KR20050042046A

KR20050042046A - 조혈 줄기세포의 증식방법

Info

Publication number: KR20050042046A
Application number: KR1020047006624A
Authority: KR
Inventors: 나와가쓰히코; 하스무라마이; 이마다치하루
Original assignee: 다이이찌 세이야꾸 가부시기가이샤
Priority date: 2001-10-30
Filing date: 2002-10-30
Publication date: 2005-05-04
Also published as: RU2297451C2; WO2003038077A1; CN1606615A; EP1445311A1; JPWO2003038077A1; CA2465001A1; EP1445311A4; RU2004113375A; US20040248295A1; NO20041737L

Abstract

본 발명은 대식세포 콜로니 자극인자(M-CSF)의 존재하에 배양하는 것을 특징으로 하는 Lin 음성 또는 약양성 세포의 배양방법, M-CSF 존재하에 Lin 음성 또는 약양성 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 조혈 줄기세포의 증식방법, 당해 증식방법에 따라 수득되는 조혈 줄기세포 집단, M-CSF를 함유하는 Lin 음성 또는 약양성 세포의 배양 키트 및 M-CSF를 함유하는 조혈 줄기세포의 증식 촉진제를 제공한다.

Description

조혈 줄기세포의 증식방법{Method of amplifying hematopoietic stem cells}

본 발명은 대식세포 콜로니 자극인자(M-CSF)를 사용하는 조혈 줄기세포의 증식방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 M-CSF 존재하에 배양하는 것을 특징으로 하는 Lin 음성 또는 약양성 세포의 배양방법, M-CSF 존재하에 Lin 음성 또는 약양성 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 조혈 줄기세포의 증식방법, 당해 증식방법에 의해 수득되는 조혈 줄기세포 집단, M-CSF를 함유하는 Lin 음성 또는 약양성 세포 배양용 키트, M-CSF로 이루어진 조혈 줄기세포의 증식 촉진제에 관한 것이다.

조혈 줄기세포는 적혈구, 백혈구, 혈소판, T 및 B 임파구 등의 모든 혈구세포를 생성하는 능력(다분화능)을 갖는 동시에 자기자신을 복제하는 능력(자기 복제능력)을 겸하여 갖는 세포라고 정의된다. 골수이식은 이식 골수중에 포함되는 조혈 줄기세포가 이의 중심적 역할을 담당하므로 조혈 줄기세포 이식으로도 대체할 수 있다. 현재 이러한 골수이식은 각종 혈액질환, 암, 면역부전증, 선천성 대사이상증 등의 많은 난치성 질환에 대한 근치적 치료법으로서 확립되어 있다. 그러나 이식을 위해서는 공여자와 환자의 사람 백혈구 항원(HLA)이 합치되지 않으면 안되며 공여자 부족이 사회적 문제로 되고 있다.

최근, 골수에 대신하는 조혈 줄기세포원으로서 말초혈이 종종 사용되고 있다. 건강한 사람의 말초혈에는 조혈 줄기세포를 포함하는 CD34 양성 세포가 극히 소수밖에 존재하고 있지 않지만, 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF)를 연속 투여하면 대량으로 골수로부터 말초혈로 동원된다. 이 시기의 말초혈로부터 혈액 성분 분리장치를 사용하여 대량으로 말초혈 조혈 줄기세포/조혈 전구세포를 채취하여, 이식에 사용한다. 그러나 말초혈에 대한 조혈 줄기세포 동원의 효율 및 공여자의 안전면에서 해결해야 할 문제를 갖는다.

또한 조혈 줄기세포원으로서 제대혈(臍帶血)을 사용하는 제대혈 줄기세포 이식도 실시되고 있다. 그러나 제대혈에 포함되는 조혈 줄기 세포수가 적으므로 이의 적용은 소아에게 한정되고 있다.

