CN106872616B - 区分大理重楼和云南重楼的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了区分大理重楼和云南重楼的方法，其特征在于：它是采用液相色谱法检测，若检测到含有重楼皂苷VII、H，不含纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷I、II或含量均低于0.010％，则可判定为大理重楼。上述检测方法，简单、准确、分析时间短、稳定性好，可以用于大理重楼与云南重楼的区分。

Description

区分大理重楼和云南重楼的方法

技术领域

本发明涉及中药材检测领域，具体涉及区分大理重楼和云南重楼的方法。

背景技术

《中华人民共和国药典》2015年版一部收载重楼品种为百合科植物云南重楼Parispolyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.或七叶一枝花Parispolyphylla Smith var.chinensis(Franch.)Hara的干燥根茎，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊的功效。现代研究表明，重楼具有抗肿瘤、止血、免疫调节、镇静、镇痛等作用，甾体皂苷成分为发挥作用的主要活性成分。近年来，因重楼市场需求巨大、野生资源濒危及人工繁育技术要求高、栽培周期长等多因素导致重楼价格飙升，从十年前的50元/kg上涨到700～900元/kg。

大理重楼Paris daliensis H.Li et V.G.Souku和独龙重楼Paris dulongensisH.Li et S.Kuritap隶属百合科Liliacceae重楼属Paris，根茎在云南、贵州等各地民间也作为重楼药材使用，味苦，性微寒，有小毒，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效，用于痈疮、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打损伤、凉风抽搐等症。目前尚未收录到2015年版《中国药典》或者各省级药材标准中。由于以云南白药为代表等系列药品对重楼类根茎的需求量日益加大，重楼属很多植物的根茎，包括大理重楼和独龙重楼均作为重楼药材大量被收购，而大理重楼和独龙重楼可否作为重楼药材的来源以及它们的资源储备如何，可否满足市场需求的研究报道很少，因此，很有必要云南重楼的亲缘品种进行基础研究，为药材供应提供依据。

目前还未见可以在大理重楼与云南重楼的混合品中准确区分两者的方法。当然，也未见区分大理重楼和独龙重楼的方法。

发明内容

2015年版《中国药典》中，以重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ和重楼皂苷Ⅶ的质量分数作为评价重楼质量指标，专利申请2016106653439中也记载，云南重楼中主要含有重楼皂苷VII、H、II、I，纤细薯蓣皂苷也会在部分云南重楼中出现，然而，大理重楼却只含重楼皂苷VII和H，不有重楼皂苷II、I和纤细偏诺皂苷。因此，与云南重楼相比，大理重楼所含化学成分中主要有重楼皂苷VII和H，而不含有重楼皂苷II、I和纤细偏诺皂苷，因此，可以通过上述成分将大理重楼与云南重楼鉴别分开。

具体地，本发明提供了区分大理重楼和云南重楼的方法，它是采用液相色谱法检测，若检测到含有重楼皂苷VII、H，不含纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷I、II或含量均低于0.010％，则可判定为大理重楼，即可以在大理重楼和云南重楼的混合品中，通过上述方法鉴定出大理重楼，达到区分的效果。

进一步地，其中，重楼皂苷VII的含量在0.3％以上；重楼皂苷H的含量在0.3％以上。

进一步地，其中，不含重楼皂苷VI或者重楼皂苷VI的含量低于0.02％。

进一步地，其中，重楼皂苷VII、VI、II和I的总含量在0.3％以上；重楼皂苷VII、VI、II、I、H和纤细薯蓣皂苷的总含量在1.4％以上。

其中，所述液相色谱法选自UPLC，本发明色谱条件可以采用已知方法进行检测，如专利申请2016106653439，也可以按照本发明下述条件进行：所述UPLC的具体操作如下：

(1)取干燥的待检样品，粉碎，以醇类溶剂或含水醇类溶剂提取，合并提取液，除去溶剂后所剩残渣用甲醇、含水甲醇、乙腈或含水乙腈复溶，制备供试品溶液；

(2)取重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、H、纤细薯蓣皂苷的混合物，制备对照品溶液；

(3)将供试品溶液、对照品溶液分别注入超高效液相色谱仪中，采用外标法检测即可；其中，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料，

