CN111172110B

CN111172110B - 一种脐带血cik细胞的培养方法

Info

Publication number: CN111172110B
Application number: CN201911329973.9A
Authority: CN
Inventors: 孙丹; 唐忆琳; 陈巧林
Original assignee: Zhongke Cell Technology Guangzhou Co ltd
Current assignee: Zhongke Cell Technology Guangzhou Co ltd
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2039-12-20
Also published as: CN111172110A

Abstract

本发明提供一种脐带血CIK细胞的培养方法，包括：将脐带血核细胞悬浮液加入纤维连接蛋白包被的培养容器中培养，并加入IFN‑γ、IL‑2、IL‑1a、抗CD3单克隆抗体，继续培养，得到所述CIK细胞。本发明成功获得增值性更高，双阳性细胞百分比和杀伤活性更强的脐带血CIK，是一种值得临床推荐且可大量扩增脐带血CIK的培养方法。

Description

一种脐带血CIK细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别是涉及一种脐带血CIK细胞的培养方法。

背景技术

细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cells,CIK)是介导细胞毒活性最强的免疫效应细胞，兼具有T淋巴细胞的高度杀瘤活性和NK细胞(natural killercell，自然杀伤细胞)非主要组织相容性复合物(MHC)的限制性杀瘤效应。CIK细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，具有增殖速度快，杀瘤活性高，杀瘤谱广等优点，被认为是肿瘤过继免疫治疗的新希望。现有技术中的CIK细胞制备方法大多采用病人的外周血单个核细胞，先加入IFN-γ，24小时后再加入其他细胞因子如IL-2、IL-I a、CD3单抗，继续培养，这种方法制备出的CIK细胞存在繁殖能力差、细胞活性低，肿瘤杀伤性差等问题，且因异体CIK细胞输注易引发严重的移植物抗宿主病(GVHD)。

随着脐血的广泛应用，脐血已成为获得CIK(cord bloodCRX℃B-CHK)细胞的一个重要来源，且脐血CIK细胞作用更强，移植后GVHD发生率亦低，越来越引起大家的注意。但是，现有方法培养得到的CIK细胞扩增率和杀伤性低，亟待解决。

申请公布号为CN 108841790 A的中国专利公开了一种胎盘来源的单个核细胞诱导CIK细胞的方法，其来源为胎盘，体积较大，不易收集和运输，提取单个核细胞较为复杂。

申请公布号为CN 105112371A的中国专利公开了一种脐带血单个核细胞来源的DC-CIK细胞制取方法及制剂，该专利采用脐带血培养DC-CIK，其增值率较低。

申请公布号为CN 105695404 A的中国专利公开了一种CIK淋巴细胞的扩增激活方法，该方法需要进行转染，操作复杂，所得CIK淋巴细胞增值率和杀伤活性较低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种脐带血CIK细胞的培养方法，有效提高CIK细胞的增值活性和杀伤活性。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供一种脐带血CIK细胞的培养方法，包括：将脐带血核细胞悬浮液加入纤维连接蛋白包被的培养容器中培养，并加入IFN-γ、IL-2、IL-1a、抗CD3单克隆抗体，继续培养，得到所述CIK细胞。

上述脐带血核细胞具体是脐带血分离的单个核细胞。

IFN-γ、IL-2、IL-1a、抗CD3单克隆抗体均可从市场上购买得到，也可以自行制备，具体可以为纯化的蛋白质或由宿主细胞在细胞膜表面即时表达得到。

可选地，所述IFN-γ是在所述脐带血核细胞加入所述包被有纤维连接蛋白的培养容器后的30min内加入，具体可以是在接种细胞后立即加入IFN-γ，也可以是在3min、5min、8min、10min、12min、15min、17min、20min、22min、23min、25min、28min、30min内加入。

