CN106754689A - 一种破骨细胞培养试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种破骨细胞培养试剂盒，试剂盒制备方法以及体外培养破骨细胞的方法，所述试剂盒中含有平衡盐溶液、1,25(OH)₂D₃、α‑MEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶、EDTA、Ficoll‑Paque PREMRUM细胞分离液、链蛋白酶E、PBS冲洗液。本发明提供的试剂盒其针对破骨细胞不同的培养阶段，特定选择了不同的处理试剂，将细胞的纯化、分离、消化以及诱导等特定地进行了结合，而且不同阶段所用的试剂也是特定选择的，其为体外快速获得破骨细胞提供了便利。

Description

一种破骨细胞培养试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及医学领域，具体而言，涉及一种破骨细胞培养试剂盒及其制备方法。

背景技术

破骨细胞(Osteoclast，OC)是骨骼的细胞成分之一，是生理状态下唯一具有骨吸收功能的细胞，破骨细胞来源于造血干细胞的粒细胞-巨噬细胞集落形成单位，是由其分化的单核细胞融合而成。人成熟破骨细胞的直径约为100μm，为成熟红细胞直径的10倍，其内含有2-50个聚集的细胞核。功能状态下，破骨细胞在接触骨质侧形成大量的微绒毛结构，称为皱褶缘，在其周围是仅有微丝而无其他细胞器的胞质区，称为亮区，皱褶缘的胞质内富含溶酶体与吞饮泡，亮区富集了高浓度的水解酶及有机酸，这些结构均利于破骨细胞功能的行使。而当细胞进入静止期，它则会失去这些结构。

破骨细胞是机体内唯一具有骨吸收功能的细胞。在骨代谢过程中，破骨细胞与成骨细胞相互协作，保障骨重建顺利进行，维持骨代谢的动态平衡。破骨细胞缺失或功能异常均能导致骨代谢疾病，如骨质硬化和骨质疏松等；除此之外，破骨细胞还参与肿瘤、炎症和自身免疫性疾病的发生、发展，影响疾病的转归和预后。体外培养破骨细胞方法主要应用于如下研究领域：研发破骨细胞生成和功能促进剂和抑制剂，人们正在不断努力尝试把上述发现应用到代谢性和免疫性骨病的临床治疗；将破骨细胞引入骨组织工程领域，将其与成骨细胞共同种植于矿化支架上，改善了组织工程化骨的重建结构；不断发现新的破骨细胞生物标志物应用于临床，用来监测骨吸收状态，反映机体骨代谢稳态；应用于代谢性和免疫性骨病的发病机制研究中，极大的促进了骨骼疾病分子发病机制研究进展。综上所述，建立体外破骨细胞培养方法是在细胞与分子水平研究各种因素(激素、细胞因子和环境元素等)影响骨吸收机制的基础，也是研究代谢性骨病(骨硬化症、骨质疏松症等)、肿瘤、炎症和自身免疫性疾病发病机制和治疗药物的有效手段。

破骨细胞主要分布于骨质表面与骨内血管通道周围的小陷窝内。破骨细胞主要的生理功能是溶解与吸收骨质，参与骨组织的重建和维持血钙的动态平衡。由于破骨细胞独特的功能，对破骨细胞的研究在阐明骨代谢性疾病的病理生理机制以及为疾病诊疗提供新方法中具有至关重要的意义。然而，破骨细胞是高代谢终末分化细胞，具有不能传代、存活时间短等特点，且破骨细胞在体内数量极少，难以分离获得。

1982年Chamber首次从乳兔四肢骨分离培养出成熟破骨细，为骨吸收的体外研究奠定了基础。我国于世风等1988年率先引进了破骨细胞的培养方法并加以改良。然而经典分离培养方法获得的破骨细胞数量有限，纯化困难。由于体外分离培养的破骨细胞无增殖能力，存活时间只有7～14天，因此经典分离培养的破骨细胞只适合于一些生物学功能和药效学研究，无法满足破骨细胞分子生物学方面的研究需要。如何获得高量、高纯度的破骨细胞对研究破骨细胞的生物学具有重要意义。近20年以来，不少的学者曾经尝试从不同种属的动物(如鸟类、啮齿类动物)分离培养成熟的破骨细胞，企图解决上述问题，然而由于骨组织里存在的正常成熟破骨细胞数量有限，因此高产量高纯度破骨细胞的获得一直是破骨细胞体外骨吸收研究的一个难题，由此，如何选择一种简便高效的破骨细胞体外培养方法，成为了当前限制对其研究的最大问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种破骨细胞培养试剂盒，该试剂盒所含试剂丰富齐全，通过消化和诱导操作可以实现破骨细胞在体外的快速培养制备。

