CN111624271B - 检测芍药甘草汤对应实物的液相色谱方法、标准指纹图谱和应用 - Google Patents

检测芍药甘草汤对应实物的液相色谱方法、标准指纹图谱和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及检测芍药甘草汤对应实物的液相色谱方法、标准指纹图谱和应用。所述方法采用配备有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，色谱条件如下：流动相：乙腈(A)‑0.05％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱0‑1min 14‑17.5％A,1‑5min 17.5‑19％A,5‑6min 19‑20％A,6‑7min 20％A,7‑8min 20‑20.5％A,8‑12min 20.5‑23％A,12‑30min 23‑36％A,30‑32min 36％A,32‑45min 36‑43％A；色谱柱：Venusil XBP C18 4.6*150mm,3μm；检测波长230‑240nm；流速：1.0ml/min；柱温20‑30℃。所得芍药甘草汤对应实物标准指纹图谱可以用于进行芍药甘草汤对应实物的质量控制。

Description

检测芍药甘草汤对应实物的液相色谱方法、标准指纹图谱和 应用
技术领域
本发明属于中药分析领域，涉及一种检测芍药甘草汤对应实物的液相色谱方法、包含该方法的建立标准指纹图谱的方法、芍药甘草汤对应实物标准指纹图谱和应用。
背景技术
芍药甘草汤对应实物按照处方由中药饮片加水煎煮后冻干制得，中药饮片为白芍、炙甘草。
《中国药典》是我国药品质量标准的法典，检验、判定药品合格与否的法定依据。现行版本是2015版，芍药甘草汤中2味中药饮片均被收载，药典中对于处方饮片的主要化学成分控制对于研究芍药甘草汤对应实物关键质量属性有重要意义。白芍、炙甘草的主要含量测定指标及其限度要求见表1。
表1单味饮片药典含量测定
Figure BDA0002532560460000011
近年，随着监管部门对药品质控提出更高要求，要求生产厂家严格控制产品批间稳定性，因此采用有效的质量控制方法尤为重要。
中药指纹图谱技术因可全面标示中药主要化学成分的特性及其比例的特点，越来越多用于中药的质量控制。色谱法是分析化学领域中发展较快，应用较广泛的分析方法之一，也是中药指纹图谱最基本的技术。常用的色谱法有薄层色谱法、液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法，其中高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)具有应用范围广、分析速度快、灵敏度高等优点，是目前研究中药指纹图谱应用最广泛的方法。蒸发光散射检测器(Evaporative Light Scattering Detector，ELSD)是一种通用型质量检测器，可弥补在HPLC中应用最广的紫外检测器对检测物质必须具有吸收紫外光的生色团的要求。ELSD作为一种浓度型检测器，在无紫外或紫外末端吸收的未知化合物的纯度检测过程中，显示出极大的优越性。
芍药甘草汤成方的主要成分包括芍药苷、甘草苷和甘草酸。目前还没有关于检测芍药甘草汤对应实物的液相色谱方法，建立芍药甘草汤标准指纹图谱的方法以及采用其进行质量控制的研究。
发明内容
为了更全面有效控制芍药甘草汤对应实物的质量，本发明人经仔细研究采用HPLC法并对流动相、检测波长、色谱柱、梯度条件、流速和进样量等条件进行研究，得到了一种检测芍药甘草汤对应实物的液相色谱方法，同时通过对提取溶液、提取方式、超声时间、溶剂量等进行研究得到了制备供试品溶液的方法，并由此得到了建立芍药甘草汤对应实物标准指纹图谱的方法和芍药甘草汤对应实物标准指纹图谱，其可以用于进行芍药甘草汤对应实物的质量控制，由此完成了本发明。
本发明一方面提供了一种检测芍药甘草汤对应实物的液相色谱方法，所述方法采用配备有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，色谱条件如下：
色谱柱：Venusil XBP C18 4.6*150mm,3μm；
流动相：乙腈(A)-0.05％磷酸水溶液(B)，
梯度洗脱：按下表中的规定进行
Figure BDA0002532560460000021
流速：1.0ml/min；
柱温：20-30℃，优选25℃；
检测波长：230-240nm，优选235nm。
本发明中，流动相和梯度洗脱中的百分数为体积百分数，例如，0.05％指的是0.05体积％。
特别地，上述色谱柱的理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000。
在检测芍药甘草汤的液相色谱方法中，用于进行检测的芍药甘草汤供试品溶液可以如下配制：将芍药甘草汤对应实物以100～500倍的液固比(体积/质量,ml/g)用70％甲醇提取。提取方式可以为超声处理、振摇提取、回流提取等，优选为超声提取。
特别地，芍药甘草汤供试品溶液可以如下配制：取芍药甘草汤对应实物约0.1g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声处理(250W，40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过,即得。此时，进样量优选为5μl。
在本发明中，芍药甘草汤对应实物指的是按照芍药甘草汤经典名方取白芍和炙甘草中药饮片进行水提所制得的水提物。在实施方式中，芍药甘草汤对应实物可以如下制备：按处方取白芍和炙甘草，加水煎煮(例如以重量比1:1取白芍和炙甘草，以固液比例如为1:5-1:25的质量/体积比，单位g/ml，加水煎煮60分钟)后趁热以200目筛过滤，得药液，干燥(例如冷冻干燥)后得芍药甘草汤干粉，即芍药甘草汤对应实物。这里的处方指的是经典名方中的芍药甘草汤处方，其中白芍和炙甘草的重量比为约1:1。
白芍水提物可以如下制备：取白芍，加水煎煮(例如以固液比为1:10-1:50的质量/体积比，单位g/ml，加水煎煮60分钟)后趁热以200目筛过滤，得药液，干燥后得白芍干粉，即白芍水提物。
炙甘草水提物可以如下制备：取炙甘草，加水煎煮(例如以固液比为1:10-1:50的质量/体积比，单位g/ml，加水煎煮60分钟)后趁热以200目筛过滤，得药液，干燥后得炙甘草干粉，即炙甘草水提物。本发明另一方面提供了一种建立芍药甘草汤对应实物标准指纹图谱的方法，所述方法包括：
(1)供试品溶液配制：
取芍药甘草汤对应实物约0.1g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，在250W，40kHz下超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得；