可选地，所述IL-2、IL-1a、抗CD3单克隆抗体是在所述脐带血核细胞加入所述包被有纤维连接蛋白的培养容器后的第24～26h加入，包括但不限于第24h、第24.1h、第24.2h、第24.3h、第24.4h、第24.5h、第24.6h、第24.7h、第24.8h、第24.9h、第25h、第25.1h、第25.2h、第25.3h、第25.4h、第25.5h、第25.6h、第25.7h、第25.8h、第25.9h、第26h。

可选地，在所述脐带血核细胞加入所述包被有纤维连接蛋白的培养容器后的第24～26h还加入IL-15，包括但不限于第24h、第24.1h、第24.2h、第24.3h、第24.4h、第24.5h、第24.6h、第24.7h、第24.8h、第24.9h、第25h、第25.1h、第25.2h、第25.3h、第25.4h、第25.5h、第25.6h、第25.7h、第25.8h、第25.9h、第26h。IL-15也可从市场上购买得到。

可选地，所述纤维连接蛋白选自RetroNectin。

可选地，采用所述纤维连接蛋白包被所述培养容器时，采用的包被液中含有所述纤维连接蛋白以及缓冲液。

可选地，所述纤维连接蛋白在所述包被液中的浓度≥6μg/mL，还可以为6.25-25μg/mL，包括但不限于6.25μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、11μg/mL、12.5μg/mL、13μg/mL、14μg/mL、15μg/mL、16μg/mL、17μg/mL、18μg/mL、19μg/mL、20μg/mL、21μg/mL、22μg/mL、23μg/mL、24μg/mL、25μg/mL。

可选地，所述缓冲液选自PBS缓冲液、生理盐水、D-PBS缓冲液中的至少一种。

可选地，所述IFN-γ在培养基中的终浓度为500-1500IU/mL。

可选地，所述IL-2在培养基中的终浓度为500-1500IU/mL。

可选地，所述IL-1a在培养基中的终浓度为500-1500IU/mL。

可选地，所述IL-15在培养基中的终浓度为10-30ng/mL。

可选地，所述抗CD3单克隆抗体在细胞液中的终浓度为30-70ng/mL。

可选地，取脐带血单个核细胞，用含有脐带血分离的上层血浆的培养基悬浮后，再将所述脐带血核细胞加入所述包被有纤维连接蛋白的培养容器中培养。

可选地，所述培养基选自免疫细胞培养基，包括但不限于GT-T551培养基、DKW培养基、LONZA培养基等。该免疫细胞培养基可以从市场上购买得到。

本发明还提供一种用于脐带血CIK细胞培养的组合物，包括：纤维连接蛋白、IFN-γ、IL-2、IL-1a、IL-15、抗CD3单克隆抗体。

可选地，所述纤维连接蛋白用于包被至培养容器。

可选地，用于包被所述培养容器的包被液中含有纤维连接蛋白以及缓冲液。

可选地，所述包被液中纤维连接蛋白的浓度为≥6μg/mL。

可选地，所述IFN-γ在细胞液中的终浓度为500-1500IU/mL。

可选地，所述IL-2在细胞液中的终浓度为500-1500IU/mL。

可选地，所述IL-1a在细胞液中的终浓度为500-1500IU/mL。

可选地，所述IL-15在细胞液中的终浓度为10-30ng/mL。

本发明具有以下有益效果：

本发明采用脐带血单个核细胞作为原始细胞进行培养，有效避免因异体CIK细胞输注易引起严重的排斥反应，通过引入特定的细胞因子，成功获得比传统方法培养的CIK细胞增值性更高，双阳性细胞百分比和杀伤活性更强的脐带血CIK细胞。进一步地，IL-15是一种多效性细胞因子，具有激活T细胞，并可介导T细胞的增殖和存活的功能，是一种肿瘤治疗的前景因子。RetroNectin是重组人纤维连接蛋白片段，有参与细胞的附着、伸展、分化和增值的生理活性，有研究表明纤维连接蛋白能够促进淋巴细胞的黏附和增值。本发明将RetroNectin包被技术和IL-15引入脐带血CIK的培养体系，一方面高扩增性使得采集一份脐带血既可用于多个患者的治疗，另一方面可以获得杀伤活性更高的效应细胞，是一种值得临床推荐的有效的大量扩增脐带血CIK的培养方法。

