CN116548300A - 一种改良玉米耐密产量的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种改良玉米耐密产量的方法及其应用，属于植物生物技术育种领域。纯合lg1突变体具有果穗较小、产量较低、空杆率较高等不利农艺性状，本申请提供了一种新的耐密育种方法，通过将lg1突变体株系与LG1野生型株系进行杂交，获得LG1/lg1杂合基因型材料。相比LG1野生型株系，该LG1/lg1杂合基因型材料减小了玉米叶夹角和雄穗分枝数，并增加了高密度条件下的产量；与lg1突变体相比，LG1/lg1杂合基因型材料具有叶片变宽、果穗变大、空杆率降低、密植增产等优良农艺性状，该育种方法在玉米耐密高产育种领域具有广阔的应用前景。

Description

一种改良玉米耐密产量的方法及其应用
技术领域
本发明属于植物生物技术育种领域，具体涉及利用LG1/lg1杂合基因型在玉米耐密产量改良方面方法及其应用。
背景技术
玉米是我国的第一大农作物，对我国的粮食安全和农业发展有着举足轻重的作用。然而，耕地面积的制约(中国的可耕耕地面积仅占世界耕地面积的7%，却面临着要养活~20%的世界总人口)，迫使我们不得不把提高单位面积的产量作为提高我国玉米产出的主要手段；并且，相较而言，我国玉米的平均产量仅仅为美国的60%，提升的潜力和空间巨大。
研究表明，提高品种耐密性和种植密度是提高玉米单产的关键。在过去80年里，美国玉米的种植密度从20世纪30年代的~30000株/公顷提高到了现在的~70000株/公顷(62000-104000 株/公顷)；同时，玉米单产也从20世纪30年代的1287 公斤/公顷提高到2010年的9595 公斤/公顷 (USDA-NASS, 2012)；而这个过程中玉米的单株产量和杂种优势的增加并不明显，单产的提升更多的是由于品种耐密性和种植密度的持续增长。而对中国不同年代玉米品种的研究也显示，近现代的品种相较于早期品种，在光合效率、抗倒性、空秆率和产量等方面都在向着更加耐密的方向发展。因此，提高品种耐密性和种植密度是现代玉米育种和生产中的重要目标和趋势。
降低植株的茎叶夹角和减小玉米雄穗分枝数是提高玉米耐密性的关键。较小的茎叶夹角和较少的雄穗分枝数可以最大程度上减少玉米植株之间的相互遮荫，改善田间整体的冠层结构，增强植株间的通风透光性，更利于玉米功能叶（穗位叶、穗上第一叶和穗下第一叶）捕获阳光和进行光合作用，利于玉米高产；同时良好的通风透光还将大大增加植株下层的红光/远红光（R/FR）的比例，减少密植避荫反应造成的茎秆徒长、根系变弱、茎秆强度降低等不利影响，利于玉米稳产。较小的雄穗会减轻因过量的花粉散落，从而减轻因下层叶片上粉尘的黏着而利于光合作用，利于“源”的供给。并且，雄穗是重要的“库”器官，且发育比雌穗早，在营养竞争上明显比雌穗优越，较小的雄穗利于节省能量，而利于玉米雌穗收获产量的提升。不同单位的研究都表明，现代玉米育种过程中叶夹角和雄穗分枝数都向着越来越小的方法改良，而这种趋势和玉米耐密性的提升是高度相关的，这也从另一个侧面反映的叶夹角和雄穗分枝数对玉米耐密育种的重要性。
降低玉米空杆率对提高玉米耐密性也至关重要。玉米空秆是指茎杆上不结果穗或有果穗但发育不好没有结籽粒的现象。密植空秆将直接影响产量三要素 (单位面积的果穗数、单穗粒数及百粒重)，从而严重影响玉米产量。玉米密植后会造成空秆率的显著升高。对玉米不同密度下的农艺性状与产量的关系进行分析发现，空秆率对产量的影响会随着种植密度的增加而快速提升，种植密度越高空秆率对产量的负面影响越大。密植空秆一般可使玉米产量降低15-20%，严重者可降低60%以上，是限制玉米密植产量提高的重要因素之一。因此，降低密植条件下的空杆率对提高玉米耐密性也至关重要。
研究发现，LG1基因是调控玉米、水稻、小麦等禾本科作物叶夹角变化的关键基因。已有研究表明，纯合lg1能同时减小植株叶夹角和雄穗分枝数，株型上有利于耐密的条件。但发明人发现，其无叶耳叶舌易造成害虫、病原菌从叶鞘侵入而增加病虫危害风险，并且前人实验表明纯合lg1突变体并不具有在高密度条件下增产的效果（5000株/亩和6000株/亩，参考文献Lambert RJ, Johnson RR: Leaf Angle, Tassel Morphology, and thePerformance of Maize Hybrids. Crop Science. 1978, 18(3):499-502）。因此，生产上能减小叶夹角和雄穗分枝数，但能正常产生叶耳叶舌，同时果穗不显著减小、空杆率不增加的育种策略和方法，在玉米耐密育种领域将具有广阔的应用前景。
