해 50개 미만 아미노산 치환, 40개 미만 아미노산 치환, 30개 미만 아미노산 치환, 25개 미만 아미노산 치환, 20개 미만 아미노산 치환, 15개 미만 아미노산 치환, 10개 미만 아미노산 치환, 5개 미만 아미노산 치환, 4개 미만 아미노산 치환, 3개 미만 아미노산 치환, 또는 2개 미만 아미노산 치환을 암호화한다.

특정 구현예에서, 아미노산 치환은 아래에서 추가로 논의되는 보존성 아미노산 치환이다. 대안으로, 돌연변이는 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위로, 예컨대 포화 돌연변이생성에 의해 도입될 수 있고, 결과적으로 생성된 돌연변이체는 생물학적 활성에 대해 스크리닝되어 활성(예컨대, SEMA4D 폴리펩타이드, 예컨대, 인간, 쥐과, 또는 인간 및 쥐과 둘 다의 SEMA4D에 결합하는 능력)을 유지하는 돌연변이체가 확인될 수 있다. "인간" 또는 "완전 인간" 항체의 그러한 변이체(또는 이의 유도체)는 "최적화된" 또는 "항원 결합에 대해 최적화된" 인간 또는 완전 인간 항체로서 지칭될 수 있고 항원에 대한 개선된 친화성을 가진 항체를 포함한다.

용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 항체 또는 면역글로불린은 중쇄의 적어도 가변 도메인을 포함하고, 일반적으로 중쇄 및 경쇄의 적어도 가변 도메인을 포함한다. 척추동물 시스템에서 기본적인 면역글로불린 구조는 비교적 잘 이해된다. 예컨대, [Harlow et al.(1988) Antibodies: A Laboratory Manual(2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press)] 참고.

본원에서 사용되는 바, 용어 "면역글로불린"은 생화학적으로 구별될 수 있는 다양한 폭넓은 부류의 폴리펩타이드를 포함한다. 기술분야에 숙련된 사람들은 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론(γ, μ, α, ε)으로서 분류되며, 이들 중 일부 하위부류(예컨대, γ1-γ4, γ4.γ4)가 있음을 인정할 것이다. 항체의 "부류"를 각각 IgG, IgM, IgA IgG, 또는 IgE로서 결정하는 것은 바로 이 사슬의 본질이다. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, 등과 같은 면역글로불린 하위부류(아이소타입)가 잘 특성화되어 있고 기능적 전문화를 부여하는 것으로 알려져 있다. 이들 부류 및 아이소타입의 각각의 변형된 버전은 본 개시의 관점에서 숙련된 전문가에게 쉽게 식별 가능하며, 따라서, 본 개시의 범주 내에 있다. 모든 면역글로불린 하위부류는 분명하게 본 개시의 범주 내에 있으며, 다음의 논의는 일반적으로 면역글로불린 분자의 IgG 부류에 관한 것일 것이다. IgG와 관련하여, 표준 면역글로불린 분자는 대략 23,000 달톤의 분자량의 2개의 동일한 경쇄 폴리펩타이드, 및 53,000-70,000 분자량의 2개의 동일한 중쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 4개의 사슬은 전형적으로 이황화 결합에 의해 경쇄가 "Y"의 입구에서 시작하여 가변 영역을 통해 계속되는 중쇄를 묶는 "Y"자형 구성으로 연결된다.

경쇄는 카파 또는 람다(κ, λ)로서 분류된다. 각각의 중쇄 부류는 카파 또는 람다 경쇄와 결합될 수 있다. 일반적으로, 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포 또는 유전자 조적된 숙주 세포에 의해 생성될 때 경쇄 및 중쇄는 서로에 공유 결합되며, 두 중쇄의 "꼬리(tail)" 부분은 공유 이황화 결합 또는 비공유 결합에 의해 서로에게 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y자형 구성의 갈래 끝에서 N 말단으로부터 각 사슬의 바닥에 있는 C 말단쪽으로 진행된다.

경쇄 및 중쇄는 모두 구조적 및 기능적 상동성의 영역으로 나누어진다. 용어 "불면" 및 "가변"은 기능적으로 사용된다. 이 관점에서, 경쇄의 가변 도메인(VL 또는 VK) 및 중쇄의 가변 도메인(VH) 두 부분이 모두 항원 인식 및 특이성을 결정하는 것이 인정될 것이다. 역으로, 경쇄의 불변 도메인(CL) 및 중쇄의 불변 도메인(전형적으로 CH1, CH2 또는 CH3)은 전형적으로 분비, 경태반 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합, 등과 같은 중요한 생물학적 특성을 부여한다. 관례에 따라 불변 영역 도메인의 넘버링은 항체의 항원 결합 부위 또는 아미노 말단으로부터 더 멀어짐에 따라 증가한다. N 말단 부분은 가변 영역이고 C 말단 부분에는 불변 영역이 있다; CH3 및 CL 도메인은 전형적으로 각각 중쇄 및 경쇄의 카르복시 말단을 포함한다.

위에서 나타낸 것과 같이, 가변 영역은 항체가 항원 상의 에피토프를 선택적으로 인식하고 특이적으로 결합하는 것을 허용한다. 즉, 항체의 VL 도메인 및 VH 도메인, 또는 이들 가변 도메인 내의 상보성 결정 영역(CDR)의 하위세트가 조합하여 3차원 항원 결합 부위를 규정하는 가변 영역을 형성한다. 이런 사차 항체 구조는 Y의 각 팔(arm)의 단부에 존재하는 항원 결합 부위를 형성한다. 보다 구체적으로, 항원 결합 부위는 VH 및 VL 사슬의 각각에 있는 3개의 CDR에 의해 규정된다. 일부 경우에, 예컨대 낙타과 종으로터 유래된 또는 낙타과 면역글로불린을 토대로 조작된 특정 면역글로불린 분자, 완전한 면역글로불린 분자가 경쇄 없이 중쇄만으로 이루어질 수 있다. 예컨대, [Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448(1993)] 참고.

자연적으로 발생하는 항체에서, 각각의 항원 결합 도메인에 존재하는 6개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항체가 수성 환경에서 3차원 형태를 가정함에 따라 항원 결합 도메인을 형성하기 위해 특이적으로 위치하는 짧은, 비연속성 아미노산 서열이다. "프레임워크" 영역으로 지칭되는, 항원 결합 도메인의 아미노산의 나머지는 더 적은 분자간 가변성을 나타낸다. 프레임워크 영역은 대부분 β 시트 형태를 채택하며 CDR은 β 시트 구조를 연결하고, 일부 경우에는 그것의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 그러므로, 프레임워크 영역은 사슬간, 비공유 상호작용에 의해 정확한 방향으로 CDR의 위치를 정하는 것을 제공하는 스캐폴드를 형성하는 작용을 한다. 배치된 CDR에 의해 형성된 항원 결합 도메인은 면역반응성 항원 상의 에피토프에 상보하는 표면을 규정한다. 이 상보적인 표면은 항체의 동족 에피토프에의 비공유 결합을 촉진한다. CDR 및 프레임워크 영역을 각각 포함하는 아미노산은, 정확하게 정의되어 있기 때문에(하기 참조) 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에 의해 임의의 주어진 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인에 대해 쉽게 확인될 수 있다.

기술분야에 내에서 사용되고/거나 허용되는 용어에 대해 둘 이상의 정의가 있는 경우에, 본원에서 사용되는 용어의 정의는 분명하게 반대로 진술되지 않는 한 모든 그러한 의미를 포함하는 것으로 의도된다. 구체적인 예는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘 다의 가변 영역 내에서 발견되는 비연속성 항원 결합 부위를 기술하기 위한 용어 "상보성 결정 영역"("CDR")의 사용이다. 이 특별한 영역은 본원에 참조로 포함된 문헌: Kabat et al.(1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" and by Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)에 의해 기술되어 있는데, 여기에서 정의는 서로에 대해 비교될 대 중복되는 또는 하위세트의 아미노산 잔기를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이의 변이체의 CDR을 지칭하기 위한 어느 하나의 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용되는 용어의 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 위에서 인용된 각각의 참고문헌에 의해 정의된 CDR을 포함하는 적절한 아미노산 잔기는 비교로서 아래의 표 1에서 제시된다. 각각의 상기 인용된 참고문헌에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 포함하는 적절한 아미노산 잔기는 비교예로서 하기 표 1에 제시되어 있다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 번호는 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 기술분야에 숙련된 사람들은 항체의 가변 영역 아미노산 서열이 주어질 때 어떤 잔기가 특정 CDR을 포함하는지를 일상적으로 결정할 수 있다.

¹표 1의 모든 CDR 정의의 넘버링은 Kabat 등(아래 참조)에 의해 제시된 넘버링 관례를 따른다.

Kabat 등은 또한 모든 항체에 적용할 수 있는 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 시스템을 정의하였다. 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람은 이 "Kabat 넘버링" 시스템을, 서열 자체 외의 어떠한 실험 데이터에도 의존하지 않으면서, 임의의 가변 도메인 서열에 명확하게 할당할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "Kabat 넘버링"은 문헌: Kabat et al. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest"에서 제시된 넘버링 시스템을 지칭한다. 다르게 명시되지 않는 한, 본 개시의 항-SEMA4D 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 특정 아미노산 잔기 위치의 넘버링에 대한 언급은 Kabat 넘버링 시스템에 따른다.

본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체에는, 한정하는 것은 아니지만, 다클론성, 단클론성, 적어도 하나의 팔이 SEMA4D에 대해 특이적인 다중특이적 및 이중특이적, 인간, 인간화된, 영장류화된, 또는 키메라 항체, 단일 사슬 항체, 에피토프 결합 단편, 예컨대, Fab, Fab' 및 F(ab')₂, Fd, Fv, 단일 사슬 Fv(scFv), 이황화 연결된 Fv(sdFv), VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 및 항-이디오타입(항-Id) 항체(예컨대, 본원에 개시된 항-SEMA4D 항체에 대한 항-Id 항체 포함)가 포함된다. ScFv 분자는 기술분야에 알려져 있고, 예컨대, 미국 특허 제 5,892,019호에 기술된다. 개시의 면역글로불린 또는 항체 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 유형(예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 부류(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2, 등)의 것일 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "중쇄 부분"은 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 중쇄 부분을 포함하는 폴리펩타이드는 VH 도메인, CH1 도메인, 힌지(예컨대, 상부, 중간, 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 그것들의 변이체 또는 단편 중 적어도 하나를 포함한다. 예를 들어, 개시에 사용하기 위한 결합 폴리펩타이드는 CH1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, 및 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬; CH1 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬, 또는 CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 개시의 폴리펩타이드는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이스 사슬을 포함한다. 추가로, 개시에 사용하기 위한 결합 폴리펩타이드는 CH2 도메인의 적어도 일부(예컨대, CH2 도메인의 전부 또는 일부)가 없을 수 있다. 위에서 제시된 것과 같이, 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람은 이들 도메인(예컨대, 중쇄 부분)이 자연적으로 발생하는 면역글로불린 분자로부터의 아미노산 서열이 다르도록 변형될 수 있는 것을 이해할 것이다.

본원에 개시된 특정 항-SEMA4D 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체에서, 다량체의 하나의 폴리펩타이드 사슬의 중쇄 부분은 다량체의 제2 폴리펩타이드 사슬 상의 중쇄 부분과 동일하다. 대안으로, 개시의 중쇄 부분 함유 단량체는 동일하지 않다. 예를 들어, 각각의 단량체는 예를 들어, 이중특이적 항체를 형성하는 상이한 표적 결합 부위를 포함할 수 있다.

본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 결합 분자의 중쇄 부분은 상이한 면역글로불린 분자로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 중쇄 부분은 IgG1 분자로부터 유래된 CH1 도메인 및 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로는 IgG1 분자로부터 유래되고, 부분적으로는 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로는 IgG1 분자로부터 유래되고, 부분적으로는 IgG4 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "경쇄 부분"은 면역글로불린 경쇄, 예컨대, 카파 또는 람다 경쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면으로, 경쇄 부분은 VL 또는 CL 도메인 중 적어도 하나를 포함한다.

본원에 개시된 항-SEMA4D 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 그것들이 인식하거나 특이적으로 결합하는 항원의 에피토프(들) 또는 부분(들), 예컨대, 본원에 개시된 표적 폴리펩타이드(예컨대, SEMA4D)의 관점에서 기술되거나 명시될 수 있다. 항체의 항원 결합 도메인과 특이적으로 상호작용하는 표적 폴리펩타이드의 부분은 "에피토프", 또는 "항원 결정기"이다. 표적 폴리펩타이드는 단일 에피토프를 포함할 수 있지만, 전형적으로 적어도 2개의 에피토프를 포함하며, 항원의 크기, 형태, 및 유형에 따라 임의의 수의 에피토프를 포함할 수 있다. 나아가, 표적 폴리펩타이드 상의 "에피토프"는 비폴리펩타이드 요소이거나 요소를 포함할 수 있으며, 예컨대, 에피토프는 탄수화물 측쇄를 포함할 수 있다.

항체에 대한 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프의 최소 크기는 약 4 내지 5개 아미노산인 것으로 여겨진다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프는, 예컨대, 적어도 7개, 적어도 9개 또는 적어도 약 15 내지 약 30개 아미노산을 함유할 수 있다. CDR은 항원성 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 그것의 삼차 형태로 인식할 수 있기 때문에, 에피토프를 포함하는 아미노산은 연속적일 필요가 없고, 일부 경우에는, 별도의 펩타이드 사슬 상에 있을 수 있다. 본 개시의 항-SEMA4D 항체에 의해 인식된 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프는 SEMA4D의 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 또는 약 15 내지 약 30개의 연속적인 또는 비연속적인 아미노산의 서열을 함유할 수 있다.

"특이적으로 결합하는"이란, 일반적으로 항체가 에피토프에 그것의 항원 결합 도메인을 통해 결합하고, 결합에는 항원 결합 도메인과 에피토프 사이에 약간의 상보성이 수반되는 것을 의미한다. 이 정의에 따르면, 항체는 그것이 무작위의, 관련이 없는 에피토프에 결합할 때보다 항원 결합 도메인을 통해 한 에피토프에 더 쉽게 결합할 때 그 에피토프에 "특이적으로 결합"한다고 말한다. 용어 "특이성"은 본원에서 항체가 특정 에피토프에 결합하는 상대적인 친화성을 한정하기 위해 사용된다. 예를 들어, 항체 "A"는 주어진 에피토프에 대해 항체 "B"보다 더 높은 특이성을 가진 것으로 볼 수 있거나, 또는 항체 "A"는 관련된 에피토프 "D"에 대해 가지는 것보다 더 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합한다고 말할 수 있다.

"우선적으로 결합하는"이란, 항체가 관련된, 유사한, 상동성인, 또는 유사한 에피토프에 결합하는 것보다 더 쉽게 한 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 그러므로, 주어진 에피토프에 "우선적으로 결합하는" 항체는, 그러한 항체는 관련된 에피토프와 교차 반응할 수 있지만, 관련된 에피토프보다 그 에피토프에 결합할 가능성이 더 많을 것이다.

