CN108034757A - 一种检测转基因玉米Bt11品系的RPA引物及检测方法 - Google Patents

一种检测转基因玉米Bt11品系的RPA引物及检测方法 Download PDF

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Abstract

一种检测转基因玉米Bt11品系的RPA引物及检测方法，根据转基因玉米Bt11外源基因草丁膦乙酰转移酶基因PAT及玉米基因组连接区域的序列，设计了RPA引物，该RPA引物包括正向引物F和反向引物R，具体序列为：F：5’‑CTGGGAGGCCAAGGTATCTAATCAGCCATCCC‑3’；R：5’‑CTGCTGTAGCTGGCCTAATCTCAACTGGTCTCC‑3’，建立了基于重组酶聚合酶等温扩增技术的快速检测方法，对转基因玉米Bt11品系进行快速鉴定，特异性强，灵敏度高，短时间内即能实现对目的片段的指数扩增，对环境设备要求低，操作简便，在转基因产品成分检测领域具有广阔的推广应用前景。

Description

一种检测转基因玉米Bt11品系的RPA引物及检测方法
技术领域
本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种检测转基因玉米Bt11品系的RPA引物及检测方法。
背景技术
随着转基因技术研究与应用的快速发展，转基因产品检测技术的研究已成为全球转基因生物安全管理的重要组成部分。PCR技术在转基因检测中有着广泛的应用，但是，常规的PCR检测需要精密的热循环仪以及复杂的实验程序，难以满足非实验室环境下转基因核酸成分快速筛查和检测的需求。
近年来，核酸等温扩增技术得到了较快的发展，与常规PCR相比，核酸等温扩增技术不再需要热循环仪器，可在恒温条件下快速扩增出目的片段，快速、简便、灵敏。目前，主要的等温扩增技术有环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、滚环扩增技术(Rolling circle amplification，RCA)以及重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase ploymerase amplification，RPA)等。
RPA技术原理是模拟生物体内DNA复制，由重组酶介导、在37℃下即可对目标片段进行等温扩增，实现单分子核酸检测。重组酶蛋白可以在ATP的参与下结合单链DNA(引物)并形成DNA核蛋白微丝。核蛋白微丝两端都可以延长，并且可以通过前端伸长后端缩短的方法向双链DNA分子运动，微丝能够拽住周围的DNA分子，将单链的寡核苷酸序列与DNA序列进行比对；当找到匹配的序列时，两个分子就会紧密结合到一起确保重组跟着发生，在单链结合蛋白的帮助下，模板DNA开始解链，引物入侵双链DNA并开始配对形成复制所需自由的3’羟基末端，在聚合酶的作用下进行复制延伸，形成新的DNA互补链反应产物。
RPA最大的特点是不需要通过高低温度循环来实现核酸解链和退火，只需要1对引物即可在37℃恒温、半小时以内即可完成模板核酸的扩增，与其他等温扩增技术相比具有明显优势。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、食品安全、生物安全、农业等领域，目前该技术在转基因农产品检测领域研究的还很少，但极具发展潜力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测转基因玉米Bt11品系的RPA引物及检测方法，用于对转基因玉米Bt11品系进行快速鉴定，特异性强，灵敏度高，20min内即能实现对目的片段的指数扩增，检测过程对环境设备要求低，操作简便，在转基因产品成分检测领域具有广阔的推广应用前景。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种检测转基因玉米Bt11品系的RPA引物，其包括正向引物F和反向引物R，具体序列如下：
