CN106868036A - 一种定点突变创制玉米紧凑株型种质的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种定点突变创制玉米紧凑株型种质的方法及其应用。本发明的培育紧凑株型玉米的方法，包括向目的玉米中导入玉米基因组编辑的载体，得到紧凑株型玉米，紧凑株型玉米与目的玉米相比，叶夹角变小；玉米基因组编辑的载体含有Cas9蛋白基因、sgRNA编码基因和RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子。采用本发明的方法能够实现对玉米的基因编辑，获得具有直立性状的紧凑型玉米，具有很高的育种和栽培价值。

Description

一种定点突变创制玉米紧凑株型种质的方法及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域中一种定点突变创制玉米紧凑株型种质的方法及其应用。
背景技术
玉米(Zea mays L.)是世界上重要的三大粮食作物之一，产量需要不断增长以满足当前和未来日益增长的需求。种植密度是影响单位面积产量的重要因素，数十年的玉米产量数据表明，种植密度的增加对总产量增长的贡献远高于单株产量的增加。因此，提高玉米单位面积的种植密度是提高总产量的可行方法之一(Brekke et al.,2011)。玉米无叶舌性状能使叶片直立、叶基角变小、光合面积变大、光能利用率提高，对发展耐密种植模式和提高群体产量都具有重要作用。单位面积的光捕获量与产量密切相关，而叶片直立玉米具有更高的种植密度和单位面积上更多的光捕获量(Lambert andJohnson,1978)，在水稻中也有同样的发现(Sinclair and Sheehy,1999)。叶片直立性状在玉米杂交种发展的文献中已有大量报道(Duvick,2005；Hammer et al.,2009)。因此，叶片直立性状有着很高的育种和栽培价值。
玉米叶舌是叶片与叶鞘交界处内侧的膜状突起，叶耳是叶舌两旁的一对从叶片基部边缘伸长出来的略如耳状的突出物。作为叶片和叶鞘的结合部，叶耳和叶舌使叶片与茎秆之间形成一定的角度。叶耳叶舌缺失突变体(liguleless mutants)缺失了叶耳和叶舌(Becraft and Freeling,1991；Fowler and Freeling,1996；Moon et al.,2013)，该突变体的杂交种在田间试验中表现出了增产潜力(Lambert and Johnson,1978)。我国紧凑型玉米育种的兴起受国际高光效育种和理想株型育种的影响，株型的改良可以为显著提高光合效率，株型育种和产量育种的结合，实际上就是高光效育种和理想型育种的结合。紧凑型玉米植株叶片斜举上冲，穗位以上叶夹角小于15°，一般透光性好，群体叶面积指数高，生物学产量高，适宜密植，是我国玉米高产、超高产的发展途径。玉米lg1突变体植株叶片直立，株型紧凑，且属于单基因隐性突变，即有表型即为纯合体，未发现其他不良性状，因此是发展紧凑型玉米的优良材料。
CRISPR/Cas9是基于细菌或古细菌规律成簇的间隔短回文重复CRISPR(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats)介导的获得性免疫***衍生而来的基因编辑技术。该技术通过RNA碱基互补配对识别DNA，指导Cas9核酸酶切割识别的双链DNA，诱发同源重组(HDR，homologous directed repair)或非同源末端链接(NHEJ，non-homologous end-joining)，进而实现目的DNA编辑。基于细菌II型免疫机制开发的基因编辑技术在植物特别是作物遗传改良上具有重大的应用前景。该技术的基本要求之一就是受体细胞内表达单分子识别RNA(sgRNA,single guidingRNA)，该分子负责识别特异性的基因编辑位点。然后介导结合Cas9蛋白行使DNA酶切活性，在设计的位点引入DNA双链断裂损伤，通过胞内的NHEJ或HDR修复途径引入突变。因此，sgRNA的表达是该技术的重要组成部分。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何培育紧凑株型玉米。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了培育紧凑株型玉米(叶夹角变小玉米)的方法。
本发明所提供的培育紧凑株型玉米(叶夹角变小玉米)的方法，包括向目的玉米中导入玉米基因组编辑的载体，得到紧凑株型玉米，所述紧凑株型玉米与所述目的玉米相比，叶夹角变小；
所述玉米基因组编辑的载体含有Cas9蛋白基因、sgRNA编码基因和RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子；所述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子启动所述sgRNA编码基因的转录；
所述sgRNA在玉米中识别的靶标DNA为编码LG1蛋白的DNA片段，所述LG1蛋白为a1或a2的蛋白质：