비제한적인 예를 들자면, 만약 항체가 제1 에피토프에 제2 에피토프에 대한 항체의 해리 상수(K_D)보다 적은 K_D로 결합한다면 항체는 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 비제한적인 예에서, 만약 항체가 제1 에피토프에 제2 에피토프에 대한 항체의 K_D보다 적어도 한 차수 적은 크기인 친화성으로 결합한다면, 항체는 제1 항원에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 비제한적인 예에서, 만약 항체가 제1 에피토프에 제2 에피토프에 대한 항체의 K_D보다 적어도 두 차수 적은 크기인 친화성으로 결합한다면, 항체는 제1 항원에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다.

또 다른 비제한적인 예에서, 만약 항체가 제1 에피토프에 제2 에피토프에 대한 항체의 오프 속도(k(오프))보다 적은 k(오프)로 결합한다면 항체는 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 비제한적인 예에서, 만약 항체가 제1 에피토프에 제2 에피토프에 대한 항체의 k(오프)보다 적어도 한 차수 적은 크기인 친화성으로 결합한다면 항체는 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 비제한적인 예에서, 만약 항체가 제1 에피토프에 제2 에피토프에 대한 항체의 k(오프)보다 적어도 두 차수 적은 크기인 친화성으로 결합한다면, 항체는 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 본원에 개시된 표적 폴리펩타이드(예컨대, SEMA4D, 예컨대, 인간, 쥐과, 또는 인간 및 쥐과 둘 다의 SEMA4D) 또는 이의 단편 또는 변이체에 5 X 10^-2 초^-1, 10^-2 초^-1, 5 X 10^-3 초^-1 또는 10^-3 초^-1 이하의 오프 속도(k(오프))로 결합한다고 말할 수 있다. 특정 측면으로, 개시의 항체는 본원에 개시된 표적 폴리펩타이드(예컨대, SEMA4D, 예컨대, 인간, 쥐과, 또는 인간 쥐과 둘 다의 SEMA4D) 또는 이의 단편 또는 변이체에 5 X 10^-4 초^-1, 10^-4 초^-1, 5 X 10^-5 초^-1, 또는 10^-5 초^-1, 5 X 10^-6 초^-1, 10^-6 초^-1, 5 X 10^-7 초^-1 또는 10^-7 초^-1의 오프 속도(k(오프))로 결합한다고 말할 수 있다.

본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 본원에 개시된 표적 폴리펩타이드(예컨대, SEMA4D, 예컨대, 인간, 쥐과, 또는 인간 및 쥐과 둘 다의 SEMA4D) 또는 이의 단편 또는 변이체에 10³ M^-1 초^-1, 5 X 10³ M^-1 초^-1, 10⁴ M^-1 초^-1 또는 5 X 10⁴ M^-1 초^-1 이상의 온 속도(k(온))로 결합한다고 말할 수 있다. 일부 구현예에서, 개시의 항체는 본원에 개시된 표적 폴리펩타이드(예컨대, SEMA4D, 예컨대, 인간, 쥐과, 또는 인간 및 쥐과 둘 다의 SEMA4D) 또는 이의 단편 또는 변이체에 10⁵ M^-1 초^-1, 5 X 10⁵ M^-1 초-¹, 10⁶ M^-1 초^-1, 또는 5 X 10⁶ M^-1 초^-1 또는 10⁷ M^-1 초^-1 이상의 온 속도(k(온))로 결합한다고 말할 수 있다.

만약 항체가 에피토프에 대한 참조 항체의 결합을 어느 정도 차단하는 정도로 그 에피토프에 우선적으로 결합한다면 항체는 주어진 에피토프에 대한 참조 항체의 결합을 경쟁적으로 억제한다고 한다. 경쟁 억제는 기술분야에 알려져 있는 임의의 방법, 예를 들어, 경쟁 ELISA 검정에 의해 측정될 수 있다. 항체는 주어진 에피토프에 대한 참조 항체의 결합을 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50% 경쟁적으로 억제한다고 말할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "친화성"은 개별 에피토프와 면역글로불린 분자의 CDR과의 결합의 강도의 척도를 지칭한다. 예컨대, [Harlow et al.(1988) Antibodies: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.) pages 27-28] 참고. 본원에서 사용되는 바, 용어 "결합력"은 면역글로불린의 집단과 항원 사이의 복합체의 전체적인 안정성, 즉, 항원과의 면역글로불린 혼합물의 기능적 조합 강도를 지칭한다. 예컨대, [Harlow의 29-34면] 참고. 결합력은 특정 에피토프가 있는 집단의 개별 면역글로불린 분자의 친화성, 및 또한 면역글로불린과 항원의 결합가에 모두 관련된다. 예를 들어, 이가 단클론성 항체와 고도로 반복적인 에피토프 구조, 예컨대 중합체를 가진 항원 사이의 상호작용이 높은 결합력 중 하나일 것이다.

개시의 항-SEMA4D 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 또한 그것의 교차 반응성의 관점에서 기술되거나 명시될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "교차 반응성"은 하나의 항원에 특이적인 항체의 제2 항원과 반응하는 능력을 지칭하며; 두 상이한 항원성 물질 사이의 관련성의 척도이다. 그러므로, 항체는 만약 그것이 그것의 형성을 유도한 것 이외의 에피토프에 결합한다면 교차 반응성이다. 교차 반응성 에피토프는 일반적으로 유도 에피토프와 동일한 상보하는 구조적 특징을 많이 함유하며, 일부 경우에는, 원래의 것보다 실제로 더 잘 맞을 수 있다.

예를 들어, 특정 항체는 관련되지만 동일하지 않은 에피토프, 예컨대, 참조 에피토프에 대해 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55%, 및 적어도 50% 동일성(기술분야에 알려져 있고 본원에 기술된 방법을 사용하여 계산된 것임)을 가진 에피토프에 결합한다는 점에서 어느 정도의 교차 반응성을 가진다. 항체는 만약 그것이 참조 에피토프에 대해 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 및 50% 미만의 동일성(기술분야에 알려져 있고 본원에 기술된 방법을 사용하여 계산된 것임)을 가진 에피토프에 결합하지 않는다면 교차 반응성을 거의 또는 전혀 갖지 않는 것으로 말할 수 있다. 항체는 만약 그것이 특정 에피토프의 임의의 다른 유사체, 오르토로그, 또는 상동체에 결합하지 않는다면, 그 에피토프에 대해 "고도로 특이적"인 것으로 간주될 수 있다.

개시의 항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 또한 개시의 폴리펩타이드, 예컨대, SEMA4D, 예컨대, 인간, 쥐과, 또는 인간 및 쥐과 둘 다의 SEMA4D에 대한 결합 친화성의 관점에서 기술되거나 명시될 수 있다. 특정 측면으로, 결합 친화성은 5 X 10^-2 M, 10^-2 M, 5 X 10^-3 M, 10^-3 M, 5 X 10^-4 M, 10^-4 M, 5 X 10^-5 M, 10^-5 M, 5 X 10^-6 M, 10^-6 M, 5 X 10^-7 M, 10^-7 M, 5 X 10^-8 M, 10^-8 M, 5 X 10^-9 M, 10^-9 M, 5 X 10 M, 10^-10 M, 5 X 10^-11 M, 10^-11 M, 5 X 10^-12 M, 10^-12 M, 5 X 10^-13 M, 10^-13 M, 5 X 10^-14 M, 10^-14 M, 5 X 10^-15 M, 또는 10^-15 M 미만의 해리 상수 또는 Kd를 가진 것들을 포함한다. 특정 구현예에서, 개시의 항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 SEMA4D에 약 5 X 10^-9 내지 약 6 X 10^-9의 Kd로 결합한다. 또 다른 구현예에서, 개시의 항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 쥐과 SEMA4D에 약 1 X 10^-9 내지 약 2 X 10^-9의 Kd로 결합한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "키메라 항체"는 면역반응성 영역 또는 부위가 제1 종으로부터 얻어지거나 유래되고 불변 영역(본 개시에 따라 온전하거나, 부분적이거나 또는 변형될 수 있음)이 제2 종으로부터 얻어지는 임의의 항체를 의미하는 것으로 여겨질 것이다. 특정 구현예에서 표적 결합 영역 또는 부위는 비인간 공급원(예컨대, 마우스 또는 영장류)으로부터 유래될 것이고 불변 영역은 인간이다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "조작된 항체"는 중쇄 또는 경쇄 또는 둘 다에 있는 가변 도메인이 알려진 특이성의 항체로부터의 하나 이상의 CDR의 적어도 부분적인 대체에 의해 및, 필요하다면, 부분적인 프레임워크 영역 대체 및 서열 변경에 의해 변경되는 항체를 지칭한다. 비록 CDR은 프레임워크 영역이 유래되는 항체와 동일한 부류 또는 심지어 하위부류로부터 유래될 수 있지만, CDR은 상이한 부류의 항체로부터, 또는 상이한 종으로부터의 항체로부터 유래될 것이다. 특이성이 알려져 있는 비인간 항체로부터의 하나 이상의 "도너" CDR이 인간 중쇄 또는 경쇄 프레임워크 영역에 그라프팅되어 있는 조작된 항체는 본원에서 "인간화된 항체"로서 지칭된다. 한 가변 도메인의 항원 결합 능력을 또 다른 것으로 전달하기 위해 언제나 모든 CDR이 도너 가변 도메인으로부터의 완전한 CDR로 대체될 필요는 없다. 오히려, 당업자는 전달될 필요가 있는 표적 결합 부위의 활성을 유지하기 위해 필요한 잔기만을 전달할 수 있다.

추가로 인간화된 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 둘 다에 있는 가변 도메인 내의 프레임워크 영역은 인간 기원의 잔기만을 포함할 수 있고, 그 경우 인간화된 항체의 이들 프레임워크 영역은 "완전 인간 프레임워크 영역"으로서 지칭되는 것이 인지된다(예를 들어, 전문이 참조로 본원에 포함되는 미국 특허 출원 공개 번호 US 2010/0285036 A1에서 MAb 2503으로서 개시된 MAb VX15/2503 또는 67). 대안으로, 도너 가변 도메인의 프레임워크 영역(들)의 하나 이상의 잔기는 SEMA4D 항원에 대한 적절한 결합을 유지하거나 결합을 향상시키기 위해 필요하다면 인간화된 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 둘 다에 있는 가변 도메인 내의 프레임워크 영역(들)의 상응하는 위치 내에서 조작될 수 있다. 이런 방식으로 조작된 인간 프레임워크 영역은 따라서 인간 및 도너 프레임워크 잔기의 혼합물을 포함할 것이고 본원에서 "부분적으로 인간 프레임워크 영역"으로서 지칭된다.

예를 들어, 항-SEMA4D 항체의 인간화는 본질적으로 Winter 및 동료들의 방법(Jones et al., Nature 321:522-525(1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327(1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536(1988))을 따라, 설치류 또는 돌연변이 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항-SEMA4D 항체의 상응하는 서열에 대해 치환함으로써 수행될 수 있다. 또한 참조로 본원에 포함되는 미국 특허 제 5,225,539호; 제 5,585,089호; 제 5,693,761호; 제 5,693,762호; 제 5,859,205호 참고. 결과적으로 생성된 인간화된 항-SEMA4D 항체는 인간화된 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인의 완전 인간 프레임워크 영역 내에 적어도 하나의 설치류 또는 돌연변이 설치류 CDR을 포함할 것이다. 일부 경우에, 인간화된 항-SEMA4D 항체의 하나 이상의 가변 도메인의 프레임워크 영역 내의 잔기는 상응하는 비인간(예를 들어, 설치류) 잔기에 의해 대체되고(예를 들어, 미국 특허 제 5,585,089호; 제 5,693,761호; 제 5,693,762호; 및 제 6,180,370호 참고), 그 경우 결과적으로 생성된 인간화된 항-SEMA4D 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인 내에 부분적으로 인간 프레임워크 영역을 포함할 것이다.

나아가, 인간화된 항체는 수령체 항체 또는 도너 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해(예컨대, 원하는 친화성을 얻기 위해) 만들어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 전부 포함할 것이고, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR은 비인간 면역글로불린의 CDR에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화된 항체는 선택적으로 또한 전형적으로 인간 면역글로불린의 것인 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 부분을 포함할 것이다. 추가의 상세한 설명에 대해서는 본원에 참조로 포함된 문헌: Jones et al., Nature 331:522-525(1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329(1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)을 참고한다. 따라서, 그러한 "인간화된" 항체는 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 적은 부분이 비인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환되어 있는 항체를 포함할 수 있다. 실제로, 인간화된 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 프레임워크 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,225,539호; 제 5,585,089호; 제 5,693,761호; 제 5,693,762호; 제 5,859,205호 참고. 또한 미국 특허 제 6,180,370호, 및 국제 공개 공보 WO 01/27160을 참고하며, 문헌에서 미리 결정된 항원에 대한 개선된 친화성을 가진 인간화된 항체 및 인간화된 항체를 제조하기 위한 기법이 개시된다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "의료 제공자"는 살아있는 대상체, 예컨대, 인간 환자와 직접적으로 상호작용하고 관리하는 개인 또는 기관을 지칭한다. 의료 제공자의 비제한적인 예에는 의사, 간호사, 기술자, 치료사, 약사, 상담사, 대체 의학 종사자, 의료 시설, 진료실, 병원, 응급실, 진료소, 긴급 치료 센터, 대체 의학 클리닉/시설, 및 한정하는 것은 아니지만 일반적인 의학적, 특수 의학적, 수술적, 및/또는 임의의 다른 유형의 치료, 평가, 유지, 치료법, 약물치료 및/또는 조언을 포함한, 환자의 건강 상태의 전부, 또는 임의의 부분과 관련된 일반 및/또는 전문 치료, 평가, 유지, 치료법, 약물치료, 및/또는 조언을 제공하는 임의의 기타 단체가 포함된다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "의료 혜택 제공자"는 환자에게 하나 이상의 의료 혜택, 혜택 계획, 건강 보험, 및/또는 의료비 계정 프로그램에 대한 접근을 전체적으로 또는 부분적으로 제공하는, 제시하는, 부여하는, 지불하는, 또는 제공하는 것과 관련되는 개별 당사자, 조직, 또는 그룹을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "임상 실험실"은 살아있는 대상체, 예컨대, 인간으로부터 유래된 물질 또는 이미지를 검사 또는 처리하는 시설을 지칭한다. 처리의 비제한적인 예에는 정보를 제공할 목적으로, 살아있는 대상체, 예컨대, 인간의 임의의 질환 또는 손상의, 예컨대, 진단, 예방, 또는 치료를 위해, 또는 건강의 평가를 위해 인체로부터 유래된 또는 인체의 일부 또는 전부의 물질의 생물학적, 생화학적, 혈청학적, 화학적, 면역혈액학적, 혈액학적, 생물물리학적, 세포학적, 병리학적, 유전적, 이미지 기반, 또는 다른 검사가 포함된다. 이들 검사에는 또한 이미지, 샘플을 수집하거나 또는 그렇지 않으면 얻기 위한, 제조, 결정, 측정을 위한, 또는 그렇지 않으면 살아있는 대상체, 예컨대, 인간의 신체에서의 다양한 물질의 존재 또는 부재를 기술하기 위한 과정, 또는 살아있는 대상체, 예컨대, 인간의 신체로부터 얻어진 샘플이 포함될 수 있다.

