CN106754712B - 诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的方法、试剂盒及***。所述诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的方法包括：利用第一培养基对所述脐带血单个核细胞进行扩增培养，以便得到扩增后的造血干细胞；以及利用第二培养基对所述扩增后的造血干细胞进行诱导培养，以便得到所述粒系细胞，所述第一培养基为spemspan培养基，所述第二培养基为含有第一添加物的X‑VIVOTM15培养基，且所述第一添加物包括重组人血小板生成素、重组人干细胞因子以及重组人粒细胞集落刺激因子。本发明的方法能够获得大量粒系细胞，诱导分化效率较高。

Description

诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域。具体地，本发明涉及诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的方法。更具体地，本发明涉及诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的方法、试剂盒及***。
背景技术
粒系细胞是血液非特异性免疫***的重要组成部分，特别是中性粒细胞，在非特异性免疫应答中执行重要的生理功能，当炎症发生时，具有趋化作用的中性粒细胞，到达炎症部位，吞噬微生物病原体，由于中性粒细胞内含有大量溶酶体酶，能将吞噬入细胞内的细菌和组织碎片分解、杀灭。化学药物、电离辐射(放化疗)、严重感染等原因会导致骨髓损伤和粒系细胞减少。粒系细胞缺乏常导致头晕、乏力，此外还可出现严重感染症状，感染部位以肺、尿路、皮肤等多见，易发生脓毒血症或败血症，死亡率可达25％。中性粒细胞减少症是由于外周血中性粒细胞数量减少而产生的综合征，是肿瘤治疗中最常见的并发症，在接受化疗的实体肿瘤病人中发生率为10％-20％，死亡率达到9.8％。造血干细胞诱导分化粒细胞为临床应用提供新的途径。
然而，目前粒系细胞的扩增及诱导体系还存在诱导分化效率低、细胞数量少等问题，仍有待研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出了一种诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的方法、试剂盒及***。利用该方法、试剂盒和***能够获得大量粒系细胞，诱导分化效率较高。
为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用第一培养基对所述脐带血单个核细胞进行扩增培养，以便得到扩增后的造血干细胞；以及利用第二培养基对所述扩增后的造血干细胞进行诱导培养，以便得到所述粒系细胞，所述第一培养基为spemspan培养基，所述第二培养基为含有第一添加物的X-VIVOTM15培养基，且所述第一添加物包括重组人血小板生成素、重组人干细胞因子以及重组人粒细胞集落刺激因子。
发明人惊奇地发现，预先将脐带血单个核细胞进行扩增培养，以获得大量的造血干细胞，再对其进行诱导培养，以获得大量的粒系细胞。采用上述两阶段培养的诱导模式获得的粒系细胞量明显高于直接将脐带血单个核细胞进行诱导培养。进一步地，发明人发现，第一培养基成分及第二培养基成分显著影响诱导分化效率，若第一培养基成分及第二培养基成分不适于脐带血单个核细胞扩增为造血干细胞及其分化为粒系细胞，会使得粒系细胞诱导分化效率较低。例如，若第一培养基成分不适，可能容易使得脐带血单个核细胞扩增为造血干细胞的数量减少，从而导致粒系细胞得率偏低；若第二培养基成分不适，可能容易使得造血干细胞定向分化为粒系细胞的数量减少，也会导致粒系细胞得率偏低。为此，发明人经过深入研究得到最优第一培养基和第二培养基成分，由此，使得粒系细胞诱导分化效率较高，从而获得大量粒系细胞。
根据本发明的实施例，上述诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的方法还可以进一步具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述spemspan培养基含有第二添加物，所述第二添加物包括：重组人血小板生成素、重组人干细胞因子、重组人白细胞介素-3以及重组人白细胞介素-6。由此，根据本发明实施例的方法能够获得大量造血干细胞，诱导分化效率较高。