a1、氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
a2、在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的由a1衍生的蛋白质。
上述方法中，所述LG1蛋白是SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，含有399个氨基酸。
上述方法中，所述LG1蛋白的cDNA基因，的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，SEQID No.2的第248-1447位为所述LG1蛋白的编码序列。
上述方法中，所述sgRNA识别的靶位点序列为SEQ ID No.3所示的DNA分子。
上述方法中，所述sgRNA编码基因是SEQ ID No.4的第10087-10106位所示的DNA分子。
上述方法中，所述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子可为启动子ZmPolⅢca99，所述启动子ZmPolⅢca99是下述a)或b)或c)的DNA片段：
a)SEQ ID No.5所示的DNA分子；
b)与a)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；
c)在严格条件下与a)或b)限定的DNA序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。
上述方法中，所述叶夹角变小为穗位以上叶夹角变小。
为解决上述技术问题，本发明还提供了玉米基因组编辑的载体。
本发明所提供的玉米基因组编辑的载体，含有Cas9蛋白基因、sgRNA编码基因和RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子；所述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子启动所述sgRNA编码基因的转录；
所述sgRNA在玉米中识别的靶标DNA为编码LG1蛋白的DNA片段，所述LG1蛋白的为a1或a2的蛋白质：
a1、氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
a2、在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的由a1衍生的蛋白质。
上述载体还包括启动Cas9蛋白基因转录的启动子(如CaMV 35s增强型启动子)，终止Cas9蛋白基因转录的终止子(如NOS终止子)，复制子和抗性基因(如卡那霉素抗性基因)。
上述载体中，所述sgRNA识别的靶位点序列为SEQ ID No.3所示的DNA分子。
上述载体中，所述sgRNA编码基因是SEQ ID No.4的第10087-10106位所示的DNA分子。
上述载体中，所述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子可为启动子ZmPolⅢca99，所述启动子ZmPolⅢca99是下述a)或b)或c)的DNA片段：
a)SEQ ID No.5所示的DNA分子；
b)与a)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；
c)在严格条件下与a)或b)限定的DNA序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。
上述载体具体可为重组载体ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9，其核苷酸序列为SEQ IDNo.4所示。其中，SEQ ID No.4的第12309-16409位所示的核苷酸序列为Cas9蛋白基因，SEQ ID No.4的第208-884位所示的核苷酸序列为CaMV 35s增强型启动子，SEQ IDNo.4的第10087-10106位所示的核苷酸序列为sgRNA的编码基因，SEQ ID No.4的第9691-10086位所示的核苷酸序列为启动子ZmPolⅢca99，SEQ ID No.4的第16477-16729位所示的核苷酸序列为NOS终止子，SEQ ID No.4的第4407-4995位所示的核苷酸序列为复制子ori，SEQ ID No.4的第2188-2982位所示的核苷酸序列为卡那霉素抗性基因。
上述玉米基因组编辑的载体在培育紧凑株型玉米中的应用也属于本发明保护的范围。
上述重组载体ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9可通过使用农杆菌介导、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。
实验证明，采用含有重组载体ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9的重组农杆菌转化玉米植株，能够对LG1基因进行编辑，获得产生lg1移码基因纯合的植株(双等位lg1移码基因的序列相同)和lg1移码基因杂合的植株(双等位lg1移码基因的序列不同)，具有无叶耳的表型，而且叶夹角与野生型组相比显著减小，叶片直立，叶向值显著提高，为紧凑型玉米植株。采用本发明的方法能够实现对玉米的基因编辑，获得具有直立性状的紧凑型玉米，具有很高的育种和栽培价值。