이러한 배경에서 조혈 줄기세포를 생체외에서 증식시키는 기술이 요구되고 있으며 지금까지도 다양한 방법이 시도되고 있다. 예를 들면, 조혈 줄기세포를 증식시키기 위해 줄기세포 인자(SCF), 인터류킨-3(IL-3), 인터류킨-6(IL-6), 인터류킨-11(IL-11), G-CSF, 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF), fms형 티로신키나제-3(Flt-3) 리간드(FL), 트롬보포에틴(TPO) 등의 사이토카인의 존재하에 배양된 결과가 보고되어 있다. 조혈 전구세포 및 추가로 분화된 세포는 이들 사이토카인이나 증식인자 등과 함께 배양함으로써 높은 증식도로 증식할 수 있지만, 조혈 줄기세포의 증식도는 수배 정도이며 만족할 수 있는 수준이 아니다(참조: Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 13648-13653, 1997, Matsunaga et al., Blood, 92, 452-461, 1998, Bryder et al., Blood, 96, 1748-1755, 2000). 조혈 전구세포는 일반적으로 시험관내에서의 콜로니 형성능을 갖는 세포로 정의되지만, 자기 복제능을 보유하고 있지 않으며 장기간에 걸쳐 혈액세포를 생성할 수 없으므로 혈구 세포원으로서 이식에는 응용할 수 없다.

또한, 골수 간질(間質) 세포와의 동시 배양에 의해 조혈 줄기세포를 증식하는 것도 시도되고 있지만, 이의 증식도도 수배 정도이다(참조: Moore et al, Blood, 89, 4337-4347, 1997).

한편, 사이토카인, 증식인자 등을 생체에 직접투여함으로써 조혈 줄기세포의 대폭적인 증식이 가능하다면, 예를 들면, 소량의 조혈 줄기세포밖에 포함하지 않는 제대혈 등을 이식원으로 할 수 있으나, 이의 성공예에 대한 보고는 없다.

본 발명은 생체외에서 사이토카인, 증식인자에 의한 조혈 줄기세포의 불충분한 증식수준을 보다 증가시켜 생체외 증식된 조혈 줄기세포의 임상응용이 가능하게 하는 것을 목적으로 한다. 또한 사이토카인 직접투여에 의한 생체내에서의 조혈 줄기세포의 증식을 목적으로 한다.

도 1은 StemSep^TM을 사용하여 항 Lin 항체 칵테일로 표지한 마우스 골수 유래 세포군을 유동세포 측정기에 의해 해석한 도면이다. 칼럼 처리전은 MACS LS⁺ 칼럼으로 처리하기 전의 세포군의 해석결과를 나타내며 칼럼 처리후는 동일 칼럼으로 처리한 후의 세포군의 해석결과를 나타낸다. StemSep^TM으로 처리함으로써 계통 특이적 항원 마커(Lin) 음성 또는 약양성인 세포가 수득됨을 알았다.

도 2는 M-CSF에 의한 세포 증식 촉진작용을 도시하는 도면이다. 도면중, 공여자 세포(%)(Percent donor cells)는 Ly5.1 마우스 유래 Lin 음성 또는 약양성 세포를 각종 사이토카인으로 처리한 다음, Ly5.2 마우스 유래 세포와 함께 치사량 방사선 조사 Ly5.2 마우스에 이식하고, 이식으로부터 6개월 경과후의 말초혈 중의 Ly5.1 마우스 유래 세포의 비율을 나타낸다. 비처리(Fresh)는 사이토카인 처리 무, SCF+IL-11+FLT는 M-CSF와 함께 SCF, IL-11, Flt-3 리간드를 동시 첨가하여 배양하는 것을 나타낸다. SCF+IL-11+TPO는 M-CSF와 함께 SCF, IL-11, TPO를 동시 첨가하여 배양한 것을 나타낸다.

도 3은 Lin 음성 또는 약양성 세포를 10ng/ml의 M-CSF와 함께 SCF, IL-11, Flt-3 리간드로 배양하며, 수득된 세포를 이식하여 6개월째의 마우스 말초혈 백혈구의 각종 분화 마커의 발현을 도시하는 도면이다. 비오틴 표지한 각종 분화 마커에 대한 항체와 PE 표지 스트렙토아비딘으로 말초혈 백혈구를 염색한 다음, FITC 표지 항 마우스 Ly5.1 항체로 이중 염색하여 유동세포 측정기에 의해 해석한다. 도면중, 세로축은 각각 Mac-1, Gr-1, B220, CD3e의 분화 마커 발현량을 나타내며, 가로축은 Ly5.1(이식세포 유래)의 발현량을 나타낸다.