II. 표적 폴리펩타이드 설명

본원에서 사용되는 바, 용어 "세마포린 4D", "SEMA4D" 및 "SEMA4D 폴리펩타이드"는, "SEMA4D" 및 "Sema4D"와 같이, 상호교환적으로 사용된다. SEMA4D는 신경교 세포 활성화, 희소돌기아교세포 및 성상세포 이동의 억제, 신경발달의 억제, 및 세포자멸사의 유도를 포함한, 신경염증을 증가시킬 수 있는 여러 과정에 연루된 경막 신호전달 단백질이다. 특정 구현예에서, SEMA4D는 세포 표면 상에 발현되거나 세포에 의해 분비된다. 또 다른 구현예에서, SEMA4D는 막 결합된다. 또 다른 구현예에서, SEMA4D는 가용성이며, 예컨대, sSEMA4D이다. 다른 구현예에서, SEMA4D는 전체 크기의 SEMA4D 또는 이의 단편, 또는 SEMA4D 변이체 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, SEMA4D의 단편 또는 SEMA4D 변이체 폴리펩타이드는 전체 크기의 SEMA4D의 일부 또는 전부의 기능적 특성을 유지한다.

전체 크기의 인간 SEMA4D 단백질은 150 kDa의 2개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 단일이량체 경막 단백질이다. SEMA4D는 세포 표면 수용체의 세마포린 패밀리에 속하며 또한 CD100으로도 지칭된다. 인간 및 마우스 SEMA4D/Sema4D는 모두 그것의 경막 형태로부터 단백질 가수분해적으로 절단되어 120-kDa 가용성 형태를 생성하며, 이것은 2개의 Sema4D 동형(isoform)의 존재를 나타낸다(Kumanogoh et al., J. Cell Science 116(7):3464(2003)). 세마포린은 가용성 및 원래 발달 중에 신경과 그것의 적절한 표적 사이에서 정확한 연결을 확립하는 데 중요한 역할을 하는 축삭 안내 인자로서 정의되었던 막 결합 단백질로 이루어진다. 구조적으로 부류 IV 세마포린으로 간주되는 SEMA4D는 아미노 말단 신호 서열과, 이어서 17개의 보존된 시스테인 잔기, Ig 유사 도메인, 리신 풍부 구간, 소수성 경막 영역, 및 세포질 꼬리를 함유하는특징적인 'Sema' 도메인으로 이루어진다.

SEMA4D의 폴리펩타이드 사슬은 약 13개 아미노산의 신호 서열을 포함할 수 있고 약 512개 아미노산의 세마포린 도메인, 약 65개 아미노산의 면역글로불린 유사(Ig 유사) 도메인, 104개 아미노산의 리신 풍부 구간, 약 19개 아미노산의 소수성 경막 영역, 및 110개 아미노산의 세포질 꼬리를 추가로 포함한다. 세포질 꼬리의 티로신 인산화를 위한 공통 부위는 SEMA4D와 티로신 키나제와의 예측된 회합을 지지한다(Schlossman, et al., Eds.(1995) Leucocyte Typing V(Oxford University Press, Oxford).

SEMA4D는 적어도 3개의 기능적 수용체, 플렉신-B1, 플렉신-B2 및 CD72를 가지는 것으로 알려져 있다. 플렉신-B1은 비림프 조직에서 발현되며, SEMA4D에 대한 고친화성(1 nM) 수용체인 것으로 밝혀졌다(Tamagnone et al., Cell 99:71-80(1999)). 플렉신-B1 신호전달의 SEMA4D 자극은 뉴런의 성장 원뿔 파괴를 유도하며, 희소돌기아교세포의 프로세스 연장 파괴 및 세포자멸사를 유도하는 것으로 밝혀졌다(Giraudon et al., J. Immunol. 172:1246-1255(2004); Giraudon et al., NeuroMolecular Med. 7:207-216(2005)). SEMA4D에 결합된 후에, 플렉신-B1 신호전달은 R-Ras의 비활성화를 매개하여, 세포외 매트릭스에 대한 인테그린 매개 부착의 감소뿐만 아니라, RhoA의 비활성화로 이어져서, 세포골격의 재구성 및 세포 이동으로 이어진다. [Kruger et al., Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6:789-800(2005); Pasterkamp, TRENDS in Cell Biology 15:61-64(2005)] 참고. 다른 한편으로 플렉신-B2는 SEMA4D에 재해 중간 친화성을 가지며 최근 보고는 플렉신-B2가 성인 뇌실하대(subventricular zone)에서 피질 뉴런의 이동 및 신경모세포의 증식 및 이동을 조절하는 것을 나타낸다(Azzarelli et al, Nat Commun 2014 Feb. 27, 5:3405, DOI: 10.1038/ncomms4405; 및 Saha et al., J. Neuroscience, 2012 Nov. 21, 32(47):16892-16905).

림프 조직에서 CD72는 저친화성(300 nM) SEMA4D 수용체로서 활용된다(Kumanogoh et al., Immunity 13:621-631(2000)). B 세포 및 APC는 CD72를 발현하며, 항-CD72 항체는 sSEMA4D와 동일한 효과 중 많은 것, 예컨대 CD40 유도 B 세포 반응의 향상 및 CD23의 B 세포 발산을 나타낸다. CD72는 많은 억제 수용체와 회합할 수 있는 티로신 포스파타제 SHP-1을 모집함으로써 B 세포 반응의 음성 조절자로서 작용하는 것으로 여겨진다. SEMA4D와 CD72와의 상호작용은 SHP-1의 단리, 및 이 음성 활성화 신호의 손실을 초래한다. SEMA4D는 시험관내에서 T 세포 자극 및 B 세포 응집 및 생존을 촉진하는 것으로 보고되었다. SEMA4D 발현 세포 또는 sSEMA4D의 첨가는 시험관내에서 CD40 유도 B 세포 증식 및 면역글로불린 생성을 향상시키며, 생체내 항체 반응을 가속화한다(Ishida et al., Inter. Immunol. 15:1027-1034(2003); Kumanogoh and H. Kukutani, Trends in Immunol. 22:670-676(2001)). sSEMA4D는 공동 자극 분자의 상향 조절 및 IL-12의 증가된 분비를 포함한, 수지상 세포(DC)의 CD40 유도 성숙화를 향상시킨다. 더불어, sSEMA4D는 면역 세포 이동을 억제할 수 있고, 이것은 차단 항-SEMA4D 항체의 첨가에 의해 반전될 수 있다(Elhabazi et al., J. Immunol. 166:4341-4347(2001); Delaire et al., J. Immunol. 166:4348-4354(2001)).

Sema4D는 비장, 흉선, 및 림프절을 포함한 림프 기관, 및 뇌, 심장, 및 신장과 같은 비림프 기관에서 고수준으로 발현된다. 림프 기관에서, Sema4D는 휴지기 T 세포에서 풍부하게 발현되지만 휴지기 B 세포 및 항원 제공 세포(APC), 예컨대 DC에서는 약하게 발현될 뿐이다. 세포 활성화는 가용성 SEMA4D(sSEMA4D)의 생성뿐만 아니라 SEMA4DDML 표면 발현을 증가시킨다.

SEMA4D의 발현 패턴은 그것이 면역 체계에서 병리적 역할뿐만 아니라 중요한 생리적 역할을 하는 것을 시사한다. SEMA4D는 B 세포 활성화, 응집 및 생존을 촉진하고; CD40 유도 증식 및 항체 생성을 향상시키며; T 세포 의존성 항원에 대한 항체 반응을 향상시키고; T 세포 증식을 증가시키며; 수지상 세포 이동 및 T 세포 자극 능력을 향상시키고; 탈수초화 및 축삭 변성에 직접적으로 연루되는 것으로 밝혀졌다(Shi et al., Immunity 13:633-642(2000); Kumanogoh et al., J Immunol 169:1175-1181(2002); 및 Watanabe et al., J Immunol 167:4321-4328(2001)).

SEMA4D 녹아웃(SEMA4D-/-) 마우스는 SEMA4D가 체액성 및 세포 면역 반응에서 모두 중요한 역할을 한다는 추가 증거를 제공하였다. SEMA4D-/- 마우스에서 비림프 조직의 알려져 있는 주요 이상은 없다. SEMA4D-/- 마우스로부터의 DC는 불량한 알로자극 능력을 가지며 공동자극 분자의 발현에서 결핍을 보이고, 그것은 sSEMA4D의 첨가에 의해 구제될 수 있다. SEMA4D 결핍 마우스(SEMA4D-/-)는, 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 특이적 T 세포가 SEMA4D가 없을 때에 빈약하게 생성되기 때문에, 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 펩타이드에 의해 유도된 실험적 자가면역 뇌척수염을 발달시키지 못한다(Kumanogoh et al., J Immunol 169:1175-1181(2002)). 상당한 양의 가용성 SEMA4D가 또한 정상 마우스에서가 아니라 자가면역 경향이 있는 MRL/lpr 마우스(SLE와 같은 전신성 자가면역 질환의 모델)의 혈청에서 또한 검출된다. 추가로, sSEMA4D의 수준은 자가 항체의 수준과 상관이 있고 연령에 따라 증가한다(Wang et al., Blood 97:3498-3504(2001)). 가용성 SEMA4D는 또한 탈수초화 질환 환자의 뇌척수액 및 혈청에서 축적되는 것으로 나타났고, sSEMA4D는 인간 만능 신경 전구체(Dev 세포)의 세포자멸사를 유도하며, 시험관내에서 래트 희소돌기아교세포의 프로세스 연장을 억제하고 세포자멸사를 유도한다(Giraudon et al., J Immunol 172(2):1246-1255(2004)). 이런 세포자멸사는 항-SEMA4D MAb에 의해 차단되었다.

본 발명자들은 헌팅턴병 및 알츠하이머병 및 이들 질환의 동물 모델을 포함한 진행성 신경퇴행성 질환의 과정에서 스트레스 또는 손상을 경험하는 실험 동물 및 환자 모두의 뇌의 뉴런이 SEMA4D를 상향조절잔 것을 이전에 보여주었다(US 9,598,495 및 US 10,385,136). 뉴런과 가까운 곳에 위치한 성상세포는 SEMA4D에 대한 고친화성 플렉신-B1 수용체를 발현하며 SEMA4D 리간드에의 결합에 의해 염증 변형과 관련된 형태 및 유전자 발현의 변화를 겪음으로써 촉발된다. 이런 염증 신호전달 경로를 SEMA4D에 대한 항체로 차단하는 것은 HD의 동물 모델(Southwell, A.L., et al. Anti-semaphorin 4D immunotherapy ameliorates neuropathology and some cognitive impairment in the YAC128 mouse model of Huntington disease. Neurobiol. Dis 76, 46-56(2015)), AD 및 다발성 경화증의 동물 모델(Smith, E.S., et al. SEMA4D compromises blood-brain barrier, activates microglia, and inhibits remyelination in neurodegenerative disease. Neurobiol. Dis 73, 254-268(2014)에서 병리를 개선하고, 가장 최근에는, 헌팅턴병을 발생시키는 유전자 돌연변이를 발현하는 환자에서 뇌 대사 활성의 손실을 방지하는 것으로 밝혀졌다. SEMA4D가 또한 암컷 Mecp 마우스의 뇌에서 상향조절된다는 관찰 및 성상세포에 대한 역할의 증거(Lioy et al., Nature, 475(7357):497-500(2012))는 이 동일한 발병 경로가 레트 증후군에서 활성이며 그것의 병리에 기여할 수 있음을 시사한다.

III. 항-SEMA4D 항체

SEMA4D에 결합하는 항체는 기술분야에서 기술되었다. 예를 들어, 미국 특허 제 8,496,938호, 미국 공개 공보 2008/0219971 A1, US 2010/0285036 A1, 및 US 2006/0233793 A1, 국제 특허 출원 WO 93/14125, WO 2008/100995, 및 WO 2010/129917, 및 Herold et al., Int. Immunol. 7(1): 1-8(1995)을 참고하며 이들의 각각은 전체적으로 참조로 본원에 포함된다.

본 개시는 일반적으로, SEMA4D에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 투여 단계를 포함하는, 레트 증후군을 가진 대상체, 예컨대, 인간 환자에서 증상을 완화시키는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 항체는 하나 이상의 그것의 수용체, 예컨대, 플렉신-B1과 SEMA4D의 상호작용을 차단한다. 이들 특성을 가진 항-SEMA4D 항체는 본원에 제공된 방법에 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 항체로는, 한정하는 것은 아니지만 US 2010/0285036 A1에서 완전히 기술된 MAb VX15/2503, 67, 및 76 및 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 들 수 있다. 본원에 제공된 방법에 사용될 수 있는 추가적인 항체로는 US 2006/0233793 A1에 기술된 BD16 및 BB18 항체뿐만 아니라 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체; 또는 US 2008/0219971 A1에 기술된 MAb 301, MAb 1893, MAb 657, MAb 1807, MAb 1656, MAb 1808, Mab 59, MAb 2191, MAb 2274, MAb 2275, MAb 2276, MAb 2277, MAb 2278, MAb 2279, MAb 2280, MAb 2281, MAb 2282, MAb 2283, MAb 2284, 및 MAb 2285 중 임의의 것, 뿐만 아니라 그것의 임의의 단편, 변이체 또는 유도체를 들 수 있다. 특정 구현예에서 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 항-SEMA4D 항체는 인간, 쥐과, 또는 인간 및 쥐과 둘 다의 SEMA4D에 결합한다. 또한 유용한 것은 전술한 항체의 임의의 것과 동일한 항체에 결합하는 항체 및/또는 전술한 항체의 임의의 것을 경쟁적으로 억제하는 항체이다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 유용한 항-SEMA4D 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 참조 항-SEMA4D 항체 분자, 예를 들어 위에서 기술된 것들에 대한 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 또는 약 95% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가진다. 추가의 구체예에서, 결합 분자는 참조 항체에 대해 적어도 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 공유한다.

또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 유용한 항-SEMA4D 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지며, VH 도메인의 CDR 중 적어도 하나는 서열 번호 6, 7, 또는 21의 CDR1, CDR2 또는 CDR3에 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가진다.

또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 유용한 항-SEMA4D 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지며, VH 도메인의 CDR 중 적어도 하나는 서열 번호 3, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 5에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가진다.

또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 유용한 항-SEMA4D 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지며, VH 도메인의 CDR 중 적어도 하나는 서열 번호 22, 서열 번호 23, 또는 서열 번호 24에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가진다.

또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 유용한 항-SEMA4D 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지며, VH 도메인의 CDR 중 적어도 하나는 서열 번호 3, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 5에 대해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 보존성 아미노산 치환을 제외하고 동일한 아미노산 서열을 가진다.

또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 유용한 항-SEMA4D 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지며, VH 도메인의 CDR 중 적어도 하나는 서열 번호 22, 서열 번호 23, 또는 서열 번호 24에 대해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 보존성 아미노산 치환을 제외하고 동일한 아미노산 서열을 가진다.

