异源动物细胞因子突变体疫苗及其应用
技术领域
本发明涉及异源动物细胞因子突变体疫苗及其应用。
背景技术
动物机体内的许多细胞会合成和分泌一些蛋白质和小分子多肽物质,它们可在细胞间传递信息,并调节自身和其它细胞的多种生理功能,这些蛋白质和小分子多肽物质统称为细胞因子。现在已发现的细胞因子根据其主要功能可分为:1.白细胞介素:在细胞间相互作用、免疫调节、造血以及炎症过程中起重要调节作用,目前已报道有三十余种;2.集落刺激因子:刺激造血干细胞或分化不同阶段的造血细胞形成细胞集落;3.干扰素:干扰病毒的感染和复制,具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用;4.肿瘤坏死因子:杀伤肿瘤细胞、免疫调节以及参与发热和炎症的发生;5.转化生长因子-β家族;6.生长因子家族;7.趋化因子家族;8.其它细胞因子等。细胞因子一般通过与靶细胞上的受体分子相结合来传递下游信号。每种细胞因子家族蛋白都会含有一些其家族特征结构,因此其受体分子往往也具有相应的特征结构,因而形成了相应的细胞因子受体家族,如肿瘤坏死因子家族等。
骨组织处于不断重建过程之中,破骨细胞的骨吸收和成骨细胞的骨生成处于平衡状态,维持骨密度和骨结构的优化来维持骨的机械功能。由于更年期、衰老、炎症或其他的因素导致过度增加破骨细胞活性而打破平衡,并导致骨质快速流失,因此提高骨质疏松和其他慢性骨疾病如类风湿性关节炎、银屑病关节炎、骨肿瘤转移和佩吉特氏病的发生率。这些慢性骨疾病最成功的药物疗法就是通过抑制破骨细胞的骨吸收而生效的。
对破骨细胞成熟和活化的调控机制的理解,可以提供了比以前更好的骨吸收有关疾病的预防和治疗。最近发现的NF-κΒ受体活化剂配体(receptor activator ofnuclear factor kappa B ligand,RANKL)和其受体——NF-κB受体活化因子(receptoractivator of NFκB,RANK)是破骨细胞发育和活化中必不可少,在调节骨重建中发挥着重要作用。RANKL是肿瘤坏死因子超家族的成员,是一种Ⅱ型跨膜蛋白,被认为主要表达在破骨细胞、活化的T细胞和骨髓基质细胞表面。人类和小鼠的RANKL在氨基酸序列上有87%的同源性,表明在进化上是一种高度保守的蛋白。象其他TNF超家族成员一样,所有型式的RANKL都是组装成同源三聚体行使功能。
RANKL的功能受体RANK是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员。它是Ⅰ型跨膜蛋白,由620个氨基酸残基组成,人类和小鼠具有85%的同源性。N-末端的胞外区域是由30-194位氨基酸残基组成的,含有4个富含半胱氨酸的重复序列(CRDs),这些重复CRDs所形成的细长形状给与受体的配体结合时提供了接触面。当与配体RANKL相互作用时,三个独立的RANK胞外区域会结合在RANKL同源三聚体的相邻单体间的间隙,从而导致三个RANK的胞内区域相互聚合。由约383个氨基酸残基组成的RANK细胞内区域是TNF受体超家族中的最长的胞内域之一。像TNF受体超家族的其他成员一样,该区域缺乏酶活性,它通过招募各种接头蛋白,包括肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAFs)来传递胞内信号,导致NF-γB、JNK、ERK、p38、NFATc1、和Akt信号通路的激活。
骨保护素(OPG)是一种RANK同源的可溶性蛋白,是RANKL的天然诱导受体。OPG主要由骨髓基质细胞和成骨细胞分泌,通过阻断RANK与RANKL的结合,充当一个重要的内源性调节RANK-RANKL信号通路的角色。OPG基因敲除小鼠表现出严重的骨质疏松症,证实了OPG是RANK-RANKL信号通路上的一个重要蛋白。此外,许多疾病模型提出RANK/OPG比例是决定骨吸收的重要因素。因此,RANKL,RANK和OPG所组成的配体/受体/受体拮抗剂***调控着骨骼平衡和其它相关的生物过程。
近年来,抗细胞因子免疫疗法为许多细胞因子产生异常相关的慢性疾病的治疗带来了革命性的突破。通过注射(被动抗细胞因子免疫疗法)或诱导体内产生特异性抗细胞因子抗体中和过度产生的细胞因子(主动抗细胞因子免疫疗法)达到阻止它们致病的作用。过去的20年,使用特异性高亲和力单克隆抗体的被动抗细胞因子免疫疗法被用于动物模型和各种临床研究(如类风湿关节炎,多发性硬化症,发炎性肠道疾病,哮喘,克罗恩病,牛皮癣和其他关节的自身免疫性疾病),在很大程度上确认了免疫疗法的功效。尽管被动抗细胞因子免疫治疗在医疗和商业上获得了成功,但是它具有几个缺点:生产困难和成本过高,患者需要定期输液,因半衰期有限阻碍抗细胞因子生物制剂的疗效,还具有一些副作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供异源动物细胞因子突变体疫苗。