본 발명자등은 상기 과제를 해결하려고 예의 검토한 결과, 조혈 줄기세포를 포함한다고 생각되는 계통 특이적 항원 마커(Lineage Marker: Lin)가 음성 또는 약양성의 세포를 대식세포 콜로니 자극인자(M-CSF) 및 기타 사이토카인으로 자극함으로써 조혈 줄기세포의 증식수준을 증가시킬 수 있음을 밝혀내고 본 발명을 완성했다.

즉, 본 발명은 대식세포 콜로니 자극인자(M-CSF)의 존재하에 배양하는 것을 특징으로 하는 Lin 음성 또는 약양성 세포의 배양방법에 관한 것이다.

또한, 대식세포 콜로니 자극인자(M-CSF) 존재하에 Lin 음성 또는 약양성 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 조혈 줄기세포의 증식방법에 관한 것이다.

또한, 상기 방법에 따라 수득되는 조혈 줄기세포 집단에 관한 것이다.

또한, 대식세포 콜로니 자극인자(M-CSF)를 함유하는 Lin 음성 또는 약양성 세포 배양 키트에 관한 것이다.

또한, 대식세포 콜로니 자극인자(M-CSF)를 함유하는 조혈 줄기세포의 증식 촉진제에 관한 것이다.

본 발명의 배양방법 및 증식방법은 M-CSF 존재하에 Lin 음성 또는 약양성 세포의 배양을 실시하는 것을 특징으로 한다. 발명자등은 M-CSF 존재하에 Lin 음성 또는 약양성 세포의 배양을 실시하여, 조혈 줄기세포가 증식되는지 여부를 검토했다. 그 결과, M-CSF 부재하에 배양하는 경우와 비교하여, M-CSF 존재하에 배양하는 경우, 유의적인 조혈 줄기세포의 증식이 유도됨을 밝혔다. 따라서, 본 발명의 배양방법은 조혈 줄기세포의 증식에 응용할 수 있다. 또한 본 발명의 증식방법에 따라 증식된 조혈 줄기세포 집단은 증혈 줄기세포 이식원으로서 사용할 수 있다.

Lin 음성 또는 약양성 세포는 세포 표면 마커를 지표로 하여 채집하면 양호하다. Lin이란 계통 특이적 항원 마커(Lineage Marker)를 의미하며, 예를 들면, 적혈구 마커인 Ter 119, 과립구 마커인 Gr-1, 단구·대식세포계 세포 마커인 Mac-1(CD11b), T 세포 마커인 Ly1 등을 들 수 있다. 조혈 줄기세포는 Lin 음성 또는 약양성 분획에 존재한다고 되어 있다.

Lin 음성 또는 약양성 세포의 채취는 단세포 부유액으로 한 골수세포를 Lin 인식 표지 항체로 처리하며, 유동세포 측정기 등의 세포 분류기를 사용하여, 표지된 세포를 제거함으로써 실시할 수 있다. 예를 들면, 마우스 세포에서는 조혈 전구세포 조제용 항체 칵테일을 포함하는 StemSep^TM(StemCell Technologies Inc.)으로 처리한 세포가 Lin 음성 또는 약양성 세포로서 널리 사용되고 있다. 실시예에서는 StemSep^TM을 사용하여 수득한 세포는 처리전 세포의 0.5% 정도이다.

이와 같이 수득된 세포를 M-CSF 존재하에 배양할 때, 사용되는 배지, 배양기간, 배양 플레이트 등의 배양조건은 특별히 한정되지 않으며 세포가 양호한 상태로 유지되는 조건을 적절하게 선택하여야 한다. 예를 들면, 실시예에서는 수득된 Lin 음성 또는 약양성 세포를 조직 배양용 6웰 마이크로플레이트(IWAKI)에 1웰당 4×10⁴개로 파종하며, 5% FBS와 10μg/ml의 겐타마이신(Sigma)를 함유하는 RPMI 1640(GIBCO-BRL)을 사용하여 5% CO₂존재하에 37℃의 조건으로 6일 동안 배양했지만, 여기에 한정되지 않는다.