附图说明
图1为重组载体ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9的结构示意图。
图2为玉米紧凑型突变株的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳。其中，M为DNA分子量Marker，wt代表野生型玉米自交系CA335，阳性对照为重组载体ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9,1-22均为实验组玉米。
图3为有表型(无叶耳)玉米突变型植株的外观形态。其中，A为野生型苗期，B为突变型苗期，C为野生型成熟期，D为突变型成熟期。
图4为sgRNA的SfcI酶切位点示意图。
图5为基因突变株的酶切鉴定。其中，wt为未经Sfc1酶切的野生型玉米自交系CA335植株的PCR扩增片段，1-5为经Sfc1酶切的野生型玉米自交系CA335植株的PCR扩增片段，6-10为经Sfc1酶切的纯合型突变体植株的PCR扩增片段，11-16为经Sfc1酶切的杂合型突变体植株的PCR扩增片段。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的玉米自交系-郑58，为河南农业科学院育成品种郑单958的母本，为国内玉米育种上常用材料，本材料取自中国农业科学院作物科学研究所国家种质资源库。
下述实施例中的Trans5α化学感受态细胞、pEASY-Uni Seamless Cloning andAssembly Kit均为北京全式金生物技术有限公司的产品。
下述实施例中的PEASY-blunt simple vector为北京全式金生物技术有限公司的产品，Trans T1感受态细胞为北京全式金生物技术有限公司的产品。
下述实施例中的琼脂糖凝胶回收试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司的产品，产品目录号为DP209。
下述实施例中的玉米自交系CA335(Chuanxiao Xie,Shihuang Zhang_,MinshunLi,Xinhai Li,Zhuanfang Hao,Li Bai,Degui Zhang,Yehong Liang.InferringGenome Ancestry and Estimating Molecular Relatedness Among 187Chinese MaizeInbred Lines.Journal of Genetics and Genomics(Formerly Acta Genetica Sinica).2007,34(8):738_748)公众可从中国农业科学院作物科学研究所(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、含有玉米RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子ZmPolⅢca99(下文简称启动子ZmPolⅢca99)的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建
一、启动子ZmPolⅢca99的克隆
取玉米自交系-郑58种子3-4粒，消毒浸种后，将其放入潮湿的石英沙盘中培育，待长出叶片，提取叶片基因组备用。以叶片基因组为模板，利用引物对ZmPolⅢca99-F(5’-AATTGGCCCTTACAAAATAG-3’)与ZmPolⅢca99-R(5’-GGAGCGGTGGTCGCAGCTG-3’)进行PCR扩增，得到PCR扩增片段。将所得PCR扩增片段利用pEASY-Blunt Cloning Kit进行亚克隆，实验操作参照说明述进行，得到重组载体1。将获得的重组载体1转化入Trans5α化学感受态细胞中，培养过夜，挑取单克隆，扩大培养并测序，结果表明重组载体1中含有SEQ ID No.5所示的启动子ZmPolⅢca99序列，将该重组载体1命名为ZmPolⅢca99亚克隆载体。
二、含有启动子ZmPolⅢca99的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建
含有启动子ZmPolⅢca99的CRISPR/Cas9基因编辑载体，其核苷酸序列为SEQ IDNo.4。其中，SEQ ID No.4的第12309-16409位所示的核苷酸序列为Cas9蛋白基因，SEQ ID No.4的第208-884位所示的核苷酸序列为CaMV 35s增强型启动子，SEQ ID No.4的第10087-10106位所示的核苷酸序列为sgRNA的编码基因，SEQ ID No.4的第9691-10086位所示的核苷酸序列为启动子ZmPolⅢca99，SEQ ID No.4的第16477-16729位所示的核苷酸序列为NOS终止子，SEQ ID No.4的第4407-4995位所示的核苷酸序列为复制子ori，SEQ ID No.4的第2188-2982位所示的核苷酸序列为卡那霉素抗性基因。
