CN111220719A - 一种人参药材质量的指纹图谱评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人参药材质量的特征图谱评价方法，所述方法包括供试品和对照品溶液制备、液相检测和评价标准的建立，其中HPLC检测的条件优选乙腈和水的梯度洗脱，液相条件简单，并且评价标准的建立是本方法的重点，通过液相得到特征图谱，关注方法的稳定性、人参皂苷Rf含量及Rg1与Re含量比对，从而获得人参药材的品质信息，对于人参药材的优劣评价起到至关重要的作用。

Description

一种人参药材质量的指纹图谱评价方法

技术领域

本发明属于中药材质量评价领域，特别涉及一种人参药材质量的指纹图谱与人参皂苷含量相结合的评价方法。

背景技术

人参为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根和根茎。多于秋季采挖，洗净经晒干或烘干。栽培的俗称“园参”；播种在山林野生状态下自然生长的称“林下参”，习称“籽海”。

人参皂苷是人参的主要活性成分，具有抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、解毒等功能因其多方面的生物活性，其化学研究开始的较早，研究也较为深入。迄今为止，中外学者已从生晒参、白参、红参中分离鉴定了50余种人参皂苷。由于其较高的保健和治疗价值，但生长年限长，生长地域限制，因而野生人参价格高，即使2015版《中国药典》收载的园参和林下参补充了野生人参的来源，但依然价高。这就让不法分子觉得有利可图，市场上充斥着质量参差不齐的人参，为了提升含量加更多的须根，更有些不法分子用将人参打碎，加入西洋参下脚料或喷以地上部分的提取物等达到含量要求。

而2015版《中国药典》中对于人参药材的含量测定仅要求人参皂苷Rg1+Re不得少于0.3％，人参皂苷Rb1不得少于0.2％(HPLC法)；美国药典USP41-NF36规定Rg1不少于0.2％，Rb1不少于0.1％(HPLC法)，欧洲药典第7.0版规定Rg1+Rb1不少于0.4％(HPLC法)和日本药局方(第16版)规定Rg1不少于0.1％，Rb不少于0.2％(紫外法)。通过研究，发现人参中须根多，能提高Re的含量，因而须根多的人参容易满足《中国药典》的要求，但并非是优质人参的来源。

特征指纹图谱是一种能够标识中药各种组分群体特征的共有峰的图谱，是一种综合的、可同时定性定量的方法，可用于鉴别中药材的真伪，评价中药材质量的稳定，有效的分析方法。尚未有研究使用指纹图谱进行人参质量的评价，原因是人参中含有的特殊成分较多，与其他相关掺杂品存在较多的相似成分，在不清楚特征组分的情况下，在没有对比分析过较大量的同属类似品的情况下，无法仅通过指纹图谱或单一含量的指标来反应人参的质量，是否存在掺杂。

发明内容

基于上述技术问题，本发明提供了一种人参药材质量的指纹图谱评价方法，包括供试品进样液和对照品的进样液制备、供试品和对照品的HPLC检测步骤和指纹图谱分析步骤，

所述供试品进样液和对照品的进样液制备包括，所述供试品为人参，所述供试品进样液制备包括人参或人参粉末经含水醇或低级醇加热回流，过滤，得到过滤液，精确取上层溶液蒸干得到残渣，所述残渣进行甲醇溶解得到供试品进样液，所述对照品为含有人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rf的溶液；

所述供试品和对照品的HPLC检测步骤中：流动相为水和乙腈，梯度洗脱，柱温20-40℃，流速0.8-1.2ml/min，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填充柱，检测UV波长为200-210nm；

得到供试品指纹图谱后，所述指纹图谱的分析步骤包括已下合格药材标准，同时满足以下A、B和C：

A 所形成的人参指纹图谱需要包括8个人参皂苷的特征峰，其中应包含有人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc和人参皂苷Rd；

B供试品指纹图谱中人参皂苷Rf的含量≥0.05％(实验数据验证，掺假中常用的人参茎叶中不含Rf，西洋参中不含Rf或含量低于0.05％的Rf，非人参制品中不含Rf)；

