CN108251551A - 应用rpa-dna试纸条联检对转基因水稻pa110-15品系特异性检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明首次公开了将重组酶聚合酶等温扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification,RPA）及DNA试纸条联检应用于检测含有转基因水稻PA110‑15品系及其衍生品种成分的引物及探针组合，其正向引物序列如SEQ ID NO1所示，反向引物序列如SEQ ID NO2所示，探针序列如SEQ ID NO3所示。本发明还公开了一种检测含有转基因水稻PA110‑15品系及其衍生品种的方法，提供了适用于转基因水稻PA110‑15品系特异性的RPA‑DNA试纸条联用检测方法。

Description

应用RPA-DNA试纸条联检对转基因水稻PA110-15品系特异性 检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及的是将重组酶聚合酶等温扩增技术（RecombinasePolymerase Amplification, RPA）及DNA试纸条联检应用于检测转基因水稻PA110-15的品系特异性。

背景技术

稻的食用部分富含碳水化合物、蛋白质、脂类和矿物质，是一种营养价值很高的谷物类主粮。作为最常见的粮食作物之一，水稻被世界上大多数人民所接受并喜爱。随着人们对粮食需求量的提高，对粮食品质要求的增加，水稻的分子育种难度也随之增加。自1986年至1988年，首例转基因水稻的研发成功以来，在短短三十年的时间里，转基因育种技术在水稻育种中得到了广泛的应用(Chan et al., 1993; 陈浩等, 2009, 科学通报, 54(18):2699-2717; Godfray et al., 2010)。目前世界上已有众多的转基因水稻在研或已进行商业化应用，涉及到抗虫、抗病、抗除草剂、农艺品质性状改良等诸多品质的提高。

转基因水稻PA110-15是浙江大学研发的转高赖氨酸基因的水稻品系，其外源基因来源于泰国翼豆的富含赖氨酸储藏蛋白(LRP)基因，目前已进入生产性试验阶段。该品系利用转基因技术进行品质性状改良，属于消费者友好型的转基因作物，具有极大的商业化潜质。发明人所在研究室已对该品系研发了常规定性及定量PCR检测方法，并分别申请发明专利，目前已获得定性PCR检测专利（ZL 2014 1 0081539.4）。但目前尚未有针对该品系的适用于田间快速现场检测的方法报道。

目前常用的转基因检测技术是基于PCR技术可以在封闭实验室中准确地定性和定量检测转基因成分，但对热循环仪器的严重依赖性制约了其在田间、野外的现场快速检测中的应用。为了适应现场快速检测需求，核酸等温扩增技术应运而生(Yan et al., 2014)。依靠核酸等温扩增技术，检测人员可以在恒温条件下进行目标片段的大量扩增(Gill andGhaemi, 2008)。经过几十年的发展，已经有十几种DNA等温扩增技术出现(Kim andEasley, 2011)，我们选择了反应温度最接近室温的重组酶介导的等温扩增技术—重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase polymerase amplification, RPA)用于转基因水稻PA110-15品系的快速检测方法研发。

RPA技术于2006年由英国TwistDx公司研发并推广，可在25-42℃中，可在20 min内完成目标片段指数倍的扩增。目前已经被广泛用于快速现场检测中(Euler et al., 2012;Xu et al., 2014)。RPA检测目前应用较多的是基于荧光的检测，这类检测方法可以适用于田间快速检测，但仍然需要便携的专用仪器，本发明采用RPA-DNA试纸条联检研发转基因高赖氨酸水稻品系PA110-15的品系特异性快速检测方法，将进一步降低对于专用仪器的需求，更适用于田间快速的现场检测应用。