F：5’-CTGGGAGGCCAAGGTATCTAATCAGCCATCCC-3’；
R：5’-CTGCTGTAGCTGGCCTAATCTCAACTGGTCTCC-3’。
一种用于检测转基因玉米Bt11品系的RPA检测试剂盒，其包括所述的RPA引物。
进一步，所述检测试剂盒包含RPA反应体系，该RPA反应体系中，各成分的终浓度为：RPA引物的正向引物、反向引物各为0.4-1.0μmol/L，且，正向引物、反向引物的比例为0.5-2:1，DNA模板100-1000ng/μL，醋酸镁10-16mmol/L。
一种检测转基因玉米Bt11品系的RPA检测方法，包括：
1)提取待测样品的DNA作为模板；
2)将权利要求1的RPA引物对加入到RPA扩增反应体系中，进行RPA扩增反应，扩增温度32-42℃，反应时间15～25分钟；
3)然后通过琼脂糖凝胶电泳，若得到片段大小为188bp的条带，则证明待测样品中含有转基因玉米Bt11品系。
进一步，进行RPA扩增反应时，所述RPA反应体系中，各成分的终浓度为：RPA引物的正、反向引物各为0.4-1.0μmol/L，且，正向引物、反向引物的比例为0.5-2：1，DNA模板100-1000ng/μL，醋酸镁10-16mmol/L。
优选地，所述RPA反应体系总体积为50μL，其中，其中，浓度为10μmol/L的RPA引物的正向引物、反向引物各加入2.4μL，浓度为100ng/μL的DNA模板加入1μL，TwistAmpTMRehydration buffer 29.5μL，浓度为280mmol/L醋酸镁溶液2.5μL，ddH2O补足至50μL。
优选地，所述RPA扩增反应程序为：温度35-40℃。
更优选地，所述步骤2)中，RPA扩增反应程序为：37℃恒温反应20分钟。
本发明根据转基因玉米Bt11外源基因草丁膦乙酰转移酶基因(phosphinothricinacetyl transferase gene，PAT)及玉米基因组连接区域的序列，设计RPA引物，并建立了基于重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA)的特异性快速检测方法。
与传统PCR引物相比，RPA引物具有更长的长度，如长度在30-35bp之间，扩增片段最好控制在100-200bp，其他规则类似于常规PCR引物设计，如GC含量在40－60％，上下游引物的GC含量相当；要尽量保证设计的引物，其自身不形成环状发卡结构；避免引物之间、引物自身形成4个bp或以上的连续配对。
本发明RPA引物的设计中，根据转基因玉米Bt11外源基因PAT及与玉米基因组的连接区域设计引物，不仅可以鉴定是否属于转基因，还可特异鉴定到品系Bt11，此引物对特异性高，灵敏度高，扩增效率高。
本发明根据所获得的RPA引物，探索了合适的RPA反应体系，该反应时间设在15-25min，反应时间少于15min时，扩增得到的条带不够清晰，反应15min时，已出现明显的目的条带；反应20min时，目的条带更亮，反应更长时间时，亮度与20min相似，表明RPA反应在20min时，就已经大量扩增，反应的效率很高，反应时间多于25min，条带亮度并未增加，从快速检测要求出发，15-25min反应时间已经足够。
本发明设置RPA反应时间在15-25min，缩短了RPA反应时间，进而缩短整个实验的时间使得检测过程更快捷，扩增条带更清楚，更利于后续检测。
本发明的RPA反应，温度设定在32-42℃，反应温度低于32℃时，温度过低，非模板与引物结合的合适温度，无扩增或者仅有微弱扩增；反应温度高于42℃时，温度过高，不适于模板与引物结合，无扩增或者仅有微弱扩增。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的RPA引物，对Bt11品系具有高度特异性，在检测转基因玉米时，只有转基因玉米Bt11的RPA反应体系中出现目的条带，其他转基因玉米品系，如GA21、Bt176、NK603均无扩增条带，说明该引物对Bt11有高度专一性。