또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 유용한 항-SEMA4D 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 서열 번호 6, 서열 번호 7, 또는 서열 번호 21에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가지는 VH 도메인을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지며, 암호화된 VH 도메인을 포함하는 항-SEMA4D 항체는 SEMA4D에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.

또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 유용한 항-SEMA4D 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지며, VL 도메인의 CDR 중 적어도 하나는 서열 번호 11, 12, 또는 서열 번호 25의 CDR1, CDR2 또는 CDR3에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가진다.

또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 유용한 항-SEMA4D 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지며, VL 도메인의 CDR 중 적어도 하나는 서열 번호 8, 서열 번호 9, 또는 서열 번호 10에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가진다.

또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 유용한 항-SEMA4D 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지며, VL 도메인의 CDR 중 적어도 하나는 서열 번호 26, 서열 번호 27, 또는 서열 번호 28에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가진다.

또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 유용한 항-SEMA4D 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지며, VL 도메인의 CDR 중 적어도 하나는 서열 번호 8, 서열 번호 9, 또는 서열 번호 10에 대해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 보존성 아미노산 치환을 제외하고 동일한 아미노산 서열을 가진다.

또 다른 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 유용한 항-SEMA4D 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지며, VL 도메인의 CDR 중 적어도 하나는 서열 번호 26, 서열 번호 27, 또는 서열 번호 28에 대해 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 보존성 아미노산 치환을 제외하고 동일한 아미노산 서열을 가진다.

추가의 구체예에서, 본원에 제공된 방법에 유용한 항-SEMA4D 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 서열 번호 11, 서열 번호 12, 또는 서열 번호 25에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가지는 VL 도메인을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지며, 암호화된 VL 도메인을 포함하는 항-SEMA4D 항체는 SEMA4D에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.

또한 전부 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 항-SEMA4D 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 생성하기 위하여 본원에 기술된 항-SEMA4D 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 암호화하는 폴리펩타이드, 그러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 그러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및 그러한 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된 방법에 사용하기 위하여 포함된다.

본 개시의 항-SEMA4D 항체의 적합한 생물학적 활성 변이체는 본 개시의 방법에 사용될 수 있다. 그러한 변이체는 모 항-SEMA4D 항체의 원하는 결합 특성을 보유할 것이다. 항체 변이체를 제조하는 방법은 일반적으로 기술분야에서 이용 가능하다.

돌연변이생성 및 뉴클레오타이드 서열 변경 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 Walker and Gaastra, eds.(1983) Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492(1985); Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382(1987); Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor, N.Y.); 미국 특허 제 4,873,192호; 및 인용된 참고문헌들을 참고한다. 관심의 폴리펩타이드의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 안내는, 전체적으로 본원에 참조로 포함되는일hoff et al.(1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), pp. 345-352의 모델에서 찾아볼 수 있다.일hoff 등의 모델은 적합한 보존성 아미노산 치환을 측정하기 위해 포인트 허용 돌연변이(PAM) 아미노산 유사성 매트릭스(PAM 250 매트릭스)를 사용한다. 특정 구현예에서, 보존성 치환, 예컨대 한 아미노산을 유사한 특성을 가진 또 다른 아미노산으로 교체하는 것이 사용될 수 있다.일hoff 등의 모델의 PAM 250 매트릭스에 의해 교시된 것과 같으 보존성 아미노산 치환의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, Gly↔Ala, Val↔Ile↔Leu, Asp↔Glu, Lys↔Arg, Asn↔Gln, 및 Phe↔Trp↔Tyr을 들 수 있다.

항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 관심의 폴리펩타이드의 변이체를 구성함에 있어서, 그 변이체가 계속해서 원하는 특성을 갖도록, 예컨대, 본원에서 기술된 것과 같이, 세포 표면상에 발현되거나 세포에 의해 분비된 SEMA4D, 예컨대, 인간, 쥐과, 또는 인간 및 쥐과 둘 다의 SEMA4D에 특이적으로 결합할 수 있고 SEMA4D 차단 활성을 갖도록 하는 변형이 이루어진다. 분명하게, 변이체 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA에서 이루어진 임의의 변형은 서열을 리딩 프레임 밖에 배치하지 않아야 하며 특정 구현예에서 이차 mRNA 구조를 생성할 수 있는 상보성 영역을 생성하지 않을 것이다. 유럽 특허 출원 공개 번호 제 75,444호 참고.

항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체, 결합 특이성을 측정하는 방법에는, 한정하는 것은 아니지만, 표준 경쟁 결합 검정, T 세포 또는 B 세포에 의한 면역글로불린 분비를 모니터링하기 위한 검정, T 세포 증식 검정, 세포자멸사 검정, ELISA 검정, 등이 포함된다. 예를 들어, 모두 참조로 본원에 포함되는 문헌: WO 93/14125; Shi et al., Immunity 13:633-642(2000); Kumanogoh et al., J Immunol 169:1175-1181(2002); Watanabe et al., J Immunol 167:4321-4328(2001); Wang et al., Blood 97:3498-3504(2001); 및 Giraudon et al., J Immunol 172(2):1246-1255(2004)에서 개시된 그러한 검정을 참고한다.

본원에서 개시된 불변 영역, CDR, VH 도메인, 또는 VL 도메인을 포함한, 임의의 특정 폴리펩타이드가 또 다른 폴리펩타이드에 대해 적어도 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 심지어 약 100% 동일한지의 여부를 본원에서 논의할 때, % 동일성은, 한정하는 것은 아니지만, BESTFIT 프로그램(위스콘신 서열 분석 패키지, 버전 8, Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711)과 같은 기술분야에 알려져 있는 방법 및 컴퓨터 프로그램/소프트웨어를 사용하여 측정될 수 있다. BESTFIT는 두 서열 사이의 상동성의 최상의 분절을 찾기 위하여 Smith 및 Waterman(1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489의 국소 상동성 알고리즘을 사용한다. 특정 서열이 본 개시에 따르는 참조 서열에 대해, 예를 들어, 95% 동일한지의 여부를 측정하기 위하여 BESTFIT 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 사용할 때, 파라미터는, 당연히, 동일성의 백분율이 전장 참조 폴리펩타이드 서열에 대해 계산되고 참조 서열의 아미노산의 총 수의 최대 5%의 상동성의 갭이 허용되도록 설정된다.

본 개시의 목적에 대해, 퍼센트 서열 동일성은 12의 갭 오픈 페널티 및 2의 갭 연장 페널티, 62의 BLOSUM 매트릭스를 포함한 아핀 갭 검색을 사용하는 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘을 사용하여 측정될 수 있다. Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘은 Smith 및 Waterman(1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489에서 교시된다. 변이체는, 예를 들어, 참조 항-SEMA4D 항체(예컨대, MAb VX15/2503, 67, 또는 76)와 단지 1 내지 15개 아미노산 잔기, 단지 1 내지 10개의 아미노산 잔기, 예컨대 6 내지 10개, 단지 5개, 단지 4, 3, 2개, 또는 심지어 1개의 아미노산 잔기가 상이하다.

"서열 동일성"의 백분율은 또한 비교 창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 측정될 수 있다. 비교를 위한 서열을 최적으로 정렬하기 위하여, 비교 창의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 부분은 첨가 또는 갭으로 명명된 결실을 포함할 수 있는 한편 참조 서열은 불변으로 유지된다. 최적 정렬은, 갭이 있음에도, 참조 서열과 비교기 서열 사이에 최대 가능한 수의 "동일한" 위치를 생성하는 정렬이다. 두 서열 사이의 백분율 "서열 동일성"은 2004년 9월 1일자로 미국 국립 생물공학 정보센터로부터 이용 가능한 프로그램 "BLAST 2 서열" 버전을 사용하여 측정될 수 있고, 그 프로그램은 프로그램 BLASTN(뉴클레오타이드 서열 비교용) 및 BLASTP(폴리펩타이드 서열 비교용)를 포함하며, 이들 프로그램은 Karlin 및 Altschul의 알고리즘(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12):5873-5877, 1993)을 토대로 한다. "BLAST 2 서열"을 활용할 때, 2004년 9월 1일자의 디폴트 파라미터인 파라미터는 워드 크기(3), 오픈 갭 페널티(11), 연장 갭 페널티(1), 갭 드롭 오프(50), 예외 값(10) 및 한정하는 것은 아니지만 매트릭스 옵션을 포함한 임의의 다른 필요한 파라미터에 대해 사용될 수 있다.

항-SEMA4D 항체의 불변 영역은 다양한 방법으로 이펙터 기능을 변경시키기 위해 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체에 대한 항체 결합을 최적화하는 Fc 돌연변이를 개시하는 미국 특허 제 6,737,056B1호 및 미국 특허 출원 공개 제 2004/0132101A1로를 참고한다.

본원에 제공된 방법에 유용한 특정 항-SEMA4D 항체 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체에서, Fc 부분은 기술분야에 알려져 있는 기법을 사용하여 이펙터 기능을 감소시키기 위해 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역 도메인의 결실 또는 비활성화(점 돌연변이 또는 다른 수단을 통한)는 순환 변형 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시킬 수 있고 그로써 종양 국지화를 증가시킬 수 있다. 다른 경우에, 불변 영역 변형은 본 개시의 중간 보체 결합과 일치하며 그로써 혈청 반감기를 감소시킨다. 불변 영역의 또 다른 변형은 증가된 항원 특이성 또는 항체 유연성으로 인해 향상된 국지화를 허용하는 이황화 결합 또는 올리고당 모이어티를 변형시키기 위해 사용될 수 있다. 결과적으로 생성된 변형의 생리적 프로파일, 생체이용률 및 다른 생화학적 효과, 예컨대 종양 국지화, 생체분포 및 혈청 반감기는 지나친 실험 없이 잘 알려져 있는 면역학적 기법을 사용하여 쉽게 측정되고 정량화될 수 있다. 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 항-SEMA4D 항체로는 예컨대, 공유 부착이 항체가 그것의 동족 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 방해하지 못하도록 임의의 유형의 분자의 항체에의 공유 부착에 의해 변형된 유도체를 들 수 있다. 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 항체 유도체에는 예컨대, 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질 가수분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에의 결합, 등에 의해 변형된 항체가 포함된다. 수많은 화학적 변형 중 임의의 변형이, 한정하는 것은 아니지만, 특정 화학적 결합, 아세틸화, 포르밀화, 등을 포함하는 공지 기법에 의해 수행될 수 있다. 추가적으로, 유도체는 하나 이상의 비고전적 아미노산을 함유할 수 있다.

"보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 전하를 가진 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 전하를 가진 측쇄를 가진 아미노산 잔기의 패밀리는 기술분야에서 정의되었다. 이들 패밀리에는 염기성 측쇄를 가진 아미노산(예컨대, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 가진 아미노산(예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 비전하 극성 측쇄를 가진 아미노산(예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 가진 아미노산(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타 분지형 측쇄를 가진 아미노산(예컨대, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄를 가진 아미노산(예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이 포함된다. 대안으로, 돌연변이는 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라, 예컨대 포화 돌연변이생성에 의해 무작위로 도입될 수 있고, 결과적으로 생성된 돌연변이체는 생물학적 활성에 대해 스크리닝되어 활성(예컨대, 항-SEMA4D 폴리펩타이드에 결합하거나, SEMA4D와 그것의 수용체와의 상호작용을 차단하거나, 또는 환자에서 신경퇴행성 장애와 관련된 증상을 완화시키는 능력)을 보유한 돌연변이체가 확인될 수 있다.

예를 들어, 돌연변이를 항체 분자의 프레임워크 영역에만 또는 CDR 영역에만 도입하는 것이 가능하다. 도입된 돌연변이는 침묵 또는 중성 미스센스 돌연변이일 수 있고, 즉, 항원에 결합하는 항체의 능력에 미치는 능력을 전혀, 또는 거의 갖지 않는다. 이들 유형의 돌연변이는 코돈 용법을 최적화하거나, 또는 하이브리도마의 항체 생성을 개선하는 데 유용할 수 있다. 대안으로, 비중성 미스센스 돌연변이는 항원에 결합하는 항체의 능력을 변경시킬 수 있다. 기술분야에 숙련된 사람은 항원 결합 활성의 변경이 없거나 또는 결합 활성의 변경이 없는 것과 같은 원하는 특성(예컨대, 항원 결합 활성의 개선 또는 항체 특이성의 변화)을 가진 돌연변이 분자를 설계 및 테스트할 수 있을 것이다. 돌연변이생성 후에, 암호화된 단백질은 일상적으로 발현될 수 있고 기능적 및/또는 암호화된 단백질의 생물학적 활성(예컨대, SEMA4D 폴리펩타이드의 적어도 하나의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 능력)은 본원에 기술된 기법을 사용하여 또는 기술분야에 알려져 있는 기법을 일상적으로 변형시킴으로써 측정될 수 있다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 항-SEMA4D 항체는 적어도 하나의 최적화된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. "최적화된 CDR"은 CDR이 최적화된 CDR을 포함하는 항-SEMA4D 항체에 전달된 결합 친화성 및/또는 항-SEMA4D 활성을 개선하기 위해 변형되고 최적화된 것으로 의도된다. "항-SEMA4D 활성" 또는 "SEMA4D 차단 활성"에는 SEMA4D와 관련된 다음의 활성 중 하나 이상을 조절하는 활성이 포함될 수 있다: B 세포 활성화, 응집 및 생존; CD40 유도 증식 및 항체 생성; T 세포 의존성 항원에 대한 항체 반응; T 세포 또는 다른 면역 세포 증식' 수지상 세포 성숙; 탈수초화 및 축삭 변성; 만능 신경 전구체 및/또는 희소돌기아교세포의 세포자멸사; 내피 세포 이동의 유도; 자발적 단핵세포 이동의 억제; 신경교 세포(성상세포, 미세아교세포, 희소돌기아교세포, 전구체) 기능 및 염증 활성의 조절; 세포 표면 플렉신-B 1 또는 다른 수용체에 대한 결합, 또는 가용성 SEMA4D 또는 세포 표면 상에 발현되는 SEMA4D와 관련된 임의의 다른 활성. 항-SEMA4D 활성은 또한, 한정하는 것은 아니지만, 림프종을 포함한 특정 유형의 암, 자가면역 질환, 중추신경계(CNS) 및 말초 신경계(PNS) 염증 질환을 포함한 염증성 질환, 이식 거부반응, 및 침습성 혈관신생을 포함한, SEMA4D 발현과 관련된 질환의 발생 또는 중증도의 감소에 기인할 수 있다. 쥐과 항-SEMA4D MAbs BD16 및 BB18을 토대로 한 최적화된 항체의 예는, 전체 내용이 참조로 본원에 포함된 미국 공개 공보 제 2008/0219971 A1호, 국제 특허 출원 WO 93/14125 및 Herold et al., Int. Immunol. 7(1): 1-8(1995)에서 기술되었다. 변형은 항-SEMA4D 항체가 SEMA4D 항원에 대한 특이성을 보유하며 개선된 결합 친화성 및/또는 개선된 항-SEMA4D 활성을 갖도록 CDR 내의 아미노산 잔기의 대체를 포함할 수 있다.