本发明所提供的异源动物细胞因子突变体疫苗,它的活性成分是异源动物细胞因子突变体,所述异源动物细胞因子突变体是对来自异源动物的细胞因子进行突变得到的,所述异源动物细胞因子突变体满足如下条件:
1)所述来自异源动物的细胞因子能和所述受体动物体内细胞膜上的所述细胞因子的受体结合;
2)所述异源动物细胞因子突变体和所述受体动物体内细胞膜上的所述细胞因子的受体结合的能力是所述受体动物的所述细胞因子和所述受体动物体内细胞膜上的所述细胞因子的受体结合能力的十分之一以下。
上述异源动物细胞因子突变体中,术语“异源动物”是指与所述受体动物不同的物种。所述结合能力可用亲和常数表示。
上述异源动物细胞因子突变体中,所述细胞因子可为TNF家族蛋白,所述细胞因子的受体可为TNFR家族受体分子。
在本发明的一个实施方式中,所述细胞因子为RANKL细胞因子,所述细胞因子的受体为RANK受体分子。
上述异源动物细胞因子突变体中,所述异源动物和所述受体动物均可为哺乳动物。在本发明的一个实施例中,所述异源动物为人,所述受体动物为大鼠,所述异源动物细胞因子突变体具体为人RANKL细胞因子突变体,其氨基酸序列为SEQ ID No.1,实验证明该人RANKL细胞因子突变体能够成功阻止大鼠骨质疏松症。在本发明的另一个实施例中,所述异源动物为小鼠,所述受体动物为大鼠或家兔,所述异源动物细胞因子突变体具体为小鼠RANKL细胞因子突变体,其氨基酸序列为SEQ ID No.2,实验证明该小鼠RANKL细胞因子突变体能够成功阻止大鼠和家兔骨质疏松症。
上文中,所述异源动物细胞因子突变体可为1)-4)中的任一种:
1)氨基酸序列是SEQ ID No.2;
2)氨基酸序列是SEQ ID No.1;
3)氨基酸序列与SEQ ID No.2具有至少85%,如88%-99%、90%-99%或95%-99%或90%-95%或99%或95%或90%或88%的同一性;
4)氨基酸序列与SEQ ID No.1具有至少85%,如88%-99%、90%-99%或95%-99%或90%-95%或99%或95%或90%或88%的同一性。
其中,可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性,如NCBI主页网站的BLAST网页。例如,可在高级BLAST2.1中,通过使用blastp作为程序,将Expect值设置为10,将所有Filter设置为OFF,使用BLOSUM62作为Matrix,将Gap existence cost,Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11,1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算。然后即可获得同一性的值(%)。
上述异源动物细胞因子突变体中,所述异源动物也可为非灵长类动物。所述受体动物可为人。
下述B1)至B6)中的任一种所述异源动物细胞因子突变体的相关生物材料也属于本发明的保护范围:
B1)编码上述异源动物细胞因子突变体的核酸分子;
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒;
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体;
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物;
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系;
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系。
上文中,所述核酸分子可以是DNA,如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也可以是RNA,如mRNA或hnRNA等。编码所述异源动物细胞因子突变体的核酸分子具体可为编码所述异源动物细胞因子突变体的基因。所述重组微生物具体可为细菌、病毒、酵母、藻和真菌。所述转基因植物细胞系和所述转基因动物细胞系不为繁殖材料。
本发明中所述表达盒可含有编码所述异源动物细胞因子突变体的基因和启动所述基因转录的启动子。本发明中所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述异源动物细胞因子突变体的DNA,该DNA不但可包括启动所述基因转录的启动子,还可包括终止所述基因转录的终止子。进一步,所述表达盒还可包括增强子序列。
以上述异源动物细胞因子突变体或上述异源动物细胞因子突变体的相关生物材料为活性成分的疫苗也属于本发明的保护范围。