C供试品指纹图谱中人参皂苷Rg1+Re含量不低于0.3％，且人参皂苷Rb1含量不低于0.1％。(如果掺入其他杂物，相应Rg1+Re以及Rb1的含量会下降)

其中所述的含水醇为水饱和的正丁醇、含水乙醇、甲醇、乙醇以及其他含不超过5个碳的醇类。

进一步地，在上述评价方法中，所述步骤C中同时满足Rg1：Re在1：1～3:1(实验数据验证，根据掺假或造假的常用的手段：西洋参下脚料的Rg1含量特别低；人参生长年限不够或者造假切断的人参或者人参须，这些掺假造假的产品均符合药典标准，但是，其Rg1含量低于Re，甚至含量为0)。

所述指示对照品包括人参的特有成分以及定量所需的其他标准品，所述对照品为至少含有人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rf的溶液；

发明人分别对现有的人参供试品提取工艺和流动相进行相应优化，人参皂苷由于其结构中大多只有单独的双键，共轭程度低，因而紫外吸收弱，在200-210nm有较弱吸收，现在高效液相色谱分析方法用ELSD检测器替代弱紫外吸收的检测器，但ELSD灵敏度较紫外检测器低一个数量级，因而如果能用紫外检测器的时候，还是尽量用紫外检测器，但对溶剂的要求也较高，不宜采用在200-210nm有末端吸收的溶剂，例如甲醇等。在测定人参中人参皂苷指纹图谱时，由于供试品处理会直接导致指纹图谱的质量，因而前处理就占了较为重要的位置，本发明中用水饱和的醇或者低级醇超声处理，目的是将人参皂苷有效地转移出来。

流动相保证更多的对照峰取得更好的分离度。

更重要的是，通过该方法，得到了一种评价标准，普遍认为人参皂苷是人参中主要活性成分，因而研究较多。但研究表明不同的人参部位所含的人参皂苷类型和含量不同。尤其在研究了同属的西洋参和人参茎叶后发现虽然都含有人参皂苷，但各有独特成分，且在含量上有区别。人参的特有成分是人参皂苷Rf，在茎叶里几乎没有，人参中Rg1含量高于Re，而人参茎叶中Rg1含量较Re低，且几乎不含Rb1；西洋参里的拟人参皂苷F11为特有成分，但含量极低，在203波长难以检测到，但西洋参里不含人参皂苷Rf，且Rg1远低于Re，Rb1含量较人参高较多。

在上述人参药材质量的指纹图谱评价方法中，根据合格药材标准，药材标准A，B，C必须同时，任何一条不满足，均可判定药材不合格。

进一步地，在上述的人参药材质量的指纹图谱评价方法中，所述供试品和对照品的HPLC检测步骤中：十八烷基硅烷键合硅胶填充柱；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱程序为，0～35分钟，流动相A19％，流动相B81％；35～55分钟，流动相A 19％→29％，流动相B81％→71％；55～70分钟，流动相A29％，流动相B71％；70～100分钟，流动相A29％→40％，流动相B71％→60％，柱温30℃，流速1ml/min。所述十八烷基硅烷键合硅胶填充柱为Agilent ZORBAX SB-C18 4.6*250mm，5μm或者Inertsil ODS-3.5μm4.6×250mm色谱柱。

所述供试品指纹图谱包括8个共有峰，其中5号峰为人参皂苷Rb1对照峰，各特征峰的相对保留时间为：1号峰，0.42±10％、2号峰，0.44±10％、3号峰，0.86±10％、4号峰，0.90±10％，5号峰，1.00、6号峰，1.06±10％、7号峰，1.13±10％、8号峰，1.25±10％。所选择的8个共有峰指认了其中六个峰(1，2，3，5，6，8)，此六个峰是通过购买标准品，对比高效液相图的保留时间和PDA图谱，以及加样回收等方法确定。

所述人参药材指纹图谱包括指认的特征峰：1号峰为人参皂苷Rg1，2号峰为人参皂苷Re，3号峰为人参皂苷Rf，5号峰为人参皂苷Rb1，6号峰为人参皂苷Rb2+人参皂苷Rc，8号峰为人参皂苷Rd。