附图说明

图1显示为本发明实施例中A、B、C、D、E、F组的脐带血CIK细胞增值曲线图。

图2显示为本发明实施例中H1、H2组的脐带血CIK细胞增值曲线图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明实施例提供了一种新的脐带血CIK细胞制备方法，取脐带血单个核细胞，用含有脐带血分离的上层血浆的培养基悬浮后，加入重组纤维连接蛋白(RetroNectin，以下简称RN，12.5μg/mL)包被的培养瓶中，D0天加入IFN-γ(1000IU/mL)，D1天加入IL-2(1000IU/mL)、IL-1a(1000IU/mL)、IL-15(20ng/mL)和抗CD3单克隆抗体(50ng/mL)，继续培养。IL-15是一种多效性细胞因子，具有激活T细胞，并可介导T细胞的增殖和存活的功能。此外，IL-15能激活、维持和扩增CD8+记忆性T细胞，而不激活调节性T淋巴细胞(Tregs，具有免疫抑制功能)，IL-15是一种肿瘤治疗的前景因子。RetroNectin包被技术应用于脐带血CIK体外培养，相比不加RetroNectin的传统细胞因子组合诱导的脐带血CIK，可以获得增殖率、活性更高和肿瘤杀伤性更强的免疫活性细胞。RetroNectin是重组人纤维连接蛋白片段，有参与细胞的附着、伸展、分化和增值的生理活性，纤维连接蛋白能够促进淋巴细胞的黏附和增值。将RetroNectin包被技术引入脐带血CIK的培养体系，一方面，其高扩增性使得采集一份脐带血即可用于多个患者的治疗，另一方面，可以获得杀伤活性更高的效应细胞，是一种值得临床推荐的有效的大量扩增脐带血CIK的培养方法。

以下实施例中，PBS缓冲液的pH为7.4。

以下实施例中，D0是指当天，即第0天，D1是指细胞培养后的第1天，D2、D3、D4等依此类推。

实施例1

本实施例的方法如下：用淋巴细胞分离液提取脐带血单个核细胞(CBMC)，计数细胞后平均分成六组，包括A、B、C、D、E、F组。A组按不加RN的传统方法培养，B组采用RN(终浓度为6.25μg/mL)包被培养，C组采用RN(终浓度为9.25μg/mL)包被培养，D组采用RN(终浓度为12.5μg/mL)包被培养，E组采用(终浓度为15.5μg/mL)包被培养，F组采用RN(终浓度为18.5μg/mL)包被培养，每3天台盼蓝染色检测各组细胞存活率、记录细胞绝对数。于培养的第7、14、21天用流式细胞仪测定各组细胞免疫表型。MTT实验测定各组细胞对K562肿瘤细胞的杀伤率。流式细胞仪测定各组效应细胞中CD3、CD56的双阳性率。确定最佳对脐带血CIK作用的RN包被浓度后，设计两组实验，H1组用确定的最佳浓度的RN包被培养，D0天加入IFN-γ(1000IU/mL)，D1天加入IL-2(1000IU/mL)、IL-1a(1000IU/mL)和抗CD3单克隆抗体(50ng/mL)，之后每次补液均添加IL-2(1000IU/mL)；H2组用确定的最佳浓度的RN包被培养，D0天加入IFN-γ(1000IU/mL)，D1天加入IL-2(1000IU/mL)、IL-15(20ng/mL)、IL-1a(1000IU/mL)和抗CD3单克隆抗体(50ng/mL)，之后每次补液均添加IL-2(1000IU/mL)和IL-15(20ng/mL)，研究IL-15对脐带血CIK的影响。