本发明的第二目的在于提供一种所述试剂盒的制备方法，以实现该试剂盒的应用。

本发明的第三目的在于提供使用该试剂盒培养破骨细胞的方法，该方法操作简便，易于控制，配合试剂盒即可实现破骨细胞体外培养的效果。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明提供了一种破骨细胞培养试剂盒，包括：所述试剂盒中含有平衡盐溶液、1,25(OH)₂D₃、α-MEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶、EDTA、Ficoll-PaquePREMRUM细胞分离液、链蛋白酶E、PBS冲洗液。

本发明提供的这种试剂盒，其含有破骨细胞的分离培养、纯化试剂，同时也含有将纯化后的细胞进行诱导分化的试剂，通过优选的试剂组合，保证细胞在不同的阶段能够快速的增殖。其中，平衡盐溶液提供破骨细胞分离时的外环境，α-MEM培养基提供细胞增殖过程中的营养需求(具体操作时加入胎牛血清、青霉素和链霉素)；Ficoll-Paque PREMRUM细胞分离液、链蛋白酶E和PBS冲洗液则用于细胞的分离、消化以及洗涤。本发明提供的试剂盒其针对破骨细胞不同的培养阶段，特定选择了不同的处理试剂，将细胞的纯化、分离、消化以及诱导等特定地进行了结合，而且不同所用的试剂也是特定选择的，其为体外快速获得破骨细胞提供了便利。

可选的，所述平衡盐溶液为D-Hanks液。

D-Hanks液可优选作为细胞培养取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗试剂，而且还可以很好的保持细胞的活性。

可选的，所述试剂盒中还包括牙片、玻片；且所述平衡盐溶液中含有青霉素和链霉素，青霉素和链霉素的浓度为100-1200微克/毫升。

可选的，所述牙片和所述玻片的尺寸均为1-2cm²。

为了使得后续细胞在诱导的过程中顺利地附着增殖，并且利于培养，所述试剂盒中还优选含有牙片和玻片，而且牙片和所述玻片的优选尺寸均为1-2cm²。

对于玻片而言，其尺寸设定合适之后，优选泡酸过夜，再分别用自来水和蒸馏水清洗后烘干、灭菌备用。

可选的，所述试剂盒包括盒体以及用于固定装有试剂的试剂瓶的支撑物，所述支撑物设置于所述盒体内。

对于试剂盒而言，难免需要经过产时间运输和保存等，剧烈的碰撞和拿放对试剂盒所含的试剂不可避免会造成影响，因此本申请中，试剂盒包括盒体以及用于固定装有试剂的试剂瓶的支撑物，所述支撑物设置于所述盒体内。对于支撑物的结构并不做具体的限定，其只要满足填充试剂之间的间隙即可，例如可以是设置了很多放置槽的泡沫垫。

可选的，所述试剂盒还含有TRAP染色试剂。

为了便于观察使用该试剂盒制备的破骨细胞的生长情况，本试剂盒中还优选含有TRAP染色试剂。

一种所述的破骨细胞培养试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

将各试剂或者载片分别封装于单独的封装装置内，再将封装装置内设置于支撑物后装于盒体中。

可选的，所述方法还包括制备牙片和玻片步骤，具体包括：

将新鲜动物牙纵切成110-120μm，用金刚砂石磨薄至12-15μm，超声波清洗后浸泡于含青霉素1200-1400μg/ml、链霉素700-900μg/ml的D-Hanks液中，换液2-4次后置入含青霉素80-90μg/ml、链霉素70-80μg/ml的D-Hanks液置换2-4次，再置于含有胎牛血清的α-MEM培养液中浸泡后，得到牙片；

将1-2cm²的玻片于酸中浸泡10-12小时后用自来水冲洗干净，再用蒸馏水洗4-6遍，干热消毒灭菌后得到玻片。

一种根据所述的破骨细胞培养试剂盒培养破骨细胞的方法，包括以下步骤：

1)、取新生兔的四肢长骨后于平衡盐溶液中去除软组织和软骨骺，得到骨干；

2)、将所述骨干置于α-MEM培养基，并在该培养基中加入胎牛血清、青霉素和链霉素，将所述骨干纵行剖开，轻刮骨的髓腔表面直至颜色变白，用吸管反复多次吹洗骨髓腔和骨干的内表面，取出骨片，吸取悬液置离心管内，离心后取沉淀物并加入α-MEM培养液吹打均匀，接种并孵育，将得到的孵育液用D-Hanks液冲洗后，加入至Ficoll-Paque PREMRUM细胞分离液后于800-900转/分钟的条件下离心6-8分钟，所得含有目的细胞的悬液层利用α-MEM培养重悬；