在得到相应的供试品指纹图谱后，发明人进一步提供指纹图谱的评价标准，所得指纹图谱中人参皂苷Rg1的理论塔板数不低于6000。

通过构建人参药材中人参皂苷的指纹图谱，可以较好地反映人参药材的成分，并通过是否含有人参皂苷Rf，人参皂苷Rg1+Re及Rb1的绝对含量以及Rg1与Re的相对含量关系，很好地判断人参药材的质量。申请人还进行了相关的文献检索，检索发现，(1)西洋参不含人参皂苷Rf，含拟人参皂苷F11；人参不含拟人参皂苷F11，含Rf，可作为西洋参与人参的鉴别依据；(2)人参须根和支根中Rb1、Rc、Rb2、Rd含量较其他部位均高，Re在叶中含量较高。(3)人参须根中Rg1相对含量低于Re。根据比较研究根据研究我们还发现(1)人参须根中Rg1相对含量低于Re；人参中Rg1：Re在1:1～1:3之间，西洋参中Rg1:Re＜1:8。(3)用相同的供试品处理条件和相同的高效液相分离条件，可以获得人参，西洋参，人参茎叶的药材指纹图谱，通过指纹图谱可以清晰地看出三种药材的区别。申请人通过多批量的实验进行相关总结，进一步简化评价标准，得到上述评价标准。

根据上述方法，发明人进一步提供一种具体的人参质量指纹图谱评价方法，包括：建立特征图谱，包括：a)供试品溶液的制备：取人参粉末约1g，精密称定，置索氏提取器中，加入精密加水饱和正丁醇50ml加热回流1小时，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。b)对照品溶液的制备：称取1)人参皂苷Rg1、2)人参皂苷Re、3)人参皂苷Rf、4)人参皂苷Rb1、5)人参皂苷Rb2、6)人参皂苷Rc、7)人参皂苷Rb3、8)人参皂苷Rd共8种对照品，加甲醇溶解定容，制成一定浓度的对照溶液，微孔滤膜0.45μm滤过，备用；c)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱程序如下：0～35分钟，流动相A19％，流动相B81％；35～55分钟，流动相A19％→29％，流动相B81％→71％；55～70分钟，流动相A29％，流动相71％；70～100分钟，流动相A29％→40％，流动相B71％→60％；检测波长200-210nm，优选201-204nm，最优选203nm。柱温20-40℃，流速0.8-1.2ml/min。进样量1-5μL理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于6000。

合格药材需同时满足以下三条，一条不满足，判定为不合格药材。

A所形成的人参指纹图谱需要包括8个人参皂苷的特征峰，其中应包含有人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc和人参皂苷Rd；

B药材指纹图谱中人参皂苷Rf的含量≥0.05％

C药材指纹图谱中人参皂苷Rg 1+Re含量需不低于0.3％，且Rg1：Re在1～3之间；人参皂苷Rb1含量需不低于0.1％。

本发明采用多种评价方式进行评价，直观的指纹图谱相似度与主要人参皂苷的绝对含量以及特有成分的相对含量相结合，来评价人参药材的质量。

根据上述的评价方法，发明人提供了一种可靠的评价方法，能够对人参的质量进行准确的检测，综合相关峰和含量以及直接的比值关系，快速判断人参质量，提高人参制品质控领域的检测水平。

附图说明：

图1：人参对照药材中人参皂苷类指纹图谱。

具体实施方式

以下优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过下述优选实施例已对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

一、人参药材中人参皂苷指纹图谱方法研究

1.仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪，岛津LC-2010AHT，十万分之一电子天平AY220型1/10万电子分析天平(岛津)，AS系列超声波清洗机(250W，50Hz/20Hz双频)(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。Agilent ZORBAX SB-C18(5μm 4.6×250mm)色谱柱。