发明内容
本文提到的所有参考文献都通过引用并入本文。除非有相反指明,本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非有相反指明,本文所使用的或提到的技术是本领域普通技术人员公知的标准技术。材料、方法和例子仅作阐述用,而非加以限制。
本申请提供了一种改良的耐密育种方法，所述方法通过将lg1突变体株系与LG1野生型株系进行杂交，获得LG1/lg1杂合基因型株系，所述杂合基因型株系具有优良的耐密性状。
可选地，所述优良的耐密性状包括：玉米叶夹角减小、雄穗分枝数减少、叶片变宽、果穗变大、空杆率降低和/或密植增产。具体 ，相比LG1野生型株系，该LG1/lg1杂合基因型材料减小了玉米叶夹角和雄穗分枝数，并且密植增产；与lg1突变体相比，叶片变宽、果穗变大、空杆率降低、密植增产和/或抗病虫害能力增强。本领域技术人员知悉，植株叶片变宽能使叶片更有效的截获太阳光，利于光合作用，进而利于产量的提升。
可选地，所述野生型LG1基因的多核苷酸序列选自下列组的序列之一：
（a）如SEQ ID No：1、2或3所示的多核苷酸序列；
（b）其编码氨基酸序列如SEQ ID No：4所示的多核苷酸序列；
（c）在严谨杂交条件下能够与（a）或（b）中所述多核苷酸序列进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸序列的纯合突变具有使植物叶舌和叶耳完全缺失、叶夹角变小、叶片直立、叶片变窄、雄穗分枝数减少、空杆率升高和/或果穗变小的功能；
（d）与（a）-（c）任一所示的多核苷酸序列至少有90%、95%、98%或以上相似性的多核苷酸序列，该多核苷酸序列的纯合突变具有使植物叶舌和叶耳完全缺失、叶夹角变小、叶片直立、叶片变窄、雄穗分枝数减少、空杆率升高和/或果穗变小；或
（e）与（a）-（d）之任一所述序列互补的多核苷酸序列。
可选地，本申请实施例所提供的LG1基因，还包括与本发明实施例所公开的多核苷酸序列有至少80％、85%、90%、95%、98％或99％序列相似性的同源基因，或者与本发明实施例所公开的LG1的氨基酸序列有至少90%、95％或98％序列相似性的同源基因，且所述同源基因内源纯合突变后，具有使植株叶舌和叶耳完全缺失、叶夹角变小、叶片直立、叶片变窄、雄穗分枝数减少、空杆率升高和/或果穗变小的功能，所述同源基因可以从任何植物中分离获得。
可选地，本申请所提供的方法可应用于任一种含有LG1同源基因的植物。优选地，所述植物包括玉米、粟、小麦、大麦、黑麦、稻和高粱等单子叶植物。
本申请中所述的序列相似性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括Myers和Miller算法、Needleman-Wunsch全局比对法、Smith-Waterman局部比对法、Pearson和Lipman相似性搜索法、Karlin和Altschul的算法，这对于本领域技术人员来说是公知的。
本领域技术人员应该知晓，同一种植物不同品种间的同一基因存在单核苷酸多样性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)，即同一基因的核苷酸序列往往存在个别碱基的差异，但同一作物品种数量很多，发明人不可能进行一一列举，本申请实施例仅提供了玉米作物中具有代表性的品种的序列。因此，本领域技术人员应该知悉，不同品种来源的与本发明所披露的LG1基因及其核苷酸序列存在SNP的核苷酸序列，利用其突变得到的纯合突变体株系与野生型进行杂交，获得叶片变宽、果穗变大、空杆率降低和/或密植增产等性状的方法和应用，也在本发明的保护范围内。
可选地，所述的lg1突变体株系通过突变的方式获得，所述突变包括在该基因的核苷酸序列上进行一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或添加。
可选地，所述突变通过物理诱变、化学诱变、ZFN、TALEN 和/或CRISPR/Cas基因编辑等技术获得。