利用本发明的RPA体系进行RPA反应，反应时间短，反应温度范围较宽，32-42℃间进行反应皆可实现扩增，反应效率高，反应15min时，便可出现明显的目的条带，可在20min内完成转基因玉米Bt11的特异性检测，加快检测进度，对于要求时间更短的实验，15min即可结束反应，检测更方便。
利用本发明的RPA引物及反应体系检测转基因玉米Bt11品系时，特异性好，灵敏度高，其可检测的模板DNA的拷贝数在100拷贝/μL以上，说明其绝对灵敏度高，可准确检测转基因玉米Bt11品系含量在0.1％以上的样品，说明其相对灵敏度高。
附图说明
图1为本发明实施例1中以Bt11为模板，设计的6对RPA引物进行扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果。
图2为本发明实施例2中不同转基因玉米品系进行RPA反应后的琼脂糖凝胶电泳结果。
图3为本发明实施例2转基因Bt11RPA反应时间验证得到的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。
图4为本发明实施例2转基因Bt11RPA反应温度验证得到的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。
图5为本发明实施例2中转基因Bt11的模板设置拷贝数梯度后进行RPA反应得到的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。
图6为本发明实施例2中转基因Bt11的模板设置百分含量梯度后进行RPA反应得到的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1一种检测转基因玉米Bt11品系RPA引物的获得
1.设计引物
根据转基因玉米Bt11外源基因草丁膦乙酰转移酶基因(phosphinothricinacetyl transferase gene，PAT)及玉米基因组连接区域的序列，设计了6对RPA引物，具体序列参见表1。
表1
2.筛选引物
1)提取转基因玉米Bt11的DNA，方法如下：
向EP管中加入约20mg转基因玉米Bt11种子粉末，再加入康为(康为世纪生物科技有限公司(北京))试剂盒中的Buffer GF1(400μL)和RNase A(4μL)，一起振荡，时间约1分钟，65℃水浴10分钟，期间进行2-3次涡旋混匀；加入130μL Buffer GF2，混匀，冰上孵育5分钟；14000rpm(～20000×g)离心5分钟，需注意：请勿在使用前将Buffer GF1与RNase A混合。
将所得液体转移到已装入收集管的过滤柱中，12000rpm离心2mins，收集滤液，需注意：为方便取样，在取离心管中的液体时可以将枪头尖端剪掉，过滤柱能除去多数杂物，不过还会流出少许杂物，会在离心后形成沉淀，在后面不要吸到沉淀。
将收集管中收集到的滤液转移到一个新离心管中，注意不要吸到沉淀，弃掉收集管；加入750uL Buffer GF3，充分混匀，需注意：加入Buffer GF3后要立即混匀。
把所得溶液和沉淀一起加入到装有收集管的吸附柱里，如果一次不能加完，可以分多次加；离心12000rpm，1min，倒掉废液，把吸附柱再装入收集管。
将500μL已加入乙醇的Buffer GW加进吸附柱里，12000rpm，1min离心，离心后将废液倒掉，该步骤重复一遍。
将吸附柱室温下放置几分钟晾干。将吸附柱放进一个新的离心管中，向吸附柱加入Buffer GE30μL，静置5min，离心，12000rpm，1min，重复一次30μL洗脱，得到DNA溶液。
2)RPA扩增及电泳
利用TwistAmp RPA凝胶检测试剂盒，以Bt11为模板DNA，分别以表1中的6对RPA引物进行RPA扩增，在37℃金属浴中，恒温反应20min，扩增结束后取反应产物，经酚/氯仿抽提纯化后，在2％琼脂糖凝胶上以120V恒压电泳25分钟，利用凝胶成像***进行鉴定。