人参对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：120917-201211)，人参皂苷Rg1(中国食品药品检定研究院，批号：11073-201530，人参皂苷Re(中国食品药品检定研究院，批号：110754-201626)，人参皂苷Rf(中国食品药品检定研究院，批号：111719-201505)，人参皂苷Rb1(中国食品药品检定研究院，批号：110704-201625)，人参皂苷Rb2(StanfordAnalytical chemicals Inc.Part Number：RSS-411868，Lot Number：MK180418-06)，人参皂苷Rc：(Stanford Analytical chemicals Inc.Part Number：RSD-152027，Lot Number：PR180325-18)，人参皂苷Rd：(Stanford Analytical chemicals Inc.Part Number：RSD-152938，Lot Number：PR180620-07)人参皂苷Rb3：(Stanford Analytical chemicalsInc.Part Number：GSB-343635，Lot Number：PR180222-05)，人参皂苷Rf：(StanfordAnalytical chemicals Inc.Part Number：GSS-107769，Lot Number：PF180626-08)乙腈为色谱纯，水为注射用水，其他试剂为分析纯。

2.色谱条件的选择

在进行人参药材中人参皂苷色谱条件选择时，尤其对流动相***进行了选择。最后确定的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相A为乙腈，流动相B为水，梯度洗脱程序如下：0～35分钟，流动相A19％，流动相B81％；35～55分钟，流动相A19％→29％，流动相B81％→71％；55～70分钟，流动相A29％，流动相71％；70～100分钟，流动相A29％→40％，流动相B71％→60％；检测波长优选203nm。柱温30℃，流速1ml/min。进样量1μL，理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于6000。

3.供试品提取条件的选择

(1)提取方法的选择

对于人参药材供试品：供试品溶液的制备：取人参粉末约1g，精密称定，精密加入水饱和正丁醇50ml加热回流1小时，除去溶剂，药渣挥干溶剂，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(2)提取时间的选择

人参药材粉碎后，精密称取1g,加入水饱和的正丁醇50ml，加热回流提取45min，60min，90min,120min对其提取率进行比较，发现60min，90min与120min提取率基本一致。

最终选择供试品提取方法用水饱和的正丁醇加热回流60min。

4.色谱柱选择

考察了Inertsil ODS-3(5μm 4.6×250mm)、Agilent ZORBAX SB-C18(5μm 4.6×250mm)柱的分离效果，分离度来说Inertsil ODS-3不如Agilent ZORBAX SB-C18，从一测多评的角度和方便性考虑，也优选Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱。

5.波长选择

人参皂苷类化合物大多只有一个孤立双键，最大吸收波长在200-210nm。药典中也以203nm波长作为人参中人参皂苷Rg1，Re和Rb1含量测定的波长，为了与含量测定保持一致，也可以达到一测多评的效果，指纹图谱沿用含量测定的波长，以203nm作为人参药材中人参皂苷类成分指纹图谱的检测波长。

6.参照峰的选择

人参皂苷提取物中人参皂苷Rb1含量较高，且与其他人参皂苷分离得很好，因而以人参皂苷Rb1作为基准峰，计算其他人参皂苷的相对化学位移。

(一)人参药材中人参皂苷类成分指纹图谱方法学

供试品溶液的制备：供试品溶液的制备：取人参粉末约1g，精密称定，精密加入水饱和正丁醇50ml加热回流1小时，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。进样量1μl。

1、精密度(Precision)：

取上述供试品连续重复进样6次，将所得结果进行相似性评价。

表1人参药材指纹图谱精密度实验

结果表明：6针之间相互的相似度结果均大于0.9

2、重复性试验：

精密称取同一批人参约1.0g，称取6份，按照上述方法进行处理，平行操作6份，进样1μl，检测其指纹图谱，所得结果进行相似性评价。结果见表2

表2人参药材指纹图谱重复性实验

3、溶液稳定性

取同一份供试品溶液，分别于0、4、8、12、24h进样测定，记录8个特征峰面积，检测其指纹图谱，所得结果进行相似性评价。结果见表3

表3人参药材指纹图谱稳定性实验

结果表明：6针之间相互的相似度结果均大于0.9

4、样品测定

取人参药材30批次，按上述方法测定，检测其指纹图谱，结果见表4。

表4.四种人参皂苷在30批人参药材中含量

5、限度

取人参药材共30批，按指纹图谱方法进行测定，计算各特征峰与参照物(Rb1)的相对保留时间，结果见表5：

表5.各特征峰与参照物(Rb1)的相对保留时间

结果表明，各特征峰与参照峰(参照峰5，对应物质为人参皂苷Rb1)保留时间RSD％均＜2％，所以将指纹图谱标准制定如下：

供试品指纹图谱中，应有8个特征峰，与参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内。规定值为0.469(峰1)、0.506(峰2)、0.846(峰3)、0.890(峰4)、1.000[峰5(s)]、1.076(峰6)、1.141(峰7)、1.230(峰8)