可选地，在使用CRISPR/Cas进行玉米植株基因编辑时，其靶位点序列如SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6所示。
可选地，所述lg1突变体具有的基因组突变体核苷酸序列如下列组的序列之一：
（a）包含整个SEQ ID No.1的核苷酸序列都被删除掉的基因组突变体核苷酸序列；
（b）SEQ ID No.1或SEQ ID No.2第743-764bp的核苷酸序列，或SEQ ID No.3第229-250bp的核苷酸序列被替换为5’-TTCCGCCGCCGTCC-3’ 的基因组突变体核苷酸序列；
（c）SEQ ID No.1或SEQ ID No.2第766-835bp的核苷酸序列，或SEQ ID No.3第252-321bp发生序列缺失的基因组突变体核苷酸序列；或
（d）SEQ ID No.1或SEQ ID No.2第836bp的核苷酸序列，或SEQ ID No.3第322bp发生单个核苷酸缺失的基因组突变体核苷酸序列。
可选地，所述密植是指玉米种植密度大于或等于4000株/亩，优选大于或等于5000株/亩。
可选地，本申请还提供了将前述任一所述的方法在玉米育种中的应用，优选地，包括但不限于在使植株叶夹角变小、叶片变宽、雄穗分枝数减少、空杆率降低、密植增产等方面的应用方面的应用。
具体地，其中所述的密植增产，是指在高密度种植条件下玉米产量增加，所述高密度是指大于或等于4000株/亩，优选大于或等于5000株/亩。
本申请还提供了一种非作为繁殖材料的植物细胞、组织、器官或商业产品，所述植物细胞、组织、器官或商业产品含有杂合的LG1/lg1基因型。所述杂合LG1/lg1基因型，是指植物细胞、组织、器官或商业产品中同时含有野生型的LG1基因和突变体lg1。
本申请还提供了一种调控玉米植株农艺性状的方法，其特征在于，通过突变植株内源基因，获得纯合突变体，所述纯合突变体具有叶舌和叶耳完全缺失、叶夹角变小、叶片直立、叶片变窄、雄穗分枝数减少、空杆率升高和/或果穗变小的表型，所述内源基因的多核苷酸序列选自下列组的序列之一：
（a）如SEQ ID No：1、2或3所示的多核苷酸序列；
（b）其编码氨基酸序列如SEQ ID No：4所示的多核苷酸序列；
（c）在严谨杂交条件下能够与（a）或（b）中所述多核苷酸序列进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸序列的纯合突变具有使植株叶舌和叶耳完全缺失、叶夹角变小、叶片直立、叶片变窄、雄穗分枝数减少、空杆率升高和/或果穗变小的功能；
（d）与（a）-（c）任一所示的多核苷酸序列至少有90%、95%、98%或以上相似性的多核苷酸序列，该多核苷酸序列的纯合突变具有使植株叶舌和叶耳完全缺失、叶夹角变小、叶片直立、叶片变窄、雄穗分枝数减少、空杆率升高和/或果穗变小的功能；或
（e）与（a）-（d）之任一所述序列互补的多核苷酸序列。
可选地，本申请实施例中所述的将核苷酸序列、载体、构建体或表达盒转入植株或引入植株或对植株进行转化，均指通过常规的转基因方法或与目标转基因植株进行杂交的方法，将目标核苷酸序列、构建体、载体或表达盒转入到受体细胞或受体植株中。本领域技术人员知悉的任何转基因方法均可被用于将重组表达载体转化进植物细胞中，以产生本申请实施例的转基因植物或突变体。转化方法可包括直接或间接的转化方法。具体地，所述转化方法包括但不限于聚乙二醇诱导的DNA摄入、脂质体介导的转化、使用基因枪导入、电穿孔、显微注射、以及农杆菌介导的植物转化方法等。
与现有技术相比，本申请具有如下有益效果：
（1）本申请提供了一种改良玉米耐密产量的方法及其应用，通过将lg1突变体株系与LG1野生型株系进行杂交，获得LG1/lg1杂合基因型株系，与lg1突变体株系相比，LG1/lg1杂合基因型株系具有叶片变宽、果穗变大、空杆率降低和/或密植增产等优良农艺性状；与LG1野生型株系相比，该LG1/lg1杂合基因型材料减小了玉米叶夹角和雄穗分枝数，并且具有密植增产的效果；在耐密高产育种中，解决了lg1突变体具有叶夹角变小，叶片直立的耐密性状，却产量降低、抗病虫害能力降低、空杆率增加的技术问题。
（2）本申请所提供的方法，为培育耐密高产的作物新品种尤其是玉米新品种提供了可能, 对全球粮食安全和农业可持续发展具有重要意义。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