(2)对照品溶液配制：
取芍药苷、甘草苷、甘草酸铵对照品各适量，精密称定，加70％甲醇制成混合对照品溶液；另取异甘草苷、异甘草素、异甘草苷芹糖、新甘草苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷、没食子酸、儿茶素对照品各适量，精密称定，加70％甲醇制成单个对照品溶液；例如浓度分别为0.1mg/ml的溶液；
(3)单味药溶液配制：
分别取白芍水提物约0.1g、炙甘草水提物约0.1g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，同“供试品溶液配制”制备各阴性样品溶液；
(4)HPLC检测
分别精密吸取上述(1)、(2)和(3)的供试品溶液、对照品溶液和阴性样品溶液各1-5μl，用根据本发明的检测芍药甘草汤对应实物的液相色谱方法检测得到供试品指纹色谱图和对照品指纹色谱图；
(5)生成标准指纹图谱
基于N批供试品的指纹色谱图中的共有峰生成标准指纹图谱，其中，选择芍药甘草汤中主要成分且分离度较好的色谱峰作为特征峰并确定为共有峰，所述N为10以上，优选为10-20；
(6)共有峰的鉴定及归属
对芍药甘草汤对应实物指纹图谱中的共有峰进行归属及鉴定。
在上述方法中，对于基于供试品指纹色谱图生成标准指纹图谱的方法没有特别限定，可以采用本领域中的常规方法。例如，可以通过将测定的芍药甘草汤供试品色谱图导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价***”(2012版)，将供试品色谱图之一设置为参照图谱，标准图谱生成方法例如为中位数法，同时采用例如多点校正法来建立芍药甘草汤标准指纹图谱。
在上述方法中，共有峰的鉴定及归属可以通过采用阴性样品对照、单味药材及对照品溶液的色谱图的比对完成。
在根据本发明的建立芍药甘草汤对应实物标准指纹图谱的方法中，采用符合中国药典质量要求的中药饮片进行制备“芍药甘草汤对应实物”。为了具备代表性，芍药甘草汤对应实物应当采用不同产地的中药饮片分别投料制备。一般而言，供试品数目N可以为10个以上，例如15个，上限例如是30个以下，20个以下等，优选为10-20。
本发明另一方面提供了一种芍药甘草汤对应实物标准指纹图谱，其包括13个特征峰，其中，以6号峰为参照，各峰的相对保留时间如下：
Figure BDA0002532560460000041
经比对，13个特征峰中，峰1、2、5、6、8、9、10、12、13来自于甘草，峰2、3、4、7、11来自于白芍，3号峰为芍药内酯苷，4号峰为芍药苷，5号峰为新甘草苷，6号峰为甘草苷，8号峰为异甘草苷芹糖，9号峰为异甘草苷，11号峰为苯甲酰芍药苷；13号峰为甘草酸。
在实施方式中，上述芍药甘草汤对应实物标准指纹图谱采用根据本发明的建立芍药甘草汤对应实物标准指纹图谱的方法得到。
在实施方式中，根据本发明的芍药甘草汤对应实物标准指纹图谱大体上如图23所示。
本发明再一方面提供了一种芍药甘草汤对应实物指纹图谱的测定方法，其包括：
(1)供试品溶液配制：
取芍药甘草汤对应实物约0.1g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，在250W，40kHz下超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得；
(2)色谱条件：
采用根据本发明的检测芍药甘草汤对应实物的液相色谱方法中的色谱条件；
(3)测定：
精密吸取上述(1)的供试品溶液5μl，注入液相色谱仪，测定，得到芍药甘草汤对应实物的指纹图谱。
另一方面，本发明提供了一种芍药甘草汤对应实物的质量控制方法，该方法包括以下步骤：
(1)供试品溶液配制：
取待检芍药甘草汤对应实物0.1g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，在250W，40kHz下超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得；
(2)色谱条件：
采用权利要求1中所述的色谱条件；
(3)测定：
精密吸取上述(1)溶液5μl，注入液相色谱仪，测定，得到待检芍药甘草汤对应实物指纹图谱；
(4)合格判定：
计算待检芍药甘草汤对应实物指纹图谱与标准图谱之间的相似度，相似度大于等于0.8即为合格产品。
所述相似度可以通过将待检芍药甘草汤对应实物的指纹图谱和芍药甘草汤对应实物标准指纹图谱导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价***”进行比较，来计算样品图谱与标准图谱之间的相似度，相似度大于等于0.8，优选大于0.9即为合格产品，否则即为不合格产品。
本发明再一方面提供了一种检测芍药甘草汤对应实物中有效成分含量的方法，其包括：
(1)供试品溶液配制：
取芍药甘草汤对应实物约0.1g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，在250W，40kHz下超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过,即得；
(2)对照品溶液配制：
取芍药苷对照品、甘草苷对照品和甘草酸铵对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成l ml中约含芍药苷0.18mg、甘草苷0.03mg和甘草酸0.03mg的混合溶液；
(3)HPLC检测
将分别精密吸取上述(1)和(2)的供试品溶液和对照品溶液各5μl，用根据本发明的检测芍药甘草汤对应实物的液相色谱方法检测得到供试品指纹图谱；
(4)含量计算
按照下式计算芍药苷、甘草苷和甘草酸的含量：
含量
Figure BDA0002532560460000061
C对—对照品浓度；V对—对照品进样体积，；A对—对照品峰面积；A供—供试品峰面积；m供—供试品取样量。
如实验结果所证实的，根据本发明的检测芍药甘草汤指纹图谱的方法，所得到的色谱图中，峰数量较多，灵敏高，基线平稳、噪音小，响应敏锐，响应值大，分离度好。此外，空白溶剂对供试品溶液的测试不存在干扰，专属性良好。方法的精密度、稳定性和重现性良好。
在上文中已经详细地描述了本发明，但是上述实施方式本质上仅是例示性，且并不欲限制本发明。此外，本文并不受前述现有技术或发明内容或以下实施例中所描述的任何理论的限制。