通过HindⅢ限制性内切酶酶切CPB载体，获得线性载体。利用引物对ZmPolⅢca99(HindIII)-F与ZmPolⅢca99(Seed)-R从步骤一的ZmPolⅢca99亚克隆载体中扩增启动子ZmPolⅢca99片段，并使启动子ZmPolⅢca99片段上游携带与线性化载体一端具有15bp同源序列的核苷酸片段，启动子ZmPolⅢca99片段下游携带Cas9目标序列中GCGGAGACTAAGTGGCTGTA片段，得到启动子ZmPolⅢca99片段1。通过PCR技术利用引物sgRNA(LG)-F与sgRNA(HindIII)-R将合成的sgRNA scaffold模板的上游加GCGGAGACTAAGTGGCTGTA序列，下游增加与线性化载体具有15bp同源序列的核苷酸片段，得到sgRNA的编码基因片段1。通过pEASY-Uni Seamless Cloning and AssemblyKit将线性载体、启动子ZmPolⅢca99片段1和sgRNA的编码基因片段1实现无缝连接克隆，得到重组载体ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9。将重组载体ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9转化至Trans5α感受态细胞中，培养过夜，挑取单克隆，扩大培养并测序。测序结果表明重组载体ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9的核苷酸序列为SEQ IDNo.4，即为含有启动子ZmPolⅢca99的CRISPR/Cas9基因编辑载体(图1)。
所用引物：
sgRNA(LG)-F:GCGGAGACTAAGTGGCTGTAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA
sgRNA(HindⅢ)-R:TGCACTGCACAAGCTTAAAAAAAGCACCGACTCG
ZmPolⅢca99(HindIII)-F:GGCCAGTGCCAAGCTTAATTGGCCCTTACAAAATAGCTA；
ZmPolⅢca99(Seed)-R:TACAGCCACTTAGTCTCCGCGGAGCGGTGGTCGCAGCTGA。
实施例2、培育玉米紧凑型突变株及其验证
一、重组农杆菌的构建
将实施例1得到的重组载体ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9转化农杆菌EHA105感受态细胞，得到重组农杆菌。将重组农杆菌提取质粒，进行测序，测序结果表明重组载体ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9成功转入农杆菌EHA105感受态细胞中，重组农杆菌构建正确。
二、培育玉米紧凑型突变株
将步骤一构建好的重组农杆菌通过诱导转化进入玉米自交系CA335幼胚中经过筛选、脱分化和再分化，获得完整的再分化植株。具体步骤如下：
1、接种
授粉后9-15d内，当幼胚长到1.8-2.2mm时，将整个果穗取回室内，用70％酒精对果穗消毒，每去1层皮用70％酒精棉消毒1次，待完全去皮后，用0.1％的升汞灭菌约10min。再用解剖刀自上而下逐行削去种皮和胚乳，用镊子从子粒中上部挑出幼胚，加入适量重悬好的OD值为0.5-0.6的步骤一制备的重组农杆菌菌液，浸泡15-20min，此间要不时的摇动。浸泡完后，弃菌液，用无菌滤纸吸干多余的菌液。将盾片向上置于经高压灭菌盛有N6诱导培养基的培养皿内，置于26℃培养箱进行暗培养，约3-5d时小心去除长出的幼芽和根，继续培养。
2、继代
继代3-4次的胚性愈伤组织最适作转基因受体材料，每隔3周继代1次，共继代3次。接种后第11周挑选胚性愈伤组织，将胚性愈伤组织夹碎成2.5-3mm大小的小块，按每瓶3块愈伤的方式转移到分化培养基进行再分化培养。
3、分化
胚性愈伤组织转接到再分化培养基后在相同温度下每天l2-16h光照培养，光照强度约为2000lx。转化筛选及除菌，同时诱导再生植株，两周继代一次，得到幼苗，即为重组农杆菌转化的玉米植株幼苗。
三、玉米紧凑型突变株的鉴定
1、PCR扩增检测
1)当步骤二的重组农杆菌转化的玉米植株幼苗长到3-4叶时，得到重组农杆菌转化的玉米植株，对重组农杆菌转化的玉米植株提取DNA，取2cm2新鲜叶片放入干净的研钵中，研钵需加液氮预冷，取来的叶片放入液氮中，然后用研杵将叶片研成粉末。
2)用移液枪加入800μL的65℃预热的CTAB缓冲液(配制500mL的CTAB提取缓冲液：加入50mL浓度为1M，pH7.5的Tris溶液，70mL浓度为5M的NaCl溶液，50mL浓度为0.5M，pH8.0的EDTA溶液，5.0g CTAB，5.0mL浓度为14Mβ-巯基乙醇溶液，325mL ddH2O，现用现配),迅速剧烈振荡使研磨样品浸入抽提液中。65℃水浴加热15min，水浴过程中要颠倒混匀几次。水浴后，取出离心管，冷却至室温。