在本申请上下文中，术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。
本申请中术语“同源基因”是指序列相似性达80％的两条或多条基因序列，其包括直向同源基因(又称为垂直同源基因、正同源基因或定向进化同源基因)、横向同源基因(又称为旁系同源基因、并系同源基因或平行进化同源基因)和/或异源同源基因。
术语序列“相似性”是指两条序列之间的相似程度，是一种量化的概念，用于比较不同序列之间的相似程度，从而发现和分析两个序列之间的关联。序列相似性可以用来比较基因序列、蛋白质序列、DNA 序列等。本申请中所述“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高（例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100%互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献（Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid assays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点（Tm）约5-10℃。Tm为在平衡状态下50%与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度（在指定离子强度、pH和核酸浓度下）（因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50%的探针被占据）。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0 M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0 M钠离子浓度（或其它盐），并且温度对于短探针（包括（但不限于）10到50个核苷酸）而言为至少约30℃，而对于长探针（包括（但不限于）大于50个核苷酸）而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50%甲酰胺，5×SSC和1% SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1% SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1% SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。
术语“重组表达载体”：一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。
术语“叶夹角”是指叶片的中脉与该叶片叶枕所接触的上部茎秆形成的夹角。
术语“杂交”，为广义的杂交，指不同种群或基因型个体间配子结合产生杂种的过程，根据亲本亲缘关系的不同，包括近缘杂交和远缘杂交。
本申请中lg1突变体、lg1纯合突变体或lg1/lg1突变体均指lg1纯合突变体。
附图说明
图1为野生型与lg1突变体的对比分析。其中，图1A为B73自交系及所获得B73背景lg1突变体的序列情况,LG1-WT是B73野生型，LG1-MT是B73背景的lg1突变体；图1B为B73自交系及B73背景lg1突变体的整株株型情况对比；图1C为B73自交系及所获得B73背景lg1突变体的叶夹角情况对比；图1D为B73自交系及所获得B73背景lg1突变体的叶耳、叶舌情况对比。
图2为LG1野生型、杂合型及突变体纯合型材料的性状对比分析。其中，图2A为B73背景下LG1/LG1野生型、LG1/lg1杂合基因型和lg1/lg1纯合突变体材料的整株株型对比照片；图2B和图2E分别为B73背景下LG1/LG1野生型、LG1/lg1杂合基因型和lg1/lg1纯合突变体材料的叶夹角对比照片和统计情况；图2C和图2F为B73背景下LG1/LG1野生型、LG1/lg1杂合基因型和lg1/lg1纯合突变体材料的雄穗对比照片及雄穗分枝数统计情况；图2D和图2G为B73背景下LG1/LG1野生型、LG1/lg1杂合基因型和lg1/lg1纯合突变体材料的果穗对比照片及穗重统计情况。