ELSD检测器条件：漂移管温度55±2℃，氮气压力40±2psi；

流动相：乙腈(A)-水(B)***，其梯度程序如下：

0～1min，(5％或10％)～(25％或30％)A；1～(2.5或3)min，(25％或30％)～30％A；(2.5或3)～4min，30％～(35％或40％)A；4～(6或8)min，(35％或40％)～40％A；(6或8)～20min，40％～50％A；20～22min，50％～70％A；22-23min，70％～90％A。

其中，步骤(1)中，醇类溶剂选自甲醇、乙醇或丙醇，含水醇类溶剂选自含水甲醇、含水乙醇或含水丙醇；步骤(2)中，对照品溶液的溶剂选自甲醇、含水甲醇、乙腈或含水乙腈。

其中，步骤(3)中，所述色谱柱尺寸型号等应满足UPLC的要求，本发明一个具体实施方式中，色谱柱尺寸为2.1×50mm，填料的粒径为1.8μm。

其中，流动相流速0.1～0.3mL·min^-1；柱温40±2℃。当然，在梯度洗脱条件确定的情况下，适当变更流速和柱温，同样可以获得满意的测定结果，但各峰的保留时间会相应改变，可以通过对照品色谱峰进行确定。

其中，流动相梯度为：

0～1min，10％～30％A；1～3min，30％～30％A；3～4min，30％～40％A；4～8min，40％～40％A；8～20min，40％～50％A；20～22min，50％～70％A；22～23min，70％～90％A。

本发明还提供了区分大理重楼和独龙重楼的方法，它是采用液相色谱法检测，若检测到含有重楼皂苷VII、H，不含纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷I、II或含量均低于0.010％，则可判定为大理重楼；若检测到含有纤细薯蓣皂苷，不含重楼皂苷VII、H、VI或含量均低于0.010％，则可判定为独龙重楼。即可以在大理重楼和独龙重楼的混合品中，将大理重楼和独龙重楼准确区分。

该检测方法中亦可以采用上述UPLC方法及色谱条件。

其中，“复溶”中所用的溶剂可以选自甲醇、含水甲醇、乙腈或含水乙腈。本发明一个具体实施方式中使用甲醇作为溶剂。但是，流动相对待检目标成分同样应具有良好的溶解性能，因此，在实际使用过程中，同样可以使用流动相溶剂——乙腈或含水乙腈进行复溶。

其中，提取方式选自超声、浸渍、渗漉或回流。本发明一个具体实施方式中，选用超声作为提取方式。当然，本发明无论选择何种提取方式，都是以尽量不影响待测样品中目标成分的检测准确度为前提，在实际操作过程中，可以通过本发明相同的检测方法来对提取方式进行筛查，其筛查实验即为普通的验证实验，无需付出创造性劳动。

本发明一个具体实施方式中，步骤(1)中，采用减压蒸发的方式除去溶剂。其中，“减压蒸发”的使用，也是基于尽量不影响待测样品中目标成分的检测准确度为目的，当然，除了这种方法，还可以使用其他的溶剂去除手段，如自然蒸发、低温加热蒸发等。即，除去溶剂的方式为本领域常规的操作手段，可根据实际情况进行选择，不应限于“减压蒸发”。

附图说明

图1混合对照品色谱图，1.重楼皂苷Ⅶ；2.重楼皂苷H；3.重楼皂苷Ⅵ；4.重楼皂苷Ⅱ；5.纤细薯蓣皂苷；6.重楼皂苷Ⅰ

图2大理重楼色谱图，1.重楼皂苷Ⅶ；2.重楼皂苷H；3.重楼皂苷Ⅵ

图3独龙重楼色谱图，1.纤细薯蓣皂苷；2.重楼皂苷Ⅰ

图4大理重楼UPLC色谱图，1.重楼皂苷VII；2.重楼皂苷H

图5独龙重楼UPLC色谱图，1.重楼皂苷II；2.纤细薯蓣皂苷；3.重楼皂苷I

具体实施方式

除非本文中另外定义，否则结合本发明使用的科技术语应具有一般技术者通常理解的含义。术语的含义及范畴应为明确的；然而，若存在任何潜在含糊性，则本文所提供的定义优先于任何词典或外来定义。