M-CSF는 제조원(Pepro Tech Inc.) 등으로부터 구입할 수 있지만, M-CSF를 암호화하는 유전자를 적당한 단백질 발현용 벡터에 도입하며, 통상적인 유전공학적 수법에 의해 제조할 수 있으며 특별히 한정되지 않는다. 또한, 사용되는 동물세포의 종(種)에 일치하는 M-CSF를 사용하는 것이 바람직하지만, 반응성이 수득되는 범위에서 타종류 유래의 M-CSF를 사용하는 경우도 있을 수 있다.

또한, 세포 배양시에는 적당한 사이토카인 및 증식인자를 첨가하는 것이 보다 바람직하다. 첨가하는 사이토카인 및 증식인자로서는 조혈 줄기세포의 유지, 증식 촉진, 분화 유도 등에 효과적인 것이 보고되어 있다(참조: Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 13648-13653, 1997, Matsunaga et al., Blood, 492, 452-461, 1998, Bryder et al., Blood, 96, 1748-1755, 2000), SCF, IL-3, IL-6, IL-11, G-CSF, GM-CSF, FLT, TPO, 백혈병 억제인자(LIF), 염기성 선유아(線維芽) 세포 증식인자(basic FGF), 간세포 증식인자(HGF), 혈관 내피 증식인자(VEGF), 인슐린형 증식인자(IGF) 등이 사료되지만, 특별히 한정되는 것이 아니다.

조혈 줄기세포는 상기한 바와 같이 모든 혈구세포를 생성하는 능력(다분화능)을 갖는 동시에 자기 자신을 복제하는 능력(자기 복제능력)을 겸하여 갖는 세포로서 정의된다. 따라서, 조혈 줄기세포가 증식되는지 여부의 확인방법으로서는 이러한 두가지 능력을 확인할 수 있는 방법이 바람직하다. 예를 들면, 마우스 세포를 사용하는 경우, 장기 골수 재구축법(Long term-repopulation assay)에 의해 실시할 수 있다. 본 방법은 실시예의 해당란에서 보다 상세하게 기재하지만, 조혈 줄기세포를 포함하는 세포군을 어떤 동물에게 이식하여, 장기간에 걸쳐 당해 줄기세포 유래의 혈액세포가 당해 동물의 혈액에 존재하는가를 확인하는 것이며, 조혈 줄기세포의 정량법으로서 현재 가장 신뢰성이 높은 방법이다(참조: Harrison et al, Exp. Hemato1., 21, 206-219, 1993).

사람세포를 사용하는 경우에는 NOD/SCID(비-비만 당뇨병/중증 복합 면역결핍질환(Non-Obese Diabetic/Severe Combined Immunodeficiency Disease)) 마우스나 β₂-마이크로글로불린이 결손된 NOD/SCID 마우스를 이식동물로서 사용하는 방법을 적용할 수 있다(참조: Larochelle et al., Nat. Med., 2, 1329-1337, 1996, Kollet et al., Blood, 95, 3102-3105, 2000).

세포 배양할 때에 첨가하는 M-CSF의 농도는 0.1 내지 100ng/ml 정도가 바람직하며, 1 내지 50ng/ml 정도가 보다 바람직하며, 5 내지 20ng/ml 정도가 더욱 바람직하다. M-CSF의 농도를 0,1, 10, 100ng/ml로 첨가하여 조혈 줄기세포의 증식능을 검토한 바, 10ng/ml에서는 유의적인 증식 촉진작용을 나타내는 데 대하여, 10Ong/ml에서는 오히려 증식을 억제하는 작용을 나타낸다. 이러한 점은 M-CSF의 조혈 줄기세포 증식작용에는 최적 농도가 존재함을 시사한다.

또한, Lin 음성 또는 약양성 세포에 대하여, 조혈 줄기세포 마커로서 공지되어 있는 c-Kit 및 Sca-1 마커 양성으로서 다시 선별을 가한 세포에서는 M-CSF 처리에 의한 조혈 줄기세포의 증식효과가 관찰되지 않는다. Lin 음성 또는 약양성 세포 중에서 조혈 줄기세포는 M-CSF 수용체(c-fms) 음성 분획으로 확인된다. 이러한 점에서 발명자는, M-CSF에 의한 조혈 줄기세포의 증식효과가 M-CSF가 직접적으로 조혈 줄기세포에 작용하는 것은 아니며 c-fms 양성 세포 등의 어떠한 세포나 이러한 세포 유래의 인자 등을 개재시킨 간접적 작용이라고 생각하고 있다.