3)通风橱下加入800μL的氯仿：异戊醇(v：v＝24：1)混合液，轻轻倒转摇动10min之后离心12000rpm，10min，将上清转至一新的2mL离心管中。
4)加入3μL的RNase溶液，室温下或37℃下温浴0.5-1h。
5)重复3步骤，将上清转入新的1.5mL的离心管中。
6)加入0.7倍体积预冷(-80℃)的异丙醇，轻轻混匀至DNA析出凝集，在12000rpm条件下离心10min，弃上清(小心DNA倒出)。
7)加入700μL的70％乙醇，洗涤1－2次。
8)室温晾干后加入50μL的ddH2O溶解DNA。
9)配制2％的琼脂糖凝胶检测提取的DNA样品，即为重组农杆菌转化的玉米植株的DNA。
10)以步骤9获得的重组农杆菌转化的玉米植株的DNA为模板，以ZmPolⅢca99-Ubi-F1和ZmPolⅢca99-Ubi-R1为引物进行PCR扩增反应，检测重组农杆菌转化的玉米植株中是否含有Cas9蛋白基因片段，记为实验组。野生型玉米自交系CA335的DNA提取方法同重组农杆菌转化的玉米植株的DNA提取方法，以重组载体ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9为阳性对照。
表1、引物设计
表2、PCR反应体系配置
PCR反应条件
PCR扩增产物用2％的琼脂糖凝胶检测，并用紫外凝胶成像仪成像检测。
结果如图2所示，22株实验组的重组农杆菌转化的玉米植株的PCR扩增产物中均含有421bp的目的片段，野生型玉米自交系CA335不含有421bp的目的片段，表明重组载体ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9成功转化入重组农杆菌转化的玉米植株。
2、突变类型的分子检测
为分析目标序列的突变类型，以LG1基因Cas9目标序列为核心，以重组农杆菌转化的玉米植株的DNA为模板，使用Primer Premier 6.0在其上下游设计引物F-lg1-E1和R-lg1-E1，得到PCR产物，通过PEASY-blunt simple vector构建亚克隆，将连接好的亚克隆载体转化至Trans T1感受态细胞中，培养过夜，挑取单克隆，扩大培养并测序，统计突变类型。野生型玉米自交系CA335的PCR扩增产物含有SEQ ID No.2的第563-585位所示的DNA片段，将该扩增片段对应的基因命名为LG1基因；重组农杆菌转化的玉米植株中PCR扩增产物不含有SEQ ID No.2的第563-585位所示的DNA片段的植株即为突变体植株，将该扩增片段对应的基因命名为lg1基因。分子检测所用引物：
F-lg1-E1:GCCAACACCGCCGTATTAG
R-lg1-E1:GATCCAGTGATGACCGAGTG
突变率＝全部转化事件突变基因总数/全部转化事件数＝(纯合突变株数×2+杂合突变株数)/全部转化事件数×100％。
共检测重组农杆菌转化的玉米植株113株，其中纯合突变株数为104株，杂合突变株数为1株，突变率为92.48％。纯合突变株和杂合突变株均记为突变体。
玉米基因组为二倍体，lg1基因为隐性基因，LG1基因为显性基因。LG1基因经CRISPR/Cas9蛋白编辑后，会产生移码突变和非移码突变的lg1基因，将产生移码突变的lg1基因命名为lg1移码基因，将产生非移码突变的lg1基因命名为lg1非移码基因。本实验的结果表明，113株重组农杆菌转化的玉米植株中，有15株lg1移码基因纯合的植株(双等位lg1移码基因的序列相同)，均无叶耳；有9株含有LG1基因的植株，均有叶耳；有3株lg1非移码基因纯合的植株(双等位lg1非移码基因的序列相同)，均有叶耳；有46株lg1移码基因杂合的植株(双等位lg1移码基因的序列不同)，均无叶耳；有40株lg1移码基因和lg1非移码基因的杂合型植株，均有叶耳。玉米叶片无叶耳会导致叶夹角变小，叶片直立。
3、野生型与突变体叶向值测定
玉米叶向值：用于表示玉米株叶形态的参数。其测量方法为：从步骤2的15株lg1移码基因纯合的植株(双等位lg1移码基因的序列相同)中随机选取7株，记为突变体组，将玉米自交系CA335记为野生型组，每株测量穗位叶以上叶子数值。n表示测定的叶片数，θ为叶片与茎秆垂直方向的夹角(度)，L为叶长(单位：厘米)，Lf为叶基至叶最高点的距离(单位：厘米)，计算方法为：lov(叶向值)＝[∑(90°-θ)(Lf/L)]/n。
表3、野生型与突变体的叶向值测定
结果如表3所示，突变体组的lov为67.78，野生型组的lov为48.75，突变体组的叶夹角与野生型组相比显著减小，叶片直立，叶向值显著提高，为紧凑型玉米植株(图3中B和D)。
4、玉米lg1基因突变体的酶切鉴定
参照B73基因组(B73AGPv3.0)中LG1基因序列搜寻LG1基因中所有G(N20)GG序列，最终在第1外显子上选取“GCGGAGACTAAGTGGCTGTA”序列为Cas9靶位点，该位点的C16-A20及相邻的PAM第一个碱基G为限制性内切酶SfcI的酶切位点(图4)，同时该酶切位点包含了Cas9蛋白的编辑位点。启动子ZmPolⅢca99启动起始碱基为G1，靶位点切口为T17，PAM序列为GGG，以此序列作为sgRNA seed引导Cas9蛋白对基因组中LG1基因中的第1外显子位置进行剪切产生缺口，经胞内的NHEJ或HDR修复途径引入突变，突变后盖酶切位点消失，目的片段lg1不可被限制性内切酶SfcI酶切。