IV. MeCP2

MECP2(메틸 CpG 결합 단백질 2) 유전자는　단백질　MeCP2를 암호화한다(Lewis et al.(June 1992). Cell.　69　(6): 905-14).　MeCP2 단백질은 뇌를 포함한 신체의 모든 세포에서 발견되며, 그곳에서 맥락에 따라 전사 억제자 및 활성자로서 작용한다. 뇌에서, 그것은 뉴런에서 고농도로 발견되며 성상세포에서는 더 낮은 정도로 발견되고 중추신경계(CNS)의 성숙과 및 시냅스 접촉 형성에 관련되는 것으로 나타난다(Luikenhuis et al.,(April 2004)　Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.　101　(16): 6033-8). MeCP2는 신경 세포의 정상적인 기능에 필수적인 것으로 여겨지며 특히 성숙한 신경 세포에 중요한데, 그곳에서 고수준으로 존재한다. 전체적으로, MeCP2는 글루타메이트 제거, 사이토카인 생성, 전기적 신호전달, 및 뉴런 형태에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌으며, 이들은 모두 신경발달에서 역할을 한다.

많은 돌연변이가 MECP2 유전자의 발현의 손실과 관련이 있으며 레트 증후군 환자에서 확인되었다. MECP2 유전자 돌연변이는 레트 증후군의 대부분의 경우의 원인이다. 이들 돌연변이에는 단일 DNA 염기쌍(SNP)의 변화, MECP2　유전자에 DNA의 삽입 또는 결실, 및 RNA 스플라이싱에 영향을 미치는 변화가 포함된다. MeCP2 유전자의 돌연변이는 MeCP2 단백질의 구조를 변경시키고 단백질의 감소된 양으로 이어진다. 그 결과로서, 단백질은 DNA에 결합할 수 없거나(MeCP2 단백질은 메틸화된 CpG 다이뉴클레오타이드에 대한 게놈 전체 결합을 통해 유전자 발현을 후생적으로 조절함) 또는 다른 유전자를 켜거나 끌 수 있다. MeCP2에 의해 정상적으로 억제되는 유전자는 그것의 생성물이 필요하지 않을 때 활성적으로 남아 있다. MeCP2에 의해 정상적으로 활성화되는 다른 유전자는 비활성으로 남아 있어 유전자 생성물의 결핍으로 이어진다. 이런 결핍은 신경 세포의 정상적인 기능을 파괴할 가능성이 있어 레트 증후군의 증상으로 이어진다.

V. 레트 증후군의 특징적인 증상

과학자들은 레트 증후군의 4 단계를 일반적으로 기술한다. 조기 발병이라고 불리는 1기는 전형적으로 생후 6개월에서 18개월 사이에 시작한다. 이 단계는 장애의 증상이 다소 모호할 수 있고 미묘하게 발달이 느려지는 것을 처음에는 알아차리지 못할 수 있기 때문에 종종 간과된다. 영유아는 눈을 덜 마주치기 시작하고 장난감에 대한 관심이 줄어들 수 있다. 앉거나 기는 것과 같은 대근육 운동 능력이 지연될 수 있다. 손을 비틀고 머리 성장이 감소할 수 있지만, 주의를 끌 만큼 충분하지는 않다. 이 단계는 보통 몇 개월 동안 지속되지만 1년 이상 계속될 수 있다.

2기, 또는 급속한 파괴 단계는 일반적으로 1세에서 4세 사이에 시작되며 몇 주 또는 몇 달 동안 지속될 수 있다. 아이가 의도적인 손 기술과 구어를 잃기 때문에 발병은 빠르거나 점진적일 수 있다. 비틀기, 씻기, 손뼉치기, 또는 두드리기, 뿐만 아니라 반복적으로 손을 입으로 가져가는 것과 같은 특징적인 손 움직임은 종종 이 단계에서 시작된다. 아이는 무작위로 만지고, 움켜쥐고, 놓으면서 손을 등 뒤로 움켜쥐거나 양옆으로 잡을 수 있다. 움직임은 아이가 깨어 있는 동안 계속되지만 잠자는 동안에는 사라진다. 무호흡 및 과호흡과 같은 불규칙 호흡이 발생할 수 있지만, 호흡은 일반적으로 수면 중에 개선된다. 일부 여자 아이는 또한 사회적 상호 작용 및 의사 소통의 상실과 같은 자폐증과 유사한 증상을 보인다. 걷는 것이 불안정할 수 있으며 운동을 시작하는 것이 어려울 수 있다. 느린 머리 성장은 일반적으로 이 단계에서 나타난다.

3기, 또는 안정기 또는 유사 정지기는 보통 2세에서 10세 사이에 시작하여 수년 동안 지속될 수 있다. 실행증, 운동 문제, 및 발작이 이 단계에서 두드러진다. 그러나 과민성, 울음, 및 자폐증 유사 특징이 줄어들면서 행동이 개선될 수 있다. 3기 여자 아이는 주변 환경에 더 많은 관심을 보일 수 있으며 주의력, 주의 지속 시간, 및 의사소통 기능이 향상될 수 있다. 많은 여자 아이들이 삶의 대부분을 이 단계에 머물게 된다.

4기, 또는 후기 모터 열화 단계는 수년 또는 수십년 동안 지속될 수 있다. 눈에 띄는 특징으로는 이동성 감소, 척추 만곡(척추측만증) 및 근육 약화, 경직, 경련, 및 팔, 다리 또는 신체 윗부분의 비정상적인 자세로 인한 근긴장 증가 등을 들 수 있다. 이전에 걸을 수 있었던 여자 아이들은 걷기를 멈출 수 있다. 인지, 의사소통, 또는 손 기능은 일반적으로 4기에서 감소하지 않는다. 반복적인 손 움직임이 줄어들 수 있으며 일반적으로 시선이 개선된다.

Mecp2 결핍 마우스는 여러 증상 및 특징을 레트 증후군 환자와 공유한다. MeCP2 결핍 마우스는 저활동성이며(Chahrour M and Zoghbi, HY, Neuron.(2007) 56:422-437; Guy et al., Nat. Genet.(2001) 3:3220326; Chen et al., Nat. Genet.(2001) 3:327-331) 불안 관련 행동, 예컨대, 뒷다리 움켜쥐기의 변경된 척도를 나타낸다(McGill et al., Proc. Nat. Acad. Sci.(2006) 103: 18267-72). 레트 증후군 인간 대상과 마찬가지로, MeCP2 결핍 마우스도 또한 비정상적인 호흡을 나타낸다(Chahrour M and Zoghbi, HY, Neuron.(2007) 56:422-437; Weese-Mayer et al., Pediatr. Res.(2006) 60:443-449).

VI. 성상세포

성상세포는 건강한 CNS에서 혈류의 조절, 유체/이온/pH/신경전달물질 항상성, 시냅스 형성/기능, 에너지 및 대사, 및 혈액 뇌 장벽 유지를 포함한, 많은 필수적인 복합 기능을 수행하는 특화된 신경교 세포이다(Barres B. A.(2008) Neuron 60:430-440). 뉴런이 최고 수준의 MeCP2 발현을 갖는 한편, 성상세포 및 다른 세포 유형 또한 검출 가능한 수준의 MeCP2를 발현한다. 최근의 연구는 성상세포가 레트 증후군의 진전에 기여할 가능성이 있음을 시사한다(McGann et al., Curr Opin Neurobiol. 2012 Oct; 22(5): 850-858 참고). 많은 연구가 성상세포의 기능이 MeCP2 결핍에 의해 손상되는 것을 시사한다(Maezawa et al., J Neurosci. 2009 Apr 22; 29(16): 5051-5061). 비록 MeCP2 수준이 뉴런에서보다 성상세포에서 대략 5배 더 낮지만(Skene et al. Mol Cell(2010) 37:457-468; Maezawa et al. Neurosci(2009) 29:5051-5061), 최근의 연구는 성상세포에서 MeCP2의 손실이 레트 유사 증후군에 기여하며 MeCP2의 회복은 이들 결핍의 일부를 구제할 수 있음을 시사한다(Lioy et al., Nature(2011) 475:497-500). 레트 증후군에서의 중심 역할을 감안하면, 장애를 효과적으로 둔화시키거나 심지어 진행을 반전시키기 위하여 정상적인 성상세포 기능을 회복하는 새로운 분자 표적을 확인하고 엄격하게 테스트할 상당한 필요성이 있다. 성상세포가 레트 증후군의 병리에 영향을 미칠 수 있는 여러 잠재적 경로가 있다.

성상세포 및 레트 증후군.

Mecp2 결핍 마우스에서 출생 후 MeCP2의 전반적인 재발현은 정상적인 수명을 초래하고, 운동 행동을 구제하고, 전반적인 건강을 개선시킨다. Guy et al.,Science.(2007) 315: 1143-1147. 초기 발달에서 뉴런 tau 유전자좌로부터의 MeCP2의 발현이 여러 레트 유사 증상의 출현을 방지하기 때문에(Luikenhuis et al., Proc. Nat. Acad. Sci.(2004) 101: 6033-6038), 뉴런은 구제에서 중요한 역할을 할 가능성이 있다. 그러나, 시험관내 연구는 성상세포 MeCP2가 정상적인 뉴런 형태를 지지한다고 나타낸다(Maezawa et al., J. Neurosci.(2009) 29: 505105056; Ballas et al., Nat. Neurosci.(2009) 12: 311-317). 그러므로, 성상세포는 또한 생체내에서 레트 신경병증을 구제하는 데 역할을 할 가능성이 있다.

정상적인 발달 중에, 신경발생이 먼저 일어나고 성상발생으로의 전환이 엄격하게 조절된다. 신경발생이 일어나는 동안, MeCP2는 성상세포 특이적 유전자 프로모터의 메틸화된 부분, 예컨대 성상세포의 특징적인 중간 필라멘트 단백질인 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP)에 부착한다. 뉴런 발달이 진행됨에 따라, 이 메틸화는 감소되며 MeCP2는 더 이상 프로모터에 부착하지 않아 유전자 전사가 허용된다. 이런 제어된 타이밍은 정확한 수의 뉴런 및 성상세포의 생성으로 이어진다. 그러나, 레트 증후군에서는, Mecp2가 돌연변이되어 프로모터의 염색질을 비활성 상태로 재모델링하는 능력을 갖지 않기 때문에 성상발생으로의 전환이 매우 신속하게 일어난다. 그러므로, 성상세포의 유전자가 매우 초기에 전사되는 기회가 있다. 레트 증후군 환자에서 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)는 대조군과 비교할 때 보다 쉽게 GFAP 양성 세포로 분화되는 것이 관찰되었고, 이것은 레트 증후군 뇌에서 GFAP 염색에서의 상승에 의해 추가로 확인된다(Axol Bioscience Ltd.(2020, February 18). Studying Astrocytes in Rett Syndrome. News-Medical. Retrieved on June 09, 2020 from https://www.news-medical.net/whitepaper/20191112/Studying-Astrocytes-in-Rett-Syndrome.aspx).

대조군 조건 하에서, 수지상 성장은 건강한 뉴런과 공동 배양될 때 건강한 성상세포에 의해 촉진된다. 그러나, Mecp2 ^-/+ 마우스로부터의 성상세포 및 건강한 해마 뉴런의 공동 배양은 더 짧은 수상돌기 및 체세포로 이어진다. 더불어, 건강한 성상세포에서 MeCP2에 대해 표적화된 siRNA가 또한 수상돌기 파생물의 감소로 이어지는 것이 관찰되었고, 이것은 성상세포의 MeCP2 결핍으로 인한 것임이 확인된다(Axol Bioscience Ltd, Ibid.).

배양물에서 야생형 iPSC 유래 중간뉴런의 형태는 레트 증후군 환자로부터의 인간 iPSC 유래 성상세포에 의해 해로운 영향을 받는다; 그러나, 야생형 iPSC 유래 인터뉴런의 형태는 레트 증후군 성상세포와의 배양과 비교하여, 건강한 iPSC 유래 성상세포는 레트 증후군 iPSC 유래 중간뉴런에 양성 영향을 나타냈다. 이것은 성상세포가 질환의 뉴런에 미칠 수 있는 효과를 추가로 강조한다(Axtol Biosciences, Ibid.).

Lioy 등은 출생 후 21일차에 성상세포로부터의 Mecp2의 제거가 널 마우스에서 전반적인 제거보다 미묘한 표현형을 초래하며, 성상세포에서의 재발현은 주로 증상을 안정화하는 것을 보고하였다(Nature(2012) 475(7357): 497-500). 다른 사람들은 질환 개시를 유발함으로써 설명될 것인 뉴런의 하위세트로부터 Mecp2의 배아상의 제거 후에 표현형의 하위세트의 출현(Chen et al., Nat. Genet.(2001) 3:327-33; Gemelli et al., Biol. Psych.(2006) 59:468-476), 및 배아 뉴런에서 Mecp2 재발현 후 레트 유사 표현형의 방지(Luikenhuis et al, Proc. Nat. Acad. Sci.(2004) 101:6033-6038)를 보고하였다. 이들 연구는 Mecp2 발현의 변화 및 시간이 지남에 따라 그것이 제어하는 경로가 질환 표현형을 조절할 수 있음을 시사한다.

Mecp2를 특히 성상세포에 재도입하는 것은 Mecp2 널 마우스에서 증상의 개선으로 이어진다(Lioy et al., Nature(2012) 475(7357): 497-500). 더욱이, 성상세포 조건부 배지는 Mecp2 ^-/- 쥐과 뉴런에 대해 유리한 영향을 미쳐서 그것의 수상돌기 길이를 향상시키는 것으로 나타났다(Axol Bioscience Ltd, Ibid). 이들 연구는 성상세포를 표적화함으로써, 레트 증후군 모델에서 음성 영향의 일부가 최소화될 수 있음을 입증한다.

VII. 치료적 항-SEMA4D 항체를 사용하는 치료 방법

본 개시의 방법은 레트 증후군을 가진 대상체를 치료하기 위한 항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체, 및 이의 항원 결합 단편, 변이체, 및 유도체의 용도에 관한 것이다. 특정 구현예에서 내피 세포가 SEMA4D 수용체를 발현하며, 다른 구현예에서 신경 세포가 SEMA4D 수용체를 발현하고, 다른 구현예에서는, 내피 및 신경 세포가 모두 SEMA4D 수용체를 발현한다. 특정 구현예에서 수용체는 플렉신-B1이다. 비록 다음의 논의가 항-SEMA4D 항체의 투여를 언급하지만, 본원에 기술된 방법은 또한 이들 항-SEMA4D 항체 또는 본 개시의 항-SEMA4D 항체의 원하는 특성을 보유한, 예컨대, SEMA4D, 예컨대, 인간, 마우스, 또는 인간 및 마우스 SEMA4D에 특이적으로 결합할 수 있고, SEMA4D 중화 활성을 가지며/거나, SEMA4D와 그것의 수용체, 예컨대, 플렉신-B1과의 상호작용을 차단할 수 있는 다른 생물학적 물질 또는 소분자의 항원 결합 단편, 변이체, 및 유도체에도 적용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 방법은 항-SEMA4D 항체의 투여를 언급하며, 본원에 기술된 방법은 또한 플렉신-B 1 및/또는 플렉신-B2에 특이적으로 결합할 수 있고 SEMA-4D와 그것의 플렉신 수용체, 예컨대, 플렉신-B1 및/또는 플렉신-B2 중 하나 또는 둘 다와의 상호작용을 차단할 수 있는 항-플렉신-B1 또는 항-플렉신-B2 결합 분자의 투여를 지칭할 수 있다.