实施例1

1.仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪，十万分之一电子天平AY220型1/10万电子分析天平(岛津)，AS系列超声波清洗机(250W，50Hz/20Hz双频)(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。Agilent ZORBAX SB-C18(5μm 4.6×250mm)色谱柱。

人参对照药材(人参对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：120917-201211)，西洋参对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：120997-201309)；人参茎叶(中国食品药品检定研究院，批号：121586-201202)人参皂苷Rg1(中国食品药品检定研究院，批号：11073-201530，人参皂苷Re(中国食品药品检定研究院，批号：110754-201626)，人参皂苷Rf(中国食品药品检定研究院，批号：111719-201505)，人参皂苷Rb1(中国食品药品检定研究院，批号：110704-201625)，人参皂苷Rb2(Stanford Analytical chemicals Inc.PartNumber：RSS-411868，Lot Number：MK180418-06)，人参皂苷Rc：(Stanford Analyticalchemicals Inc.Part Number：RSD-152027，Lot Number：PR180325-18)，人参皂苷Rd：(Stanford Analytical chemicals Inc.Part Number：RSD-152938，Lot Number：PR180620-07)人参皂苷Rb3：(Stanford Analytical chemicals Inc.Part Number：GSB-343635，Lot Number：PR180222-05)，人参皂苷Rf：(Stanford Analytical chemicalsInc.Part Number：GSS-107769，Lot Number：PF180626-08)，乙腈为色谱纯，水为注射用水，其他试剂为分析纯。

2.色谱条件的选择

在进行人参药材中人参皂苷色谱条件选择时，尤其对流动相***进行了选择。最后确定的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；Agilent ZORBAX SB-C18，5μm 4.6×250mm，检测波长203nm，流速：1.0ml/min，流动相A为乙腈，流动相B为水，梯度洗脱程序如下：0～35分钟，流动相A19％，流动相B81％；35～55分钟，流动相A19％→29％，流动相B81％→71％；55～70分钟，流动相A29％，流动相71％；70～100分钟，流动相A29％→40％，流动相B71％→60％；检测波长优选203nm。柱温30℃，流速1ml/min。进样量1μL，理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于6000。

3.供试品溶液的制备：

取人参粉末约1g，精密称定，置索氏提取器中，加入精密加水饱和正丁醇50ml加热回流1小时，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4.对照品溶液的制备：

称取1)人参皂苷Rg1、2)人参皂苷Re、3)人参皂苷Rf、4)人参皂苷Rb1、5)人参皂苷Rb2、6)人参皂苷Rc、7)人参皂苷Rb3、8)人参皂苷Rd共8种对照品，加甲醇溶解定容，制成一定浓度的对照溶液，微孔滤膜0.45μm滤过，备用；

5.测定法：分别精密吸取对照品溶液10μL与供试品溶液10～20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

人参对照药材HPLC图谱见图1。

实施例2

色谱条件与***适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱程序如下：0～35分钟，流动相A19％，流动相B81％；35～55分钟，流动相A19％→29％，流动相B81％→71％；55～70分钟，流动相A29％，流动相71％；70～100分钟，流动相A29％→40％，流动相B71％→60％；检测波长优选203nm。柱温30℃，流速1ml/min。理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于6000。

对照品溶液的制备：

称取1)人参皂苷Rg1、2)人参皂苷Re、3)人参皂苷Rf、4)人参皂苷Rb1、共4种对照品，加甲醇溶解定容，制成一定浓度的对照溶液，微孔滤膜0.45μm滤过，备用；