根据本发明的实施例，所述第二添加物进一步包括下列的至少一种：FMS样酪氨酸激酶3、芳香烃受体抑制剂和芳香烃受体拮抗剂的增强剂。根据本发明的优选实施例，所述第二添加物进一步包括芳香烃受体抑制剂和芳香烃受体拮抗剂的增强剂。由此，根据本发明实施例的方法能够获得大量造血干细胞，诱导分化效率较高。
根据本发明的实施例，在所述第二培养基中，所述重组人血小板生成素的浓度为30～100ng/mL，优选50ng/mL；所述重组人干细胞因子的浓度为30～100ng/mL，优选50ng/mL；所述粒细胞集落刺激因子的浓度为30～100ng/mL，优选50ng/mL。由此，根据本发明实施例的方法能够获得大量粒系细胞，诱导分化效率较高。
根据本发明的实施例，在所述第一培养基中，所述重组人血小板生成素的浓度为5～20ng/mL，优选10ng/mL；所述重组人干细胞因子的浓度为30～100ng/mL，优选50ng/mL；所述重组人白细胞介素-3的浓度为10～50ng/mL，优选20ng/mL；所述重组人白细胞介素-6的浓度为10～50ng/mL，优选20ng/mL；所述芳香烃受体抑制剂的浓度为0.3～0.8μM，优选0.5μM；所述芳香烃受体拮抗剂的增强剂的浓度为0.3～0.8μM，优选0.5μM。由此，根据本发明实施例的方法能够获得大量造血干细胞，诱导分化效率较高。
根据本发明的实施例，所述扩增培养的时间为5～10天，优选7天。由此，根据本发明实施例的方法能够获得大量造血干细胞，诱导分化效率较高。
根据本发明的实施例，所述诱导培养的时间为14～25天，优选21天。由此，根据本发明实施例的方法能够获得大量粒系细胞，诱导分化效率较高。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种用于诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：第一培养基，所述第一培养基用于对所述脐带血单个核细胞进行扩增培养，以便得到扩增后的造血干细胞；以及第二培养基，所述第二培养基用于对所述扩增后的造血干细胞进行诱导培养，以便得到所述粒系细胞，其中，所述第一培养基和第二培养基是如前面所描述的诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的方法定义的。由此，根据本发明实施例的试剂盒能够获得大量粒系细胞，诱导分化效率较高。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种用于诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的***。根据本发明的实施例，所述***包括：第一培养装置，所述第一培养装置用于利用第一培养基对所述脐带血单个核细胞进行扩增培养，以便得到扩增后的造血干细胞；以及第二培养装置，所述第二培养装置用于利用第二培养基对所述扩增后的造血干细胞进行诱导培养，以便得到所述粒系细胞，其中，所述第一培养基和第二培养基是如前面所描述的诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的方法定义的。由此，根据本发明实施例的***能够获得大量粒系细胞，诱导分化效率较高。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的方法的流程示意图；
图2显示了根据本发明一个实施例的体外诱导的粒系细胞形态图(1000×)；
图3显示了根据本发明一个实施例的体外诱导的粒系细胞CD18表达(400×)；以及
图4显示了根据本发明一个实施例的体外诱导的粒系细胞吞噬功能的显微镜图(1000×)。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
本发明提出了一种诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的方法、试剂盒及***，下面将分别对其进行详细描述。
诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的方法
在本发明的一个方面，本发明提出了一种诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的方法。根据本发明的实施例，参见图1，该方法包括扩增培养S100以及诱导培养S200。由此，根据本发明实施例的方法能够获得大量粒系细胞，诱导分化效率较高。下面将详细描述诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的方法。