한 구현예에서, 치료는 항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 본원에 기술된 바와 같이 SEMA4D에 결합하여 중화하는 다른 생물학적 물질 또는 소분자의 환자에 대한 적용 또는 투여를 포함하고, 환자는 레트 증후군을 가지며, 예컨대, 환자는 레트 증후군의 증상을 가졌거나 증상이 발병할 위험이 있다. 또 다른 구현예에서, 치료는 또한 항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물의 환자에의 적용 또는 투여를 포함하는 것으로 의도되며, 여기서 환자는 레트 증후군의 증상을 가졌거나 증상이 발병할 위험이 있다.

본원에 기술된 항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 그것의 결합 단편은 레트 증후군의 다양한 증상의 치료에 유용하다. 일부 구현예에서, 치료는 장애와 관련된 증상의 개선을 유도하기 위해 의도된다. 다른 구현예에서, 레트 증후군의 치료는 증상 표시의 증가를 감소, 지연 또는 중단시키기 위해 의도된다. 다른 구현예에서, 레트 증후군의 치료는 증상의 표시를 억제, 예컨대, 억압, 지연, 방지, 중단, 또는 반전시키기 위해 의도된다. 다른 구현예에서, 레트 증후군의 치료는 장애와 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화시키기 위해 의도된다. 이들 상황에서, 증상은 신경정신병 증상, 인지 증상, 및/또는 운동 기능장애일 수 있다. 다른 구현예에서, 레트 증후군의 치료는 호흡기 증상을 감소시키기 위해 의도된다. 다른 구현예에서, 치료는 삶의 질을 개선하기 위해 의도된다.

한 구현예에서, 본 개시는 항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 의약으로서의 용도, 특히 레트 증후군과 관련된 하나 이상의 증상을 개선, 감소, 또는 반전시키기 위한 레트 증후군의 치료에 사용하기 위한 용도에 관한 것이다.

본 개시의 방법에 따르면, 적어도 하나의 항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체, 또는 본원의 다른 곳에서 정의된 다른 생물학적 물질 또는 소분자는 레트 증후군과 관련하여 양성 치료 반응을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 레트 증후군과 관련하여 "양성 치료 반응"은 증상이 있는 대상체에서 장애와 관련된 증상의 개선을 포함하는 것으로 의도되며 또한 무증상 대상체에서 또는 장애의 초기 발병(1기) 중에 증상의 예방 및/또는 개선을 포함하는 것으로 의도된다. 그러한 양성 치료 반응은 투여 경로에 제한되지 않으며 기증자, 기증자 조직(예를 들어 장기 관류와 같은), 숙주, 이의 임의의 조합, 등에 대한 투여를 포함할 수 있다. 특히, 본원에 제공된 방법은 환자에서 레트 증후군의 진행을 억제, 방지, 감소, 완화, 또는 축소시키는 것에 관한 것이다. 그러므로, 예를 들어, 장애의 개선은 일부 또는 모든 임상적으로 관찰 가능한 증상의 부재, 일부 또는 모든 임상적으로 관찰 가능한 증상의 감소, 또는 일부 또는 모든 임상적으로 관찰 가능한 증상의 변화로서 특징지어질 수 있다.

레트 증후군과 관련된 증상을 변화시키는 활성은 생체내 마우스 모델을 사용하여 검출 및 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, Mecp2 마우스 모델이 사용될 수 있다. 마우스는 레트 증후군의 특징인 Mecp2에 돌연변이를 포함한다. Mecp2 마우스 모델은 레트 증후군의 다양한 단계와 관련된 원발성 병리: 불안, 손 비틀기와 유사한 반복적인 동작, 예컨대 뒷다리 움켜쥐기, 호흡기 문제, 예컨대 무호흡, 또는 불규칙 호흡 패턴, 기억 손상 및 근긴장도 및 운동 결손 중 일부를 나타낸다. 기술분야에 숙련된 사람은 다른 모델이 기술되었고 문헌에서 질환 메커니즘 및 레트 증후군에서의 증상의 치료의 연구에 대해 유용하게 사용된 것과 본 개시는 임의의 한 특정 모델에 제한되지 않아야 하는 것을 인정하여야 한다.

항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체 또는 다른 생물학적 물질 또는 소분자는 레트 증후군의 적어도 하나 이상의 다른 치료와 조합하여 사용될 수 있다; 추가 치료법은 항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체 치료법의 투여 전에, 중에, 또는 후속하여 투여된다. 그러므로, 조합된 치료법이 또 다른 치료제의 투여와 함께 항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 투여를 포함하는 경우, 개시의 방법은 별도의 제제 또는 단일 약학적 제제를 사용하여 동시의 또는 어떠한 순서로든 연속적인 투여로 공동 투여를 포함한다.

VIII. 약학 조성물 및 투여 방법

항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 제조하고 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법은 기술분야에 잘 알려져 있거나 기술분야에 숙련된 사람들에 의해 쉽게 결정된다. 항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 투여 경로는, 예를 들어, 경구, 비경구, 척수강내, 뇌실내 주사이거나 또는 흡입 또는 국소 투여에 의한 것일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 비경구에는, 예컨대, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 직장, 또는 질 투여가 포함된다. 이들 형태의 투여는 모두 분명하게 개시의 범주 내에 있는 것으로 고려되는 한편, 투여에 대한 형태의 예는 주사용 용액, 특히 정맥내 또는 동맥내 주사 또는 드립용 용액일 것이다. 주사용으로 적합한 약학 조성물은 완충제(예컨대 아세테이트, 인산염 또는 시트레이트 완충액), 계면활성제(예컨대 폴리소르베이트), 선택적으로 안정화제(예컨대 인간 알부민), 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 교시와 부합하는 다릉 방법에서, 항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 불리한 세포 집단의 부위에 직접 전달됨으로써 병든 조직의 치료제에의 노출이 증가될 수 있다.

본원에서 논의되는 것과 같이, 항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 레트 증후군의 생체내 치료를 위해 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 이런 견지에서, 개시된 결합 분자는 투여를 용이하게 하고 활성제의 안정성을 촉진하기 위하여 제제화될 수 있는 것이 인정될 것이다. 특정 구현예에서, 본 개시에 따르는 약학 조성물은 생리 식염수, 무독성 완충제, 보존제 등과 같은 약학적으로 허용되는, 무독성 멸균 담체를 포함한다. 본 출원의 목적에 대해, 항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 약학적으로 유효량은 표적에 대해 효과적인 결합을 달성하고 유익을 달성하기에, 예컨대, 레트 증후군과 관련된 증상을 개선하기에 충분한 양을 의미하는 것으로 유지되어야 할 것이다.

본 개시에 사용된 약학 조성물은 예컨대, 이온 교환제, 알루미나, 스테아르산 알루미늄, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 인산염과 같은 완충제 물질, 글리신, 소르브산, 소르브산 칼륨, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예컨대 황산 프로타민, 인산 수소 이나트륨, 인산 수소 칼륨, 염화 나트륨, 아연 염, 콜로이드 실리카, 삼규산 마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스 기반 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 카르복시메틸셀룰로스 나트륨, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜, 및 양모 지방을 포함한, 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

비경구 투여를 위한 제형에는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 및 에멀션이 포함된다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 오일, 및 에틸 올레에이트와 같은 주사용 유기 에스테르이다. 수성 담체에는, 예컨대, 물, 알코올성/수성 용액, 에멀션 또는 현탁액, 이를테면 식염수 및 완충 매질이 포함된다. 본 개시에서, 약학적으로 허용되는 담체로는, 한정하는 것은 아니지만, 0.01-0.1 M, 예컨대, 약 0.05 M 인산염 완충애 또는 0.9% 식염수를 들 수 있다. 다른 일반적인 비경구 비히클로 인산 나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화 나트륨, 락테이트화된 링거, 또는 고정 오일을 들 수 있다. 정맥내 비히클로는 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제, 예컨대 링거 덱스트로스를 기반으로 한 보충제, 등을 들 수 있다. 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제, 및 비활성 가스 등과 같은 보존제 및 다른 첨가제가 또는 존재할 수 있다.

보다 구체적으로, 주사 가능한 용도에 적합한 약학 조성물에는 멸균 수성 용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 그러한 경우에, 조성물은 멸균되어야 하고 용이한 주사성이 존재할 정도로 유체여야 한다. 제조 및 보관 조건 하에서 안정적이어야 하고 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 재해 보존될 수 있어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜, 등), 및 그것들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 본원에 개시된 치료 방법에 사용하기에 적합한 제형은 문헌: Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.) 16th ed.(1980)에 기재되어 있다.

미생물 작용의 예방은 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장성 작용제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화 나트륨이 포함될 수 있다. 주사 가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 발생될 수 있다.

어떠한 경우든지, 멸균 주사 가능한 용액은 활성 화합물(예컨대, 항-SEMA4D 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체 자체 또는 다른 활성제와 조합됨)을 필요한 양으로 적절한 용매에, 필요에 따라 본원에서 열거된 성분들 중 하나 또는 조합과 함께 포함하고 이어서 여과된 멸균에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본적인 분산 매질 및 위에서 열거된 것들로부터 필요한 다른 성분을 함유한 멸균 비히클에 포함시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은 진공 건조 및 냉동 건조를 포함하며, 그것으로 이전의 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 플러스 임의의 추가의 원하는 성분의 분말이 얻어진다. 주사용 제제는 처리되고, 앰풀, 주머니, 병, 주사기 또는 바이알과 같은 용기에 채워지며, 기술분야에 알려져 있는 방법에 따라 무균 조건 하에 밀봉된다. 추가로, 제제는 키트 형태로 포장되고 판매될 수 있다. 그러한 제조 물품은 회합된 조성물이 질환 또는 장애를 앓고 있거나, 또는 걸리기 쉬운 대상체를 치료하는 데 유용한 것을 나타내는 라벨 또는 포장 삽입물을 가질 수 있다.

비경구 제형은 유지 용량이 이어지는 단일 볼루스 용량, 주입 또는 로딩 볼루스 용량일 수 있다. 이들 조성물은 특정 고정 또는 가변 간격으로, 예컨대, 1일 1회, 또는 "필요에 따라" 기준으로 투여될 수 있다.

본 개시에 사용된 특정 약학 조성물은 예컨대, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 포함한 허용되는 투여량으로 경구 투여될 수 있다. 특정 약학 조성물은 또한 비강 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 그러한 조성물은 벤질 알코올 또는 다른 적합한 보존제, 생체 이용률을 향상시키기 위한 흡수 촉진제, 및/또는 다른 종래의 가용화제 또는 분산제를 사용하여 식염수 중의 용액으로서 제조될 수 있다.

단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체의 양은 치료되는 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 조성물은 단일 용량, 다중 용량으로서 또는 주입으로 확립된 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 투약 요법은 또한 최적의 원하는 반응(예컨대, 치료 또는 예방 반응)을 제공하기 위해 조정될 수 있다.

본 개시의 범주에 따라, 항-SEMA4D 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 치료 효과를 발생시키기에 충분한 양으로 전술한 치료 방법에 따라 인간 또는 다른 동물에게 투여될 수 있다. 항-SEMA4D 항체, 또는 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 개시의 항체를 공지된 기법에 따라 종래의 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 조합함으로써 제조된 종래의 투여 형태로 그러한 인간 또는 다른 동물에게 투여될 수 있다. 기술분야에 숙련된 사람은 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제의 형태 및 특징은 그것과 조합될 활성 성분의 양, 투여 경로 및 다른 잘 알려져 있는 변수에 의해 결정되는 것을 인식할 것이다. 기술분야에 숙련된 사람은 개시의 항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 하나 이상의 종을 포함하는 칵테일이 사용될 수 있는 것을 추가로 인정할 것이다.

"치료적 유효 용량 또는 양" 또는 "유효량"은 투여되었을 때 레트 증후군 환자의 치료와 관련하여 양성 치료 반응을 유발하는 항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 양인 것으로 의도된다. 양성 치료 반응은 장애의 증상을 완화시키거나; 증상의 발생을 감소, 축소, 지연 또는 중단시키거나; 증상의 중증도를 감소, 축소, 지연시키거나; 증상의 표시를 억제, 예컨대, 억압, 지연, 방지, 중단, 또는 반전시키거나; 장애와 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도로 완화시키거나; 이환율 및 사망률을 감소시키거나; 삶의 질을 개선시키거나; 또는 그러한 효과들의 조합일 수 있다. 특정 구현예에서, 치료적 유효 용량 또는 양의 투여는 하나 이상의 증상의 발생을 완화, 감소, 축소, 지연 또는 중단시키고; 하나 이상의 증상의 중증도를 감소, 축소, 지연시키며; 하나 이상의 증상의 표시를 억제, 예컨대, 억압, 지연, 방지, 중단, 또는 반전시키고, 증상에는 불규칙 호흡 패턴, 과호흡, 수면 무호흡, 불안, 몸 떨림, 손 비틀기, 두드리기, 움켜쥐기 등과 같은 반복적인 손 동작, 조정 및/또는 보행의 어려움, 미세한 또는 대근육 운동 조절의 발달 지연, 대근육 또는 미세 운동 조절의 감소, 인지력 감소, 기억력 감소, 의사소통 기능의 지연 또는 감소, 실행증, 근육 약화, 비정상적인 자세, 발작, 위장 장애, 비정상적인 심폐 결합, 골밀도 감소, 조기 발병 골다공증, 이갈이, 이상지질혈증, 담낭 염증, 척추 측만증, 비뇨기과 기능장애, 및 수면 장애, 불량한 삶의 질(모두 비-레트 증후군 "정상" 대상체와 비교된 것임), 및 그것들의 조합이 포함된다(Vashi N and Justice MJ. Mammalian Genome(2019) 30:90-110 참고).

증상의 발생률의 감소의 발생의 방지를 위해, 본 개시의 조성물은 치료적 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리적 상테, 장애의 병리 단계, 투여된 다른 약물, 및 치료가 예방적인지 또는 치료적인지의 여부를 포함한 많은 상이한 요인에 따라 달라진다. 치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위하여 기술분야에 숙련된 사람들에게 알려져 있는 일상적인 방법을 사용하여 적정될 수 있다.

투여될 적어도 하나의 항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 양은 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에 의해 본 개시를 감안하여 과도한 실험 없이 쉽게 결정된다. 적어도 하나의 항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체, 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체의 투여 방식 및 각각의 양에 영향을 미치는 요인에는, 한정하는 것은 아니지만, 장애의 중증도, 장애의 이력, 장애의 단계, 치료법을 받는 개체의 연령, 신장, 체중, 건강, 및 신체 조건이 포함된다. 유사하게, 투여될 항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체의 양은 투여 방식 및 대상체가 이 작용제의 단일 용량 또는 다중 용량을 받을 것인지의 여부에 따라 달라질 것이다.

