CN106801092A - 应用RPA技术对转基因玉米Bt176品系特异性鉴定 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种应用RPA技术对转基因玉米BT176品系特异性鉴定的方法。该方法首先提取待测样品的DNA作为模板,利用筛选的引物及探针进行RPA快速扩增及实时荧光检测,如果得到扩增曲线,则证明所检样品含有转基因玉米BT176成分。本发明根据外援***DNA序列与玉米基因组的连接区域设计大量RPA引物,从中筛选出一对可快速有效检测出转基因玉米BT176成分的引物及探针组合,首次提供了转基因玉米BT176品系特异性的RPA检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种品系鉴定方法,特别涉及一种应用RPA技术对转基因玉米Bt176品系特异性鉴定。
背景技术
核酸等温扩增技术(isothermal nucleic acid amplification technology)是一种新型的扩增技术,恒定温度条件下即可进行反应,具有简便、快速、灵敏等优点,并可用于进行现场检验。RPA技术模拟了生物体内DNA的复制过程,重组酶蛋白在ATP参与下与单链DNA(引物)结合,形成DNA核蛋白微丝。该微丝牵扯周围的DNA分子,对模板DNA序列进行比对并搜索出与之匹配的序列,在单链结合蛋白的帮助下,双链模板DNA解链,引物和模板配对形成复制起始所需3’羟基末端,在DNA聚合酶的作用下开始复制延伸,并形成新的DNA。RPA的引物长度在35nt左右,在设计引物时应避免前后引物之间形成二级结构及引物间出现重复序等问题。在设计RPA反应的探针时,要在探针的中后部选择两个T碱基,各标记一个荧光集团(FAM和BHQ1),在两个集团之间有一个脱碱基位点(dSpacer),该位点在反应过程中被核酸外切酶识别并切割,使两个荧光集团分离产生荧光信号,特异性的探针可以实时监测荧光检测的结果。RPA荧光检测技术在20分钟内就可以完成,极大的缩短了反应时间。
转基因玉米BT176是先正达公司开发的抗虫且耐草铵膦除草剂的转基因玉米品种,是利用基因工程技术将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)亚种kurstaki的Cry1A(b)基因、土壤细菌(soil bacteria)的bar基因等外源基因导入玉米中而获得的抗玉米螟和耐草铵膦转基因品种。自1995年在美国首次准许无限制种植以来,Bt-176玉米已经在许多国家和地区大面积种植并作为食品和饲料广泛应用。随后日本(1996)、加拿大(1996)、阿根廷及欧盟各成员国(1997)也先后准许无限制种植,同时,美国(1995)、加拿大(1995)、日本(1996)、及英国、丹麦、瑞士和阿根廷等国分别批准BT176玉米作为食物或饲料来源并准许上市销售。在已报道的对转基因玉米BT176检测方法中,主要是利用PCR仪在实验室中进行常规检测,也有应用于环介导的等温扩增(LAMP)技术对其进行检测,目前还没有利用RPA技术对其进行基因特异性鉴定。
发明内容
针对上述领域的空白,本发明提供了准确、快速、简便检测转基因玉米BT11品系特异性的检测方法。
一种应用RPA技术对转基因玉米BT176品系特异性鉴定的引物和探针,所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
一种鉴定转基因玉米BT176品系的试剂盒,包含上述的引物和探针。
一种应用RPA技术对转基因玉米BT176品系特异性鉴定的方法,提取待测样品的DNA作为模板,利用权利要求1所述的引物及探针进行RPA快速扩增及实时荧光检测,如果得到扩增曲线,则证明所检样品含有转基因玉米BT176成分;如果得不到扩增曲线,则证明所检样品不含有转基因玉米BT176成分。
所述RPA快速扩增的反应体系为50μl,包括10μmol/L的引物各2μl,10μmol/L的探针0.5μl,模板DNA 50ng,缓冲溶液Buffer 29.5μl,其余用去离子水补齐。
所述RPA快速扩增及实时荧光检测的程序为:RPA扩增检测仪或荧光定量PCR仪于39摄氏度反应20分钟;同时进行实时荧光检测。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:本发明是根据外援***DNA序列与玉米基因组的连接区域设计大量RPA引物,从中筛选出一对可快速有效检测出转基因玉米BT176成分的引物及探针组合。以转基因玉米BT176为模板,利用该对引物和探针进行荧光检测,可以得到明显的扩增曲线,以其他转基因玉米品系MON810等5种玉米材料以及非转基因玉米的基因组DNA为模板均没有产生扩增曲线。将模板DNA用水稀释至1000,500,100,50,10个拷贝,结果只有10拷贝时未能扩增,其它都有扩增曲线,具有较高的灵敏度。本发明首次提供了转基因玉米BT176品系特异性的RPA检测方法。