根据本发明的实施例，诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的方法包括：
S100扩增培养
在该步骤中，利用第一培养基对脐带血单个核细胞进行扩增培养，以便得到造血干细胞。
S200诱导培养
在该步骤中，利用第二培养基对扩增后的造血干细胞进行诱导培养，以便得到粒系细胞。
发明人惊奇地发现，预先将脐带血单个核细胞进行扩增培养，以获得大量的造血干细胞，尤其是CD34+造血干细胞，再对其进行诱导培养，以获得大量的粒系细胞。采用上述两阶段培养的诱导模式获得的粒系细胞量明显高于直接将脐带血单个核细胞进行诱导培养。进一步地，发明人发现，第一培养基成分及第二培养基成分显著影响诱导分化效率，若第一培养基成分及第二培养基成分不适于脐带血单个核细胞扩增及其分化为粒系细胞，会使得诱导分化效率较低。例如，若第一培养基成分不适，可能容易使得脐带血单个核细胞扩增为造血干细胞的数量减少，从而导致粒系细胞得率偏低；若第二培养基成分不适，可能容易使得造血干细胞定向分化为粒系细胞的数量减少，也会导致粒系细胞得率偏低。
为此，发明人经过深入研究得到最优第一培养基和第二培养基成分，具体地，第一培养基为spemspan培养基，第二培养基为含有第一添加物的X-VIVOTM15培养基，且第一添加物包括重组重组人血小板生成素(rhTPO)、重组人干细胞因子(rhSCF)以及重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)。
发明人发现，利用X-VIVOTM15培养基诱导分化所得到的粒系细胞数量明显多于其他培养基，例如SCGM培养基。进一步地，发明人发现，X-VIVOTM15培养基中加入细胞因子(第一添加物)，使得造血干细胞进一步分化为粒系细胞，且细胞因子的种类显著影响诱导分化效率。进而，发明人经过大量实验发现，重组重组人血小板生成素、重组人干细胞因子以及重组人粒细胞集落刺激因子发挥协同作用，能够显著促进脐带血单个核细胞诱导分化为粒系细胞。
根据本发明的实施例，spemspan培养基含有第二添加物，第二添加物包括：重组重组人血小板生成素、重组人干细胞因子、重组人白细胞介素-3以及重组人白细胞介素-6。发明人经过大量实验发现，重组人血小板生成素、重组人干细胞因子、重组人白细胞介素-3以及重组人白细胞介素-6作为生长因子，能够显著促进脐带血单个核细胞扩增，获得的大量且活性较高的造血干细胞，尤其是CD34+造血干细胞，从而便于后续诱导分化得到大量的粒系细胞。
根据本发明的实施例，第二添加物进一步包括下列的至少一种：FMS样酪氨酸激酶3(FLt3)、芳香烃受体抑制剂(StemRegenin 1，SR1)和芳香烃受体拮抗剂的增强剂(UM729)。发明人发现，通过添加FLt3、SR1和UM729至少一种能够进一步提高脐带血单个核细胞的扩增效率，获得的大量且活性较高的造血干细胞，尤其是CD34+造血干细胞，从而便于后续诱导分化得到大量的粒系细胞，进一步发现，同时含有SR1和UM729时，效果最佳。
根据本发明的实施例，在第一培养基中，重组人血小板生成素的浓度为5～20ng/mL，优选10ng/mL；重组人干细胞因子的浓度为30～100ng/mL，优选50ng/mL；重组人白细胞介素-3的浓度为10～50ng/mL，优选20ng/mL；重组人白细胞介素-6的浓度为10～50ng/mL，优选20ng/mL；SR1的浓度为0.3～0.8μM，优选0.5μM；UM729的浓度为0.3～0.8μM，优选0.5μM。
发明人发现，第一培养基中细胞因子的浓度显著影响脐带血单个核细胞的扩增为造血干细胞，进而影响粒系细胞的诱导分化效率。进而，发明人经过大量实验得到上述最优浓度，由此，能够有效地提高脐带血单个核细胞的扩增效率，获得的大量且活性较高的造血干细胞，尤其是CD34+造血干细胞，从而便于后续诱导分化得到大量的粒系细胞。然而，其他浓度效果不佳。
根据本发明的实施例，在第二培养基中，重组人血小板生成素的浓度为30～100ng/mL，优选50ng/mL；重组人干细胞因子的浓度为30～100ng/mL，优选50ng/mL；粒细胞集落刺激因子的浓度为30～100ng/mL，优选50ng/mL。发明人发现，第二培养基中细胞因子的浓度显著影响诱导分化效率。进而，发明人经过大量实验得到上述最优浓度，由此，能够获得大量粒系细胞，诱导分化效率较高。然而，其他浓度效果不佳。