该步骤2)中，得到的骨干在α-MEM培养基中剖开的过程中，为了保证所得细胞悬液的活性，优选的，α-MEM培养基中含有15％的胎牛血清，链霉素和青霉素的浓度分别为80-90微克/微升和110-120微克/微升。

所取得悬液在4℃、1200转/分钟的条件下离心8分钟，去除上清后所得沉淀加入浓度分别为80-90微克/微升和110-120微克/微升的α-MEM培养基吹打均匀，接种至培养皿后于36-38℃的CO₂培养箱中孵育培养16-18小时。

将得到的孵育液用D-Hanks液冲洗后，加入至Ficoll-Paque PREMRUM细胞分离液后于800-900转/分钟的条件下离心6-8分钟，所得含有目的细胞的悬液层利用α-MEM培养重悬。

3)、将重悬后的细胞用链蛋白酶E处理后，利用胰蛋白酶和EDTA消化之后，使用D-Hanks液冲洗后，使用PBS冲洗液，再利用胰蛋白酶和EDTA进行消化处理，得到待诱导细胞；

该步骤为细胞诱导前的准备过程，分离利用链蛋白酶E、利用胰蛋白酶和EDTA处理重悬液之后，可以提高细胞的纯度(提高到90％以上)，便于后续诱导过程的顺利进行。

另外，本发明创造性地采用了将经过链蛋白酶E处理后的悬液使用胰蛋白酶和EDTA消化(0.5％蛋白酶和0.02％EDTA)，该消化操作可以将贴壁能力较强的细胞消化下来，进而提高了待诱导细胞的量。

4)、将所述待诱导细胞利用1,25(OH)₂D₃诱导，得到体外培养的破骨细胞。

可选的，在步骤4)中，具体包括：

将步骤3)中所得的待诱导细胞收集于离心管内，在3-5℃，1200-1400r/min下离心8-9min，弃上清，加α-MEM培养基稀释接种于细胞培养板中，并向细胞培养板内加入1,25(OH)₂D₃，置35-38℃，3-6％CO₂培养箱内培养，隔天换液1次；

其中，细胞培养板内分别置玻片和牙片。

优选的，在接种细胞的过程中，细胞的接种密度控制在2.5-3×10⁶个/cm²。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)、提供了一种体外培养破骨细胞的试剂盒，该试剂盒所含试剂种类丰富，可以满足细胞分离、纯化、消化以及诱导等步骤的需求，而且实际选择合理得当，破骨细胞在体外的快速制备提供了便利，进而为可为破骨细胞的体外研究提供丰富的细胞来源。

(2)、该体外破骨细胞的制备方法简单，产生的破骨样细胞量很多，经试验统计，在1×l cm²的玻片上诱导产生的破骨细胞产量约为正常分离的成熟破骨细胞的50倍以上。

(3)、在诱导前利用0.5％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化可使破骨细胞纯度达95％以上，因此适合于破骨细胞生化学方面的研究，尤其适合于凝胶迁移等分子生物学研究，可提供足够的核提取物来研究破骨细胞分化过程中一些转录因子的变化。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明制备厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明提供了一种用于体外培养破骨细胞的试剂盒、试剂盒的制备方法以及利用该试剂盒体外培养破骨细胞的方法，所述试剂盒中含有平衡盐溶液、1,25(OH)₂D₃、α-MEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶、EDTA、Ficoll-Paque PREMRUM细胞分离液、链蛋白酶E、PBS冲洗液。另外，优选的，为了更好的实现制备效果，在上述方案的基础之上，本申请的试剂盒可以包含以下限定中的一种或几种；优选的，所述平衡盐溶液为D-Hanks；或所述试剂盒中还包括牙片、玻片；且所述平衡盐溶液中含有青霉素和链霉素，青霉素和链霉素的浓度为100-1200微克/毫升；或所述牙片和所述玻片的尺寸均为1-2cm²，或所述试剂盒包括盒体以及用于固定装有试剂的试剂瓶的支撑物，所述支撑物设置于所述盒体内。另外，该试剂盒还可以含有TRAP染色试剂，以方便后续破骨细胞培养监控。