上述疫苗中,所述疫苗单独使用或与佐剂同时使用;进一步,所述佐剂具体为铝佐剂。
所述疫苗具体可为治疗和/或预防哺乳动物骨质疏松症、自身免疫性疾病或肿瘤的疫苗。所述哺乳动物可为大鼠。
其中,所述异源动物细胞因子突变体可采用大肠杆菌表达***表达。
上述异源动物细胞因子突变体或其相关生物材料在制备治疗和/或预防哺乳动物疾病药物中的应用也属于本发明的保护范围。
其中,所述哺乳动物疾病可为骨质疏松症、自身免疫性疾病或肿瘤。
实验证明,在卵巢摘除(OVX)大鼠模型中,应用人RANKL细胞因子突变体和小鼠RANKL细胞因子突变体能够成功阻止大鼠骨质疏松症。说明异源动物细胞因子突变体疫苗可用于治疗受体动物的骨质疏松症。本发明的异源动物细胞因子突变体相对于治疗个体为异源,所以具有免疫原性;失去了RANKL的可激活破骨细胞的生物活性,所以具有安全性。本发明的异源动物细胞因子突变体疫苗可用于治疗和/或预防哺乳动物骨质疏松症、自身免疫性疾病或肿瘤。
附图说明
图1为典型的胫骨近端扫描片层和胫骨近端所感兴趣的空间区域(VOI)的骨小梁结构的三维重建图。
A是胫骨近段片层的三维重建图,B为从胫骨近端的感兴趣的空间区域(VOI)的松质骨结构的三维重建图。扫描从胫骨近端生长板开始以空间分辨率20μm扫描,这组图从第51层取到第100层(左图)和第一层到第25层(右图)。
图中,Sham表示假手术组,HSA表示阴性对照组,223+300M表示治疗组。
图2为用micro-CT对人RANKL223+300M在OVX大鼠中的抑制骨吸收作用的评价。
图中A为骨密度(BMD)、B为包括骨体积密度(Bv/Tv)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁间隙(Tb.Sp)、骨小梁数量(Tb.N)、骨表面积密度(Bs/Bv,)和骨形态参数(Tb.Pf)在内的其他的形态学和测量参数。计算得到的数值用平均值±标准差表示。
图中,Sham表示假手术组,HSA表示阴性对照组,223+300M表示治疗组;数据为平均值±标准差。
图3为用Elisa法检测免疫人RANKL细胞因子突变体hRANKL223+300M的大鼠抗血清对小鼠RANKL细胞因子的效价。
图中,BSA表示BSA包被到Elisa板上作为阴性对照,anti-MRL serum表示作为阳性对照的兔抗小鼠RANKL细胞因子的抗血清,HSA group表示人血清白蛋白疫苗免疫的阴性对照组抗血清,223+300M group表示人RANKL223+300M疫苗免疫的治疗组抗血清;数据为平均值±标准差。
图4为利用免疫小鼠RANKL细胞因子突变体mRANKL222+299M方法来治疗OVX大鼠及OVX家兔的骨质疏松。
A.高分辨率micro-CT对OVX大鼠胫骨三维重建后获得的VOI区域骨小梁结构。
B.经小鼠RANKL细胞因子突变体mRANKL222+299M免疫治疗后各组OVX大鼠胫骨的BMD值。
C.高分辨率micro-CT对OVX家兔胫骨三维重建后获得的VOI区域骨小梁结构。D.率micro CT对OVX家兔胫骨三维重建后获得的VOI区域骨小梁结构。
D.经小鼠RANKL细胞因子突变体mRANKL222+299M免疫治疗后各组OVX家兔胫骨的BMD值。*和**为各组同阴性对照组的统计学比较。
图中,Sham为假手术组;HSA为阴性对照组;M29为小鼠RANKL细胞因子突变体mRANKL222+299M治疗组;Calcitonin为Calcitonin组;数据为平均值±标准差。
图5为hRANKL158-317及其突变体与mRANK26-210的平衡解离常数曲线
A为hRANKL158-317,B为hRANKL300M,C为hRANKL223M,D为hRANKL223+300M。
图6为hRANKL158-317及其突变体的抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果。
A为hRANKL158-317,B为hRANKL300M,C为hRANKL223M,D为hRANKL223+300M。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
2月龄的雌性Sprague–Dawley大鼠和8月龄的雌性新西兰大耳白兔购于北京维通利华实验动物技术有限公司。
Raw264.7细胞系购于American Type Culture Collection,并按照操作手册进行培养传代。
引物合成于生工生物工程(上海)股份有限公司。限制性内切酶和T4DNA合成酶购于Fermentas Molecular Biology Tools。Pfu DNA合成酶购于天根生化科技(北京)有限公司。
实施例1、用人RANKL细胞因子突变体hRANKL223+300M治疗大鼠骨质疏松症
一、人RANKL细胞因子突变体hRANKL223+300M治疗大鼠骨质疏松症