除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值范围包括其中的任何子范围和以其中给定值的最小子单位递增的任何数值。除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值表示对包括与给定值的微小偏差以及具有大约所提及的值以及具有所提及的精确值的实施方案的范围的近似度量或限制。除了在详细描述最后提供的工作实施例之外，本申请文件(包括所附权利要求)中的参数(例如，数量或条件)的所有数值在所有情况下都应被理解为被术语“大约”修饰，不管“大约”是否实际出现在该数值之前。“大约”表示所述的数值允许稍微不精确(在该值上有一些接近精确；大约或合理地接近该值；近似)。如果“大约”提供的不精确性在本领域中没有以这个普通含义来理解，则本文所用的“大约”至少表示可以通过测量和使用这些参数的普通方法产生的变化。例如，“大约”可以包括小于或等于10％，小于或等于5％，小于或等于4％，小于或等于3％，小于或等于2％，小于或等于1％或者小于或等于0.1％的变化，并且在某些方面，小于或等于0.01％的变化。
本发明可以通过许多不同形式的实施方式来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施方式。在不偏离本发明的技术思想和技术实质的范围的情况下可以对本发明的技术方案进行各种各样的修改、变化或替换，这些经修改、变化或替换的技术方案仍然包括在本发明的范围内。
将理解的是，说明书和权利要求书中使用的词或术语不应解释为常用词典中定义的含义。将进一步理解的是，基于发明人可以适当地定义词语或术语的含义以最好地解释本发明的原则，这些词语或术语应当被解释为具有与其在相关领域的语境中和本发明的技术思想中的含义一致的含义。
附图说明
图1显示使用甲醇-0.05％磷酸水溶液作为流动相检测的液相色谱图，A对照品，B样品；1芍药苷，2甘草苷，3甘草酸。
图2显示使用乙腈-0.05％磷酸水溶液作为流动相检测的液相色谱图，A对照品，B样品；1芍药苷，2甘草苷，3甘草酸。
图3显示使用乙腈-水作为流动相检测的液相色谱图，A对照品，B样品；1芍药苷，2甘草苷，3甘草酸。
图4显示使用甲醇-水作为流动相检测的液相色谱图，A对照品，B样品；1芍药苷，2甘草苷，3甘草酸。
图5显示使用甲醇-0.1％甲酸作为流动相检测的液相色谱图，A对照品，B样品；1芍药苷，2甘草苷，3甘草酸。
图6显示使用乙腈-0.1％甲酸作为流动相检测的液相色谱图，A对照品，B样品；1芍药苷，2甘草苷，3甘草酸。
图7显示在199nm下检测的对照品液相色谱图。
图8显示在220-250nm下检测的对照品液相色谱图，A 220nm，B 230nm，C 240nm，D250nm；1芍药苷，2甘草苷，3甘草酸。
图9显示在230-240nm下检测的对照品液相色谱图，A 230nm，B 231nm，C 232nm，D233nm，E 234nm，F 235nm，G 236nm，H 237nm；1芍药苷，2甘草苷，3甘草酸。
图10显示在不同温度下检测的对照品液相色谱图，A 20℃，B25℃，C30℃，D35℃；1芍药苷，2甘草苷，3甘草酸。
图11显示在不同温度下检测的样品液相色谱图，A 20℃，B25℃，C30℃，D35℃；1芍药苷，2甘草苷，3甘草酸。
图12显示梯度考察a-8的样品液相色谱图。
图13显示使用不同色谱柱检测的样品液相色谱图，A.Ultimare AQ-C18 4.6*150mm,5μm；B.Thermo BDS Hypersil C18 4.6*150mm,5μm；C.Venusil XBP C18 4.6*150mm,3μm；1.芍药苷；2.甘草苷。
图14显示梯度考察b-3的样品液相色谱图，1芍药苷，2甘草苷，3甘草酸。
图15显示梯度考察b-5的样品液相色谱图，1芍药苷，2甘草苷，3甘草酸。
图16显示流速考察的样品液相色谱图，A.0.8ml/min；B.1.0ml/min；C.1.2ml/min；1.芍药苷；2.甘草苷；3.甘草酸。
图17显示进样量考察的样品液相色谱图，A.5μl；B.10μl；C.15μl；D.20μl；1.芍药苷；2.甘草苷；3.甘草酸。
图18显示梯度考察的样品液相色谱图，A c-1；B c-2；C c-3；1.芍药苷；2.甘草苷；3.甘草酸。
图19显示专属性实验色谱图，A.对照品溶液；B.供试品溶液；C.炙甘草阴性溶液；D.白芍阴性溶液；E.空白溶液；1.芍药苷；2.甘草苷；3.甘草酸。
图20显示白芍对照色谱图，A-芍药甘草汤供试品，B-白芍阴性，C-混合对照品，D-芍药内酯苷，E-苯甲酰芍药苷，F-氧化芍药苷，G-没食子酸，H-儿茶素；1.芍药苷；2.甘草苷；3.甘草酸。
图21显示炙甘草对照色谱图，A-芍药甘草汤供试品，B-炙甘草阴性，C-混合对照品，D-异甘草苷，E-新甘草苷，F-异甘草苷芹糖，G-异甘草素。
图22显示采用根据本发明方法得到的15批对应实物的HPLC指纹图谱。
图23显示采用根据本发明方法得到的标准指纹图谱。
具体实施方式
以下结合技术方案和附图详细说明本发明，但本发明不限于此。
1芍药甘草汤对应实物制备
处方组成：白芍55.20g，炙甘草55.20g
取上述处方量饮片于2L煎药壶中，加水600ml，煎煮60分钟，趁热过滤(200目)，得药液，经干燥，得芍药甘草汤干粉，即芍药甘草汤对应实物，棕黄色至棕褐色粉末,自封袋密封，置干燥柜保存。
芍药苷、甘草苷、甘草酸铵、没食子酸、儿茶素均购于中国食品药品检定研究院；异甘草苷、异甘草素、异甘草苷芹糖、新甘草苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷购于上海鸿永生物科技有限公司。
使用下列设备。
Figure BDA0002532560460000081
2液相条件考察
溶液配制
供试品溶液的制备：取芍药甘草汤冻干粉约0.5g，精密成定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟(250W，40KHz)，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
对照品溶液：取芍药苷、甘草苷、甘草酸铵(甘草酸重量＝甘草酸铵重量/1.0207)对照品适量，用70％甲醇溶液配制成每ml约含芍药苷0.18mg、甘草苷0.03mg、甘草酸0.03mg的混合对照品溶液。
2.1流动相***考察
考察乙腈(A)-0.05％磷酸水溶液(B)，乙腈(A)-水(B)，乙腈(A)-0.1％甲酸水溶液(B)，甲醇(A)-0.05％磷酸水溶液(B)，甲醇(A)-水(B)，甲醇(A)-0.1％甲酸水溶液(B)这6种流动相对样品的分析情况。
液相色谱条件：梯度洗脱：0-8min 19％A，8-35min 19-50％A，35-36min 50-100％A；色谱柱：依利特Hypersil ODS 250×4.6mm，5μm，检测波长237nm，流速：1.0ml/min，柱温30℃。