其中，RPA反应的总体系为50μL，包括：ddH2O 12.2μL，Rehydration Buffer 29.5μL，浓度为10μmol/L的正向引物、反向引物各2.4μL，浓度为100ng/μL的模板DNA 1μL，试剂盒自带浓度为280mmol/L的醋酸镁溶液2.5μL，试剂盒自带的冻干酶粉。
扩增结果参见图1，其中，1-6泳道分别为引物对F1/R1、F2/R2、F3/R3、F4/R4、F5/R5、F6/R6的扩增产物，结果显示：引物对F1/R1，F2/R2和F3/R3没有扩增出目的条带；F4/R4扩增的条带不明确；F5/R5出现目的条带，但扩增效率低；F6/R6出现明确的目的条带，且扩增效率较高，其为本发明的RPA引物对F/R。
实施例2一种检测转基因玉米Bt11品系的方法验证
1.特异性验证
用康为世纪基因组DNA提取试剂盒(康为世纪生物科技有限公司(北京))提取转基因玉米GA21种子粉末、Bt176种子粉末和NK603种子粉末的基因组DNA，具体提取实验步骤同实施例1。
分别以转基因玉米Bt11、GA21、Bt176和NK603的基因组DNA为模板DNA，以本发明的RPA引物对为引物，进行RPA反应。
其中，RPA反应的总体系为50μL，包括：ddH2O 10.0μL，Rehydration Buffer 29.5μL，浓度为10μmol/L的正向引物、反向引物各3.0μL，浓度为100ng/μL的模板DNA2.0μL，试剂盒自带的醋酸镁溶液2.5μL，试剂盒自带的冻干酶粉。
对转基因玉米Bt11、GA21、Bt176和NK603的RPA反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图2，其中，1-6泳道分别为：空白(ddH2O)、阴性对照(非转基因玉米)、转基因玉米GA21、转基因玉米Bt176、转基因玉米NK603、转基因玉米Bt11。
结果显示：只有含GM玉米Bt11的反应体系中出现188bp目的条带，不含模板的空白和阴性对照(非转基因玉米)中均无扩增条带，表明实验过程无污染，其他GM玉米品系GA21、Bt176、NK603均无扩增条带。
可见，本发明的RPA引物对转基因玉米Bt11据有高度专一性。
2.转基因玉米Bt11RPA反应时间和温度条件验证
1)转基因玉米Bt11RPA反应时间验证
以转基因玉米Bt11基因组DNA为模板，配置RPA反应体系，于37℃金属浴中反应，控制反应时间分别为5min、10min、15min、20min、30min、40min，反应结束，立即加酚/氯仿抽提纯化，取上清跑电泳，RPA反应体系参见实施例1，结果见图3，其中，1-6泳道分别为：反应时间5min、10min、15min、20min、30min、40min的电泳结果。
由图3可见，随着反应时间的增加，目的条带亮度呈梯度变化，空白反应时间为40min；反应5min时，条带不清晰；反应10min时，条带不够明确；反应15min时，已出现明显的目的条带；反应20min时，目的条带更亮；反应30min和40min，亮度与20min相似，表明RPA反应在20min时，就已经大量扩增，反应的效率很高。
2)转基因玉米Bt11RPA反应温度验证
以转基因玉米Bt11基因组DNA为模板，配置RPA反应体系，RPA反应体系参见实施例1，控制反应时间为20min，反应温度以37℃展开，以5℃为梯度，分别设置为17℃、22℃、27℃、32℃、37℃、42℃、47℃、52℃，反应结束，立即加酚/氯仿抽提纯化，取上清跑电泳，结果见图4，其中，1-8泳道分别为：反应温度17℃、22℃、27℃、32℃、37℃、42℃、47℃、52℃的电泳结果。
由图4可见，反应温度在17℃、22℃与52℃时，无扩增；在27℃与47℃时，有微弱扩增；在32℃、37℃与42℃时均有扩增，37℃与42℃时扩增效率较高。
3.灵敏度验证
1)绝对灵敏度实验