图3为所获得的PH4CV和PH6WC玉米自交系背景下LG1基因的突变情况。
图4为PH6WC、PH4CV和B73自交系背景下LG1/LG1野生型、LG1/lg1杂合基因型和lg1/lg1纯合突变体材料在不同密度条件下的叶夹角对比照片及其统计情况。LD：3000株/亩，MD：6000株/亩，HD：9000株/亩。
图5为PH4CV和PH6WC自交系背景下LG1/LG1野生型、LG1/lg1杂合基因型和lg1/lg1纯合突变体材料在不同密度条件下的雄穗对比照片及雄穗分枝数统计情况。LD：3000株/亩，MD：6000株/亩，HD：9000株/亩。
图6为杂交种B73/PH6WC、B73/PH4CV和PH6WC/PH4CV背景下LG1/LG1野生型、LG1/ lg1杂合基因型和lg1/lg1纯合突变体材料在不同密度条件下的叶夹角照片及其统计情况。LD：3000株/亩，MD：5000株/亩，HD：7000株/亩。
图7为杂交种B73/PH6WC和B73/PH4CV背景下LG1/LG1野生型、LG1/lg1杂合基因型和lg1/lg1纯合突变体材料在不同密度条件下的雄穗对比照片及雄穗分枝数统计情况。LD：3000株/亩，MD：5000株/亩，HD：7000株/亩。
图8为不同株系在不同密度条件下的空杆率统计分析。其中，图8A、图8B和图8C分别为B73、PH4CV和PH6WC自交系背景下LG1/LG1野生型、LG1/lg1杂合基因型和lg1/lg1纯合突变体材料在不同密度条件下的空杆率统计情况；图8D、图8E和图8F分别为杂交种B73/PH4CV、B73/PH6WC和PH6WC/PH4CV背景下LG1/LG1野生型、LG1/lg1杂合基因型和lg1/lg1纯合突变体材料在不同密度条件下的空杆率统计情况。LD：3000株/亩，MD：6000株/亩，HD：9000株/亩。
图9杂交种B73/PH6WC、B73/PH4CV和PH6WC/PH4CV背景下LG1/LG1野生型、LG1/lg1杂合基因型和lg1/lg1纯合突变体材料在不同密度条件下的小区产量统计情况。
图10为不同自交系和杂交种背景的叶宽统计分析。其中，图10A和图10B分别为PH4CV和PH6WC自交系背景下LG1/LG1野生型、LG1/lg1杂合基因型和lg1/lg1纯合突变体材料在不同密度条件下的叶宽统计情况；图10C和图10D分别为杂交种B73/PH4CV和PH6WC/PH4CV背景下LG1/LG1野生型、LG1/lg1杂合基因型和lg1/lg1纯合突变体材料在不同密度条件下的叶宽统计情况。LD：3000株/亩，MD：6000株/亩，HD：9000株/亩。
实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
以下实施例中所用的自交系可从“中国作物种质信息网”得到相关信息和申请获取对应的种子。
实施例1. 利用“单倍体介导的基因编辑技术（IMGE）”快速创制B73自交系背景的lg1基因突变体
发明人前期巧妙地将单倍体诱导与基因编辑技术结合起来，开发了“单倍体介导的基因编辑技术 (IMGE)”。该方法的技术路线是：利用回交或遗传转化的方法将CRISPR/Cas9 载体导入单倍体诱导系中，之后利用携带有CRISPR/Cas9 载体的单倍体诱导系作为父本与商业化自交系杂交，获得单倍体，然后根据目标性状的变化和测序分析筛选出靶位点被编辑的单倍体，最后通过人工或自然染色体加倍获得纯合的经过基因编辑的双单倍体材料，从而实现在两代 (1年) 内创制性状改良且不含转基因成分的商业化种质双单倍体品系，大大加速作物育种的进程。IMGE技术打破了传统基因编辑受待改良材料遗传背景和遗传转化能力限制的困扰，2代内即可实现农艺性状定向改良，快速、高效，同时改良后的材料不携带外源转基因成分、易于商业化开发，尤其是对育种家非常友好，操作便捷：通过授粉就能实现基因编辑。