附图说明
图1为BT176引物筛选Basic电泳图,其中,1:100bp Maker;2:BT176-F1与BT176-R1;3:BT176-F2与BT176-R2;4:BT176-F3与BT176-R3;5:BT176-F4与BT176-R4;6:BT176-F5与BT176-R5;7:BT176-F6与BT176-R6;8:BT176-F7与BT176-R7;9:BT176-F8与BT176-R8。
图2为BT176引物筛选实时荧光检测图,其中,1:BT176-F5与BT176-R5;2:BT176-F1与BT176-R1;3:BT176-F2与BT176-R2;4:BT176-F3与BT176-R3;5:BT176-F4与BT176-R4;6:BT176-F6与BT176-R6;7:BT176-F7与BT176-R7;8:BT176-F8与BT176-R8。
图3为BT176特异性检测图,其中,1:转基因玉米BT176;2:转基因玉米MON810;3:转基因玉米MON863;4:转基因玉米MON89034;5:转基因玉米NK603;6:转基因玉米BT11;7:非转基因玉米;8:水。
图4为灵敏度检测图,从1到6模板拷贝数依次为1000;500;100;50;10;0。
具体实施方式
下面结合附图,对本发明的具体实施方式进行详细描述,但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
下面实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等的《分子克隆:实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)中所述条件,或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件。
实施例1
首先根据转基因玉米BT176转化体特异性区域设计引物及探针。引物长度为35nt左右,RPA实验需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化、筛选,个别碱基的增减或替换都会对实验结果产生重要影响。本实验中设计了大量的引物,并从中筛选出来有一对灵敏度高且特异性好的引物用于RPA荧光检测。引物和探针序列见表1。
表1
注:FAM:发光集团;dSpacer:脱碱基位点;BHQ1:淬灭集团;block:封闭集团,本次使用的碳酸化。
1.实验材料
1.1 植物材料
转基因玉米BT176标准物质,转基因玉米MON810标准物质,转基因玉米MON89034标准物质,转基因玉米MON863标准物质,转基因玉米NK603标准物质,转基因玉米BT11标准物质,非转基因玉米等材料。
1.2 酶与试剂
分子生物学试剂,TwistAmp DNA amplification Exo Kits购自TwistDX公司,TwistAmp DNA amplification Basic Kits购自TwistDX公司,其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物和探针由北京生工生物技术有限公司合成。
1.3 实验仪器
DNA处理仪器:低温混合球磨仪ΜM400(Retsch)
荧光检测仪:RPA扩增检测仪(Twista)
其它仪器包括:恒温水浴锅、电子天平、离心机、纯水仪等。
2.实验方法和过程
2.1 玉米基因组DNA的提取
以转基因玉米标准品粉末为材料,依照TianGen Plant Genomic DNA Kit试剂盒的操作手册,进行玉米DNA的提取。
1.取充分碾磨新鲜玉米粉末150mg,加入700μl 65摄氏度预热的缓冲液GP1,64℃水浴60min,期间颠倒离心管数次以混合样品。
2.加入1:1的酚/氯仿进行抽提,12000rpm离心5min。
3.取上清加入700μl氯仿充分混匀,12000rpm离心5min。
4.取上清加入700μl缓冲液GP2,充分混匀。
5.将混匀的液体转入吸附柱CB3中,12000rpm离心30sec,弃废液。
6.向吸附柱中加入500μl缓冲液GD,12000rpm离心30sec,弃废液。
7.向吸附柱中加入600μl漂洗液PW,12000rpm离心30sec,弃废液。
8.重复7。
9.将吸附柱CB3放入收集管,12000rpm空转2min,弃废液,室温放置
10分钟。
10.将吸附柱CB3转入干净收集管,滴加50μl水,室温放置10min,12000rpm收集到离心管中。
2.2 DNA浓度和纯度测定
使用NanoDrop 1000分光光度计(Thermo Scientific)测定DNA的纯度和浓度,并用去离子双蒸水调节DNA浓度至50ng/μl。
2.3 引物的筛选