RPA引物的长度在35个碱基左右，远长于常规的PCR引物，在设计引物时除常规的引物设计注意事项如避免前后引物之间形成二级结构、GC含量尽量控制在40%-60%之间以及尽量避免引物出现重复序外，还需进行大量的引物筛选，因为RPA反应可能存在对引物或模板DNA序列的偏好性。RPA反应与DNA试纸条联检的下游引物需在5’端修饰一个生物素基团；RPA反应与DNA试纸条联检的探针需具有特殊的结构和修饰方式，在探针的5’端标记一个荧光集团（FAM），3’端用磷酸化封闭，探针的靠3’端约三分之一位置设置一个脱碱基位点（dSpacer），该位点在反应过程中被核酸外切酶识别并切割，RPA反应最终可被DNA试纸条所识别的两端分别带有FAM基团和生物素基团的DNA片段。

RPA反应的完成依赖于精细而复杂的蛋白***，包括重组酶特性的UvsX酶、具有维持DNA单链作用的蛋白Gp32、能够完成链置换反应的DNA聚合酶Bsu以及其他数种蛋白，在与荧光RPA或与DNA试纸条联用时还需加入识别并切割脱碱基位点的酶系。复杂的酶系对RPA引物及探针的序列是否具有偏好，目前尚无科学结论，但RPA的引物和探针的设计与筛选无疑是RPA检测方法研发的关键。

发明内容

针对上述领域的空白，本发明提供了准确、快速、简便检测转基因水稻PA110-15品系特异性的检测方法。

本发明的技术方案是通过重组酶聚合酶等温扩增及DNA试纸条联检来检测样品中是否含有转基因水稻PA110-15成分，特定的正向引物序列如SEQ ID NO1所示，反向引物序列如SEQ ID NO2所示，探针序列如SEQ ID NO3所示。

具体实施方法是利用本发明提供的引物及探针组合进行RPA扩增，并通过DNA试纸条进行检测，如果在试纸条的质控线和检测线的位置上皆出现条带，则证明所检样品含有转基因水稻PA110-15成分。实验步骤为：向推荐的RPA扩增试剂盒的50μl扩增体系中加入正、反向引物各2μl（10μmol/L），探针0.5μl（10μmol/L），模板DNA 50ng，在RPA扩增检测仪39摄氏度反应20分钟，反应完成后，利用推荐的DNA试纸条进行检测，扩增产物用PBST缓冲液稀释50倍，然后取20-30 μL滴加在试纸条上。1 min内通过肉眼观察，在阳性样品的试纸条上，质控线和检测线位置处皆出现条带，而阴性样品只在质控线位置处出现条带。

本发明是根据外源DNA与水稻基因组的整合连接区域设计RPA引物及探针，利用RPA Basic试剂盒及凝胶电泳检测筛选可有效检测转基因水稻PA110-15的引物组合；利用该对引物组合及荧光RPA扩增筛选可效检测转基因水稻PA110-15的探针。根据所筛选的引物及探针序列，合成RPA-DNA试纸条检测用引物及探针。研究结果表明，本发明获得的引物和探针组合可特异性检测转基因水稻PA110-15，最低可检测75个拷贝的目标模板，整个检测时间可在20分钟左右完成，对专用仪器的需求进一步降低，适用于田间现场快速检测。

附图说明

图1为基础RPA筛选转基因水稻PA110-15检测用RPA引物组合电泳图，其中，A：M为100 bp DNA ladder，1和2为“PA110-F1、PA110-R1”引物组合，3和4为“PA110-F5、PA110-R2”引物组合，5和6为“PA110-F5、PA110-R4”引物组合，7和8为“PA110-F2、PA110-R4”引物组合；B：M为100 bp DNA ladder，1和2为“PA110-F3、PA110-R4”引物组合，3和4为“PA110-F3、PA110-R5”引物组合，5和6为“PA110-F4、PA110-R1”引物组合，7和8为“PA110-F5、PA110-R1”引物组合。

图2为RPA引物组合“PA110-F5、PA110-R4”检测转基因水稻PA110-15的特异性，其中，M：100 bp DNA ladder；1：转基因水稻PA110-15；2：转基因水稻KMD1；3：转基因水稻mf-MH3301-1；4：非转基因水稻；5：非转基因大豆；6：非转基因小麦；7：空白对照。