根据本发明的实施例，扩增培养的时间为5～10天。由此，培养所得到的造血干细胞处于指数生长期，细胞的活性高。根据本发明的优选实施例，扩增培养的时间为7天。由此，处于指数生长期的扩增后的造血干细胞形态好、细胞活性更高，有利于诱导分化得到粒系细胞。
根据本发明的实施例，诱导培养的时间为14～25天。由此，诱导分化所得到的粒系细胞数较多。根据本发明的优选实施例，诱导培养的时间为21天。由此，诱导分化效率最优。
用于诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的试剂盒
在本发明的另一方面，本发明提出了一种用于诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：第一培养基，第一培养基用于对脐带血单个核细胞进行扩增培养，以便得到扩增后的造血干细胞；以及第二培养基，第二培养基用于对扩增后的造血干细胞进行诱导培养，以便得到粒系细胞，其中，第一培养基和第二培养基是如前面所描述的诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的方法定义的。
根据本发明实施例的用于诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的试剂盒，第一培养基为spemspan培养基，该第一培养基对脐带血单个核细胞进行扩增培养，从而获得造血干细胞，第二培养基为含细胞因子的X-VIVOTM15培养基，该第二培养基对扩增后的造血干细胞进行诱导培养，促进造血干细胞诱导分化为粒系细胞。采用上述两阶段培养的诱导模式获得的粒系细胞量明显高于直接将脐带血单个核细胞进行诱导培养。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对第一培养基和第二培养基所描述的特征和优点，同样适用于该用于诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的试剂盒，在此不再赘述。
用于诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的***
在本发明的又一方面，本发明提出了一种用于诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的***。根据本发明的实施例，该***包括：第一培养装置，第一培养装置用于利用第一培养基对脐带血单个核细胞进行扩增培养，以便得到扩增后的造血干细胞；以及第二培养装置，第二培养装置用于利用第二培养基对扩增后的造血干细胞进行诱导培养，以便得到粒系细胞，其中，第一培养基和第二培养基是如前所描述的诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的方法定义的。
根据本发明实施例的用于诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的试剂盒，第一培养基为spemspan培养基，该第一培养基对脐带血单个核细胞进行扩增培养，从而获得造血干细胞，第二培养基为含细胞因子的X-VIVOTM15培养基，该第二培养基对扩增后的造血干细胞进行诱导培养，促进造血干细胞诱导分化为粒系细胞。采用上述两阶段培养的诱导模式获得的粒系细胞量明显高于直接将脐带血单个核细胞进行诱导培养。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对第一培养基和第二培养基所描述的特征和优点，同样适用于该用于诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的***，在此不再赘述。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
一般方法
1资料
1.1一般资料
健康孕妇的脐带血，均得到志愿者的知情同意。
1.2仪器与试剂