实施例1

仪器与材料

1.1仪器

METTLER AE240电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；KQ-5200E型超声波清洗器(40kHz、250W，昆山超声仪器有限公司)；BP211D型电子天平(德国Sartorius公司)；Waters AcquityH-Class超高效液相色谱仪(美国Waters公司)。

1.2材料与试剂

水(屈臣氏蒸馏水)；甲醇(成都市科龙化工试剂厂分析纯)；HPLC级乙腈(美国Sigma公司)。

化合物1：重楼皂苷Ⅶ(批号：MUST-14060302，Purity：99.03％)、化合物4：重楼皂苷Ⅵ(批号：MUST-14071904，Purity：98.67％)、化合物5：重楼皂苷Ⅱ(批号：MUST-15060810，Purity：98.45％)、化合物6：纤细薯蓣皂苷(批号：MUST-15081110，Purity：98.86％)、化合物7：重楼皂苷Ⅰ(批号：MUST-15061611，Purity：98.34％)均购自成都曼思特生物科技有限公司；化合物2(偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→3)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷)及化合物3(重楼皂苷H)为四川大学华西药学院张浩教授课题组分离所得，HPLC检测纯度均≥98％。

大理重楼和独龙重楼由西南民族大学民族医药研究院刘圆教授、四川大学华西药学院张浩教授鉴定，原植物标本及药材样品保存在西南民族大学、四川大学华西药学院。样品信息见表1。

表1

2试验方法

2.1色谱条件

ACQUITY BEH C18色谱柱(2.1mm×50mm，1.7μm)；ELSD检测器漂移管温度55℃，氮气压力40psi，增益500，冷却模式；柱温40℃；流速0.2mL·min^-1；进样量：1μL；流动相为乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱程序为：0-1min 10％-30％A；1-3min，30％-30％A；3-4min，30％-40％A；4-8min，40％-40％A；8-20min，40％A-50％A；20-22min，50％A-70％A；22-23min，70％A-90％A。混合对照品、样品见图1、2、3。

2.2对照品溶液的制备

分别精密称取重楼皂苷VII 2.060mg、重楼皂苷H 2.100mg、重楼皂苷VI 2.060mg、重楼皂苷II 2.080mg、纤细薯蓣皂苷2.040mg、重楼皂苷I 2.020mg，分别加甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中，经0.22μm微孔滤膜过滤，备用。化合物2为四川大学华西药学院张浩老师课题组自制，数量不足够用于定量分析，只能用于定性分析。

2.3供试品溶液的制备

干燥后的药材打粉机打粉，过40目筛，取药材粉0.5g，精密称量，置于100mL锥形瓶中，按料液比1:100(g:mL)加入甲醇，摇匀，静置4h后，超声30min，过滤，取滤液置于烧瓶，重复上述操作2次。合并滤液，减压回收溶液，残渣加甲醇溶解并定容至25mL容量瓶中，置于4℃冰箱保存，备用。0.22μm滤膜过滤(进样前)，备用。

2.4方法学考察

2.4.1线性关系的考察

精密吸取“2.2”项下对照品溶液适量均稀释到2mL，制成不同稀释倍数的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定。以峰面积为纵坐标(Y)，进样量(μg)为横坐标(X)，绘制外标法标准曲线，结果见表2。