图3为荧光RPA筛选PA110-15检测用RPA探针，其中，A图为探针PA110-P；B图为探针PA110-P3；1：转基因水稻PA110-15；2：非转基因水稻；3：转基因水稻TT51-1；4：转基因水稻G6H1；5：非转基因玉；6：非转基因大豆；7：空白对照

图4为RPA-DNA试纸条检测PA110-15的特异性，其中，1：转基因水稻PA110-15；2：转基因水稻TT51-1；3：转基因水稻KMD1；4：转基因水稻Bar68-1；5：非转基因水稻；6：非转基因大豆；7：非转基因小麦；8：空白对照

图5为RPA-DNA试纸条检测PA110-15的灵敏性，从1到8模板拷贝数依次为10 000；5000；3 000；2 000；1 000；500；75；0。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等的《分子克隆：实验室手册》（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）中所述条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件。

实施例

首先根据转基因水稻PA110-15外源DNA与基因组连接区序列设计引物及探针。本实施例设计了5组上游引物和下游引物以及3条探针，上下游引物两两配对进行筛选，筛选出的引物对用于探针的筛选；筛选出的引物及探针序列用于后续的RPA-DNA试纸条检测方法的建立。引物和探针序列见表1。

表1 RPA的引物和探针序列

注: FAM：发光集团；dSpacer：脱碱基位点；BHQ1：淬灭集团；Phosphate：3’磷酸化

1．实验材料

1.1 植物材料

转基因水稻PA110-15、转基因水稻mf-MH3301-1 (转cry1Ab基因)、转基因水稻克螟稻1号(转cry1Ab基因)、转基因水稻Bar68-1 (转bar基因)、转基因水稻G6H1 (转cryAb/vip3H基因)、转基因水稻TT51-1 (转cry1Ab/Ac基因)以及其他转基因的和非转基因材料样品均由本实验室保存。

1.2 酶与试剂

TwistAmp DNA amplification Basic Kits、TwistAmp DNA amplification ExoKits、TwistAmp DNA Amplification Nfo Kits及Milenia Genline HybriDetect 1试纸条均购自TwistDX公司，其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

引物和探针由北京生工生物技术有限公司合成。

1.3 实验仪器

植物材料处理仪器：低温混合球磨仪ΜM400（Retsch）

荧光检测仪：RPA扩增检测仪(Twista)

其它仪器包括：恒温水浴锅、电子天平、离心机、纯水仪等。

2．实验方法和过程

2.1 植物材料基因组DNA的提取

以植物材料粉末为材料，依照TianGen Plant Genomic DNA Kit试剂盒的操作手册，进行植物材料DNA的提取。

1）取充分碾磨的植物材料粉末150mg，加入700μl 65摄氏度预热的缓冲液GP1，64℃水浴60min，期间颠倒离心管数次以混合样品。

2）加入1：1的酚/氯仿进行抽提，12000rpm 离心5min。

3）取上清加入700μl 氯仿充分混匀，12000rpm 离心5min。

4）取上清加入700μl缓冲液GP2，充分混匀。

5）将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm 离心30sec，弃废液

6）向吸附柱中加入500μl缓冲液GD，12000rpm 离心30sec, 弃废液

7）向吸附柱中加入600μl漂洗液PW，12000rpm 离心30sec, 弃废液

8）重复7)

9）将吸附柱CB3放入收集管，12000rpm 空转2min， 弃废液，室温放置10分钟

10)将吸附柱CB3转入干净收集管，滴加50μl 水，室温放置10min，12000rpm 收集到离心管中。

2.2 DNA浓度和纯度测定

使用NanoDrop 1000分光光度计（Thermo Scientific）测定DNA的纯度和浓度，并用去离子双蒸水调节DNA浓度至50ng/μl。

2.3 引物的筛选

本实施例设计了5条正向引物、5条反向引物（表1），正、反向引物两两配对进行引物对筛选。使用Basic试剂盒（TwistAmp DNA Amplification Basic Kits）进行扩增并进行电泳，筛选能够扩增正确条带且背景清晰的引物对再进行后续实验。