1、试剂及耗材

PBS，50mL离心管，10mL移液管，25mL移液管，RetroNectin(购自TAKARA)，IFN-γ(购自北京同立海源生物科技有限公司)，IL-15，单克隆抗体CD3(购自北京同立海源生物科技有限公司)，IL-2(购自北京双鹭药业股份有限公司)，IL-1a(购自PEPRO TECH)，GT-T551H3培养基(购自TAKARA)，T175培养瓶，0.4％的台盼蓝染液，1％多聚甲醛，BD试管，枪头，K562细胞(购自南京科佰生物科技有限公司)，1640培养基，T25培养瓶，96孔板，LDH试剂盒。

2、仪器设备

离心机，电动移液枪，生物安全柜，流式细胞仪，漩涡振荡器，CO₂培养箱，血球计数仪，倒置显微镜，手动移液枪，MTT。

3、实验步骤

3.1包被：取RetroNectin，用PBS缓冲液配置成包被液，终浓度分别为6.25μg/mL、9.25μg/mL、12.5μg/mL、15.25μg/mL、18.25μg/mL，将各包被液独立加入各T175培养瓶，平放，混匀，4℃，避光，过夜。

3.2采血：在受试者知情同意下，采集自然分娩产妇脐带血100mL。

3.3分离CBMC：先全血离心取出血浆，血浆灭活离心备用。再用淋巴细胞分离液提取脐带血单个核细胞，PBS清洗3次，计数细胞后平均分成四组，即A、B、C、D、E、F六组，每组的细胞数量为5×10⁷。

3.4D0接种细胞：B、C、D、E、F组取对应浓度RN隔夜包被的培养瓶，去除包被液，PBS洗两遍，加入CBMC和GT-T551培养基，A组细胞按常规方法制备和体外诱导培养，六组另外再分别加入10％自体血浆和IFN-γ(终浓度1000IU/mL)

常规制备方法是指不加重组纤维连接蛋白，D0添加INF-γ，24小时后加入IL-2、IL-1a和抗CD3单克隆抗体，之后每次补液只添加IL-2和新鲜培养基。

3.5A、B、C、D、E、F六组D1分别添加IL-2(终浓度1000IU/ml)、IL-1a(终浓度1000IU/ml)、抗CD3单克隆抗体(50ng/ml)。

3.6继续培养，当细胞密度大培养基变黄时，及时补液，A、B、C、D、E、F六组新鲜加入的培养基中均加有IL-2(终浓度1000IU/mL。

4、实验数据采集测定

4.1CIK细胞增值活性的测定

将细胞液混匀后，抽取A、B、C、D、E、F六组CIK细胞，每份1mL，混匀，用台盼蓝染色，倒置显微镜下用血球计数仪计数细胞的总数，然后计算每组细胞平均值。每三天抽取一次，根据细胞增值倍数绘制生长曲线。

4.2表型检测方法

使用流式抗体分别组合标记第0、3、6、9、12、15天的各组细胞，每组含有5×10⁵个细胞，然后使用流式细胞仪检测四组脐带血CIK中CD3+CD56+比例。

4.3LDH法检测两组细胞对K562细胞杀伤活性

于培养的第12、15天收集六组细胞，以肿瘤细胞K562为靶细胞在96孔板上进行LDH杀伤检测，逐步处理后将其置于酶标仪上检测OD值。

5结果

5.1RetroNectin对脐带血CIK增值的影响

根据第0、3、6、9、12和15天计数结果绘制脐带血CIK增值曲线，结果如图1所示，图1中，横坐标为细胞培养天数，纵坐标为细胞数量，前3天细胞增值不明显，第4天开始大量增值，可以看出D、E、F组增殖数量明显高于A、B、C组。