人RANKL细胞因子突变体hRANKL223+300M是对来自人的细胞因子hRANKL158-317进行突变得到的。hRANKL158-317的氨基酸序列如序列SEQ ID No.7,人RANKL细胞因子突变体hRANKL223+300M的氨基酸序列如SEQ ID No.1。其中,SEQ ID No.1的第1位对应人RANKL细胞因子的第158位,SEQ ID No.1的第160位对应人RANKL细胞因子的第317位。人RANKL细胞因子突变体hRANKL223+300M将人RANKL细胞因子第223位(SEQID No.7的第66位)的精氨酸突变为丙氨酸,将人RANKL细胞因子第300位(SEQ IDNo.7的第143位)的天冬氨酸为丙氨酸。
1、制备人RANKL细胞因子突变体hRANKL223+300M
用SEQ ID No.3所示的hRANKL223+300M的基因替换pGEX-6p-1载体(美国GEHealthcare公司)的BamHI和XhoI之间的小片段,得到含有hRANKL223+300M基因的重组表达载体pGEX-6p-hRANKL223+300M。
将pGEX-6p-hRANKL223+300M转入大肠杆菌BL21菌株(北京全式金生物技术有限公司),得到含有pGEX-6p-hRANKL223+300M的重组大肠杆菌BL21/pGEX-6p-hRANKL223+300M。
在表达菌(BL21/pGEX-6p-hRANKL223+300M)的生长浓度达到OD600nm=0.6时,用0.5mM的IPTG诱导,并20℃过夜表达。利用glutathione-Sepharose fast flow4Bbeads(GE Healthcare)来纯化可溶性的hRANKL223+300M,然后用PreScission protease(GE healthcare)切除GST标签,用分子排阻色谱法(Superdex200)在PBS pH7.4的缓冲条件下进一步纯化,得到人RANKL细胞因子突变体hRANKL223+300M。
2、人RANKL细胞因子突变体hRANKL223+300M治疗大鼠骨质疏松症
用卵巢摘除(OVX)大鼠作为骨质疏松的模型来检验人RANKL细胞因子突变体hRANKL223+300M免疫对于骨质疏松的治疗作用。在卵巢摘除手术和随即进行的蛋白免疫后,用高分辨率的微型计算机断层扫描(micro-CT)来对大鼠的胫骨进行三维重建。具体实验方法如下:
供试药剂:hRANKL223+300M疫苗和人血清白蛋白疫苗。
步骤1的人RANKL细胞因子突变体hRANKL223+300M用PBS(KCl0.2g/L,NaCl8.2g/L,Na2HPO4·12H2O3.6g/L,KH2PO40.245g/L,pH7.4)进行溶解后,与氢氧化铝佐剂按照质量比1:3的配比混合得到hRANKL223+300M疫苗。
人血清白蛋白用PBS(KCl0.2g/L,NaCl8.2g/L,Na2HPO4·12H2O3.6g/L,KH2PO40.245g/L,pH7.4)进行溶解后,与氢氧化铝佐剂按照质量比1:3混合得到人血清白蛋白疫苗。
供试动物:2月龄的雌性Sprague–Dawley(SD)大鼠。
24只SD大鼠等分成三组:阴性对照组,进行卵巢摘除去势手术,在手术后10周后皮下注射免疫人血清白蛋白;阳性对照组(假手术组),进行卵巢摘除假手术,即手术但不摘除卵巢,不进行免疫;治疗组,进行卵巢摘除去势手术,在手术后10周后皮下注射免疫hRANKL223+300M疫苗。阴性对照组和治疗组的每只大鼠每次免疫0.2mg蛋白,每两周免疫一次,总共免疫六次,在第一次免疫的六个月后,处死24只大鼠并收集血清用下述步骤二的Elisa方法进行抗小鼠RANKL细胞因子抗体效价的测定,在血液处理完毕后,分离出大鼠的胫骨并去除上面的软组织进行μ-CT扫描分析。μ-CT扫描分析的方法如下:用Quantum FX microscopyCT(μ-CT)(Perkin Elmer)对大鼠的右腿胫骨近端进行扫描,扫描射线的能量为90kv,0.16mA,扫描在视野10mm下进行(体素大小为20μm,扫描时间为3分钟)。扫描部位从大鼠膝关节胫骨近端开始共扫描512层,数据计算从胫骨生长板消失的那层开始,向远端计算100层。骨形态学测量包括骨矿物密度(BMD,mg/cc)、骨体积密度(Bv/Tv)、骨表面积密度(Bs/Bv,mm-1)、骨小梁厚度(Tb.Th,mm)、骨小梁数量(Tb.N,mm-1)、骨小梁间隙(Tb.Sp,mm)和骨形态参数(Tb.Pf,mm-1)用Inveon research workplace软件进行计算。计算得到的数值用平均值±标准差表示。P值小于0.05被认为有显著差异而当P值小于0.01时认为有非常显著的差异。