为了利用IMGE技术快速的创制B73背景的lg1突变体，我们构建了靶向LG1基因的基因编辑载体（其靶位点为SEQ ID No.5: 5’-GCGGAGACTAAGTGGCTGTAGGG-3’和SEQ IDNo.6:5’-GGGGGAGCATCACCATCAACTGC-3’），并将该载体遗传转化ZC01自交系，将所获得的突变率高的转基因事件与玉米单倍体诱导系CAU5杂交，之后与CAU5回交三代，获得BC3F1世代的含有LG1基因编辑载体的玉米单倍体诱导系——CAU5LG1-IMGE。该过程中有两个技术关键点：其一是利用基因载体上的Bar基因作为筛选标记保证靶向LG1基因的基因编辑载体保留在回交后代中，其二是通过测序鉴定保证源自CAU5的单倍体诱导等位基因Zmmtl和Zmdmp以纯合状态保留在回交后代中。
接着，利用CAU5LG1-IMGE对B73自交系进行IMGE单倍体诱导，成功获得了含有lg1突变的单倍体，并通过自然加倍获得了B73自交系背景下的lg1突变体 (图1)，该突变体不含有外源转基因成分(不含有CRISPR 载体)。测序分析发现该突变体中包含整个LG1基因编码区的8.8kb序列都被删除掉了（图1A），且其余的遗传背景几乎与B73一样。表型分析发现，B73-lg1纯合突变体叶舌和叶耳完全缺失，从而导致叶夹角变小、叶片直立（图1B-图1D）。
实施例2. B73背景下LG1/LG1野生型、LG1/lg1杂合基因型和lg1/lg1纯合突变体材料的表型分析
对比B73及B73背景下lg1纯合突变体发现，除了叶耳叶舌缺失、叶夹角变小外，纯合lg1/lg1突变体的叶片变窄(图1C和1D)，雄穗分枝数减少，且果穗明显变小（图2）。通常情况下，同时减小植株叶夹角和雄穗分枝数，株型上是有利于玉米耐密的，但lg1纯合突变体无叶耳叶舌易造成害虫、病原菌从叶鞘侵入而增加病虫危害风险，且果穗变小，这些因素极不利于玉米密植条件下的高产和稳产，预示着lg1/lg1纯合突变体不能真正实现耐密育种应用。
接着，我们通过杂交创制了B73背景下的LG1/lg1杂合基因型材料，结合LG1/LG1野生型和lg1/lg1纯合突变体分析表明（图2）：在玉米正常种植密度4500株/亩情况下，LG1/ lg1杂合基因型材料的叶夹角及雄穗分枝数都介于lg1/lg1纯合突变体和LG1/LG1野生型之间；而LG1/lg1杂合基因型材料拥有正常的叶耳叶舌，可有效的防治害虫、病原菌侵入叶鞘。更有意思的是，我们发现，在4500株/亩情况下，LG1/lg1杂合基因型材料的果穗大小几乎和纯合LG1/LG1野生型的一样，没有表现出果穗变小和减产的效应。叶夹角变紧凑、雄穗分枝数减少，同时果穗不变小，该结果表明LG1/lg1杂合基因型材料具有意想不到的耐密育种的应用潜力。
实施例3. 多个自交系背景下测试LG1/LG1野生型、LG1/lg1杂合基因型和lg1/lg1纯合突变体材料耐密效应
为了测试LG1/lg1杂合基因型材料的耐密育种应用潜力及其普适性，我们利用前期所创制的含有LG1基因编辑载体的玉米单倍体诱导系CAU5LG1-IMGE对骨干玉米自交系PH6WC和PH4CV进行了IMGE单倍体诱导，并成功获得了含有lg1突变的单倍体，并通过自然加倍获得了PH6WC和PH4CV自交系背景下的lg1突变体。其中获得PH4CV背景下的lg1基因突变体1个（图3），将其命名为PH4CV-lg1，其突变位点序列情况如图3所示，其基因组突变体核苷酸序列特征为：SEQ ID No.1或SEQ ID No.2第743-764bp的核苷酸序列，或SEQ ID No.3第229-250bp的核苷酸序列被替换为5’-TTCCGCCGCCGTCC-3’（SEQ ID NO:7）；PH6WC背景下的lg1基因突变体2个（图3），分别命名为PH6WC-lg1#1和PH6WC-lg1#2，其突变位点序列情况如图3所示，其中PH6WC-lg1#1基因组突变体核苷酸序列特征为：SEQ ID No.1或SEQ ID No.2第836bp，或SEQ ID No.3第322bp的核苷酸序列发生单个核苷酸缺失；PH6WC-lg1#2基因组突变体核苷酸序列特征为：SEQ ID No.1或SEQ ID No.2第766-835bp，或SEQ ID No.3第252-321bp的核苷酸序列发生序列缺失。接着通过杂交创制了PH6WC和PH4CV自交系背景的LG1/ lg1杂合基因型材料，其中PH6WC用PH6WC-lg1#1进行创制。