5.2RetroNectin对脐带血CIK中CD3+CD56+细胞百分比的影响

不同培养时间下六组细胞表型如表1所示，加RetroNectin组的CD3+CD56+双阳性细胞所占比例明显高于不加RetroNectin的组。从表2可以看出，六组主要效应CD3+CD56+双阳性细胞所占百分比随着诱导时间的延长大幅度升高，从第9天起，D、E、F组百分比明显高于其他三组。而D、E、F组双阳性细胞百分比无明显差异

表1不同培养时间下六组细胞表型

CD3+CD56+百分比	D0	D3	D6	D9	D12	D15
							A组	1	5	7.1	18.5	35.8	48.6
B组	1	5.4	8.7	22.5	40.9	54.1
							C组	1	5.8	9.2	26.1	45.6	60.4
D组	1	6.2	9.8	30.4	50.3	68.8
							E组	1	6.1	9.7	30.3	50.1	68.7
F组	1	6.2	9.9	30.5	50.4	68.8

5.3不同浓度的RetroNectin对脐带血CIK杀伤活性的影响

以K562为靶细胞，效靶比10：1、20：1、40：1进行杀伤实验，表2为六组细胞对K562杀伤活性统计表，可见，D、E、F组对肿瘤细胞K562的杀伤活性高于A、B、C组：收集12、15天的两组细胞，结果显示D、E、F组的杀伤活性更高，D、E、F三组CIK杀伤活性无明显差异。

上述效靶比是指效应细胞与靶细胞的数量之比。

杀伤活性％＝(实验组OD值-效应细胞OD值-靶细胞组OD值)/靶细胞组OD值。

表2六组细胞对K562杀伤活性统计表

5.4结论

上述实验结果显示，在最小浓度为12.5μg/mL的RN包被诱导培养下，脐带血CIK的增值性更高，杀伤性更强，RN所用量最少，所以12.5μg/ml为人重组纤维连接蛋白作用于脐带血CIK的最佳浓度。

12.5μg/mL是RN的饱和浓度，可见，达到饱和浓度后，脐带血CIK的增值性和杀伤性无显著变化。

6在最佳浓度12.5μg/mL的RN包被诱导下，进行IL-15对脐带血CIK影响实验。

6.1实验步骤

6.1.1包被：取RetroNectin，用PBS配置成包被液，包被液中RetroNectin的终浓度为12.5μg/mL，将包被液加入T175培养瓶，平放，混匀，4℃，避光，过夜。

6.1.2采血：在受试者知情同意下，采集自然分娩产妇脐带血50mL。

6.1.3分离CBMC：先全血离心取出血浆，血浆灭活离心备用。再用淋巴细胞分离液提取脐带血单个核细胞，PBS清洗3次，计数细胞后平均分成两组，标记为H1、H2两组，各组的细胞数为5×10⁷。

6.1.4D0接种细胞：H1、H2组分别取浓度12.5μg/mL的RN隔夜包被的培养瓶，去除包被液，PBS洗两遍，加入CBMC和GT-T551培养基，另外再向两组细胞中分别加入10％自体血浆(即加入血浆的体积为细胞液体积的10％)和IFN-γ(终浓度1000单位/mL，即1000IU/mL)。

6.1.5H1组D1添加IL-2(1000IU/mL)、IL-1a(1000IU/mL)、抗CD3单克隆抗体(50ng/mL)，H2组D1天加入IL-2(终浓度1000IU/mL)、IL-15(终浓度20ng/mL)、IL-1a(终浓度1000IU/mL)和抗CD3单克隆抗体(终浓度50ng/mL)。

6.1.6继续培养，当细胞密度增大至培养基变黄时及时补液，H1组新鲜加入的培养基中均加有IL-2(终浓度1000IU/mL)，H2组新鲜加入的培养基中均加有IL-2(终浓度1000IU/mL)和IL-15(终浓度20ng/mL)。