供试品溶液制备：取人参粉末(过四号筛)约1g,精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流3小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒移入100ml锥形瓶中，精密加水饱和正丁醇50ml,密塞，放置过夜，超声处理(功率250W,频率50kHz)30分钟，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml容量品中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液10μL与供试品溶液10～20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

人参对照药材HPLC与图1相似，未列出。

实施例3

测定人参，人参茎叶，西洋参对照药材的指纹图谱及含量

色谱条件与***适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱：检测波长为203nm。理论塔板数按人参皂苷Rg1峰计算不得低于6000。色谱条件如表6

表6.色谱条件

对照品溶液制备精密称定人参皂苷Rg1对照品，人参皂苷Re对照品，人参皂苷Rb1对照品，人参皂苷Rf对照品，加甲醇制成每1ml各含0.2mg的混合溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备分别取人参对照药材粉末(过四号筛)，西洋参对照药材粉末(过四号筛)，人参茎叶对照药材粉末(过四号筛)约1g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流1小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒移入100ml锥形瓶中，精密加水饱和正丁醇50ml，密塞，放置过夜，超声处理(功率250W，50KHz)30分钟，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照溶液10μl与供试品溶液10-20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

测定结果见表7：

表7

结果表明：

1.人参中人参皂苷Rg1的含量较人参皂苷Re的含量高，西洋参中Rg1含量远低于Re，人参茎叶中Rg1含量高于Re。

2.人参里含有人参皂苷Rf，人参茎叶和西洋参里不含有。

3.人参中人参皂苷Rb1含量低于西洋参，人参茎叶中不含Rb1。

实施例4

测定人参中加入不同比例的西洋参后测定的指纹图谱及含量数据

色谱条件与***适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱：检测波长为203nm。理论塔板数按人参皂苷Rg1峰计算不得低于6000。液相条件见表8

表8

对照品溶液制备精密称定人参皂苷Rg1对照品，人参皂苷Re对照品，人参皂苷Rb1对照品，人参皂苷Rf对照品，加甲醇制成每1ml各含0.2mg的混合溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备分别取人参药材粉末(过四号筛)，西洋参药材粉末(过四号筛)约以人参粉：西洋参粉9:1，4:1和1:1混合各1g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流1小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒移入100ml锥形瓶中，精密加水饱和正丁醇50ml，密塞，放置过夜，超声处理(功率250W，50KHz)30分钟，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照溶液10μl与供试品溶液10-20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

测定结果见表9：

表9

结果表明：1.人参里掺入10％的西洋参Rg1的含量就不等于或者高于Re的含量了，随着加入量的增加Rg1与Re的比值越低。

2.人参皂苷Rf的含量也随着西洋参掺入量越多而越低。

实施例5人参须根占比30％

色谱条件与***适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱：检测波长为203nm。理论塔板数按人参皂苷Rg1峰计算不得低于6000。液相条件见表10。

表10

对照品溶液制备精密称定人参皂苷Rg1对照品，人参皂苷Re对照品，人参皂苷Rb1对照品，人参皂苷Rf对照品，加甲醇制成每1ml各含0.2mg的混合溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备分别取人参药材粉末(过四号筛)1g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流1小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒移入100ml锥形瓶中，精密加水饱和正丁醇50ml，密塞，放置过夜，超声处理(功率250W，50KHz)30分钟，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照溶液10μl与供试品溶液10-20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。测定结果见表11。

表11

结果表明：1.人参里掺入30％的须根Rg1的含量就不等于或者高于Re的含量了，随着加入量的增加Rg1与Re的比值越低；2.人参皂苷Rf的含量也随着人参须根掺入量越多而越低。

因此，为防止人参药材中掺入须根、人参叶和西洋参等常用杂质，本评价方法提出了一种标准，对于Rg1、Re、Rb1和Rf进行了相关研究和验证，提出了相应的标准，必须同时满足，即1.所形成的人参指纹图谱需要包括8个人参皂苷的特征峰，其中应包含有人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc和人参皂苷Rd；(必须含有相应的人参必须峰)；