接着对PH6WC、PH4CV和B73自交系背景下LG1/LG1野生型、LG1/lg1杂合基因型和lg1/lg1纯合突变体材料进行田间严格密度实验处理。实验在2022年河北廊坊试验站开展，每个材料设立3个种植密度，分别为3000株/亩、6000株/亩和9000株/亩，每种材料和密度设3个重复，4行区种植，选取中间两行进行各个农艺性状的考察。表型分析发现，在不同自交系背景及不同种植密度条件下，LG1/lg1杂合基因型材料的叶夹角及雄穗分枝数都介于lg1/lg1纯合突变体和LG1/LG1野生型之间（图4和图5，B73背景的材料没有再重复统计），且LG1/lg1杂合基因型材料拥有正常的叶耳叶舌，可有效的防至害虫、病原菌侵入叶鞘。此外我们发现，不同自交系背景及不同种植密度条件下，lg1/lg1纯合突变体的空杆率较LG1/ lg1杂合基因型和LG1/LG1野生型材料都显著增高，lg1/lg1纯合突变体的叶宽较LG1/lg1杂合基因型和LG1/LG1野生型材料都显著变窄，表明LG1基因在玉米空杆率和叶宽调控方面也具有重要作用。更有意思的是，我们发现，不同自交系材料的相同种植密度条件下， LG1/ lg1杂合基因型材料的空杆率及叶宽与LG1/LG1野生型之间没有显著差异（图8A, 8B, 8C,图10A和10B）。LG1/lg1杂合基因型材料叶夹角变紧凑、雄穗分枝数减少，同时空杆率不增加、叶宽不变窄，预示着LG1/lg1杂合基因型材料具有意想不到的耐密育种的应用潜力。
实施例4 多个杂交种背景下测试LG1/LG1野生型、LG1/lg1杂合基因型和lg1/lg1纯合突变体材料耐密效应
为了测试LG1/lg1杂合基因型材料的在玉米杂交种耐密育种中的应用潜力及其普适性，接着对PH6WC、PH4CV和B73自交系背景下的不同LG1遗传材料进行杂交创制了不同的杂交种组合。接着对杂交种B73/PH6WC、B73/PH4CV和PH6WC/PH4CV背景下LG1/LG1野生型、LG1/lg1杂合基因型和lg1/lg1纯合突变体材料进行田间严格密度实验处理。实验在2022年河北廊坊试验站开展，每个材料设立3个种植密度，分别为3000株/亩、5000株/亩和7000株/亩，每种材料和密度设3个重复，4行区种植，选取中间两行进行各个农艺性状的考察。表型分析发现，同自交系种类似，在不同杂交种背景及不同种植密度条件下，LG1/lg1杂合基因型材料的叶夹角及雄穗分枝数都介于lg1/lg1纯合突变体和LG1/LG1野生型之间（图6和图7，PH6WC/PH4CV杂交种背景的材料没有统计雄穗分枝数），且LG1/lg1杂合基因型材料拥有正常的叶耳叶舌，可有效的防至害虫、病原菌侵入叶鞘；lg1/lg1纯合突变体的空杆率较LG1/lg1杂合基因型和LG1/LG1野生型材料都显著增高，lg1/lg1纯合突变体的叶宽较LG1/ lg1杂合基因型和LG1/LG1野生型材料都显著变窄，而LG1/lg1杂合基因型材料的空杆率及叶宽与LG1/LG1野生型之间没有显著差异（图8D, 8E, 8F, 图10C和10D）。
对不同杂交种材料的小区产量（单位面积产量）进行考察发现，在不同杂交种及不同密度条件下，lg1/lg1纯合突变体都较LG1/LG1野生型材料的小区产量显著降低，且在高密度条件下降低的更加厉害（图9），表明lg1/lg1纯合突变体尽管株型上有优势，但不能真正用于玉米常规产量育种及耐密育种。低密度条件下，LG1/lg1杂合基因型材料的小区产量较LG1/LG1野生型略微降低，但随着种植密度的增加，LG1/lg1杂合基因型材料的小区产量逐渐超越LG1/LG1野生型；在高密度条件下（≥5000株/亩或以上），LG1/lg1杂合基因型材料的小区产量较LG1/LG1野生型显著增加（图9），表明其具有密植增产的效果，并且在不同杂交种背景下都适用。综上，我们发现，LG1/lg1杂合基因型材料（较LG1/LG1野生型）具有促使不同密度条件玉米叶夹角变紧凑、雄穗分枝数减少，同时叶宽不变窄、空杆率不增加的效果，并且LG1/lg1杂合基因型材料可显著提高高密度条件下（≥5000株/亩）的玉米杂交种的单位面积产量。

Claims (11)

1.一种改良耐密育种的方法，其特征在于，将lg1突变体株系与LG1野生型株系进行杂交，获得LG1/lg1杂合基因型株系，所述杂合基因型株系具有优良的耐密性状。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述优良的耐密性状包括：玉米叶夹角减小、雄穗分枝数减少、叶片变宽、果穗变大、空杆率降低和/或密植增产。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述的LG1基因的多核苷酸序列选自下列组的序列之一：