또한, 본 발명은 M-CSF를 함유하는 Lin 음성 또는 약양성 세포 배양용 키트를 제공한다. 본 배양용 키트는 예를 들면, 적당한 사이토카인, 배지 등과 함께 M-CSF를 함유하므로 Lin 음성 또는 약양성 세포의 생체외 배양에 사용할 수 있다.

또한, M-CSF는 상기한 바와 같이 조혈 줄기세포를 포함하는 세포군의 증식을 촉진하므로 조혈 줄기세포의 증식 촉진제로서 사용할 수 있다. M-CSF를 함유하는 조혈 줄기세포 증식 촉진제는 M-CSF와 함께 적당한 사이토카인이나 증식인자를 함유할 수 있다. 이들 조혈 줄기세포 증식 촉진제를 첨가하여 배양함으로써 조혈 줄기세포가 충분한 생체외 증식을 할 수 있게 되면 소량의 골수, 말초혈, 제대혈로부터 생체외 증식시킨 세포를 조혈 줄기세포원으로서 사용할 수 있다. 또한, M-CSF를 생체에 직접투여함에 의해 조혈 줄기세포를 대폭적으로 증식시킬 수 있다면 이식할 때의 조혈 줄기 세포수는 소량으로도 충분한 것이 되며, 예를 들면, 제대혈 이식 등을 소아뿐만 아니라 성인에게도 적용할 수 있게 된다.

하기에 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

(골수세포의 채취)

C57BL/6J-Ly5.1 마우스(Jackson Laboratories)의 대퇴골과 경골(脛骨)에서 채취한 골수세포를 5% 소 태아 혈청(FBS, 면역생물연구소)을 함유하는 행크스 평형 염류 용액(GIBCO-BRL)(이하, HBSS라고 약칭한다)에 현탁한 다음, 22게이지의 주사 바늘을 장치시킨 1ml의 주사기를 사용하여 세포 부유액을 조제하며, 공극 크기 40μm의 나일론 메쉬(팔콘)를 통과시켜 세포 덩어리를 제거한다. 1,100rpm, 5분 동안의 원심분리에 의한 세정후, HBSS에 현탁하여 단세포 부유액으로 한다.

(Lin 음성 또는 약양성 세포의 취득)

마우스 조혈 전구세포 조제용의 StemSep^TM(StemCell Technologies Inc.)를 사용하여 분화 항원 음성 또는 약양성(Lin<약양성) 세포를 키트에 첨부된 매뉴얼에 따라 조제한다. 우선, 단세포 부유액에 분화 항원에 대한 비오틴 표지 항체 칵테일을 가하여, 빙상에서 20분 동안 반응시킨 다음, HBSS에서 세정하여 1,100rpm, 5분 동안 원심처리한다. 세포를 HBSS에 재현탁하여, 비오틴 표지 항체 결합용 4량체 항체 복합체 칵테일을 가하여, 빙상에서 40분 동안 반응시킨 다음, 자기 콜로이드를 가하여 다시 40분 동안 반응시킨다. MACS LS⁺ 칼럼(Miltenyi Biotec.)에 세포 현탁액을 통과시킴으로써 표지 세포를 흡착시켜 미표지 세포를 회수한다. 회수한 세포의 일부에 PE(파이코에리트린) 표지한 스트렙토아비딘(Pharmingen)을 첨가한 다음, EPICS-XL 유동세포 측정기(벡맨콜타)에 의해 해석을 한다. 회수한 세포는 도 1에 도시된 바와 같이 Lin<약양성인 미숙한 세포 집단이다.

(배양)

수득된 Lin<약양성 세포를 조직 배양용 6웰 마이크로플레이트(IWAKI)에 1웰당 4×10⁴개로 파종하며, 5% FBS와 10μg/ml의 겐타마이신(Sigma)를 함유하는 RPMI1640(GIBCO-BRL)을 사용하여 5% CO₂ 존재하에 37℃의 조건으로 배양한다. 배양액 중에 첨가되는 사이토카인은 SCF, IL-11, FLT 및 TPO를 모두 100ng/ml의 농도로 사용한다. 또한, M-CSF의 효과를 검토하기 위해 1, 10, 100ng/ml의 최종 농도로 M-CSF를 첨가하여 배양한다. 사용한 사이토카인은 전부, 제조원(Pepro Tech Inc.)에서 구입한다.

