CN112608896A - 一种nk细胞的培养方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种NK细胞的培养方法及其应用，属于细胞培养技术领域。所述的NK细胞的培养方法，包括如下步骤：(1)抗体包被；(2)脐血单核细胞的分离及血清制备；(3)NK细胞活化培养；(4)NK细胞的扩增培养。本发明提供的分离培养方法解决了淋巴细胞难获得的问题，培养初始阶段排除了红细胞的污染，后期收获的NK细胞纯度均可达到90％以上，弥补了肿瘤病人NK细胞培养纯度低的不足，在同种异体NK细胞应用方面具有巨大的优势。

Description

一种NK细胞的培养方法及其应用
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种NK细胞的培养方法及其应用。
背景技术
NK细胞又称自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)，是机体内重要的免疫细胞，负责杀伤老化、受病毒感染、肿瘤等异常细胞，这种天然杀伤活性无需抗原致敏，并且无MHC限制性。它能自己识别和攻击外来病毒、癌细胞和异常细胞，一旦被激活，通过释放颗粒酶和穿孔素等杀伤性介质及分泌大量细胞因子直接攻击靶细胞，或通过抗体依赖的细胞毒作用(ADCC效应)杀伤肿瘤细胞，或通过诱导Fas/Fasl和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Trail)分子使靶细胞凋亡。过继免疫疗法是取对肿瘤有免疫力的供者淋巴细胞，或患者自体淋巴细胞在体外活化、扩增后，再回输入患者体内发挥抗肿瘤作用。NK细胞由于独特的抗肿瘤特点，在肿瘤免疫中的作用越来越受到重视。目前，NK细胞不仅广泛用于肿瘤病人的免疫治疗，还可应用于预防肿瘤发生，提高免疫能力的作用。
近年来，由于NK细胞扩增方法的进展，使得NK细胞在过继细胞治疗中的应用变为可能，现在可以将NK细胞从仅几毫升的外周血中扩增成数十亿活化的NK细胞。但国内外的扩增方法各不相同且繁琐，因此高质量NK细胞的获得仍是限制其临床应用的关键，为患者治疗生成大量符合GMP(良好生产规范)标准的NK细胞更是一项巨大挑战。
CN108251376A公开一种人工抗原递呈细胞及其构建方法与在嵌合抗原受体T细胞扩增中的应用，然而，研究发现，其构建的人工抗原递呈细胞无法对NK细胞进行扩增，且该人工抗原递呈细胞较为复杂，成本较高。
CN108300693A公开一种自然杀伤细胞体外扩增方法，该方法扩增得到的NK细胞杀瘤活性较差，在NK细胞:肿瘤靶细胞＝10:1的情况下，才能产生良好的杀瘤效应，不利于临床应用。同时研究发现，其扩增得到的NK细胞在低氧条件下，杀瘤活性较差。
综上，如何克服现有技术的不足，研究出一种新的具有良好的杀瘤活性的体外NK细胞稳定扩增的方法是生物领域亟需解决的问题。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种NK细胞的培养方法。
本发明的第二个目的在于提供上述NK细胞的培养方法的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种NK细胞的培养方法，包括如下步骤：
(1)抗体包被
用生理盐水稀释NK细胞激活用单抗，并用稀释好的单抗包被T175培养瓶，抗体包被浓度为20～50μg/mL，然后孵育；
(2)脐血单核细胞的分离及血清制备
羟乙基淀粉与人血按体积比4:1混合，离心，去除血浆和红细胞，得到浓缩后的细胞悬液；向浓缩后的细胞悬液中加入Ficoll淋巴细胞分离液，离心分离得到单个核细胞，并使用X-VIVO15培养基将上述单个核细胞的浓度调整至约1～2×106个/mL；同时将分离得到的血浆灭活，然后离心取上清备用；
(3)NK细胞活化培养
将分离后的细胞转移至包被并用生理盐水清洗过的培养瓶中，然后加入柴胡皂苷、IL-2和IL-15，它们的终浓度约为10μg/mL、500IU/mL和25ng/mL，最后加入AB型脐血浆；
(4)NK细胞的扩增培养