用ddH2O将已测定浓度的GM玉米Bt11基因组DNA进行稀释，得到浓度分别为1000拷贝/μL、500拷贝/μL、200拷贝/μL、100拷贝/μL、50拷贝/μL及10拷贝/μL的DNA溶液，作为模板进行RPA反应，并进行2％琼脂糖凝胶电泳，反应条件及反应体系参见实施例1，电泳结果见图5，其中，1-7泳道分别为：转基因玉米Bt11DNA模板浓度1000拷贝/μL、500拷贝/μL、200拷贝/μL、100拷贝/μL、50拷贝/μL、10拷贝/μL以及空白ddH2O对照的电泳结果。
结果显示：当DNA含量为1000拷贝/μL、500拷贝/μL、200拷贝/μL、100拷贝/μL时，均有188bp的目的条带。DNA含量为50拷贝/μL及10拷贝/μL时，无目的条带。表明本实验建立的RPA方法特异性检测Bt11的绝对检测限约为100拷贝。
2)相对灵敏度实验
转基因玉米Bt11含量5％、含量1％、含量0.1％的DNA，用相同浓度的非GM玉米DNA将含量0.1％的Bt11玉米DNA稀释成Bt11含量为0.05％、0.01％的DNA样品，得到5％、1％、0.1％、0.05％、0.01％五个含量梯度的模板，进行RPA反应，并进行2％琼脂糖凝胶电泳，反应条件及反应体系参见实施例1，电泳结果见图6，其中，1-6泳道分别为：转基因玉米Bt11含量5％、1％、0.1％、0.05％、0.01％以及空白ddH2O对照的电泳结果。
结果显示：当Bt11的含量为5％、1％、0.1％时，出现188bp的目的条带；当Bt11含量为0.05％、0.01％时，无目的条带，表明建立的RPA方法特异性检测Bt11的相对检测限约为0.1％。

Claims (8)

1.一种检测转基因玉米Bt11品系的RPA引物，其包括正向引物F和反向引物R，具体序列如下：
F：5’-CTGGGAGGCCAAGGTATCTAATCAGCCATCCC-3’；
R：5’-CTGCTGTAGCTGGCCTAATCTCAACTGGTCTCC-3’。
2.一种用于检测转基因玉米Bt11品系的RPA检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的RPA引物。
3.根据权利要求2所述的RPA检测试剂盒，其特征在于，其包含RPA反应体系，该RPA反应体系中，各成分的终浓度为：RPA引物的正向引物、反向引物各为0.4-1.0μmol/L，且，正向引物、反向引物的比例为0.5-2：1，DNA模板100-1000ng/μL，醋酸镁10-16mmol/L。
4.一种检测转基因玉米Bt11品系的RPA检测方法，包括：
1)提取待测样品的DNA作为模板；
2)将权利要求1的RPA引物对加入到RPA扩增反应体系中，进行RPA扩增反应，扩增温度32-42℃，反应时间15～25分钟；
3)然后通过琼脂糖凝胶电泳，若得到片段大小为188bp的条带，则证明待测样品中含有转基因玉米Bt11品系。
5.根据权利要求4所述检测转基因玉米Bt11品系的RPA检测方法，其特征在于，进行RPA扩增反应时，所述RPA反应体系中，各成分的终浓度为：RPA引物的正向引物、反向引物各为0.4-1.0μmol/L，且，正向引物、反向引物的比例为0.5-2：1，DNA模板100-1000ng/μL，醋酸镁10-16mmol/L。
6.根据权利要求4所述检测转基因玉米Bt11品系的RPA检测方法，其特征在于，所述RPA反应体系总体积为50μL，其中，浓度为10μmol/L的RPA引物的正向引物、反向引物各加入2.4μL，浓度为100ng/μL的DNA模板加入1μL，TwistAmpTM Rehydration buffer 29.5μL，浓度为280mmol/L醋酸镁溶液2.5μL，ddH2O补足至50μL。
7.根据权利要求4所述检测转基因玉米Bt11品系的RPA检测方法，其特征在于所述步骤2)中，所述RPA扩增反应程序为：扩增温度35-40℃。
8.根据权利要求4所述检测转基因玉米Bt11品系的RPA检测方法，其特征在于，所述步骤2)中，RPA扩增反应程序为：37℃扩增20分钟。
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