6％羟乙基淀粉和人淋巴细胞分离液均购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司；X-VIVOTM15培养基购自Lonza公司；SCGM无血清培养基购自德国CellGenix公司；生长因子rhSCF、rhFlt-3、rhIL-6、rhIL-3和rhG-CSF购自peprotech公司；胎牛血清(FBS)购于美国GIBCO公司。rhTPO购自沈阳三生制药有限责任公司；抗人CD15-PE单克隆抗体、抗人CD35-APC单克隆抗体和抗人CD11b-Percp单克隆抗体购自eBioscience公司；小鼠抗人CD-18单克隆抗体抗体购自Abcam公司；山羊抗小鼠IgG-FITC抗体购自中衫金桥ZSGB-BIO公司；瑞氏-姬姆萨A液和B液购自BaSo珠海贝索生物科技有限公司；得阁墨汁购自北京利明恒通工贸有限公司；0.9％生理盐水购自石家庄四药有限公司。Vi-CELLXR细胞活力分析仪购自德国贝克曼公司；5910型低温离心机购自日本久保田公司；CKS31倒置显微镜购自OLYMPUS公司；TXD3细胞涂片离心机购自湘仪离心机公司；倒置荧光显微镜和正置显微镜购自Nikon公司；流式细胞仪购自BD公司。
2脐带血单个核细胞获得
脐带血采用6％羟乙基淀粉室温沉降红细胞15～30min。小心吸取上清，生理盐水重悬细胞。缓慢加入含淋巴细胞分离液的离心管中，室温密度梯度离心20min，收集中间白膜层，生理盐水洗涤2次，细胞计数。接种细胞，置于37℃，5％CO2培养箱中进行诱导扩增，传代，诱导14～21天后取细胞进行检测，得到脐带血单个核细胞。
3粒系细胞形态学观察
甩片：取2×105个/片细胞1200rpm离心3min。加入2滴瑞氏-姬姆萨A液染色1～3min，加入2滴左右瑞氏-姬姆萨B液染色10min，超纯水中清洗残余染料。显微镜观察粒系细胞染色。
4免疫荧光检测粒系细胞CD18表达
取2×107个细胞于EP管中，PBS洗一次，4％多聚甲醛4℃固定1h后，弃上清。加入300μl含0.1％Triton的PBS中，4℃处理15～30min，离心，弃上清。PBS洗涤，加1％BSA混匀，加入1:300稀释的小鼠抗人CD18抗体，4℃孵育1h。PBS洗涤，弃上清。PBS重悬细胞，加入1:200稀释的FITC标记的抗小鼠二抗，4℃孵育1h，PBS洗涤，离心，弃上清。PBS重悬细胞，1000rpm离心5min甩片，荧光显微镜观察。
5流式细胞仪检测粒系细胞表面标志
每管取2×105个细胞，生理盐水洗2次，加入100μl生理盐水重悬，以不同荧光标记IgG抗体为对照组，实验组1-3为分别加入CD15-PE抗体、CD35-APC抗体、CD11b-percp抗体，实验组4为同时加入上述三种抗体，每个样品重复三个。4℃孵育30min。生理盐水洗2次，加入200μl重悬，筛网过滤，上机检测。
6粒细胞吞噬功能检测
生理盐水按1:1000稀释墨汁，取1×106个细胞悬于100μl生理盐水中，加入100μl稀释好的墨汁，37℃孵育3h，生理盐水洗2～3次，1000rpm离心5min甩片。瑞士吉姆萨染色，显微镜观察100个细胞中墨汁的吞噬情况。
实施例1脐带血单个核细胞扩增培养基的选择
采用含50ng/ml rhSCF、10ng/ml rhTPO、20ng/ml IL-3、10ng/ml IL-6的stemspan培养基，分别添加0.5μM SR1和0.5μM UM729合用、50ng/ml Flt3、0.5μM SR1、0.5μM UM729，扩增培养7天，比较细胞存活率和CD34+细胞数。结果如表1所示，在上述培养基中添加0.5μMSR1和0.5μM UM729合用扩增脐带血单个核细胞中CD34阳性细胞，效果最佳。因此可以选择50ng/ml rhSCF、10ng/ml rhTPO、20ng/ml IL-3、10ng/ml IL-6、0.5μM SR1和0.5μM UM729的stemspan培养基作为CD34+造血干细胞的扩增培养基。
表1 不同培养配方对脐带血单个核细胞扩增的影响
检测指标 FLt3 SR1 UM729 SR1+UM729
存活率(％) 88.17±1.08 90.62±1.01 94.55±1.08 94.74±0.36
CD34<sup>+</sup>细胞数 3.41×10<sup>6</sup> 4.09×10<sup>6</sup> 3.33×10<sup>6</sup> 4.97×10<sup>6</sup>
实施例2粒系细胞诱导培养基的选择
1、胎牛血清(FBS)和rhTPO对粒系细胞扩增和分化的影响
采用含rhSCF、rhG-CSF细胞因子的X-VIVOTM15培养基，按照表2所示的方式添加TPO和FBS，其中“+”表示添加；“-”表示不添加，诱导14天，观察对粒系细胞诱导扩增的影响。结果显示，加入胎牛血清后明显抑制了粒系细胞扩增和表达。加入rhTPO所得到的，粒系细胞的细胞数、存活率以及CD15+、CD15+CD11b+表达百分率更佳。因此，选择含rhSCF、rhG-CSF、rhTPO的X-VIVOTM15培养基作为诱导粒系细胞的培养基。