개시는 또한 레트 증후군을 가진 대상체를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 개시의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 용도를 제공한다. 특정 구현예에서, 의약은 레트 증후군의 제1 임상 단계, 즉, 위에서 정의된 1기의 대상체에서 사용하기 위해 제조된다. 또 다른 구현예에서, 의약은 레트 증후군의 나중의 임상 단계, 즉, 위에서 정의된 2기, 3기, 또는 4기의 대상체에서 사용하기 위해 제조된다. 특정 구현예에서, 의약은 적어도 하나의 치료법으로 사전 치료된 대상체에서 사용하기 위해 제조된다. "사전 치료된" 또는 "사전 치료"는 대상체가 항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 의약을 받기 전에 하나 이상의 다른 치료법을 받은(예컨대, 레트 증후군의 하나 이상의 증성에 대한 적어도 하나의 다른 치료법으로 치료된) 것으로 의도된다. "사전 치료된" 또는 "사전 치료"는 항-SEMA4D 결합 분자, 예를 들어, 본원에 개시된 단클론성 항체 VX15/2503, 67, 또는 76, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체를 포함하는 의약으로 치료를 개시하기 전 2년 내에, 18개월 내에, 1년 내에, 6개월 내에, 2개월 내에, 6주 내에, 1개월 내에, 4주 내에, 3주 내에, 2주 내에, 1주 내에, 6일 내에, 5일 내에, 4일 내에, 3일 내에, 2일 내에, 또는 심지어 1일 내에 적어도 하나의 다른 치료법으로 치료된 대상체를 포함한다. 그러므로, 항-SEMA4D 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 의약을 받은 대상체는 선행 치료법으로의 사전 치료에, 또는 사전 치료가 다중 요법을 포함하는 하나 이상의 선행 치료법에 반응하였거나, 또는 반응하지 못하였을 수 있다.

본 개시의 실시는, 다르게 표시되지 않는 한, 기술분야의 지식 내에 있는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 형질전환 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 종래 기법을 사용할 것이다. 그러한 기법은 문헌에서 완정하게 설명된다. 예를 들어, [Sambrook et al., ed.(1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual(2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed.(1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,(Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed.,(1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed.(1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis 등 미국 특허 제 4,683,195호; Hames and Higgins, eds.(1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds.(1984) Transcription And Translation; Freshney(1987) Culture Of Animal Cells(Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press)(1986); Perbal(1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology(Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds.(1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells,(Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds.(1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds.,(1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,(1986); 및 Ausubel et al.(1989) Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)]를 참고한다.

항체 조작의 일반적인 원리는 문헌: Borrebaeck, ed.(1995) Antibody Engineering(2nd ed.; Oxford Univ. Press)에서 제시된다. 단백질 조작의 일반적인 원리는 문헌: Rickwood et al., eds.(1995) Protein Engineering, A Practical Approach(IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.)에서 제시된다. 항체 및 항체-합텐 결합의 일반적인 원리는 문헌: Nisonoff(1984) Molecular Immunology(2nd ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); 및 Steward(1984) Antibodies, Their Structure and Function(Chapman and Hall, New York, N.Y.)에서 제시된다. 추가적으로, 기술분야에 알려져 있고 특이적으로 기술되지 않은 면역학의 표준 방법은 일반적으로 문헌: Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites et al., eds.(1994) Basic and Clinical Immunology(8th ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.) 및 Mishell and Shiigi(eds)(1980) Selected Methods in Cellular Immunology(W.H. Freeman and Co., NY)에서와 같이 따른다.

면역학의 일반적인 원리를 제시하는 표준 참조 작업에는 [Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein(1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination(John Wiley & Sons, NY); Kennett et al., eds.(1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses(Plenum Press, NY); Campbell(1984) "Monoclonal Antibody Technology" in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden et al.,(Elsevere, Amsterdam); Goldsby et al., eds.(2000) Kuby Immunology(4th ed.; H. Freemand & Co.); Roitt et al.(2001) Immunology(6th ed.; London: Mosby); Abbas et al.(2005) Cellular and Molecular Immunology(5th ed.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann and Dubel(2001) Antibody Engineering(Springer Verlang); Sambrook and Russell(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press); Lewin(2003) Genes VIII(Prentice Hall 2003); Harlow and Lane(1988) Antibodies: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach and Dveksler(2003) PCR Primer(Cold Spring Harbor Press)]가 포함된다.

위에서 인용된 모든 참고문헌, 뿐만 아니라 거기에서 인용된 모든 참고문헌은 전체적인 내용으로 본원에 참조로 포함된다.

다음의 실시예가 제한이 아닌 예시에 의해 제공된다.

실시예

실시예 1: Mecp2 ^T158A 레트 증후군 마우스 모델에서 레트 증후군과 관련된 증상에 미치는 항-SEMA4D 결합 분자의 영향의 테스트

실험 설계.

Mecp2 ^T158A 레트 증후군 마우스 모델은 Goffin 등에 의해 생성하였고(Nature Neuroscience volume　15,　pages 274-283(2012)) 인간 장애의 표현형 특징을 밀접하게 요약한다. 트레오닌 158에서의 돌연변이는 레트 증후군 환자에서 관찰된 가장 흔한 Mecp2 돌연변이이고 형질전환 마우스에서 매우 가변적인 표현형을 생성한다. Mecp2 ^T158A/y 반접합성 수컷 마우스(이하 Mecp2 마우스로 지칭함)는 상이한 연령에서 다양한 증상을 나타내며 일반적으로 생후 4-6주령일 때 증상이 발생하기 시작한다. 전임상 시험을 반접합성 Mecp2 ^T158A/y 및 야생형 C57BL/6 수컷 마우스에서 수행하였다.

반접합성 Mecp2 ^T158A/y 및 야생형 C57BL/6 수컷 마우스를, Mecp2 ^T158A/y 마우스가 전 증상인 경우 생후 4주령에 또는 Mecp2 ^T158A/y 마우스가 증상이 있는 경우 생후 4주령에 항-SEM4D(Mab 67) 또는 아이소타입 대조군 단클론성 항체로 처리하였다(표 1). 모든 마우스는 50 mg/kg의 항-SEM4D(Mab 67) 또는 아이소타입 대조군 항체(Mab 2B8 마우스 IgG1)를 복강내 주사에 의해 10주 동안 받았다. 전 증상 마우스(4주 코호트; "4주") 및 4주 대조군을 주 2회 주사한 한편, 증상이 있는 마우스(8주 코호트; "8주") 및 8주 대조군을 시험의 처음 4주에는 주 2회로 및 5-10주에는 주 1회 투약하였다.

표현형 채점을 표 2의 기준에 따라 떨림 및 뒷다리 움켜쥐기를 포함한 RTT 특이적 증상의 중증도에 대해 주 기초로 수행하였다. 2주마다, 조정력, 보행력, 인지 및 호흡 패턴 척도를 로타로드, 고가 플러스 미로, 및 전신 혈량측정 테스트를 사용하여 평가하였다. 이들 행동 테스트를 3-4일 동안 수행하여 마우스의 불안 및 피로를 감소시켰다. 마우스를 주 1회 체중을 측정하였다.

로타로드. 마우스를 가속 로타로드 장치 상에 배치하고(도 1) 시험 사이에 적어도 15분 동안 휴식을 취하게 하였다. 각 시험은 최대 3분 동안 지속하였고, 그 동안 로드를 15초마다 5 rpm씩 5에서 6 rpm으로 가속하였다. 로드에서 떨어지는 대기 시간을 각 시험마다 기록하였다.

고가 플러스 미로. 각 마우스를 고가 플러스 미로 장치의 횡단면에 이전에 공개된 것과 같이 5분 동안 배치하였다(도 2)(Komada et al., 2008, Vis. Exp., Dec. 22(22): 1088). 폐쇄된 아암 및 개방된 아암에서 보낸 시간 및 폐쇄된 아암 및 개방 아암에 진입한 횟수를 기록하였다.

전신 혈량측정. 각 마우스를 암실에서 3시간 동안 방해하지 않고 전신 혈량측정 장치의 챔버에 앉혀두었다(도 3). 각 동물의 호흡 패턴(표 3)을 기록하고 EMKA iox 소프트웨어에 의해 분석하였다.

행동 테스트의 결론에 따라, 마우스를 희생시키고, 뇌 조직을 포르말린 고정 파라핀 내장(FFPE) 면역조직화학에 대해 처리하였다. 모든 테스트에 대해, 통계적 분석을 반복 측정이 있는 이원변량분석을 사용하여 수행하였다.

생후 4주령 전 증상 마우스(4주)의 분석.

항-SEMA4D는 전 증상 마우스에서 뒷다리 움켜쥐기 표현형을 개선시키고 몸 떨림을 감소시킨다.

Mecp2 마우스에서 뒷다리 움켜쥐기는 레트 증후군 환자에 존재하는 특징적인 손 비틀기 정형화를 닮은 자세 반응이다. Mecp2 마우스의 표현형 뒷다리 움켜쥐기는 도 4A에 도시한다. 표 2에서 요약한 0 내지 2 범위의 채점 기준을 사용하여 뒷다리 움켜쥐기의 중증도를 평가하였다. 아이소타입 대조군 항체를 받은 전 증상 마우스에서 뒷다리 움켜쥐기는 10주 연구 내내 점진적으로 악화되어, 약 1.8의 점수에 도달하였다. 대조적으로, 항-SEMA4D 처리 마우스에서 뒷다리 움켜쥐기는 3주째에 피크였고(약 1.1의 점수) 2주 동안 감소하여, 결국 연구 나머지 기간 동안 약 0.75의 점수에서 정체되었다. 야생형 마우스는 연구기간 내내 뒷다리 움켜쥐기를 나타내지 않았다(도 4B).

몸 떨림은 인간에서 레트 증후군의 많은 증상 중 하나이다. Mecp2 마우스는 장애가 진행됨에 따라 떨림이 전개된다. 표 2에서 요약한 0 내지 2 범위의 채점 기준을 사용하여 10주 연구 내내 전신 떨림의 중증도를 평가하였다. 아이소타입 대조군 항체를 받은 전 증상 마우스에서 몸 떨림은 1 내지 8주에 점진적으로 악화되어, 결국 약 1.6 내지 1.7의 점수에서 평준화되었다. 항-SEMA4D 처리 Mecp2 마우스에서 떨림은 치료의 처음 4주 동안에는 약 1의 점수로 아이소타입 대조군 마우스와 동일한 수준에서 진행된 후 10주 연구의 나머지 기간 동안 약 .75의 점수로 감소하였다. 야생형 마우스는 10주 연구기간 내내 떨림을 나타내지 않았다(도 5). 이들 결과는 항-SEMA4D 항체 치료가 장애의 전증상 단계에서 레트 증후군의 특징적인 자세 정형화를 개선할 뿐만 아니라, 장애의 이 단계와 관련된 몸 떨림을 감소시킨 것을 나타낸다.

항-SEMA4D는 전 증상 마우스에서 조정력 및 보행력을 개선한다.

시간이 지남에 따라, 레트 증후군을 가진 어린이는 동작, 조정력 및 의사소통을 제어하는 근육 사용에 문제가 증가한다. Mecp2 마우스는 조정력 및 보행력에 유사한 문제를 나타낸다.

생후 4주령 마우스를 위에서 기술한 것과 같이 로타로드 장치 상에서 보행력 및 조정력에 대해 테스트하였다. 결과를 도 6에 도시한다. 알 수 있는 것과 같이, 아이소타입 항체 처리된 Mecp2 마우스는 제1 주 후에는 개선하지 못하였고, 보행력 및 조정력은 3주 후에 악화되었다. 대조적으로, 항-SEMA4D 처리된 Mecp2 마우스는 초기 조정력 및 보행력을 유지하였고, 연구 과정 동안 측정 가능한 개선을 보였지만, 야생형 마우스와 동일한 정도는 아니었다.

항-SEMA4D는 전 증상 마우스에서 인지 손실을 방지하거나 감소시킨다.

고가 플러스 미로(EPM) 테스트는 2개의 개방 및 2개의 폐쇄된 아암이 있는 고가의, 플러스 형상(+) 장치를 사용한다. 행동 모델은 개방 공간에 대한 마우스의 일반적인 혐오감을 토대로 한다. 이 혐오감은 폐쇄된 공간에 남아 있거나 또는 경계가 있는 공간의 가장자리 가까운 것에 대한 선호도로서 표현되며, 그것은 동물이 장치의 폐쇄된 아암으로의 이동을 제한하는 것으로 해석한다. 불안 감소는 고가 플러스 미로에서 개방 아암에서 보내는 시간의 비율(개방 아암에서의 시간/개방 또는 폐쇄된 아암에서의 총 시간)의 증가 및 개방 아암으로 진입하는 비율(개방 아암으로의 진입/개방 또는 페쇄된 아암으로의 총 진입)의 증가에 의해 나타난다. 아암 진입의 총 횟수 및 폐쇄된 아암 진입 횟수를 일반적 활성의 척도로서 사용한다.

본 연구에서, EPM을 사용하여 Mecp2 단백질의 결핍으로 인해 손상된 인지가 EPM 과업에서 마우스의 행동에 어떻게 영향을 미쳤는지와 항-SEMA4D로의 치료가 손상된 마우스에서 인지에 영향을 미치는지의 여부를 측정하였다. 야생형, 아이소타입 항체 처리된 대조군 및 항-SEMA4D 처리된 코호트의 각각의 마우스를 고가 플러스 미로 장치의 단면에 5분 동안 배치하였다(도 2). 폐쇄된 아암 및 개방 아암에서 보내는 시간 및 폐쇄된 아암 및 개방 아암에 진입하는 횟수를 기록하였다. Mecp2 마우스는 연구를 시작할 때 인지에 결핍을 보이지 않았고, 테스트의 처음 3주 내에, 항-SEMA4D 처리된 Mecp2 마우스는 야생형 마우스가 했던 것처럼, 개방 아암의 혐오 특성의 인식을 입증하였다. 대조적으로, 아이소타입 항체 처리된 대조군 Mecp2 마우스는 EPM의 개방 아암의 혐오 특성을 학습할 수 없었다. 야생형 마우스 및 항-SEMA4D 처리된 Mecp2 마우스는 아이소타입 항체 처리된 Mecp2 마우스보다 개방 아암에서 상당히 더 적고 감소된 시간을 보냈고(도 7A) 또한 아이소타입 항체 처리된 마우스와 비교하여 개방 아암에 진입하는 횟수를 더 적게 함으로써 개방 아암의 위험의 인식을 입증하였다(도 7B). 이들 결과는 MeCP2 마우스의 항불안제 유사 행동이 선천적 불안 수준과 관련이 있을뿐만 아니라 EPM 과업의 개방 아암과 관련된 잠재적 위험을 인식하지 못하는 무능력과 관련된 것을 보여준다. 항-SEMA4D 항체로의 처리는 전 증상 Mecp2 마우스의 인지를 유지시켜서, 마우스가 개방 아암의 잠재적 위험을 인식하고 피할 수 있게 한다.