分别采用上述流动相，进样对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，结果见图1-6。
从图3-4可以看出，当水相为纯水时，不管有机相为甲醇或乙腈，甘草酸色谱峰峰形拖尾很严重，甚至不成峰，因此不选用这两种流动相。从图5可以看出，流动相为甲醇-0.1％甲酸时基线不平，随着时间一直往下降，因此也不选用。图1相较于图6和图2而言，芍药苷色谱峰峰形较差。图6显示基线的平稳性不如图2，因此适用于本样品最佳流动相为乙腈-0.05％磷酸水溶液。
2.2波长考察
分别测定了甘草酸、甘草苷和甘草酸的紫外光谱图，由图中可以看出芍药苷在199nm、231nm处，甘草苷在199nm、216nm、276nm处，甘草酸在199nm、250nm处有最大吸收。
然而，提取在199nm下检测的色谱图如图7所示，可以看出199nm下色谱图基线噪音较大，芍药苷的吸收强度远远高于甘草苷和甘草酸，使得甘草酸的峰高比例过于小，因此不选用。
从其他最大吸收波长可知，较符合3种化合物的吸收波长集中在220-250nm之间。图8显示在220-250nm下检测的色谱图，从图上可以看出，波长越大，甘草酸响应越高，甘草苷和芍药苷响应越低，反之则甘草酸越低，因此选择230-240nm下最好。
图9显示230-240nm下检测的色谱图，从图上可以看出，各谱图中的3个目标峰均响应良好，且不影响芍药苷前面色谱峰的响应，在235nm下检测结果最佳。
2.3柱温考察
液相色谱条件：流动相：乙腈(A)-0.05％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱：0-8min 19％A，8-35min 19-50％A，35-36min 50-100％A；色谱柱：依利特Hypersil ODS 250×4.6mm，5μm，检测波长235nm，流速：1.0ml/min。
在20℃、25℃、30℃、35℃下，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，结果见图10(对照品)和图11(供试品)。
由图10-11中可以看出，温度越高，芍药苷拖尾越严重，温度越低，越不利于甘草苷的分离。表2列出了由图10-11得出的不同柱温下芍药苷、甘草苷、甘草酸的拖尾因子和峰高。从表中数据可以看出就甘草酸色谱峰而言，对照品和样品均显示在不同温度下对其峰高及拖尾因子均没有影响，表明温度对甘草酸的色谱峰没有影响；就甘草苷色谱峰而言，温度越高，响应高度越好；而就芍药苷色谱峰而言，温度越高，拖尾因子越大，峰形越差。综合3种成分色谱峰形色谱峰而言及响应情况，在20-30℃下分析比较适宜，25℃下分析最好。
表2不同柱温下的拖尾因子和峰高结果
Figure BDA0002532560460000101
2.4色谱柱和梯度条件考察a
液相色谱条件：流动相：乙腈(A)-0.05％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱：0-8min 19％A，8-35min 19-50％A，35-36min 50-100％A；检测波长235nm，流速：1.0ml/min，柱温：25℃。
分别采用A依利特Hypersil ODS 250×4.6mm，5μm；B赛默飞C18 thermo HypersilBDS C18 250×4.6mm，5μm；C赛默飞AQ thermo Hypersil GOLD aQ 250×4.6mm，5μm；D迪马Diamonsil(钻石)C18 250×4.6mm，5μm，E月旭Ultimate AQ-C18 150×4.6mm，5μm色谱柱进行测定。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定色谱曲线，然后由色谱曲线分别计算芍药苷、甘草苷、甘草酸的峰面积和峰高，列入表3中。
表3不同色谱柱峰面积及峰高比较
Figure BDA0002532560460000102
由表3分析可以看出，迪马色谱柱对三种成分的响应高度相较于其他色谱柱均较低，因此不选用，月旭作为分析柱对三种成分的响应面积及高度均较高，因此选择其作为分析柱。
除了以月旭Ultimate AQ-C18 150×4.6mm，5μm为色谱柱并按照表4中的梯度以外，其他色谱条件同上。分别精密吸取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，进行分析，以寻找合适的梯度，使芍药苷、甘草苷、甘草酸三个成分的色谱峰达到含量测定要求。
所得结果如下。
在a-1的梯度条件下，所得色谱图在甘草苷的色谱峰后面有小峰，因此不选用该梯度。在a-2和a-3的梯度条件下，所得色谱图在芍药苷的色谱峰后有小峰，甘草苷未达到分离，因此不选用该梯度。在a-4的梯度条件下，所得色谱图中芍药苷的色谱峰拖尾，甘草苷未达到分离，因此不选用该梯度。在a-5的梯度条件下，芍药苷色谱峰纯度为6，峰形好看，符合要求，表明可适当缩短保留时间。在a-6的梯度条件下，芍药苷色谱峰峰形好看，符合要求，可确定芍药苷出峰的梯度程序。在a-7的梯度条件下，甘草苷色谱峰未达到分离度，因此不适用。在a-8的梯度条件下，所得色谱图见图12，可见芍药苷色谱峰的峰形好，可以确定前梯度比例为0-1min，14-15％A,1-5min 15％-15.8％A。
在a-9、a-10、a-11和a-12的梯度条件下，甘草苷色谱峰未达到分离度，因此不适用。
表4梯度考察a
Figure BDA0002532560460000111
综上，考虑到更换各种梯度比例均未能使甘草苷得到有效分离，因此考虑更换色谱柱。
2.5色谱柱和梯度条件考察b
液相色谱条件：流动相：乙腈(A)-0.05％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱：0-1min 14％-15％A，1-5min，15％-18％A，5-6min 18％-20％A，6-7min 20％-22％A，7-13min 22％A；检测波长235nm；流速：1.0ml/min；柱温25℃。
分别采用A.Ultimare AQ-C18 4.6*150mm,5μm；B.Thermo BDS Hypersil C184.6*150mm,5μm；C.Venusil XBP C18 4.6*150mm,3μm色谱柱进行测定。分别精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，结果见图13。
由图13可以看出，在此色谱条件下，三种色谱柱对芍药苷的分离均较好。对甘草苷的分离，色谱柱B中甘草苷与前一个峰混为一个大峰，色谱柱A和色谱柱C能分离出甘草苷峰，色谱柱C分离较好，因此选用色谱柱Venusil XBP C18 4.6*150mm,3μm作为芍药甘草汤液相分析柱。