(배양 세포의 마우스로의 이식)

사이토카인 존재하에 6일 동안 배양한 다음, 피페팅 조작에 의해 마이크로플레이트로부터 세포를 회수한다. HBSS에서 세포를 현탁한 다음, C57BL/6J-Ly5.2 마우스(니혼크레아)로부터 채취한 10⁶개의 신선한 골수세포를 가하여 1,100rpm, 5분 동안 원심처리한다. 최종적으로 세포는 400μl의 1mM HEPES 함유 HBSS에 현탁하여, 치사량 방사선(800렌트겐)을 조사한 C57BL/6J-Ly5.2 마우스에서 꼬리정맥으로부터 이식한다.

(이식한 세포에 유래하는 백혈구의 검출)

이식후 6개월 경과한 마우스의 꼬리 말단에서 헤파린 피복 모세관을 사용하여 약 25μl의 말초혈을 채취한 다음, 즉시 10unit/ml의 헤파린을 포함하는 500μl의 인산 완충액[PBS(-); GIBCO-BRL]에 현탁한다. 상등액을 1,100rpm, 5분 동안의 원심처리에 의해 제거한 다음, 세포를 500μl의 HBSS에 현탁한다. 다음에 PBS(-)로 10배 희석한 FITC 표지한 항 마우스 Ly5.1(Pharmingen)을 10μl 가하여, 얼음 속에서 차광, 30분 동안 반응시킨다. 세포를 1,100rpm, 5분 동안의 원심처리에 의해 회수하며, 실온에서 155mM 염화암모늄(NH₄Cl), 10mM 중탄산칼륨(KHCO₃), 0.1mM 에틸렌디아민4아세트산(EDTA)으로 구성되는 용혈 용액 500μl에 현탁하는 용혈조작을 2회 실시한다. 세포를 HBSS에서 세정한 다음, 1,100rpm, 5분 동안의 원심처리에 의해 회수하고, 2μg/ml의 7아미노악티노마이신D, 0.2%의 소 혈청 알부민, 0.05%의 아지화나트륨, 0.02%의 에틸렌디아민4아세트산(EDTA)을 함유하는 HBSS에 현탁하여 EPICS-XL 유동세포 측정기에 의해 해석을 실시한다.

도 2에 도시된 바와 같이 M-CSF 농도 의존적으로 이식한 세포 유래의 백혈구의 비율이 높다. 이것은 배양기간 중에 조혈 줄기세포가 보다 많은 자기 복제를 하는 것을 반영한 것으로 해석된다. 그러나 M-CSF의 작용은 고농도에서는 억제효과를 나타내며 M-CSF의 조혈 줄기세포의 자기 복제 촉진효과는 농도에 따라 엄격하게 제어되어 있음을 알았다(도 2).

이 결과를 정량화한 것이 표 1이다. 10⁶개의 골수세포와 동등한 골수 재구축능을 나타내는 활성을 1단위로 하여 표중에 기재된 계산식을 사용하여, 배양전과 사이토카인 존재하에 배양후에 함유되는 조혈 줄기세포로서의 골수 재구축 활성(Repopulation Unit; RU)를 비교한다. 10ng/ml의 M-CSF의 첨가에 의해 RU는 다시 2배 이상 증가하는 점으로부터 M-CSF는 조혈 줄기세포의 증식에 있어서 유용한 것임을 실험적으로 밝혔다.

이와 같이 조혈 줄기세포를 높은 증식도로 증식할 수 있으면 조혈 줄기세포 이식에 필요한 채취 줄기 세포수를 감소시킬 수 있게 되며 본 발명은 공여자의 안전성 확보의 측면으로부터 유용하다.