本发明所述的破骨细胞培养试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

将各试剂或者载片分别封装于单独的封装装置内，再将封装装置内设置于支撑物后装于盒体中；另外，该制备方法还可包括牙片和玻片的制备步骤，具体的，该制备步骤包括：将新鲜人牙纵切成110-120μm，用金刚砂石磨薄至12-15μm，超声波清洗后浸泡于含青霉素1200-1400μg/ml、链霉素700-900μg/ml的D-Hanks液中，换液2-4次后置入含青霉素80-90μg/ml、链霉素70-80μg/ml的D-Hanks液置换2-4次，再置于α-MEM培养液中浸泡后，得到牙片；将1-2cm²的玻片于酸中浸泡10-12小时后用自来水冲洗干净，再用蒸馏水洗4-6遍，干热消毒灭菌后得到玻片。

接下来，本发明基于试剂盒对破骨细胞体外培养方法给出以下具体实施例。

实施例1

本实施例提供的试剂盒包括：α-MEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、D-Hanks液、胰蛋白酶、EDTA、Ficoll-Paque PREMRUM细胞分离液、链蛋白酶E、PBS冲洗液。基于该试剂盒的破骨细胞培养方法包括如下步骤：

S11：取新生兔的四肢长骨后于平衡盐溶液中去除软组织和软骨骺，得到骨干；

S12：将所述骨干置于α-MEM培养基，并在该培养基中加入胎牛血清(体积占比为15％)、青霉素和链霉素(加入后的浓度分别为100微克/毫升和300微克/毫升)，将所述骨干纵行剖开，轻刮骨的髓腔表面直至颜色变白，用吸管反复多次吹洗骨髓腔和骨干的内表面，取出骨片，吸取悬液置离心管内，离心后取沉淀物并加入α-MEM培养液吹打均匀，接种并孵育，将得到的孵育液用D-Hanks液冲洗后，加入至Ficoll-Paque PREMRUM细胞分离液(孵育液覆盖于分离液表面)后于800转/分钟的条件下离心8分钟，所得含有目的细胞(包括破骨细胞的前体细胞，以下实施例同)的悬液层利用α-MEM培养重悬；

S13：将重悬后的细胞用链蛋白酶E在适当温度下处理15分钟后，利用胰蛋白酶和EDTA消化之后，使用D-Hanks液冲洗后，使用PBS冲洗液，再利用胰蛋白酶和EDTA进行消化处理，得到待诱导细胞；

S14：将所述待诱导细胞利用1,25(OH)₂D₃诱导，得到体外培养的破骨细胞。

实施例2

本实施例的试剂盒与实施例1致，在此不做赘述，仅仅对体外制备破骨细胞的方做进一步的说明。

S21：取新生兔的四肢长骨后于平衡盐溶液中去除软组织和软骨骺，得到骨干；

在该步骤中，出生24h内的新生兔断颈处死，无菌取其四肢长骨，在D-Hanks液中去净附着在其表面的软组织和软骨骺，得到骨干。

S22：将所述骨干置于α-MEM培养基，并在该培养基中加入胎牛血清(体积占比为14％)、青霉素和链霉素(加入后的浓度分别为300微克/毫升和200微克/毫升)，将所述骨干纵行剖开，轻刮骨的髓腔表面直至颜色变白，用吸管反复多次吹洗骨髓腔和骨干的内表面，取出骨片，吸取悬液置离心管内，离心(4℃，1000r/min离心10min)后取沉淀物并加入α-MEM培养液吹打均匀，接种并孵育，将得到的孵育液用D-Hanks液冲洗后，加入至Ficoll-PaquePREMRUM细胞分离液后于800转/分钟的条件下离心8分钟，所得含有目的细胞的悬液层利用α-MEM培养重悬；

S23：将重悬后的细胞用链蛋白酶E在适当温度下处理20分钟后，利用5％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化之后，使用D-Hanks液冲洗后，使用PBS冲洗液，再利用4％胰蛋白酶和0.04％EDTA进行消化处理，得到待诱导细胞；

S24：将所述待诱导细胞利用1,25(OH)₂D₃诱导(最终加入浓度为10^-8M)，得到体外培养的破骨细胞。

实施例3

本实施例的试剂盒与实施例1一致，在此不做赘述，仅仅对体外制备破骨细胞的方做进一步的说明。

S31：出生24h内的新生兔断颈处死，取其四肢长骨后在D-Hanks液中去除软组织和软骨骺，得到骨干；

S32：将所述骨干置于α-MEM培养基，并在该培养基中加入胎牛血清(体积占比为13％)、青霉素和链霉素(加入后的浓度分别为400微克/毫升和300微克/毫升)，将所述骨干纵行剖开，轻刮骨的髓腔表面直至颜色变白，用吸管反复多次吹洗骨髓腔和骨干的内表面，取出骨片，吸取悬液置离心管内，离心(4℃，800r/min离心12min)后取沉淀物并加入α-MEM培养液吹打均匀，接种并孵育(37℃孵育18h)，将得到的孵育液用D-Hanks液冲洗后，加入至Ficoll-Paque PREMRUM细胞分离液后于900转/分钟的条件下离心7分钟，所得含有目的细胞的悬液层利用α-MEM培养重悬；