图1给出了典型的胫骨近端扫描片层和胫骨近端所感兴趣的空间区域(VOI)的骨小梁结构的三维重建图。与假手术组的大鼠相比,用人血清白蛋白疫苗免疫的OVX大鼠(阴性对照组)松质骨片状结构有更多的孔隙,并且形成松质骨网状结构的小梁越来越细直至消失,导致骨结构连接不良,表明在卵巢摘除后出现了骨质疏松的症状。然而用hRANKL223+300M疫苗免疫的治疗组OVX大鼠的松质骨明显比人血清白蛋白疫苗免疫的OVX大鼠(阴性对照组)的松质骨更厚更密,即使与假手术组的大鼠相比较,也没有表现出任何的骨质丢失。除了可见的特征外,用定量micro-CT分析了胫骨骨松质的骨矿物密度(BMD),即钙羟磷灰石的体积密度。分析结果显示假手术组的BMD值(431.1±104.8mg/cc)和用hRANKL223+300M疫苗免疫的治疗组的BMD值(445.8±156.9mg/cc)明显高于人血清白蛋白疫苗免疫的阴性对照组的BMD值(238.0±139.1mg/cc)(两组数据均P<0.05)(图2中A)。另外,还用定量micro-CT分别计算了测量参数包括骨体积密度(Bv/Tv)即松质骨的体积与整个VOI的体积的比值、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁间隙(Tb.Sp)、骨小梁数量(Tb.N)、骨表面积密度(Bs/Bv)、和骨形态参数(Tb.Pf)(图2中B)。结果表明,在假手术组和人血清白蛋白疫苗免疫的阴性对照组中,尽管所有参数都没有统计学差异,卵巢摘除导致假手术组的Bv/Tv,Tb.Th和Tb.N均高于人血清白蛋白疫苗免疫的阴性对照组。在比较人血清白蛋白疫苗免疫的阴性对照组的OVX大鼠和hRANKL223+300M疫苗免疫的治疗组免疫的大鼠的测量参数,可以看到相似的差异。但是这些差异更显著并具有统计学差异(BS/BV,P<0.05;其他,P<0.01)。这些结果清楚的证明了人RANKL细胞因子突变体hRANKL223+300M(异源动物细胞因子突变体)免疫对于大鼠(受体动物)骨质疏松的治疗作用。
二、人RANKL细胞因子突变体hRANKL223+300M诱导大鼠产生抗小鼠RANKL细胞因子的抗体
1、制备小鼠RANKL细胞因子
用SEQ ID No.5所示的小鼠RANKL细胞因子(mRANKL)基因替换pGEX-6p-1(美国GE Healthcare公司)的SalI和XhoI之间的小片段得到含有小鼠RANKL基因的重组表达载体pGEX-6p-mRANKL。
将pGEX-6p-mRANKL转入大肠杆菌BL21菌株(北京全式金生物技术有限公司),得到含有pGEX-6p-mRANKL的重组大肠杆菌BL21/pGEX-6p-mRANKL。
在表达菌(BL21/pGEX-6p-mRANKL)的生长浓度达到OD600nm=0.6时,用0.5mM的IPTG诱导,并20℃过夜表达。利用glutathione-Sepharose fast flow4B beads(GEHealthcare)来纯化可溶性的mRANKL,然后用PreScission protease(GE healthcare)切除GST标签,用分子排阻色谱法(Superdex200)在PBS pH7.4的缓冲条件下进一步纯化,得到氨基酸序列是SEQ ID No.6的小鼠RANKL细胞因子。
2、按照如下方法检验从步骤一的人血清白蛋白疫苗免疫的阴性对照组大鼠取出的抗血清、hRANKL223+300M疫苗免疫的治疗组大鼠取出的抗血清是否具有抗小鼠RANKL细胞因子的能力。方法如下:其中,Elisa测定抗血清的效价的方法如下:用PBS(KCl0.2g/L,NaCl8.2g/L,Na2HPO4·12H2O3.6g/L,KH2PO40.245g/L,pH7.4)作为包被液,小鼠RANKL细胞因子和作为阴性对照的牛血清白蛋白BSA以1ug/孔的量过夜包被到Elisa板上。从人血清白蛋白疫苗免疫的阴性对照组大鼠取出的抗血清、hRANKL223+300M疫苗免疫的治疗组大鼠取出的抗血清和作为阳性对照的兔抗小鼠RANKL的抗血清分别作为一抗,并以10-3开始10倍稀释直到10-7。每个样品做两个复孔。450nm光吸收值(O.D.450)用来定量抗血清的效价,数据以平均值±标准差来表示。
Elisa分析显示,与阳性对照组即抗小鼠RANKL的抗血清和阴性对照即用人血清白蛋白疫苗免疫的大鼠来源的抗血清相比较,用hRANKL223+300M疫苗免疫的治疗组大鼠来源的抗血清在检测小鼠RANKL细胞因子时有着高效价(图3)。说明人RANKL细胞因子突变体hRANKL223+300M(异源动物细胞因子突变体)诱导大鼠(受体动物)产生抗小鼠RANKL细胞因子的抗体。
三、人RANKL细胞因子与小鼠RANK结合
1、hRANKL158-317及其突变体与mRANK的结合作用