RPA扩增体系为：总体系50μL，Rehydration Buffer 29.5μL，Magnesium Actate(280μmol/L) 2.5μL，引物 (10μmol/L) 各2.0μL，植物基因组DNA (50ng/μL) 1μL，剩余用水补足。

扩增程序：RPA扩增检测仪39摄氏度反应30分钟，扩增液用1:1（v:v）酚：氯仿抽提，电泳。

2.4 RPA引物对的特异性检测

将筛选出的较好引物对进行特异性检测，检测材料以转基因水稻PA110-15为阳性材料，选取转基因水稻KMD1、转基因水稻mf-MH3301-1、非转基因水稻、大豆、小麦作为参照材料进行RPA扩增，同时设置空白对照。RPA扩增及电泳检测程序如2.3所述。

2.5 探针的筛选

采用荧光RPA的方法来进行探针筛选，通过实时检测荧光信号，来快速判断探针序列的有效性及实用性。本研究设计了3条探针(表1)，使用Exo试剂盒（TwistAmp DNAAmplification Exo Kits）以转基因水稻PA110-15、非转基因水稻、转基因水稻TT51-1、转基因水稻G6H1、非转基因玉米，非转基因大豆等的基因组DNA为模板进行扩增，并设空白对照。

RPA扩增体系为：总体系50μL，Rehydration Buffer 29.5 μL，Magnesium Actate(280μmol/L) 2.5μL，引物 (10μmol/L) 各2.0μL，探针 (10μmol/L) 0.5μL，植物基因组DNA(50 ng/μL) 1μL，剩余用水补足。

扩增程序：RPA扩增检测仪39摄氏度反应20分钟，同时进行实时荧光检测。

2.6 RPA-DNA试纸条检测转基因水稻PA110-15方法的特异性测试

根据前述筛选的引物及探针序列设计合成RPA-DNA试纸条联检用的引物及探针。使用Nfo试剂盒（TwistAmp DNA Amplification Nfo Kits）以转基因水稻PA110-15、转基因水稻TT51-1、转基因水稻KMD1、转基因水稻Bar68-1、非转基因水稻、非转基因大豆、非转基因小麦等的基因组DNA为模板进行扩增，并设空白对照。RPA扩增体系为：总体系50μl，Rehydration Buffer 29.5 μL，Magnesium Actate (280μmol/L) 2.5μL，引物(10μmol/L)各2.0μL，探针(10μmol/L) 0.5μL，植物基因组DNA (50ng/μL) 1μL，剩余用水补足，39℃反应20 min。反应完成后，用PBST缓冲液稀释50倍，取20-30μL滴加在DNA试纸条(MileniaGenline HybriDetect 1 Lateral Flow Strips)，1 min内肉眼观察试纸条的检测线和质控线位置处是否出现条带。

2.7 RPA-DNA试纸条检测转基因水稻PA110-15方法的灵敏度测试

将转基因水稻PA110-15的基因组模板DNA稀释至10 000 copies/μL，5 000 copies/μL，3 000 copies/μL，2 000 copies/μL，1 000 copies/μL，500 copies/μL，75 copies/μL，反应体系与检测步骤如2.6所述进行RPA-DNA试纸条检测。

3．实验结果

3.1 转基因水稻PA110-15的RPA检测引物的筛选

引物设计参考的目标模板序列来自本实验室通过PCR技术及测序进行分子特征鉴定获得的结果。根据PA110-15分子特征序列设计品系特异性5组上下游引物（表1），筛选过程中以上下游引物两两组合形成测试组合。应用Basic试剂盒 (TwistAmp DNA AmplificationBasic Kits) 以转基因水稻PA110-15基因组DNA为模板进行扩增测试，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。本实施例所设计的多数RPA扩增子的长度分布在300~500 bp，其中最大扩增片段达到700 bp，最小的扩增片段小于100 bp。扩增效果表明，部分引物组合的扩增拖带严重，部分组合的扩增过程产生了引物二聚体，这便导致长度大于700 bp的条带扩增结果往往会受到泳道背景的影响，而长度小于100 bp的片段扩增结果会受到引物二聚体的影响（图1）。因此，我们选择了扩增片段长度在200~500 bp之间背景较为清晰、扩增子条带明显的“PA110-F5、PA110-R4”引物对作为转基因水稻PA110-15的RPA检测引物组合。