6.2实验数据采集测定

6.2.1CIK细胞增值活性的测定

混匀后抽取H1、H2两组脐带血CIK细胞，每份1mL，混匀，用台盼蓝染色，倒置显微镜下用血球计数仪计数细胞的总数，然后计算每组细胞平均值。每三天抽取一次，根据细胞增值倍数绘制生长曲线。

6.2.2表型检测方法

使用流式抗体组合标记第0、3、6、9、12、15天的各组细胞，每组细胞数量为5×10⁵个，然后使用流式细胞仪检测两组脐带血CIK中CD3+CD56+双阳性细胞比例。

6.2.3LDH法检测四组细胞对K562细胞杀伤活性

于培养的第12、15天收集两组细胞，以肿瘤细胞K562为靶细胞，在96孔板上进行LDH杀伤检测，逐步处理后将其置于酶标仪上检测OD值。

6.3结果

6.3.1最佳RN包被浓度下IL-15对脐带血CIK增值的影响

根据第0、3、6、9、12和15天计数结果绘制脐带血CIK增值曲线，图2所示为细胞培养增值曲线图，从图中可以发现，前3天细胞增值不明显，第4天开始大量增值，可以看出，加浓度为12.5μg/mL的RetroNectin和IL-15即H2组增值活性明显高于不加IL-15的H1组。

6.3.2最佳RN包被浓度下IL-15对脐带血CIK中CD3+CD56+的影响

H2组的CD3+CD56+双阳性细胞所占比例明显高于不加IL-15的H1组。从表3可以看出，两组主要效应CD3+CD56+双阳性细胞所占百分比随着诱导时间的延长大幅度升高，H2组双阳性细胞百分比明显高于H1组。

表3不同培养时间下两组细胞表型

CD3+CD56+双阳性

D0

D3

D6

D9

D12

D15

H1组

1％

6.1％

9.5％

27.9％

51.2％

68.9％

H2组

1％

6.3％

11.8％

31.9％

58.6％

77.1％

6.3.3最佳RN包被浓度下IL-15对脐带血CIK杀伤活性的影响

以K562为靶细胞，以效靶比10：1、20：1、40：1进行杀伤实验，收集12、15天的两组细胞，结果如表4所示，可见，H2组对肿瘤细胞K562的杀伤活性高于H1组，说明H2组的杀伤活性更高。

表4两组细胞对K562杀伤活性统计表

6.4结论

上述实验结果显示，在浓度为12.5μg/mL的RN包被诱导培养下，添加IL-15脐带血CIK的增值性比不加IL-15更高，杀伤性更强。

需要说明的是，即使不加IL-15，本发明实施例也获得了一种操作简单的CIK细胞培养方法，所得CIK细胞的增殖活性和杀伤活性均处于较高水平，加入IL-15可进一步提高CIK细胞的增殖活性和杀伤活性。

实施例2

本实施例参照实施例1的步骤6进行，不同在于，IFN-γ在培养体系中的终浓度为500IU/mL，IL-2、IL-1a在培养体系中的终浓度均为500IU/mL，抗CD3单克隆抗体在培养体系中的终浓度为30ng/mL。

表5不同培养时间下两组细胞表型

CD3+CD56+双阳性

D0

D3

D6

D9

D12

D15

H1组

1％

5.8％

9.1％

27.3％

49.8％

66.4％

H2组

1％

6％

11.5％

30.5％

57.3％

75.3％

从表5可以看出IFN-γ、IL-2、IL-1α在培养体系中的终浓度为500IU/mL，抗CD3单克隆抗体在培养体系中的终浓度为30ng/mL时，与IFN-γ、IL-2、IL-1α在培养体系中的终浓度为1000IU/mL，抗CD3单克隆抗体在培养体系中的终浓度为50ng/mL细胞表型无显著差异。