1.供试品指纹图谱中人参皂苷Rf的含量≥0.05％；(即使掺入30％的须根，Rf也仅为0.045％，如果掺入是西洋参，Rf含量更低)

2.供试品指纹图谱中人参皂苷Rg1+Re含量不低于0.3％(见须根的数据)，且人参皂苷Rb1含量不低于0.1％(防止掺入人参茎叶)。

Claims (10)

1.一种人参药材质量的指纹图谱评价方法，其特征在于，包括供试品进样液和对照品的进样液制备、供试品和对照品的HPLC检测步骤和指纹图谱分析步骤，

所述供试品进样液和对照品的进样液制备包括，所述供试品为人参，所述供试品进样液制备包括人参经含水醇或低级醇加热回流，过滤，得到过滤液，精确取上层溶液蒸干得到残渣，所述残渣进行甲醇溶解得到供试品进样液，所述对照品为含有人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rf的溶液；

所述供试品和对照品的HPLC检测步骤中：流动相为水和乙腈，梯度洗脱，柱温20-40℃，流速0.8-1.2ml/min，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填充柱，检测UV波长为200-210nm；

得到供试品指纹图谱后，所述指纹图谱的分析步骤包括以下合格药材标准，同时满足以下A、B和C：

A 所形成的人参指纹图谱至少包括8个人参皂苷的特征峰，其中应包含有人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc和人参皂苷Rd；

B供试品指纹图谱中人参皂苷Rf的含量≥0.05％；

C供试品指纹图谱中人参皂苷Rg1+Re含量不低于0.3％，且人参皂苷Rb1含量不低于0.1％。

2.根据权利要求1所述的人参药材质量的指纹图谱评价方法，其特征在于，所述步骤C中同时满足Rg1：Re在1:1～3:1。

3.根据权利要求1所述的人参药材质量的指纹图谱评价方法，其特征在于，所述的含水醇为水饱和的正丁醇、含水乙醇、甲醇、乙醇以及其他含不超过5个碳的醇类。

4.根据权利要求1所述的人参药材质量的指纹图谱评价方法，其特征在于，所述UV波长为202-204nm。

5.根据权利要求1-4任一所述的人参药材质量的指纹图谱评价方法，其特征在于，所述供试品和对照品的HPLC检测步骤中：十八烷基硅烷键合硅胶填充柱；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱程序为，0～35分钟，流动相A19％，流动相B81％；35～55分钟，流动相A 19％→29％，流动相B81％→71％；55～70分钟，流动相A29％，流动相B71％；70～100分钟，流动相A29％→40％，流动相B71％→60％，柱温30℃，流速1ml/min，检测UV波长为203nm。

6.根据权利要求1-5任一所述的人参药材质量的指纹图谱评价方法，其特征在于，所述十八烷基硅烷键合硅胶填充柱为Agilent ZORBAX SB-C18 4.6*250mm，5μm或者InertsilODS-3.5μm 4.6×250mm色谱柱。

7.根据权利要求1所述的人参药材质量的指纹图谱评价方法，其特征在于，所述供试品指纹图谱包括8个人参皂苷峰，其中5号峰为人参皂苷Rb1对照峰，各特征峰的相对保留时间为：1号峰，0.42±10％、2号峰，0.44±10％、3号峰，0.86±10％、4号峰，0.90±10％，5号峰，1.00、6号峰，1.06±10％、7号峰，1.13±10％、8号峰，1.25±10％。

8.根据权利要求1所述的人参药材质量的指纹图谱评价方法，其特征在于，所得指纹图谱中人参皂苷Rg1的理论塔板数不低于6000。

9.根据权利要求1-8所述的人参药材质量的指纹图谱评价方法，其特征在于，所述供试品指纹图谱包括8个人参皂苷峰：1号峰为人参皂苷Rg1、2号峰为人参皂苷Re、3号峰为人参皂苷Rf、5号峰为人参皂苷Rb1、6号峰为人参皂苷Rb2+人参皂苷Rc、8号峰为人参皂苷Rd。

10.根据权利要求1-8所述的人参药材质量的指纹图谱评价方法，其特征在于，所述供试品优选人参粉末。

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