表2 FBS和rhTPO对粒系细胞诱导的影响
名称 细胞数(×10<sup>7</sup>) 存活率(％) CD15<sup>+</sup>(％) CD15<sup>+</sup>CD11b<sup>+</sup>(％)
rhTPO<sup>+</sup>/FBS<sup>-</sup> 2.53±0.02 94.92±1.59 96.05±0.40 52.60±3.54
rhTPO<sup>+</sup>/FBS<sup>+</sup> 1.03±0.03 89.63±2.27 88.22±0.38 44.13±4.40
rhTPO<sup>-</sup>/FBS<sup>+</sup> 0.74±0.01 86.08±3.49 84.53±0.21 47.85±4.88
2、X-VIVOTM15培养基和SCGM培养基对粒系细胞扩增和分化的影响
采用含有50ng/ml rhTPO、50ng/ml rhSCF、50ng/ml rhG-CSF的X-VIVOTM15培养基和SCGM培养基，在24孔板中扩增培养脐带血单个核细胞14天，检测细胞数以及标志分子CD15、CD11b和CD35的表达，结果如表3所示。粒系细胞在X-VIVOTM15培养基中细胞数、表面标志CD15+、CD15+CD11b+表达高于SCGM培养基；两种培养基诱导的成熟粒系细胞表型CD35+CD15+的表达无显著差异(p＞0.05)，因此，首选X-VIVOTM15培养基作为粒系细胞基础培养基。用该培养体系继续诱导诱导培养21天，流式检测细胞表型CD15+表达为(91.68±0.32)％，CD15+CD11b+表达为(47.50±2.55)％，CD35+CD15+(78.65±1.63)％，与诱导14天相比，成熟的粒细胞CD35+CD15+增多。
表3 不同培养基培养诱导粒系细胞
名称 细胞数(×10<sup>7</sup>) CD15<sup>+</sup>(％) CD15<sup>+</sup>CD11b<sup>+</sup>(％) CD35<sup>+</sup>CD15<sup>+</sup>(％)
X-VIVO<sup>TM</sup>15 1.46±0.03 97.73±0.37 53.15±2.33 49.35±1.06
SCGM 0.86±0.01 84.35±1.91 51.35±4.74 49.90±8.06
实施例3诱导模式的选择
直接诱导模式：采用50ng/ml rhTPO、50ng/ml rhSCF、50ng/ml rhG-CSF的X-VIVOTM15培养基，诱导脐带血单个核细胞14天；
先扩增后诱导的两阶段诱导模式：采用含有50ng/ml rhSCF、10ng/ml rhTPO、20ng/mlIL-3、10ng/ml IL-6、50ng/ml Flt-3的stemspan培养基扩增培养脐带血单个核细胞7天，将所得到的扩增后细胞按照4×106个/mL接种于含有50ng/ml rhTPO、50ng/mlrhSCF、50ng/mlrhG-CSF的X-VIVOTM15培养基诱导14天。
结果如表4所示。流式细胞检测表明，两阶段诱导模式，粒系细胞分化效率滞后于直接诱导模式。但是，细胞扩增倍数，明显高于直接诱导模式。
表4 诱导培育模式比较
CD15<sup>+</sup>(％) CD15<sup>+</sup>CD11b<sup>+</sup>(％) CD35<sup>+</sup>CD15<sup>+</sup>(％)
直接诱导模式 97.73±0.37 53.15±2.33 49.35±1.06
两阶段诱导模式 69.6±1.06 34.11±1.27 26.83±1.17
采用两阶段诱导模式进行扩增、诱导后，扩增倍数为132倍。诱导21天后，扩增倍数为2590.5倍。瑞氏-姬姆萨染色可见不同阶段的粒细胞，包括分叶核粒细胞。如图2所示，成熟的分叶核粒细胞，胞核更致密，呈带状钝弯或分叶状，核质比更小，胞质嗜碱性消失，着色淡红。
CD18是粒细胞中的溶酶体蛋白，免疫荧光检测，脐带血单个核细胞经体外诱导获得的粒系细胞CD18抗体检测为阳性，发绿色荧光，具体如图3所示。