除了以Venusil XBP C18 4.6*150mm,3μm为色谱柱并按照表5中的梯度以外，其他色谱条件同上。分别精密吸取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，进行分析，以寻找合适的梯度，使芍药苷、甘草苷、甘草酸三个成分的色谱峰达到含量测定要求。
表5梯度考察b
Figure BDA0002532560460000121
所得结果如下。
在b-1的梯度条件下，五个条件所得色谱图均未对芍药苷色谱峰的峰分离有影响，但甘草苷色谱峰前面有个小峰，因此不选用该梯度。在b-2的梯度条件下，六个条件所得色谱图未对芍药苷的色谱峰峰分离有影响，但甘草苷前面有个小峰，分离度在1.3左右，未达到1.5的要求，因此不适用。
在b-3的梯度条件下，所得色谱图如图14所示，发现甘草苷分离度为1.570，峰纯度41，方法分离度良好，峰纯度符合要求，因此确定芍药苷和甘草苷的梯度洗脱条件。调整后面的洗脱程序，使得甘草酸的分离度符合要求。
在b-4的梯度条件下，发现甘草酸色谱峰前面均有小峰，分离度均为达到要求,因此不适用。在b-5的梯度条件下，所得色谱图如图15所示，所得产品的分离度和纯度计算结果见表6。在此梯度条件下，分离度良好，色谱峰纯度高，因此确定为梯度洗脱为0-1min 14-15％A,1-5min 15-15.8％,5-6min 15.8-20％A,6-7min 20％A,7-8min 20-21％A,8-12min21％A,12-30min 21-36％A,30-32min 36％A,32-45min 36-43％A。
表6梯度考察b-5结果
化合物 分离度 纯度
芍药苷 1.256 2
甘草苷 1.563 1
甘草酸 1.679 40
2.6流速考察
液相色谱条件：流动相：乙腈(A)-0.05％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱：0-1min 14-15％A,1-5min 15-15.8％,5-6min 15.8-20％A,6-7min 20％A,7-8min 20-21％A,8-12min21％A,12-30min 21-36％A,30-32min 36％A,32-45min 36-43％A；色谱柱：Venusil XBPC18 4.6*150mm,3μm；检测波长235nm；柱温25℃。
液相流速分别为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min，分别精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，结果见图16。
如图16所示，流速越快，出峰速度越快。流速为0.8ml/min时，甘草苷峰后有一个小峰会被包裹进峰中，导致峰不纯；流速为1.2ml/min时，甘草苷峰与前面的峰分离度为1.175，小于分离度要求；流速为1.0ml/min时，三个成分的分离度良好，因此选择最佳流速为1.0ml/min。
2.7进样量考察
液相色谱条件：流动相：乙腈(A)-0.05％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱：0-1min 14-15％A,1-5min 15-15.8％,5-6min 15.8-20％A,6-7min 20％A,7-8min 20-21％A,8-12min21％A,12-30min 21-36％A,30-32min 36％A,32-45min 36-43％A；色谱柱：Venusil XBPC18 4.6*150mm,3μm；检测波长235nm；流速：1.0ml/min；柱温25℃。
分别精密吸取供试品溶液5、10、15、20μl，注入液相色谱仪，测定，结果见图17。
如图17所示，进样量多少，对芍药苷、甘草酸的影响小，但对甘草苷的影响较大。进样量越小，甘草苷出峰位置基线噪音越小，甘草苷的分离度越好，因此选择最佳进样量5μl。
2.8梯度条件考察c
为了让色谱峰基线更平稳，同时使峰的峰形更好，对流动相梯度进一步进行了优化。
液相条件：流动相：乙腈(A)-0.05％磷酸水溶液(B)，色谱柱：Venusil XBP C184.6*150mm,3μm；检测波长235nm；流速：1.0ml/min；柱温25℃。
按照表7中的梯度，分别精密吸取供试品溶液5μl注入液相色谱仪，进行测定。
表7梯度考察c
Figure BDA0002532560460000141
结果见图18和表8，可以看出，在c-1的色谱条件下，分离度良好，且峰形较好，因此确定为梯度洗脱为0-1min 14-17.5％A,1-5min 17.5-19％A,5-6min 19-20％A,6-7min20％A,7-8min 20-20.5％A,8-12min 20.5-23％A,12-30min 23-36％A,30-32min 36％A,32-45min 36-43％A。
表8梯度考察c结果
Figure BDA0002532560460000142
最终确定的色谱条件：
流动相：乙腈(A)-0.05％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱0-1min 14-17.5％A,1-5min17.5-19％A,5-6min 19-20％A,6-7min 20％A,7-8min 20-20.5％A,8-12min 20.5-23％A,12-30min 23-36％A,30-32min 36％A,32-45min 36-43％A；色谱柱：Venusil XBP C184.6*150mm,3μm；检测波长235nm；流速：1.0ml/min；柱温25℃。
3、供试品溶液制备考察
液相色谱条件：流动相：乙腈(A)-0.05％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱：0-1min 14-15％A,1-5min 15-15.8％,5-6min 15.8-20％A,6-7min 20％A,7-8min20-20.5％A,8-12min 20.5-23％A,12-30min 23-36％A,30-32min 36％A,32-45min 36-43％A；色谱柱：Venusil XBP C18 4.6*150mm,3μm；检测波长235nm；流速：1.0ml/min；柱温25℃。
3.1提取溶剂考察