观察细胞状态，当观察到细胞的克隆团较多且较大时，将其转入新的培养瓶中，并补加已经添加IL-2的X-VIVO15培养基，IL-2的终浓度为500IU/mL，随后进行隔天补液，使细胞浓度维持在1×106～2×106个/mL，在培养第18～21天后，收集的细胞即为NK细胞。
步骤(1)中所述的单抗优选为CD16单抗。
步骤(1)中所述的单抗的浓度优选为35μg/mL。
步骤(2)中所述的孵育的温度优选为4～37℃，时间为2h。
步骤(2)中所述的孵育优选在培养箱中进行。
步骤(2)中所述的人血优选为脐血和外周血中的至少一种。
步骤(2)中所述的离心的条件优选为：离心力50g，离心时间10min。
步骤(2)中所述的灭活的温度优选为56℃、时间为30min。
步骤(2)中所述的上清的保存条件优选为4℃。
步骤(3)中所述的AB型脐血浆的加入量优选为体系总量的10％。
步骤(4)中所述的细胞的克隆团较大优选为在10×的显微镜下观察细胞团的直径大于1cm。
步骤(4)中所述的新的培养瓶优选为未曾包被过的培养瓶。
所述的NK细胞的培养方法在培养NK细胞中的应用。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明克服了现有技术在NK培养中细胞数量不足、纯度低的问题，同时降低了成本，简化了操作步骤，本方法同样适用于外周血。
(2)本发明提供的分离培养方法解决了淋巴细胞难获得的问题，培养初始阶段排除了红细胞的污染，后期收获的NK细胞纯度均可达到90％以上，弥补了肿瘤病人NK细胞培养纯度低的不足，在同种异体NK细胞应用方面具有巨大的优势。
(3)本制备方法培养流程简单，操作方便易于实施，适合工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中的各物质若非特别说明，均可通过市售得到。
柴胡皂苷购于成都普瑞法科技开发有限公司，货号BP1242；IL-2购于达科为生物技术有限公司，货号：212-12；IL-15购于达科为生物技术有限公司，货号：400-24；AB型脐血浆购于广东省脐带血造血干细胞库。
实施例1
一种NK细胞的培养方法，步骤如下：
(1)抗体包被
用生理盐水稀释NK细胞激活用CD16单抗，并用稀释好的单抗包被T175培养瓶，抗体包被浓度为35μg/mL。然后置于4℃孵育过夜培养箱中孵育2h；
(2)脐血单核细胞的分离及血清制备
羟乙基淀粉与脐血4:1体积混合，离心力50g，离心10min，去除血浆和红细胞；将浓缩后的细胞悬液加入盛有Ficoll淋巴细胞分离液(购于美景生物科技有限公司)的离心管中，进行离心分离从而得到单个核细胞，并使用X-VIVO15培养基(购于北京毕特博生物技术有限责任公司)将脐血单核细胞的浓度调整至约1.5×106个/mL，同时将分离得到的血浆于56℃进行灭活30min；然后离心后取上清并于4℃储存备用；
(3)NK细胞活化培养
将分离后的细胞转移至包被并用生理盐水清洗过的培养瓶中，然后加入柴胡皂苷、IL-2和IL-15，它们的终浓度约为10μg/mL、500IU/mL和25ng/mL，最后加入体系总体积10％的AB型脐血浆；
(4)NK细胞的扩增培养
观察细胞状态，当观察到细胞的克隆团较多且较大时，将其转入新的培养瓶中，并补加已经添加IL-2的X-VIVO15培养基，IL-2的终浓度为500IU/mL，随后进行隔天补液，使细胞浓度维持在1.5×106个/mL。在培养第20天后，收集的细胞即为脐血NK细胞。
(5)NK细胞表型鉴定
流式细胞仪检测培养至20天细胞的CD3-CD56+和CD3-的细胞比例数值。
(6)NK细胞增殖能力鉴定
细胞培养至20天，取200μL细胞悬液，细胞计数仪(Sysmex XS-500i)进行细胞计数。
对比例1
Corning组：康宁Corning NK细胞活化扩增培养基套装，购于康宁公司，货号：88-570-kit；按照产品说明书进行操作。
美天旎组：美天旎NK细胞高效扩增培养基，购于德国美天旎生物技术公司，货号：130-114-429；按照产品说明书进行操作。
同立海源组：NK细胞培养试剂盒套装，购于北京同立海源生物科技有限公司，货号：AS-01；按照产品说明书进行操作。