表6两组细胞对K562杀伤活性统计表

从表6可以看出IFN-γ、IL-2、IL-1α在培养体系中的终浓度为500IU/mL，抗CD3单克隆抗体在培养体系中的终浓度为30ng/mL时与IFN-γ、IL-2、IL-1α在培养体系中的终浓度为1000IU/mL，抗CD3单克隆抗体在培养体系中的终浓度为50ng/mL细胞对K562杀伤活性百分比无显著差异。

实施例3

本实施例参照实施例1进行，不同在于，IFN-γ在培养体系中的终浓度为1500IU/mL，IL-2、IL-1a在培养体系中的终浓度均为1500IU/mL，抗CD3单克隆抗体在培养体系中的终浓度为70ng/mL。

表7不同培养时间下两组细胞表型

CD3+CD56+双阳性

D0

D3

D6

D9

D12

D15

H1组

1％

6.2％

9.4％

26.9％

50.9％

68.8％

H2组

1％

6.3％

11.5％

32％

59.1％

76.9％

从表7可以看出IFN-γ、IL-2、IL-1α在培养体系中的终浓度为1500IU/mL，抗CD3单克隆抗体在培养体系中的终浓度为70ng/mL时与IFN-γ、IL-2、IL-1α在培养体系中的终浓度为1000IU/mL，抗CD3单克隆抗体在培养体系中的终浓度为50ng/mL细胞表型无显著差异。

表8两组细胞对K562杀伤活性统计表

从表8可以看出IFN-γ、IL-2、IL-1α在培养体系中的终浓度为1500IU/mL，抗CD3单克隆抗体在培养体系中的终浓度为70ng/mL时与IFN-γ、IL-2、IL-1α在培养体系中的终浓度为1000IU/mL，抗CD3单克隆抗体在培养体系中的终浓度为50ng/mL细胞对K562杀伤活性百分比无显著差异。

综上，本发明实施例将脐带血单个核细胞用含有脐带血分离的上层血浆的培养基悬浮后，加入重组纤维连接蛋白(RetroNectin12.5μg/mL)包被的培养瓶中，D0天加入IFN-γ(1000IU/mL)，D1天加入IL-2(1000IU/mL)、IL-1a(1000IU/mL)、IL-15(20ng/mL)和抗CD3单克隆抗体(50ng/mL)能获得增值性更高，双阳性细胞百分比和杀伤活性更强的脐带血CIK，是一种值得临床推荐且可大量扩增脐带血CIK的培养方法。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种脐带血CIK细胞的培养方法，其特征在于，将脐带血单个核细胞悬浮液加入纤维连接蛋白包被的培养容器中培养，并加入IFN-γ、IL-2、IL-1a、抗CD3单克隆抗体、IL-15，继续培养，得到所述CIK细胞；

所述纤维连接蛋白选自RetroNectin，采用所述纤维连接蛋白包被所述培养容器时，采用的包被液中含有所述纤维连接蛋白以及缓冲液，所述纤维连接蛋白在所述包被液中的浓度为≥12.5 μg/ml；所述IFN-γ是在所述脐带血单个核细胞加入所述包被有纤维连接蛋白的培养容器后30min内加入；所述IL-2、IL-1a、抗CD3单克隆抗体是在所述脐带血单个核细胞加入所述包被有纤维连接蛋白的培养容器后的第24～26 h加入；在所述脐带血单个核细胞加入所述包被有纤维连接蛋白的培养容器后的第24～26 h加入IL-15。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述IL-15添加后在培养体系中的终浓度为10～30 ng /ml。

3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述IFN-γ在培养体系中的终浓度为500～1500IU/ml。

4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述IL-2在培养体系中的终浓度为500～1500 IU/ml。

5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述IL-1a在培养体系中的终浓度为500～1500 IU/ml。

6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述抗CD3单克隆抗体在培养体系中的终浓度为30～70 ng/ml。

7.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，取脐带血单个核细胞，用含有脐带血上层血浆的培养基悬浮后，再将所述脐带血单个核细胞加入所述包被有纤维连接蛋白的培养容器中培养。