供试品溶液的制备：取芍药甘草汤冻干粉约0.25g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入溶剂(甲醇、30％甲醇、70％甲醇、无水乙醇、30％乙醇、70％乙醇、乙腈、30％乙腈、70％乙腈、水)25ml，称定重量，超声处理(250W，40KHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
对照品溶液的制备：用70％甲醇精密配制含芍药苷126.632μg/ml；甘草苷29.196μg/ml；甘草酸84.918μg/ml的对照品混合溶液。
分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5μl注入液相色谱仪，测定，结果见表9。
表9提取溶剂考察结果
Figure BDA0002532560460000151
由上表中数据可知，无水乙醇与乙腈均对甘草酸提取率特别低，因此不选用。在剩余的8种溶剂中，甲醇提取的甘草酸含量最低，不选用，剩余7种溶剂中，70％乙醇与70％甲醇虽然提取效率相当同时也高于其他溶剂的提取率，但比较两者的样品色谱图会发现，用70％乙醇制备的样品相较于70％甲醇制备的样品，色谱峰有缺失，因此选用最佳的提取溶剂为70％甲醇。
3.2提取方式考察
供试品溶液的制备：取芍药甘草汤冻干粉约0.25g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，分别进行超声处理(250W，40KHz)20分钟、振摇提取2小时、回流提取1小时，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
对照品溶液的制备：用70％甲醇配制芍药苷155.84μg/ml、甘草苷119.54μg/ml、甘草酸141.66μg/ml的对照品混合溶液。
分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5μl注入液相色谱仪，测定，结果见表10。
表10提取方式考察结果
Figure BDA0002532560460000152
上表数据表明，三种提取方式处理下，芍药苷、甘草苷及甘草酸的提取量相差不大，因超声操作简便，时间短，因此选作最佳处理方式。
3.3超声时间考察
供试品溶液的制备：取芍药甘草汤冻干粉约0.25g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，分别进行超声处理(250W，40KHz)10分钟、20分钟、30分钟、40分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
对照品溶液的制备：用70％甲醇配制芍药苷155.84μg/ml、甘草苷119.54μg/ml、甘草酸141.66μg/ml的对照品混合溶液。
分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5μl注入液相色谱仪，测定，结果见表11。
表11超声时间考察结果
Figure BDA0002532560460000161
上表数据表明超声时间越长，提取越完全，超声时间为20分钟时，已能提取完全，因此选择最佳的超声时间为20分钟。
3.4溶剂量考察
供试品溶液的制备：取芍药甘草汤冻干粉约0.05g、0.10g、0.25g、0.5g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，则加入溶剂量分别为500、250、100、50倍，称定重量，分别进行超声处理(250W，40KHz)20分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
对照品溶液的制备：用70％甲醇配制含芍药苷155.84μg/ml、甘草苷119.54μg/ml、甘草酸141.66μg/ml的对照品混合溶液。
分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各5μl注入液相色谱仪，测定，结果见表12。
表12溶剂量考察结果
Figure BDA0002532560460000162
上表数据表明溶剂加入量越多，提取越完全，从3种成分含量看，50倍溶剂量(体积/质量,ml/g)提取较不完全，100、250、500倍的加入量提取趋于稳定，基于居中原则，因此选用液固比250倍(体积/质量,ml/g)。
综上，确定供试品溶液制备条件为：提取溶剂：70％甲醇，超声处理(250W，40KHz)20分钟，液固比(体积/质量,ml/g)250倍。
4方法学研究
色谱条件：流动相：乙腈(A)-0.05％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱0-1min 14-17.5％A,1-5min 17.5-19％A,5-6min 19-20％A,6-7min 20％A,7-8min 20-20.5％A,8-12min20.5-23％A,12-30min 23-36％A,30-32min 36％A,32-45min 36-43％A；色谱柱：VenusilXBP C18 4.6*150mm,3μm；进样量：5μl，检测波长235nm；流速：1.0ml/min；柱温25℃。
供试品溶液的制备：取芍药甘草汤冻干粉约0.1g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声处理(250W，40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
对照品溶液的制备：用70％甲醇配制得到含芍药苷188.41μg/ml、甘草苷34.11μg/ml、甘草酸34.00μg/ml的对照品溶液。
测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
白芍阴性样品溶液的制备：取白芍阴性冻干粉约0.1g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声处理(250W，40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
炙甘草阴性样品溶液的制备：取炙甘草阴性冻干粉约0.1g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声处理(250W，40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
4.1专属性试验
分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、白芍阴性样品溶液、炙甘草阴性样品溶液、70％甲醇空白溶剂各5μl，注入液相色谱仪，测定，结果见图19。