以步骤2中获得的突变体植株和野生型玉米自交系CA335植株叶片为实验材料，分别提取基因组DNA。
表4、引物设计相关信息
PCR反应体系
PCR反应条件
PCR扩增产物用2％的琼脂糖凝胶检测，并用紫外凝胶成像仪成像检测；用琼脂糖DNA回收试剂盒回收目的片段。
酶切鉴定
酶切体系：50μL
DNA质量：300ng
酶切时间：2h
片段大小：553bp
酶切后片段大小：340bp、213bp
结果如图5所示，LG1基因可以被Sfc1酶切，酶切后片段大小为340bp和213bp；lg1基因无法被Sfc1酶切，片段大小仍为553bp。杂合体因分别含有LG1和lg1基因，因此酶切后片段为三条，即553bp、340bp和213bp。通过Sfc1酶切即可鉴定野生型玉米自交系CA335植株(LG1LG1)、纯合突变株(lg1lg1)和杂合突变株(LG1lg1)。

Claims (10)

1.培育紧凑株型玉米的方法，包括向目的玉米中导入玉米基因组编辑的载体，得到紧凑株型玉米，所述紧凑株型玉米与所述目的玉米相比，叶夹角变小；
所述玉米基因组编辑的载体含有Cas9蛋白基因、sgRNA编码基因和RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子；所述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子启动所述sgRNA编码基因的转录；
所述sgRNA在玉米中识别的靶标DNA为编码LG1蛋白的DNA片段，所述LG1蛋白为a1或a2的蛋白质：
a1、氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
a2、在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的由a1衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述sgRNA识别的靶位点为SEQ IDNo.3所示的DNA分子。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述sgRNA编码基因是SEQ IDNo.4的第10087-10106位所示的DNA分子。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子为启动子ZmPolⅢca99，所述启动子ZmPolⅢca99是下述a)或b)或c)的DNA片段：
a)SEQ ID No.5所示的DNA分子；
b)与a)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；
c)在严格条件下与a)或b)限定的DNA序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述叶夹角变小为穗位以上叶夹角变小。
6.权利要求1所述的玉米基因组编辑的载体，含有Cas9蛋白基因、sgRNA编码基因和RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子；所述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子启动所述sgRNA编码基因的转录；
所述sgRNA在玉米中识别的靶标DNA为编码LG1蛋白的DNA片段，所述LG1蛋白为a1或a2的蛋白质：
a1、氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
a2、在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的由a1衍生的蛋白质。
7.根据权利要求6所述的载体，其特征在于：所述sgRNA识别的靶位点为SEQ IDNo.3所示的DNA分子。
8.根据权利要求6或7所述的载体，其特征在于：所述sgRNA编码基因是SEQ IDNo.4的第10087-10106位所示的DNA分子。
9.根据权利要求6-8中任一所述的载体，其特征在于：所述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子为启动子ZmPolⅢca99，所述启动子ZmPolⅢca99是下述a)或b)或c)的DNA片段：
a)SEQ ID No.5所示的DNA分子；
b)与a)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；
c)在严格条件下与a)或b)限定的DNA序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。
10.权利要求6-9中任一所述的载体在培育紧凑株型玉米中的应用。
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