本实施例中用于RPA方法扩增的靶标序列为玉米基因组与外援***DNA的5’端部分序列。针对这一转化体特异性序列,设计RPA探针并在探针上游与下游分别设计了8条正向引物、8条反向引物。筛选过程中,首先使用RPA-Basic试剂盒进行扩增并进行电泳,筛选能够扩增正确条带的引物再进行RPA-Exo实验。
2.4 引物的扩增
RPA扩增体系为:总体系50μl,Rehydration Buffer 29.5μl,280μm MagnesiumActate 2.5μl,引物各2.4μl(10uM),玉米DNA 1μl(50ng/μl),剩余用水补足。
引物扩增程序:RPA扩增检测仪39摄氏度反应30分钟,酚:氯仿1:1抽提,电泳。
2.5 特异性检测
将筛选出的较好引物对进行特异性检测,检测材料分别为转基因玉米BT176标准物质,转基因玉米MON810标准物质,转基因玉米MON89034标准物质,转基因玉米MON863标准物质,转基因玉米NK603标准物质,转基因玉米BT11标准物质,非转基因玉米。相同50μl体系,进行RPA-EXO实验。
2.6 灵敏度检测
将BT176基因组DNA分别稀释如下的拷贝数:200,100,20,10,2。相同50μ反应体系各加入5μl的DNA进行RPA-EXO实验测试灵敏度,同时进行阴性对照。
3.实验结果
根据转化体特异性序列设计的正向引物和反向引物及探针,运用RPA-Basic试剂盒首先确定能够扩增正确片段的引物(图1),其中6孔道引物对BT176-F5与BT176-R5扩增条带较好,后改名为BT176-RPA-F(序列如SEQ ID NO.1)与BT176-RPA-R(序列如SEQ ID NO.2)运用RPA-EXO试剂盒进行特异性实时荧光筛选(图2),其中1号线起飞时间以及扩增效果较好,其引物对与Basic实验6孔道引物对一致。
从上述中筛选出的引物,以转基因玉米BT176为模板可以得到明显的扩增曲线,以其他转基因玉米品系MON810等5种玉米材料以及非转基因玉米的基因组DNA为模板均没有产生扩增曲线(图3)。模板DNA拷贝数分别为1000,500,100,50,10个拷贝,结果在阴性材料没有起飞的前提下,只有10拷贝未扩增其它都有扩增曲线(图4),说明本发明设计引物和方法鉴定转基因玉米BT176具有较高的灵敏度和准确性。
以上公开的仅为本发明的具体实施例,但是,本发明并非局限于此,任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 应用RPA技术对转基因玉米Bt176品系特异性鉴定
<130> 1111
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BT176-RPA-F
<400> 1
gcggccggct tcaagcacgg gaactggcat gacgt 35
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BT176-RPA-R
<400> 2
gagggagaac tccgtgggcg tggtatcgac tttat 35
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BT176-RPA-P
<400> 3
cgtcaccgag atctgatgtt ctctcccatg atgcacg 37
Claims (5)
1.一种应用RPA技术对转基因玉米BT176品系特异性鉴定的引物和探针,其特征在于,所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.一种鉴定转基因玉米BT176品系的试剂盒,其特征在于,包含权利要求1所述的引物和探针。
3.一种应用RPA技术对转基因玉米BT176品系特异性鉴定的方法,其特征在于,提取待测样品的DNA作为模板,利用权利要求1所述的引物及探针进行RPA快速扩增及实时荧光检测,如果得到扩增曲线,则证明所检样品含有转基因玉米BT176成分;如果得不到扩增曲线,则证明所检样品不含有转基因玉米BT176成分。
4.根据权利要求3所述的应用RPA技术对转基因玉米BT176品系特异性鉴定的方法,其特征在于,所述RPA快速扩增的反应体系为50μl,包括10μmol/L的引物各2μl,10μmol/L的探针0.5μl,模板DNA 50ng,缓冲溶液Buffer 29.5μl,其余用去离子水补齐。
5.根据权利要求4所述的应用RPA技术对转基因玉米BT176品系特异性鉴定的方法,其特征在于,所述RPA快速扩增及实时荧光检测的程序为:RPA扩增检测仪或荧光定量PCR仪于39摄氏度反应20分钟;同时进行实时荧光检测。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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