从图19可以看出，供试品色谱中，在与芍药苷对照品、甘草苷对照品及甘草酸对照品色谱相应位置上有色谱峰，阴性样品色谱上没有相应峰，表明阴性无干扰，本方法专属性强。
4.2线性试验
分别精密吸取对照品溶液1、2、5、10、15、20、25μl注入液相色谱仪，测定。以对照品进样量(μg)作为横坐标(X)，测得的峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，结果见表13。
表13线性回归方程结果
Figure BDA0002532560460000171
上述结果表明，芍药苷在188.41-4710.25μg范围内其进样量与峰面积呈良好的线性关系；甘草苷在34.11-852.75μg范围内其进样量与峰面积呈良好的线性关系；甘草酸在34.00-850.00μg范围内其进样量与峰面积呈良好的线性关系。
4.3精密度试验
4.3.1中间精密度试验
取批次为S6、S7、S8的芍药甘草汤对应实物约0.1g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，6份，同“供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液。
精密吸取供试品溶液5μl分别注入岛津LC-20A型高校液相色谱仪及另一岛津LC-20A型高效液相色谱仪，测定，计算含量，结果见表14。
表14中间精密度试验
Figure BDA0002532560460000181
数据表明三批次的芍药甘草汤对应实物在两种仪器上的含量测定值芍药苷含量的RSD值分别为1.2％，1.9％，1.0％，甘草苷含量的RSD值分别为2.7％、5.9％、2.0％，甘草酸含量的RSD值分别为0.7％、2.0％、0.7％，均小于6％表明本分析方法在不同仪器上的重现性良好。
4.3.2重复性试验
按照“供试品溶液的制备”的方法制备6份供试品溶液。精密吸取供试品溶液5μl注入液相色谱仪，测定峰面积并计算含量，结果见表15。
表15重复性试验
Figure BDA0002532560460000182
重复性试验结果显示，测得的6份供试品中芍药苷、甘草苷、甘草酸的RSD％值分别为1.5％、1.2％、1.5％，均小于3.0％，表明此方法重复性良好。
4.3.3加样回收率试验
供试品溶液的制备：取芍药甘草汤冻干粉0.05g(由重复性试验结果可知芍药苷40.37mg/g，甘草苷7.99mg/g，甘草酸13.93mg/g)，平行取6份，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入由70％甲醇配制的含芍药苷0.13038mg/ml，甘草苷0.02784mg/ml，甘草酸0.04683mg/ml的对照品溶液15ml，称定重量，超声处理(250W，40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过,即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μl注入液相色谱仪，测定峰面积，计算回收率，结果见表16。
表16加样回收试验
Figure BDA0002532560460000191
结果表明，芍药苷的回收率在94.4％-97.2％范围内，RSD值为1.1％，甘草苷含量的回收率在93.4％-95.4％范围内，RSD值为0.8％，甘草酸含量的回收率在102.1％-105.0％范围内，RSD值为1.0％，均符合2015版药典92-105％的要求，表明本方法回收率良好，准确度高。
5特征图谱研究
色谱条件：流动相：乙腈(A)-0.05％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱0-1min 14-17.5％A,1-5min 17.5-19％A,5-6min 19-20％A,6-7min 20％A,7-8min 20-20.5％A,8-12min20.5-23％A,12-30min 23-36％A,30-32min 36％A,32-45min 36-43％A；色谱柱：VenusilXBP C18 4.6*150mm,3μm；检测波长235nm；流速：1.0ml/min；柱温25℃。
供试品溶液的制备：取芍药甘草汤冻干粉约0.1g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声处理(250W，40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过,即得。
单味药溶液的制备：分别取白芍水提物0.1g、炙甘草水提物0.1g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，同“供试品溶液的制备”制备各阴性样品溶液。
对照品溶液：取芍药苷、甘草苷、甘草酸铵对照品各适量，加70％甲醇制成混合对照品溶液(芍药苷188.41μg/ml、甘草苷34.11μg/ml、甘草酸34.00μg/ml)；另取异甘草苷、异甘草素、异甘草苷芹糖、新甘草苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷、没食子酸、儿茶素等对照品各适量，加70％甲醇制成单个对照品溶液(浓度为1ml约含异甘草苷0.16mg，异甘草素0.27mg、异甘草苷芹糖0.23mg、新甘草苷0.16mg、芍药内酯苷0.27mg、苯甲酰芍药苷0.33mg、氧化芍药苷0.23mg、没食子酸0.13mg、儿茶素0.14mg。
分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液、各阴性样品溶液各1-5μl，注入液相色谱仪，测定。
5.1色谱峰的指认
通过比较确定化合物位置及其归属，白芍对照见图20；炙甘草对照见图21。
由图20中可以看，供试品图中，在与芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷对照品相应位置显示色谱图，且阴性无干扰。没食子酸供试品图中有其他成分干扰，氧化芍药苷、儿茶素在供试品图中显示峰特别小。此外，经测试，芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷的样品光谱图与对照品一致。
由图21中可以看，供试品图中，在与新甘草苷、异甘草苷、异甘草苷芹糖对照品相应位置显示色谱图，且阴性无干扰。异甘草素在供试品图中显示峰特别小。此外，经测试，样品的光谱图与对照品一致。
通过对照品与供试品中色谱峰保留时间一致且阴性样品图谱中未出现而单味药色谱中有出现的色谱峰进行分析比较，并根据紫外光谱信息及对照品光谱信息，确认芍药甘草汤的化合物位置及其药材归属，见表17。
表17化合物归属表
化合物 保留时间 来源