3.2 转基因水稻PA110-15的RPA检测引物的特异性检测

以“PA110-F5、PA110-R4”引物对为扩增引物，以转基因水稻PA110-15为阳性材料，选取转基因水稻KMD1、转基因水稻mf-MH3301-1、非转基因水稻、大豆、小麦作为参照材料进行RPA扩增，同时设置空白对照。扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果显示除了阳性材料PA110-15中扩增出大小为337 bp的片段，其他材料均无扩增（图2）。结果表明该对引物在转基因水稻PA110-15材料的特异性检测中表现良好，可用于转基因水稻PA110-15 RPA检测方法的后续研究。

3.3 转基因水稻PA110-15的RPA检测方法的探针筛选

本实施例采用荧光RPA的方法来进行探针筛选，通过实时检测荧光信号，来快速判断探针序列的有效性及实用性。本研究设计了3条探针（表1），使用Exo试剂盒（TwistAmp DNAAmplification Exo Kits）以转基因水稻PA110-15、非转基因水稻、转基因水稻TT51-1、转基因水稻G6H1、非转基因玉米，非转基因大豆等的基因组DNA为模板进行扩增，并设空白对照。探针筛选的结果表明探针PA110-P1在检测过程中未获得扩增曲线，探针PA110-P2及PA110-P3均获得扩增曲线。但在PA110-P2探针的反应中发现背景信号增长过高；而在PA110-P3探针的反应中，只有阳性材料转基因水稻PA110-15获得了良好的扩增曲线，在非转基因水稻、转基因水稻TT51-1、转基因水稻G6H1、非转基因玉米和非转基因大豆等阴性对照材料及空白对照中未得到扩增，表现了良好的特异性（图3）。因此，选择PA110-P3探针序列用于后续DNA试纸条检测探针的设计。

3.4 RPA-DNA试纸条检测转基因水稻PA110-15方法的特异性测试

根据前述筛选的引物及探针序列设计RPA-DNA试纸条联检的引物及探针，上游引物不作改变，下游引物在5’端修饰一个生物基团，探针序列的脱碱基位点及3’磷酸化不变，改变FAM荧光基团的修饰位置于5’端，不进行BHQ1基团的修饰(表2)。使用Nfo试剂盒（TwistAmpDNA Amplification Nfo Kits）以转基因水稻PA110-15、转基因水稻TT51-1、转基因水稻KMD1、转基因水稻Bar68-1、非转基因水稻、非转基因大豆、非转基因小麦等的基因组DNA为模板进行扩增，并设空白对照。RPA反应体系中加入模板DNA量为50 ng，39℃反应20 min。反应完成后，用PBST缓冲液稀释50倍，利用DNA试纸条（Milenia Genline HybriDetect 1Lateral Flow Strips）进行检测。测试结果表明，只需15-30 s，在检测转基因水稻PA110-15样品的试纸条上同时出现紫色的检测线和质控线，而检测其他样品及以水作模板的空白对照的试纸条上只出现质控线（图4）。结果表明，本研究的引物对及探针组合应用RPA-DNA试纸条可以快速准确地检出转基因水稻PA110-15样品。

表2 RPA-DNA试纸条检测转基因水稻PA110-15中使用的引物和探针

引物及探针	序列(5’-3’)
		PA110-RPA-LFD-F	CGAGTTTCTCCATAATAATGTGTGAGTAGTT
PA110-RPA-LFD-R	(Biotin) GATTTGATTTGGCTGATCTAGGAGTTACT
		PA110-RPA-LFD-P	(FAM)TAAAAACGTCCGCAATGTGTTATTAAGTTG(dSpacer)CTAAGCGTC(phosphate)