（a）如SEQ ID No：1、2或3所示的多核苷酸序列；
（b）其编码氨基酸序列如SEQ ID No：4所示的多核苷酸序列；
（c）在严谨杂交条件下能够与（a）或（b）中所述多核苷酸序列进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸序列的纯合突变具有使植株叶舌和叶耳完全缺失、叶夹角变小、叶片直立、叶片变窄、雄穗分枝数减少、空杆率升高和/或果穗变小的功能；
（d）与（a）-（c）任一所示的多核苷酸序列至少有90%、95%、98%或以上相似性的多核苷酸序列，该多核苷酸序列的纯合突变具有使植株叶舌和叶耳完全缺失、叶夹角变小、叶片直立、叶片变窄、雄穗分枝数减少、空杆率升高和/或果穗变小的功能；或
（e）与（a）-（d）之任一所述序列互补的多核苷酸序列。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述的lg1突变体株系通过突变的方式获得，所述突变包括在该基因的核苷酸序列上进行一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或添加。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述的突变通过物理诱变、化学诱变、ZFN、TALEN和/或CRISPR/Cas基因编辑等技术获得。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述的lg1突变体具有的基因组突变体核苷酸序列选自下列组的序列之一：
（a）整个SEQ ID No.1的核苷酸序列都被删除掉的基因组突变体核苷酸序列；
（b）SEQ ID No.1或SEQ ID No.2第743-764bp的核苷酸序列被替换为5’-TTCCGCCGCCGTCC-3’ 的基因组突变体核苷酸序列；
（c）SEQ ID No.1或SEQ ID No.2第836bp发生单个核苷酸缺失的基因组突变体核苷酸序列；或
（d）SEQ ID No.1或SEQ ID No.2第766-835bp发生序列缺失的基因组突变体核苷酸序列。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述的密植是指大于或等于4000株/亩。
8.权利要求1-7之任一所述的方法在用于使植株叶夹角变小、叶片变宽、雄穗分枝数减少、空杆率降低和/或密植增产方面的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其中所述的密植增产，是指在高密度条件玉米产量增加，所述高密度是指大于或等于4000株/亩。
10.一种非作为繁殖材料的植物细胞、组织、器官或商业产品，其特征在于，所述植物细胞、组织、器官或商业产品含有LG1/lg1杂合基因。
11.一种调控玉米植株农艺性状的方法，其特征在于，通过突变植株内源基因，获得纯合突变体，所述纯合突变体具有叶舌和叶耳完全缺失、叶夹角变小、叶片直立、叶片变窄、雄穗分枝数减少、空杆率升高和/或果穗变小的表型，所述内源基因的多核苷酸序列选自下列组的序列之一：
（a）如SEQ ID No：1、2或3所示的多核苷酸序列；
（b）其编码氨基酸序列如SEQ ID No：4所示的多核苷酸序列；
（c）在严谨杂交条件下能够与（a）或（b）中所述多核苷酸序列进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸序列的纯合突变具有使植株叶舌和叶耳完全缺失、叶夹角变小、叶片直立、叶片变窄、雄穗分枝数减少、空杆率升高和/或果穗变小的功能；
（d）与（a）-（c）任一所示的多核苷酸序列至少有90%、95%、98%或以上相似性的多核苷酸序列，该多核苷酸序列的纯合突变具有使植株叶舌和叶耳完全缺失、叶夹角变小、叶片直立、叶片变窄、雄穗分枝数减少、空杆率升高和/或果穗变小的功能；或
（e）与（a）-（d）之任一所述序列互补的多核苷酸序列。
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