芍药内酯苷 6.9 白芍
芍药苷 7.9 白芍
新甘草苷 10.3 炙甘草
甘草苷 10.8 炙甘草
异甘草苷芹糖 18.2 炙甘草
异甘草苷 19.7 炙甘草
苯甲酰芍药苷 28.4 白芍
甘草酸 38.0 炙甘草
5.2特征图谱
对15个批次的芍药甘草汤对应实物按照“供试品溶液的制备”中的描述分别制备供试品溶液，然后分别精密吸取5μl，注入液相色谱仪，测定。
15批芍药甘草汤对应实物的色谱图见图22。
将15批芍药甘草汤对应实物色谱图数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价***”(2012版)软件，以S1为参照图谱，时间窗宽度设为0.1min，经多点校正，选择图谱中含量较大、分离度好且具有特征的13个共有峰进行Mark峰匹配，采用平均值法生成标准指纹图谱，见图23。在标准指纹图谱中新甘草苷在13个特征峰中较稳定、含量相对较高、分离度好，故确定以甘草苷(6号峰)为参照峰，计算13个特征峰的相对保留时间，见表18，可以看出各峰的保留时间为0.375(峰1)，0.516(峰2)，0.647(峰3)，0.731(峰4)、0.948(峰5)、1.000(峰6)、1.497(峰7)、1.715(峰9)、1.847(峰10)、2.150(峰10)、2.663(峰11)、2.860(峰12)、3.566(峰13)。
表18 15批芍药甘草汤对应实物的相对保留时间结果
Figure BDA0002532560460000211
计算13个特征峰的相对峰面积，见表19，显示15批次的13个特征峰相对峰面积RSD值在9.9％-73.0％，表明每批次的化合物含量大小有差异。
表19 15批芍药甘草汤对应实物的相对峰面积结果
Figure BDA0002532560460000212
5.3含量测定
含量如下计算：含量
Figure BDA0002532560460000221
其中，C对—对照品浓度；V对—对照品进样体积，；A对—对照品峰面积；A供—供试品峰面积；m供—供试品取样量。
表20显示对于上述15批芍药甘草汤对应实物主要活性成分含量的检测结果。
5.4相似度
指纹图谱相似度如下计算：将待测芍药甘草汤对应实物色谱图数据(AIA数据)导入“中药色谱指纹图谱相似度评价***”(2012版)软件，与标准指纹图谱进行比较，即可在软件上得到待测对应实物指纹图谱与标准指纹图谱的相似度。
上述15批芍药甘草汤对应实物的指纹图谱与上述所得标准指纹图谱的相似度结果见表20，可以看出15批芍药甘草汤对应实物的相似度均大于0.9，表明化学成分稳定。
表20 15批对应实物主要活性成分含量的检测结果和相似度
Figure BDA0002532560460000222

Claims (6)

1.一种建立芍药甘草汤对应实物标准指纹图谱的方法，所述方法包括：
（1）供试品溶液配制：
取芍药甘草汤对应实物0.1g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25ml，称定重量，在250W，40kHz下超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得；
（2）对照品溶液配制：
取芍药苷、甘草苷、甘草酸铵对照品各适量，精密称定，加70%甲醇制成混合对照品溶液；另取异甘草苷、异甘草素、异甘草苷芹糖、新甘草苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷、没食子酸、儿茶素对照品各适量，精密称定，加70%甲醇制成单个对照品溶液；
（3）单味药溶液配制：
分别取白芍水提物0.1g、炙甘草水提物0.1g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，同“供试品溶液配制”制备各阴性样品溶液；
（4）HPLC检测
分别精密吸取上述（1）、（2）和（3）的供试品溶液、对照品溶液和阴性样品溶液各1-5μl，用如下的液相色谱方法检测得到供试品指纹色谱图和对照品指纹色谱图；其中，所述液相色谱方法采用配备有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，色谱条件如下：
色谱柱：Venusil XBP C18 4.6*150mm, 3μm；
流动相：流动相 A 为乙腈，流动相 B 为 0.05% 磷酸水溶液 ，
梯度洗脱：按下表中的规定进行
时间（分钟） 流动相A(%) 流动相B(%) 0～1 14→17.5 86→82.5 1～5 17.5→19 82.5→81 5～6 19→20 81→80 6～7 20 80 7～8 20→20.5 80→79.5 8～12 20.5→23 79.5→77 12～30 23→36 77→64 30～32 36 64 32～45 36→43 64→57
流速：1.0 ml/min；
柱温：20-30℃；
检测波长：230-240nm；
（5）生成标准指纹图谱
基于N批供试品的指纹色谱图中的共有峰生成标准指纹图谱，其中，选择芍药甘草汤中主要成分且分离度较好的色谱峰作为特征峰并确定为共有峰，所述N为10以上；
（6）共有峰的鉴定及归属
对芍药甘草汤对应实物指纹图谱中的共有峰进行归属及鉴定。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（4）HPLC检测中，柱温：25℃；检测波长：235nm。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（4）HPLC检测中，所述色谱柱的理论板数按芍药苷峰计算不低于2000。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，芍药甘草汤对应实物如下制备：按质量比1:1取白芍和炙甘草，加水煎煮后趁热以200目筛过滤，得药液，干燥后得芍药甘草汤干粉，即芍药甘草汤对应实物。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（5）生成标准指纹图谱中，所述N为10-20。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，芍药甘草汤对应实物标准指纹图谱包括13个特征峰，其中，以6号峰为参照，各峰的相对保留时间如下：
峰号 相对保留时间 1 0.375 2 0.516 3 0.647 4 0.731 5 0.948 6 1.000 7 1.497 8 1.715 9 1.847 10 2.150 11 2.663 12 2.860 13 3.566
。
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