对比例1-1：本对比例所述方法与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤(3)中，将柴胡皂苷替换成相同用量的环孢素A。
对比例1-2：本对比例所述方法与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤(3)中不加入柴胡皂苷。
对比例1-3：本对比例所述方法与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤(4)中，X-VIVO15培养基中还添加了IL-15，IL-15的终浓度为15ng/mL。
将上述各组与实施例1所得NK细胞的扩增倍数和CD3-CD56+指标进行检测。
结果如下表1所示：
表1
组别 扩增倍数 CD3<sup>-</sup>CD56<sup>+</sup>％
Corning组 23±4 83.82±5％
美天旎组 17.5±2 80.99±11％
同立海源组 32±6 68.76±16％
对比例1-1 13±2 40.12±8％
对比例1-2 10±1 45.67±6％
对比例1-3 15±2 55.32±9％
实施例1 42±8 90±2％
从上表1可以看出：扩增出的NK细胞流式表型(CD3-CD56+)达到90％以上，效果优于市售同类产品和对比例1-1、1-2及1-3组。说明本发明所述培养方法具有良好的杀瘤活性，能够在体外稳定扩增得到NK细胞。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种NK细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)抗体包被
用生理盐水稀释NK细胞激活用单抗，并用稀释好的单抗包被T175培养瓶，抗体包被浓度为20～50μg/mL，然后孵育；
(2)脐血单核细胞的分离及血清制备
羟乙基淀粉与人血按体积比4:1混合，离心，去除血浆和红细胞，得到浓缩后的细胞悬液；向浓缩后的细胞悬液中加入Ficoll淋巴细胞分离液，离心分离得到单个核细胞，并使用X-VIVO15培养基将上述单个核细胞的浓度调整至约1～2×106个/mL；同时将分离得到的血浆灭活，然后离心取上清备用；
(3)NK细胞活化培养
将分离后的细胞转移至包被并用生理盐水清洗过的培养瓶中，然后加入柴胡皂苷、IL-2和IL-15，它们的终浓度约为10μg/mL、500IU/mL和25ng/mL，最后加入AB型脐血浆；
(4)NK细胞的扩增培养
观察细胞状态，当观察到细胞的克隆团较多且较大时，将其转入新的培养瓶中，并补加已经添加IL-2的X-VIVO15培养基，IL-2的终浓度为500IU/mL，随后进行隔天补液，使细胞浓度维持在1×106～2×106个/mL，在培养第18～21天后，收集的细胞即为NK细胞。
2.根据权利要求1所述的NK细胞的培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述的单抗为CD16单抗；
步骤(1)中所述的单抗的浓度为35μg/mL。
3.根据权利要求1所述的NK细胞的培养方法，其特征在于，
步骤(2)中所述的孵育的温度为4～37℃，时间为2h；
步骤(2)中所述的孵育在培养箱中进行。
4.根据权利要求1所述的NK细胞的培养方法，其特征在于，
步骤(2)中所述的人血为脐血和外周血中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的NK细胞的培养方法，其特征在于，
步骤(2)中所述的离心的条件为：离心力50g，离心时间10min。
6.根据权利要求1所述的NK细胞的培养方法，其特征在于，
步骤(2)中所述的灭活的温度为56℃、时间为30min。
7.根据权利要求1所述的NK细胞的培养方法，其特征在于，
步骤(3)中所述的AB型脐血浆的加入量为体系总量的10％。
8.根据权利要求1所述的NK细胞的培养方法，其特征在于，
步骤(4)中所述的细胞的克隆团较大为在10×的显微镜下观察细胞团的直径大于1cm。
9.权利要求1～8任一所述的NK细胞的培养方法在培养NK细胞中的应用。
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