表2对照品的线性回归方程

2.4.2精密度试验

取S3批次供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录重楼皂苷VII、重楼皂苷H、重楼皂苷VI、重楼皂苷II、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷I、重楼皂苷V峰的相对保留时间和相对峰面积。结果得到重楼皂苷VII、VI、II、纤细薯蓣皂苷、I峰面积的RSD分别为1.25％、1.33％、1.89％、1.67％、1.99％，均小于3％，表明仪器精密度良好。

2.4.3重复性试验

取S3批次供试品溶液，按“2.3”项下平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录重楼皂苷VII、重楼皂苷H、重楼皂苷VI、重楼皂苷II、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷I、重楼皂苷V峰的相对保留时间和相对峰面积。结果得到重楼皂苷VII、VI、II、纤细薯蓣皂苷、I峰面积的RSD分别为1.26％、1.21％、1.83％、1.27％、1.55％，均小于3％，表明方法重复性良好。

2.4.4稳定性试验

取S3批次供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24h进样测定，记录重楼皂苷VII、重楼皂苷H、重楼皂苷VI、重楼皂苷II、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷I、重楼皂苷V峰的相对保留时间和相对峰面积。结果得到重楼皂苷VII、VI、II、纤细薯蓣皂苷、I峰面积的RSD分别为1.15％、1.78％、1.81％、1.07％、1.79％，均小于3％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.4.5加样回收试验

取S3批次已知含量的重楼药材样品5份，分别加精密称量加入重楼皂苷VII、VI、II、纤细薯蓣皂苷、I对照品，按“2.3”项下步骤操作制样，定容，测定，计算回收率。重楼皂苷VII、VI、II、纤细薯蓣皂苷、I平均加样回收率分别为：98.92％、99.44％、102.13％、98.44％、99.21％，RSD为1.86％、1.54％、1.48％、1.92％、1.83％。

3结果与分析

精密吸取“2.3”项下制得供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算样品中重楼皂苷含量，大理重楼皂苷含量结果见表2、独龙重楼皂苷含量结果见表3。其大理重楼色谱图见4、独龙重楼色谱图见5。

表3 10批大理重楼样品中6个甾体皂苷含量(％)

注：“—”表示无

表4 7批独龙重楼样品中6个甾体皂苷含量(％)

注：“—”表示无

现代药理研究中表明重楼甾体皂苷是重楼发挥药理功效最主要的活性成分，甾体皂苷的结构相似，在紫外光谱上属于末端吸收，灵敏度相对较小。蒸发光散射检测器(ELSD)是上世纪90年代开始应用的一种新型通用性质量检测器，其对无紫外吸收的化合物在ELSD能产生响应信号，具有稳定灵敏、可梯度洗脱分析等优点。本试验采用超高效液相色谱结合蒸发光散射检测器(UPLC-ELSD)检测技术对大理重楼和独龙重楼药材中6个甾体皂苷进行了分析。结果表明，在24min内可将6种重楼皂苷分离，此方法极大地缩短了重楼类药材分离分析的时间，方法的精密度、稳定性、重复性和加样回收试验等均表明所建方法稳定可靠。

大理重楼属于极度濒危重楼品种，历版《中国药典》均以重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ和重楼皂苷Ⅶ的质量分数总量作为评价重楼质量指标，总量≧0.6％为合格。试验结果表明：(1)10批大理重楼的药典规定的重楼皂苷含量平均值为1.2153％，除S7批次，其他批次大理重楼均达到药典规定的标准；(2)大理重楼主要含有重楼皂苷Ⅶ和重楼皂苷H；10个批次只有S10批次中检查到微量的重楼皂苷Ⅵ，没有检测到重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ和纤细偏诺皂苷；(3)本次试验结果与课题组前期大理重楼的含量结果基本一致。

独龙重楼只分布在怒江州独龙江乡，其资源蕴藏量比大理重楼更加稀少。本次专程野外赴怒江州独龙江乡开展资源采集工作，但是只采集到了7份样品。试验结果表明：(1)在7批独龙重楼中，重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ和重楼皂苷Ⅶ的质量分数平均值为0.6872％，且只有S13、S14、S17批次达到药典规定的皂苷含量的标准；(2)独龙重楼均含有重楼皂苷Ⅰ和纤细偏诺皂苷，S17批次含有重楼皂苷Ⅱ，7个批次均不含重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ和重楼皂苷H。