hRANKL158-317的两种单突变体hRANKL223M和hRANKL300M。hRANKL223M的氨基序列是将SEQ ID No.7的第66位的精氨酸残基替换为丙氨酸残基,其它氨基酸残基不变得到的序列。hRANKL300M的氨基序列是将SEQ ID No.7的第143位的天冬氨酸残基替换为丙氨酸残基,其它氨基酸残基不变得到的序列。
小鼠RANK命名为mRANK26-210,其氨基酸序列是SEQ ID No.8。
1)制备hRANKL158-317、hRANKL223M、hRANKL300M和mRANK26-210
用SEQ ID No.9的hRANKL158-317基因替换pGEX-6p-1载体(美国GE Healthcare公司)的BamHI和XhoI之间的小片段,得到含有hRANKL158-317基因的重组表达载体pGEX-6p-hRANKL158-317。用hRANKL223M基因替换pGEX-6p-1载体(美国GEHealthcare公司)的BamHI和XhoI之间的小片段,得到含有hRANKL223M基因的重组表达载体pGEX-6p-hRANKL223M。用hRANKL300M基因替换pGEX-6p-1载体(美国GE Healthcare公司)的BamHI和XhoI之间的小片段,得到含有hRANKL300M基因的重组表达载体pGEX-6p-hRANKL300M的基因。用SEQ ID No.10所示的mRANK26-210的基因替换pET28a载体(美国Novagen公司)的NdeI和XhoI之间的小片段,得到含有mRANK26-210基因的重组表达载体pGEX-6p-mRANK26-210。
hRANKL223M的基因序列是将SEQ ID No.9的第202-204位的“cga”替换为“gca”,其它核苷酸不变得到的序列。hRANKL300M的基因序列是将SEQ ID No.9的第433-435位的“gat”替换为“gcc”,其它核苷酸不变得到的序列。
将pGEX-6p-hRANKL158-317、pGEX-6p-hRANKL223M、pGEX-6p-hRANKL300M和pET28a-mRANK26-210分别单独转入大肠杆菌BL21菌株(北京全式金生物技术有限公司),得到含有pGEX-6p-hRANKL158-317的重组大肠杆菌BL21/pGEX-6p-hRANKL158-317、含有pGEX-6p-hRANKL223M的重组大肠杆菌BL21/pGEX-6p-hRANKL223M、含有pGEX-6p-hRANKL300M的重组大肠杆菌BL21/pGEX-6p-hRANKL300M、含有pET28a-mRANK26-210的重组大肠杆菌BL21/pET28a-mRANK26-210。
在表达菌(BL21/pGEX-6p-hRANKL158-317、BL21/pGEX-6p-hRANKL223M、BL21/pGEX-6p-hRANKL300M)的生长浓度达到OD600nm=0.6时,用0.5mM的IPTG诱导,并20℃过夜表达。利用glutathione-Sepharose fast flow4B beads(GE Healthcare)来纯化可溶性的hRANKL223+300M,然后用PreScission protease(GE healthcare)切除GST标签,用分子排阻色谱法(Superdex200)在PBS pH7.4的缓冲条件下进一步纯化,分别得到hRANKL158-317、hRANKL223M和hRANKL300M。在表达菌(BL21/pET28a-mRANK26-210)的生长浓度达到OD600nm=0.6时,用1mM的IPTG诱导,并37℃过夜表达。利用超声处理获得纯化后的包涵体并且将包涵体重新溶解在6M的盐酸胍中。通过如下步骤实现mRANK26-210的重新折叠:该包涵体稀释在包含20mM的Na2HPO4(pH7.3)、1M L-精氨酸、20%甘油、10mM还原型谷胱苷肽以及1mM氧化型谷胱苷肽的复性溶液中,然后在含有20mM的Na2HPO4(pH7.3)、0.5M L-精氨酸、10%甘油的重新折叠缓冲液1中4℃下透析12小时,然后在含有20mM的Na2HPO4(pH7.3)、0.2M L-精氨酸、5%甘油的重新折叠缓冲液2中4℃下透析12小时,最后在20mM的Na2HPO4(pH7.3)、0.2M L-精氨酸中4℃下透析12小时,在20000g离心10分钟后,将上清液用75(Superdex75)色谱柱(购自Amersham pharmacia公司)进行纯化,并且收集正确折叠的mRANK26-210。
2)Biacore分析