3.5 RPA-DNA试纸条检测转基因水稻PA110-15方法的灵敏度测试

本实施例进一步进行了RPA-DNA试纸条检测转基因水稻PA110-15方法的灵敏度实验，将转基因水稻PA110-15模板基因组DNA分别稀释至10 000，5 000，3 000，2 000，1 000，500，及75拷贝，进行RPA-DNA试纸条检测。检测结果表明：当模板DNA高于3 000拷贝时，可轻易检出目标，但随着模板拷贝数的降低，试纸条上形成检测线的色度逐渐降低；当模板DNA降低至75拷贝时，检测线的色度虽然已经很低，但仍可肉眼辨别；以水作模板的空白对照中只出现质控线，未出现检测线（图5）。灵敏度测试结果表明本发明提供的引物和探针组合可完全满足野外现场快速检测转基因水稻PA110-15的需要。

参考文献

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Euler M., Wang Y., Otto P., Tomaso H., Escudero R., Anda P., Hufert F.T.,and Weidmann M., 2012, Recombinase polymerase amplification assay for rapiddetection of Francisella tularensis, Journal of Clinical Microbiology, 50(7):2234-2238

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<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>应用RPA-DNA试纸条联检对转基因水稻PA110-15品系特异性检测方法

<160> 3

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<400> 1

CGAGTTTCTCCATAATAATGTGTGAGTAGTT 31

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<400> 2

(Biotin)GATTTGATTTGGCTGATCTAGGAGTTACT 29

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<400> 3

(FAM)TAAAAACGTCCGCAATGTGTTATTAAGTTG(dSpacer)CTAAGCGTC(phosphate) 39

Claims (9)

1.一种用于通过重组酶聚合酶等温扩增及DNA试纸条联检检测转基因水稻PA110-15的引物和探针的组合，其特征在于: 正向引物序列如SEQ ID NO1所示，反向引物序列如SEQID NO2所示，探针序列如SEQ ID NO3所示；具体为：

SEQ ID NO1：称为PA110-RPA-LFD-F，序列为：CGAGTTTCTCCATAATAATGTGTGAGTAGTT

SEQ ID NO2：称为PA110-RPA-LFD-R，序列为：

(Biotin) GATTTGATTTGGCTGATCTAGGAGTTACT

SEQ ID NO3：称为PA110-RPA-LFD-P，序列为：

(FAM)TAAAAACGTCCGCAATGTGTTATTAAGTTG(dSpacer)CTAAGCGTC(phosphate)。

2.一种检测包含转基因水稻PA110-15的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含权利要求1所述的引物和探针的组合。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：进一步包括DNA试纸条。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述DNA试纸条具体为Milenia GenlineHybriDetect 1 Lateral Flow Strips或相同原理DNA试纸条。

5.一种通过重组酶聚合酶等温扩增及DNA试纸条联检检测含有转基因水稻PA110-15的方法，其特征在于：提取待测样品的DNA作为模板，利用权利要求1所述的引物和探针的组合进行快速扩增，随后进行DNA试纸条检测，如果在试纸条质控线和检测线的位置上皆出现条带，则证明所检样品含有转基因水稻PA110-15成分。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：

以50μL扩增体系计，其中Rehydration Buffer 29.5 μL，280μmol/L的MagnesiumActate 2.5μL，10μmol/L的引物各2μL，10μmol/L的探针0.5μL，模板DNA 50ng，水补充到50μL。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述扩增程序为：39摄氏度水浴或恒温仪上反应20分钟。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：扩增反应完成后，利用DNA试纸条进行检测，扩增产物用PBST缓冲液稀释50倍，然后取20-30 μL滴加在试纸条上；1 min内肉眼观察，在阳性样品的试纸条上，质控线和检测线位置处皆出现条带，而阴性样品只在质控线位置处出现条带。

9.如权利要求5-8任一项所述的方法，其特征在于：所述DNA试纸条具体为MileniaGenline HybriDetect 1 Lateral Flow Strips或相同原理DNA试纸条。