M-CSF의 조혈 줄기세포 증식효과

	% Ly5.1	RU	증식배율
무처리	18.4±2.3	0.23	1.0
SCF+IL-11+FLT	27.2±1.1	0.37	1.6
SCF+IL-11+FLT+M-CSF	45.5±2.9	0.83	3.6
SCF+IL-11+TPO	31.2±9.8	0.45	2.0
SCF+IL-11+TPO+M-CSF	52.2±6.1	1.09	4.7
RU= % Ly5.1/(100-% Ly5.1)

(이식한 세포에 유래하는 백혈구 위의 분화 항원의 검출)

이식후 6개월 경과한 마우스의 꼬리 말단에서 헤파린 피복 모세관을 사용하여 약 100μl의 말초혈을 채취한 다음, 즉시 10unit/ml의 헤파린를 함유하는 2ml의 인산 완충액[PBS(-); Gibco-BRL에 현탁하여, 항체 염색을 위해 4등분 한다. 세포를 세정한 다음, HBSS 500μl에 현탁하여, 분화 항원에 대한 항체로서 비오틴 표지한 항 마우스 Mac-1, 항 마우스 Gr-1, 항 마우스 B220, 항 마우스 CD3e(Pharmingen mouse lineage panel)를 각각 튜브당 2μl 첨가하며, 얼음 속에서 20분 동안 항체반응을 실시한다. 반응시킨 다음, HBSS에서 세포를 2회 세정하여, 500μl의 HBSS에 재현탁한다. 또한 PE 표지 스트렙토아비딘(Pharmingen)을 0.5μl와 FITC 표지 항 마우스 Ly5.1(Pharmingen)을 1μl 첨가하여, 얼음 속에서 차광하에 20분 동안 반응시킨다. 세포를 1,100rpm, 5분 동안의 원심에 의해 회수하고, 실온에서 155mM 염화암모늄(NH₄C1), 10mM 중탄산칼륨(KHCO₃), 0.lmM 에틸렌디아민4아세트산(EDTA)로 구성되는 용혈 용액 500μl에 현탁하는 용혈조작을 2회 실시한다. HBSS를 사용하여 세포를 세정한 다음, 1,100rpm, 5분 동안의 원심처리에 의해 세포를 회수하고, 2μg/ml의 7아미노악티노마이신D, 0.2%의 소 혈청 알부민, 0.05%의 아지화나트륨, 0.02%의 에틸렌디아민4아세트산(EDTA)을 함유하는 HBSS에 현탁하여 EPICS-XL 유동세포 측정기에 의해 해석을 실시한다.

이전에 기재된 바와 같이 조혈 줄기세포는 자기 복제하는 능력과 모든 혈액세포로 분화되는 능력을 가지는 세포이다. 만약, 조혈 줄기세포가 존재하지 않으면, 이식세포 유래의 혈구세포는 이식후 3개월 정도로 소실할 것이다. 도 3에 도시된 바와 같이 이식후 6개월을 경과한 마우스에서도 이식한 세포 유래(Ly5.1 마우스 골수 유래)로 골수구, 임파구의 분화 항원을 나타내는 세포가 검출되는 점으로부터 이식한 세포 집단 중에 조혈 줄기세포가 함유되어 있다는 것이 명확해졌다. (도 3).

본 발명을 상세하면서 또한 특정한 실시 양태를 참조하여 설명했지만, 본 발명의 취지와 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경이나 수정을 가할 수 있음이 당업자에게 명백하다.

본 출원은 2001년 10월30일 출원의 일본 특허출원(특원 2001-331940)에 근거하는 것이며, 이의 내용은 여기에 참조로서 인용한다.

본 발명의 배양방법, 증식방법, 당해 방법에 따라 수득되는 조혈 줄기세포 집단, 배양 키트, 증식 촉진제에 의해 생체외에서 조혈 줄기세포를 증식시킬 수 있게 되며 조혈 줄기세포 이식에 응용할 수 있다. 또한 증식 촉진제의 직접투여에 의해 보다 소량의 조혈 줄기 세포수에서 이식을 수행할 수 있다.

Claims

대식세포 콜로니 자극인자(M-CSF)의 존재하에 배양함을 특징으로 하는, Lin 음성 또는 약양성 세포의 배양방법.
대식세포 콜로니 자극인자(M-CSF)의 존재하에 Lin 음성 또는 약양성 세포를 배양함을 특징으로 하는, 조혈 줄기세포의 증식방법.
제2항에 따른 방법으로 수득되는 조혈 줄기세포 집단.
대식세포 콜로니 자극인자(M-CSF)를 함유하는, Lin 음성 또는 약양성 세포 배양용 키트.
대식세포 콜로니 자극인자(M-CSF)를 함유하는, 조혈 줄기세포의 증식 촉진제.