而专利申请2016106653439中记载，云南重楼中主要含有重楼皂苷VII、H、II、I，而纤细薯蓣皂苷并不是云南重楼中必然存在的成分，23批药材中仅有6批含有，且含量都在0.5或更低。因此，与云南重楼相比，独龙重楼所含化学成分中主要有重楼皂苷Ⅰ和纤细薯蓣皂苷，而不含有重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ和重楼皂苷H，同时，大理重楼和七叶一枝花也不具备独龙重楼的上述特征，因此，可以通过上述成分将云南重楼和独龙重楼鉴别分开。

附：七叶一枝花的含量检测

色谱条件

HSS C18色谱柱(2.1mm×75mm，1.7μm)；ELSD检测器漂移管温度55℃，氮气压力40psi，增益500，冷却模式；柱温40℃；流速0.2mL·min^-1；进样量：2μL；流动相为乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱程序见表5。

表5梯度洗脱程序

表6七叶一枝花中各成分含量

Claims (9)

1.区分大理重楼和云南重楼的方法，其特征在于：它是采用液相色谱法检测，若检测到含有重楼皂苷VII、H，不含纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷I、II或含量均低于0.010％，则可判定为大理重楼；

所述液相色谱法选自UPLC，UPLC的具体操作如下：

(1)取干燥的待检样品，粉碎，以醇类溶剂或含水醇类溶剂提取，合并提取液，除去溶剂后所剩残渣用甲醇、含水甲醇、乙腈或含水乙腈复溶，制备供试品溶液；

(2)取重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、H、纤细薯蓣皂苷的混合物，制备对照品溶液；

(3)将供试品溶液、对照品溶液分别注入超高效液相色谱仪中，采用外标法检测即可；其中，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料，

ELSD检测器条件：漂移管温度55±2℃，氮气压力40±2psi；

流动相：乙腈A-水B***，其梯度程序如下：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：大理重楼中，重楼皂苷VII的含量在0.3％以上，重楼皂苷H的含量在0.3％以上。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：大理重楼中，不含重楼皂苷VI或者重楼皂苷VI的含量低于0.02％。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：大理重楼中，重楼皂苷VII、VI、II和I的总含量在0.3％以上；重楼皂苷VII、VI、II、I、H和纤细薯蓣皂苷的总含量在1.4％以上。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，醇类溶剂选自甲醇、乙醇或丙醇，含水醇类溶剂选自含水甲醇、含水乙醇或含水丙醇；步骤(2)中，对照品溶液的溶剂选自甲醇、含水甲醇、乙腈或含水乙腈。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述色谱柱尺寸为2.1×50mm，填料的粒径为1.8μm。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：流动相流速0.1～0.3mL·min^-1；柱温40±2℃。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：流动相梯度为：

9.区分大理重楼和独龙重楼的方法，其特征在于：它是采用液相色谱法检测，若检测到含有重楼皂苷VII、H，不含纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷I、II或含量均低于0.010％，则可判定为大理重楼；若检测到含有纤细薯蓣皂苷，不含重楼皂苷VII、H、VI或含量均低于0.010％，则可判定为独龙重楼；

所述液相色谱法选自UPLC，UPLC的具体操作如下：

(1)取干燥的待检样品，粉碎，以醇类溶剂或含水醇类溶剂提取，合并提取液，除去溶剂后所剩残渣用甲醇、含水甲醇、乙腈或含水乙腈复溶，制备供试品溶液；

(2)取重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、H、纤细薯蓣皂苷的混合物，制备对照品溶液；

(3)将供试品溶液、对照品溶液分别注入超高效液相色谱仪中，采用外标法检测即可；其中，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料，

ELSD检测器条件：漂移管温度55±2℃，氮气压力40±2psi；

流动相：乙腈A-水B***，其梯度程序如下：