이들 결과는 장애의 전 증상 기간 중에 항-SEMA4D 치료가 인지를 유지시킨다, 즉, 미처리 Mecp2 마우스에서 관찰된 인지 감소를 방지하는 것을 입증한다.

항-SEMA4D는 전 증상 마우스의 호흡 패턴을 개선시킨다.

RTT 환자는 과호흡, 무호흡, 발살바법(Valsalva maneuvers)에 의해 종료되는 호흡 정지, 강제 심호흡 및 무호흡 호흡, 뿐만 아니라 심박수 조절 및 심폐 통합의 이상을 포함할 수 있는 복잡한 호흡 표현형을 나타낸다. 중증의 부정맥 호흡은 레트 증후군의 특징이며 환자와 그 가족의 삶의 질에 중대한 영향을 미친다.

RTT의 마우스 모델의 최근 연구는, 특히 신경전달물질 및 신경조절인자 발현의 비정상적인 패턴으로부터 유발된 신경화학적 신호전달의 결핍을 포함하는 호흡 기능장애에 기여할 가능성이 있는 신경학적 결손에 대해 밝혔다. Mecp2 마우스에서 SEMA4D 신호전달을 차단하는 것이 레트 증후군 대상체의 호흡 패턴에 영향을 미칠 수 있는지의 여부를 측정하기 위하여, Mecp2 마우스에게 위에서 기술한 것과 같이 전신 혈량측정을 실시하였다. 도 8A 및 B에서 나타낸 것과 같이, 항-SEMA4D 처리된 마우스는 야생형 마우스의 호흡 패턴과 유사한 호흡 패턴(흡기 및 호기 모두)을 나타냈다. 아이소타입 항체 처리된 Mecp2 마우스는 불규칙 호흡 패턴을 나타냈는데, 항-SEMA4D 처리된 Mecp2 마우스와 비교하여 흡기 및 호기 시간이 낮았다. 이들 데이터는 항-SEMA4D 치료가 레트 증후군과 관련된 호흡 불규칙성을 방지할 수 있음을 입증한다.

생후 8주령 증상이 있는 마우스(8주)의 분석.

항-SEMA4D는 증상이 있는 마우스에서 뒷다리 움켜쥐기 표현형을 개선하고 몸 떨림을 감소시킨다.

표 2에서 요약한 0 내지 2 범위의 채점 기준을 사용하여 야생형, 및 대조군 처리된 및 항-SEMA4D 처리된 생후 8주령의 증상이 있는 Mecp2 마우스에서 10주 기간 동안 뒷다리 움켜쥐기의 중증도를 평가하였다. 아이소타입 대조군 항체를 받은 증상이 있는 마우스에서 뒷다리 움켜쥐기는 10주 연구기간 내내 점진적으로 악화되어, 아이소타입 대조군 전 증상 마우스와 유사한 약 1.8의 점수에 도달하였다(도 5B). 대조적으로, 항-SEMA4D 처리된 마우스에서 뒷다리 움켜쥐기는 테스트를 시작할 때 가장 높았고(약 1.4의 점수) 감소하여 테스트 기간 동안 그 수준 아래에서 유지되었다. 야생형 마우스는 연구 기간 내내 뒷다리 움켜쥐기를 나타내지 않았다(도 9).

표 2에서 요약한 0 내지 2 범위의 채점 기준을 사용하여 10주 연구기간 내내 증상이 있는 Mecp2 마우스의 전신 떨림의 중증도를 평가하였다. 아이소타입 항체 대조군을 받은 증상이 있는 마우스에서 몸 떨림은 1주차부터 10주차까지 점진적으로 악화되어, 결국 약 1.8의 점수에서 평준화되었다. 항-SEMA4D 처리된 Mecp2마우스에서의 떨림은 5주차까지 점진적으로 감소된 후 1 미만의 점수로, 즉, 아이소타입 항체 대조군 마우스의 점수의 절반 미만으로 평준화되었다. 야생형 마우스는 10주 연구기간 내내 떨림을 나타내지 않았다(도 10).

이들 결과는 항-SEMA4D 항체 치료가 장애의 전 증상 단계에서와 같이, 장애의 증상이 있는 단계에서 레트 증후군의 특징적인 자세 정형화를 개선하고 장애의 전 증상 또는 증상이 있는 단계 동안 투여 여부에 관계없이 몸 떨림을 상당히 감소시키는 것을 나타낸다.

항-SEMA4D는 증상이 있는 Mecp2 마우스에서 조정력 및 보행력을 개선시킨다.

항-SEMA4D 항체가 근육 조절 문제가 발생한 후에 투여되는 경우 조정력 및 보행력에 영향을 주는지의 여부를 측정하기 위하여, 증상이 있는 마우스 및 대조군을 가속 로타로드 장치 상에서 테스트하였다. 증상이 있는 마우스(8주)를 위에서 기술한 것과 같이 3회 시험에 대해 2주마다 가속 로타로드 장치 상에 배치하고 시험 사이에 적어도 15분을 쉬게 하였다. 그 결과를 도 11에 도시한다. 알 수 있는 것과 같이, 아이소타입 항체 처리된 Mecp2 마우스는 제1 주 후에 개선되지 못하였고, 보행력 및 조정력은 테스트 기간 동안 악화되었다. 대조적으로, 항-SEMA4D 처리된 Mecp2 마우스는 연구 과정 동안 상당히 개선되었고, 심지어 테스트 내내 비교적 꾸준한 수준의 기술을 유지한 야생형 마우스의 기술 수준을 능가하였다.

항-SEMA4D는 증상이 있는 마우스에서 인지를 증가시킨다.

EPM을 사용하여 증상이 있는 마우스(8주)의 항-SEMA4D로의 치료가 손상된 마우스에서의 인지에 영향을 미치는지의 여부를 측정하였다. 야생형, 아이소타입 항체 처리된 대조군 및 항-SEMA4D 처리된 코호트의 각각의 마우스를 고가 플러스 미로 장치의 단면(도 2)에 5분 동안 배치하였다. 폐쇄된 및 개방 아암에서 보낸 시간 및 폐쇄된 및 개방 아암에 진입하는 횟수를 기록하였다. 야생형 마우스는 항-SEMA4D 처리된 Mecp2 마우스가 했던 것처럼, 개방 아암의 혐오 특성의 인식을 입증한 반면, 아이소타입 항체 처리된 대조군 Mecp2 마우스는 EPM의 개방 아암의 혐오 특성을 학습할 수 없었다. 전 증상 마우스로 볼 수 있었던 것과 같이, 야생형 마우스 및 항-SEMA4D 처리된 Mecp2 마우스는 아이소타입 항체 처리된 Mecp2 마우스보다 개방 아암에서 상당히 더 적고 감소된 시간을 보냈고(도 12A) 또한 아이소타입 항체 처리된 마우스와 비교하여 개방 아암에 진입하는 횟수를 더 적게 함으로써 개방 아암의 위험의 인식을 입증하였다(도 12B). 이들 결과는 증상이 있는 마우스의 항-SEMA4D 항체로의 치료가 전 증상 마우스에서 항-SEMA4D 치료가 인지 저하를 방지하는 것처럼 인지를 증가시킨다는 것을 보여준다.

항-SEMA4D는 증상이 있는 마우스의 호흡 패턴을 개선시킨다.

증상이 있는 대상체의 호흡 패턴에 대해 SEMA4D 신호전달을 차단하는 것이 양성 효과를 갖는지의 여부를 측정하기 위하여, 항-SEMA4D 처리된, 대고준 Mecp2 및 야생형 마우스에 대해 위에서 기술한 것과 같이, 전신 혈량측정을 수행하였다. 간단히 설명하면, 야생형, 항-SEMA4D 처리된 Mecp2 마우스 및 아이소타입 항체 처리된 Mecp2 마우스를 암실에서 방해 없이 3시간 동안 도 3에 도시된 전신 혈량측정 장치의 챔버에 두었다. 각 동물의 호흡 패턴(표 3)을 기록하고 EMKA iox 소프트웨어에 의해 분석하였다.

도 13A 및 B에서 나타낸 것과 같이, 항-SEMA4D 처리된 마우스는 치료 3주 후에 개선된 호흡 패턴(흡기 및 호기 모두)을 나타냈고, 야생형 마우스의 호흡 패턴에 도달하였다. 아이소타입 항체 처리된 MeCP2 마우스는 불규칙 호흡 패턴을 나타냈는데, 항-SEMA4D 처리된 Mecp2 마우스와 비교하여 흡기 및 호기 시간이 모두 낮았다. 이들 데이터는 항-SEMA4D 치료가 호흡기 증상의 개시 후에 호흡 불규칙성을 개선할 수 있음을 입증한다.

아래의 표 4는 위에서 보고된 연구 결과를 요약한다.

SEMA4D는 레트 마우스의 뉴런에서 상향조절된다.

생후 약 8개월령의 암컷 마우스(Mecp2^T158A 및 야생형 한배새끼 대조군 C57BL/6)로부터의 뇌의 포르말린 고정 파라핀 내장 섹션을 SEMA4D(CD100 다클론성 항체-　Invitrogen-PA5-47711) 및 뉴런 마커 HuC/HuD(단클론성 항체(16A11)- Invitrogen:　A-21271)에 대해 염색하였다. 해마 영역의 대표적인 이미지를 도 14에 도시한다. 알 수 있는 것과 같이, SEMA4D는 레트 마우스의 뉴런에서 상당히 상향조절되는 한편, 야생형 대조군과 비교한 레트 마우스에서의 뉴런 마커 HuC/HuD의 발현에는 차이가 없다.

SEQUENCE LISTING <110> VACCINEX, INC. <120> USE OF ANTI-SEMAPHORIN-4D BINDING MOLECULES FOR TREATMENT OF RETT SYNDROME <130> 8555.039Z <140> 63/043,945 <141> June 25, 2020 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 862 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> HUMAN semaphorin-4D <400> 1 Met Arg Met Cys Thr Pro Ile Arg Gly Leu Leu Met Ala Leu Ala Val 1 5 10 15 Met Phe Gly Thr Ala Met Ala Phe Ala Pro Ile Pro Arg Ile Thr Trp 20 25 30 Glu His Arg Glu Val His Leu Val Gln Phe His Glu Pro Asp Ile Tyr 35 40 45 Asn Tyr Ser Ala Leu Leu Leu Ser Glu Asp Lys Asp Thr Leu Tyr Ile 50 55 60 Gly Ala Arg Glu Ala Val Phe Ala Val Asn Ala Leu Asn Ile Ser Glu 65 70 75 80 Lys Gln His Glu Val Tyr Trp Lys Val Ser Glu Asp Lys Lys Ala Lys 85 90 95 Cys Ala Glu Lys Gly Lys Ser Lys Gln Thr Glu Cys Leu Asn Tyr Ile 100 105 110 Arg Val Leu Gln Pro Leu Ser Ala Thr Ser Leu Tyr Val Cys Gly Thr 115 120 125 Asn Ala Phe Gln Pro Ala Cys Asp His Leu Asn Leu Thr Ser Phe Lys 130 135 140 Phe Leu Gly Lys Asn Glu Asp Gly Lys 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Claims (18)

1. 대상체에서 레트 증후군을 치료하는 데 사용하기 위한, 세마포린-4D(SEMA4D)에 특이적으로 결합하는, 단리된 결합 분자.
2. 제1항에 있어서, 결합 분자는, VX15/2503, D2517, D2585, 및 Mab 67로 이루어지는 군으로부터 선택되는 참조 단클론성 항체가 SEMA4D에 특이적으로 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 것인 단리된 결합 분자.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 결합 분자는 SEMA4D와 이의 수용체 또는 이의 수용체의 일부와의 상호작용을 억제하는 것인 단리된 결합 분자.
4. 제3항에 있어서, 수용체는 플렉신-B1 및 플렉신-B2, 및 CD72로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 단리된 결합 분자.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 분자는 SEMA4D 수용체 매개 신호 전달을 억제하는 것인 단리된 결합 분자.
6. 제1항에 있어서, 단리된 결합 분자는 VX15/2503, D2517, 또는 Mab 67로 이루어지는 군으로부터 선택되는 참조 단클론성 항체와 동일한 SEMA4D 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 결합 분자.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 결합 분자는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 단리된 결합 분자.
8. 제7항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 VX15/2503, D2517, 또는 Mab 67인 단리된 결합 분자.
9. 제7항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열 번호 3, 4, 및 5를 포함하는 VHCDR 1-3을 포함하는 가변 중쇄(VH), 및 각각 서열 번호 8, 9, 및 10을 포함하는 VLCDR 1-3을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는 것인 단리된 결합 분자.
10. 제9항에 있어서, VH 및 VL은 각각 서열 번호 6 및 서열 번호 11 또는 서열 번호 7 및 서열 번호 12를 포함하는 것인 단리된 결합 분자.
11. 제7항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열 번호 22, 23, 및 24를 포함하는 VHCDR 1-3을 포함하는 가변 중쇄(VH), 및 각각 서열 번호 26, 27, 및 28을 포함하는 VLCDR 1-3을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함하는 것인 단리된 결합 분자.
12. 제11항에 있어서, VH 및 VL은 각각 서열 번호 21 및 서열 번호 25를 포함하는 것인 단리된 결합 분자.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 레트 증후군의 1기에 있는 것인 단리된 결합 분자.
14. 제13항에 있어서, 상기 사용은 신경정신병 증상, 인지 증상, 운동 기능장애, 신체 발달 지연, 의사소통 발달 지연, 의사소통 기능 상실, 수면 장애, 불규칙 심장박동, 불규칙 호흡 패턴, 반복적인 갑자기 움직이는 동작, 몸 떨림, 및 이의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 레트 증후군 질환 단계 증상을 완화시키는 것인 단리된 결합 분자.
15. 제14항에 있어서, 증상을 완화시키는 것은 불안 유사 행동의 방지 또는 감소, 인지력 증가, 조정력 증가, 보행력 증가, 신체 발달 진전, 몸 떨림 감소, 반복적인 동작 감소, 운동 기능 증가, 의사소통 기능 증가, 수면 장애 감소, 초조 감소, 불안증 감소, 호흡 불규칙성 감소, 및 이의 임의의 조합을 포함하는 것인 단리된 결합 분자.
16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 레트 증후군의 2기, 3기, 또는 4기에 있는 것인 단리된 결합 분자.
17. 제16항에 있어서, 상기 사용은 신경정신병 증상, 인지 증상, 신체 발달 지연, 운동 기능장애, 불규칙 심장박동 및 호흡, 의사소통 기능 감소, 척추 측만증, 수면 장애, 발작, 위장 장애, 반복적인 갑자기 움직이는 동작, 몸 떨림, 및 이의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 레트 증후군 증상을 완화시키는 것인 단리된 결합 분자.
18. 제17항에 있어서, 증상을 완화시키는 것은 불안 유사 행동의 감소, 인지력 증가, 조정력 증가, 보행력 증가, 신체 발달 진전, 몸 떨림 감소, 반복적인 동작 감소, 운동 기능 증가, 의사소통 기능 증가, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 것인 단리된 결합 분자.