图4为墨汁吞噬实验的显微镜图，箭头指向的为吞噬墨汁的粒细胞，墨汁吞噬实验表明，体外扩增诱导的粒系细胞具有一定的吞噬墨汁的功能，吞噬效率为(51.43±0.05)％。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (7)

1.一种诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的方法，其特征在于，包括：
利用第一培养基对所述脐带血单个核细胞进行扩增培养，以便得到扩增后的造血干细胞；以及
利用第二培养基对所述扩增后的造血干细胞进行诱导培养，以便得到所述粒系细胞，
所述第一培养基为stemspan培养基，
所述第二培养基为含有第一添加物的X-VIVOTM15培养基，且所述第一添加物为重组人血小板生成素、重组人干细胞因子以及重组人粒细胞集落刺激因子；
所述stemspan培养基含有第二添加物，所述第二添加物为重组人血小板生成素、重组人干细胞因子、重组人白细胞介素-3、重组人白细胞介素-6、芳香烃受体抑制剂和芳香烃受体拮抗剂的增强剂；
在所述第二培养基中，
所述重组人血小板生成素的浓度为30～100ng/mL；
所述重组人干细胞因子的浓度为30～100ng/mL；
所述粒细胞集落刺激因子的浓度为30～100ng/mL；
在所述第一培养基中，
所述重组人血小板生成素的浓度为5～20ng/mL；
所述重组人干细胞因子的浓度为30～100ng/mL；
所述重组人白细胞介素-3的浓度为10～50ng/mL；
所述重组人白细胞介素-6的浓度为10～50ng/mL；
所述芳香烃受体抑制剂的浓度为0.3～0.8μM；
所述芳香烃受体拮抗剂的增强剂的浓度为0.3～0.8μM；
所述扩增培养的时间为5～10天；
所述诱导培养的时间为14～25天。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述第二培养基中，
所述重组人血小板生成素的浓度为50ng/mL；
所述重组人干细胞因子的浓度为50ng/mL；
所述粒细胞集落刺激因子的浓度为50ng/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述第一培养基中，
所述重组人血小板生成素的浓度为10ng/mL；
所述重组人干细胞因子的浓度为50ng/mL；
所述重组人白细胞介素-3的浓度为20ng/mL；
所述重组人白细胞介素-6的浓度为20ng/mL；
所述芳香烃受体抑制剂的浓度为0.5μM；
所述芳香烃受体拮抗剂的增强剂的浓度为0.5μM。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增培养的时间为7天。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导培养的时间为21天。
6.一种用于诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的试剂盒，其特征在于，包括：
第一培养基，所述第一培养基用于对所述脐带血单个核细胞进行扩增培养，以便得到扩增后的造血干细胞；以及
第二培养基，所述第二培养基用于对所述扩增后的造血干细胞进行诱导培养，以便得到所述粒系细胞，
其中，所述第一培养基选自权利要求1～5任一项所述的诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的方法中的第一培养基；
所述第二培养基选自权利要求1～5任一项所述的诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的方法中的第二培养基。
7.一种用于诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的***，其特征在于，包括：
第一培养装置，所述第一培养装置用于利用第一培养基对所述脐带血单个核细胞进行扩增培养，以便得到扩增后的造血干细胞；以及
第二培养装置，所述第二培养装置用于利用第二培养基对所述扩增后的造血干细胞进行诱导培养，以便得到所述粒系细胞，
其中，所述第一培养基选自权利要求1～5任一项所述的诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的方法中的第一培养基；
所述第二培养基选自权利要求1～5任一项所述的诱导脐带血单个核细胞分化为粒系细胞的方法中的第二培养基。
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