采用表面等离子体共振进行检测,具体方法如下:利用Biacore3000(GE Heathcare)来计算野生型的hRANKL158-317、两种单位点突变体(hRANKL223M和hRANKL300M)和双位点突变体(hRANKL223+300M)与mRANK的结合力。将步骤1纯化的mRANK26-210固定在螯合NTA传感芯片通道1上,再将步骤1纯化的hRANKL158-317、hRANKL223M和hRANKL300M分别以不同的浓度(0,0.47,0.94,1.88,3.75,7.5,15和30nM)注入螯合NTA传感芯片上的通道中,信号以传感图的方式记录。重组肿瘤坏死受体超家族TNFRSF9(Zhang S,Liu C,Huang P,et al.The affinity of human RANKbinding to its ligand RANKL.Arch Biochem Biophys.2009;487:49-53;Liu C,Walter TS,Huang P,et al.Structural and functional insights of RANKL-RANK interaction andsignaling.J Immunol.2010;184:6910-6919)、固定在通道2中用来当做对照。平衡解离常数(KD)用BIAevaluation software4.1来计算。
结果表明与mRANKL157-316结合mRANK26-210的力(Kd=6.8×10-11M)[2]相比,hRANKL158-317与mRANK26-210的结合力(Kd=1.56×10-10M)稍弱(图5)。hRANKL223M和hRANKL300M这两种单突变体与mRANK26-210的结合力明显下降,从Kd值上分析分别下降了20倍和70倍,而hRANKL223+300M双位点突变体在三种突变体中结合mRANK26-210的结合力最低,下降了260倍。因此选择了hRANKL223+300M来检验其生物学性质和功能的改变。
3)RAW264.7细胞的分化实验
细胞实验证实hRANKL222+299M不具有刺激小鼠破骨细胞前体细胞分化成破骨细胞能力
用含有50ng/ml的hRANKL158-317、hRANKL223M、hRANKL300M或hRANKL223+300M的培养液(含有10%的胎牛血清的α-MEM)培养RAW264.7细胞,不含hRANKL158-317及其突变体的培养液培养细胞作为对照,4天后固定细胞并用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)试剂盒(编号387A,美国Sigma公司)染色。标尺:200μm。
结果如图6所示,hRANKL158-317刺激后的RAW264.7细胞已经分化成TRAP染色阳性的、具有大细胞直径(>100μm)、多核的(>3个细胞核)的成熟的破骨细胞(A),而hRANKL300M刺激后的RAW264.7细胞形成的破骨细胞比hRANKL158-317刺激的破骨细胞在成熟程度上要弱很多,另两种蛋白hRANKL223M和hRANKL223+300M刺激后无破骨细胞出现,说明与野生型hRANKL158-317的强烈的刺激破骨细胞成熟的能力相反,用hRANKL223+300M刺激后,没有发现成熟的破骨细胞,这说明hRANKL158-317的突变体hRANKL223+300M不具有刺激小鼠破骨细胞前体细胞分化成破骨细胞能力。
从Biacore分析和RAW264.7细胞的分化实验表明,hRANKL可以结合如mRANK的异源受体,从而刺激非人源破骨细胞的成熟。
实施例2、用小鼠RANKL细胞因子突变体mRANKL222+299M治疗大鼠骨质疏松症和家兔骨质疏松症
一、小鼠RANKL细胞因子突变体mRANKL222+299M治疗大鼠骨质疏松症和家兔骨质疏松症
小鼠RANKL细胞因子突变体mRANKL222+299M的氨基酸序列是SEQ ID No.2。SEQ IDNo.2的第1位对应小鼠RANKL细胞因子的第158位,SEQ ID No.2的第159位对应小鼠RANKL细胞因子的第316位。小鼠RANKL细胞因子突变体mRANKL222+299M将小鼠RANKL细胞因子第222位的精氨酸突变为丙氨酸,第299位的天冬氨酸为丙氨酸。
1、制备小鼠RANKL细胞因子突变体mRANKL222+299M
用SEQ ID No.4所示的小鼠RANKL细胞因子突变体mRANKL222+299M的基因替换pGEX-6p-1载体(美国GE Healthcare公司)的SalI和XhoI之间的小片段得到含有mRANKL222+299M基因的重组表达载体pGEX-6p-mRANKL222+299M。
将pGEX-6p-mRANKL222+299M转入大肠杆菌BL21菌株(北京全式金生物技术有限公司),得到含有pGEX-6p-mRANKL222+299M的重组大肠杆菌BL21/pGEX-6p-mRANKL222+299M。
在表达菌(BL21/pGEX-6p-mRANKL222+299M)的生长浓度达到OD600nm=0.6时,用0.5mM的IPTG诱导,并20℃过夜表达。利用glutathione-Sepharose fast flow4Bbeads(GE Healthcare)来纯化可溶性的mRANKL222+299M,然后用PreScissionprotease(GE healthcare)切除GST标签,用分子排阻色谱法(Superdex200)在PBS pH7.4的缓冲条件下进一步纯化,得到小鼠RANKL细胞因子突变体mRANKL222+299M。
2、小鼠RANKL细胞因子突变体mRANKL222+299M治疗大鼠骨质疏松症和家兔骨质疏松症
具体实验方法如下:
供试药剂:mRANKL222+299M疫苗、人血清白蛋白疫苗、鲑鱼降钙素注射液(密盖息)(Novartis Pharma Schweiz AG,Switzerland)。
步骤1的小鼠RANKL细胞因子突变体mRANKL222+299M用PBS(KCl0.2g/L,NaCl8.2g/L,Na2HPO4·12H2O3.6g/L,KH2PO40.245g/L,pH7.4))进行溶解后,与氢氧化铝佐剂按照质量比1:3混合得到mRANKL222+299M疫苗。
人血清白蛋白用PBS(KCl0.2g/L,NaCl8.2g/L,Na2HPO4·12H2O3.6g/L,KH2PO40.245g/L,pH7.4)进行溶解后,与氢氧化铝佐剂按照质量比1:3混合得到人血清白蛋白疫苗。
供试动物:2月龄的雌性Sprague–Dawley(SD)大鼠和8月龄的雌性新西兰大耳白兔。
32只SD大鼠等分成四组:HSA组(阴性对照组),进行卵巢摘除去势手术,在手术后10周后皮下注射免疫人血清白蛋白疫苗;Sham组(假手术组),进行卵巢摘除假手术,即手术但不摘除卵巢,不进行免疫;M29组(治疗组),进行卵巢摘除去势手术,在手术后10周后皮下注射免疫mRANKL222+299M疫苗;Calcitonin组,进行卵巢摘除去势手术,在手术后10周后皮下注射免疫鲑鱼降钙素注射液。HSA组和M29组的每只大鼠每次免疫0.2mg蛋白,Sham组免疫等体积的PBS,Calcitonin组每只大鼠每次注射0.2mg。每两周免疫一次,总共免疫六次,在第一次免疫的六个月后,处死32只大鼠,分离出大鼠的胫骨并去除上面的软组织按照实施例1的方法进行μ-CT扫描分析。
24只新西兰大耳白兔被均分为三组,Sham组(假手术组)、HSA组(阴性对照组)和M29组(治疗组)。其中,Sham组进行卵巢摘除假手术,即手术但不摘除卵巢,不进行免疫,阴性对照组和治疗组在进行卵巢摘除去势手术后第三天开始每天按0.5mg/kg的量肌肉注射***,六周后停药,并开始免疫治疗,阴性对照组用人血清白蛋白疫苗免疫,治疗组用mRANKL222+299M疫苗免疫,免疫剂量均为每只兔子0.5mg蛋白,每两周皮下注射免疫一次,共免疫六次,第一次免疫六个月后,处死兔子,分离出兔子的胫骨、第三和第四腰椎并去除上面的软组织按照如下方法进行μ-CT扫描分析。
用Quantum FX microscopyCT(μ-CT)(Perkin Elmer)对兔子的右腿胫骨近端、第三和第四腰椎进行扫描,扫描射线的能量为90kv,0.16mA,扫描在视野24mm下进行(体素大小为46.875μm,扫描时间为2分钟)。扫描部位从兔子膝关节胫骨近端开始共扫描512层,数据计算从胫骨生长板消失的那层开始,向远端计算85层。对于脊椎,扫描部位从椎间盘开始向上扫描512层,数据分析从椎间盘上面1mm开始,向上计算85层。骨矿物密度(BMD,mg/cc)用Inveon research workplace软件进行计算。计算得到的数值用平均值±标准差表示。P值小于0.05被认为有显著差异而当P值小于0.01时认为有非常显著的差异。
图4中A和C分别为高分辨率micro-CT对大鼠和家兔的胫骨进行三维重建后获得的所感兴趣的空间区域(VOI)骨小梁结构的三维重建图。结果表明,mRANKL222+299M免疫的OVX大鼠和OVX家兔的松质骨明显比HSA免疫的OVX大鼠和OVX家兔的松质骨更厚更密,即使与假手术组的大鼠和家兔相比较,也没有表现出任何的骨质丢失。mRANKL222+299M免疫的OVX大鼠的松质骨结构甚至要好于市场药物鲑鱼降钙素(密盖息)治疗的OVX大鼠的松质骨结构。定量分析胫骨骨松质的骨矿物密度(BMD)获得了相同的结果:mRANKL222+299M免疫的OVX大鼠和OVX家兔的BMD值要明显高于相应HSA免疫组的BMD值,并且具有统计学差异(图4中B和D)。其值甚至高于阳性对照假手术大鼠和家兔,及鲑鱼降钙素治疗的OVX大鼠的BMD值。这些结果清楚地证明了小鼠RANKL细胞因子突变体mRANKL222+299M(异源动物细胞因子突变体)免疫对于大鼠和家兔(受体动物)骨质疏松的治疗作用。