S33：将重悬后的细胞用链蛋白酶E在适当温度下处理30分钟后，利用5％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化之后，使用D-Hanks液冲洗后，再使用PBS冲洗液冲洗，再利用5％胰蛋白酶和0.02％EDTA进行消化处理，得到待诱导细胞；

S34：将所述待诱导细胞利用1,25(OH)₂D₃诱导(最终加入浓度为10^-8M)，得到体外培养的破骨细胞。

实施例4

本实施例的试剂盒与实施例1一致，在此不做赘述，仅仅对体外制备破骨细胞的方做进一步的说明。

S41：出生24h内的新生兔断颈处死，取其四肢长骨后在D-Hanks液中去除软组织和软骨骺，得到骨干；

S42：将所述骨干置于α-MEM培养基，并在该培养基中加入胎牛血清(体积占比为16％)、青霉素和链霉素(加入后的浓度分别为800微克/毫升和200微克/毫升)，将所述骨干纵行剖开，轻刮骨的髓腔表面直至颜色变白，用吸管反复多次吹洗骨髓腔和骨干的内表面，取出骨片，吸取悬液置离心管内，离心(4℃，1000r/min离心8min)后取沉淀物并加入α-MEM培养液吹打均匀，接种并孵育(37℃孵育22h)，将得到的孵育液用D-Hanks液冲洗后，加入至Ficoll-Paque PREMRUM细胞分离液后于900转/分钟的条件下离心8分钟，所得含有目的细胞的悬液层利用α-MEM培养重悬；

S43：将重悬后的细胞用链蛋白酶E在适当温度下处理25分钟后，利用5％蛋白酶和0.02％EDTA消化10分钟后利用D-Hanks液冲洗后，再使用PBS冲洗液冲洗，再利用5％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化5分钟，得到待诱导细胞；

S44：将所述待诱导细胞利用1,25(OH)₂D₃诱导(最终加入浓度为10^-8M)，得到体外培养的破骨细胞。

实施例5

本实施例的试剂盒与实施例1一致，在此不做赘述，仅仅对体外制备破骨细胞的方做进一步的说明。

S51：出生24h内的新生兔断颈处死，取其四肢长骨后在D-Hanks液中去除软组织和软骨骺，得到骨干；

S52：将所述骨干置于α-MEM培养基，并在该培养基中加入胎牛血清(体积占比为15％)、青霉素和链霉素(加入后的浓度分别为500微克/毫升和700微克/毫升)，将所述骨干纵行剖开，轻刮骨的髓腔表面直至颜色变白，用吸管反复多次吹洗骨髓腔和骨干的内表面，取出骨片，吸取悬液置离心管内，离心(4℃，1000r/min离心8min)后取沉淀物并加入α-MEM培养液吹打均匀，接种并孵育(37℃孵育20h)，将得到的孵育液用D-Hanks液冲洗后，加入至Ficoll-Paque PREMRUM细胞分离液后于800转/分钟的条件下离心10分钟，所得含有目的细胞的悬液层利用α-MEM培养重悬；

S53：将重悬后的细胞用链蛋白酶E在适当温度下处理20分钟后，利用5％蛋白酶和0.02％EDTA消化5分钟后利用D-Hanks液冲洗后，再使用PBS冲洗液冲洗，再利用5％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化5分钟，得到待诱导细胞；

S54：将所述待诱导细胞利用1,25(OH)₂D₃诱导(最终浓度为10^-8M)，得到体外培养的破骨细胞。

实施例6

本实施例提供的试剂盒，与实施例1相比，其还含有牙片、玻片、TRAP染色试剂、盒体以及用于固定装有试剂的试剂瓶的支撑物，所述支撑物设置于所述盒体内。具体的破骨细胞培养方法如下：

S61：与实施例5一致，在此不做赘述；

S62：将所述骨干置于α-MEM培养基，并在该培养基中加入胎牛血清(体积占比为15％)、青霉素和链霉素(加入后的浓度分别为1000微克/毫升和800微克/毫升)，将所述骨干纵行剖开，轻刮骨的髓腔表面直至颜色变白，用吸管反复多次吹洗骨髓腔和骨干的内表面，取出骨片，吸取悬液置离心管内，离心(4℃，1000r/min离心10min)后取沉淀物并加入α-MEM培养液吹打均匀，接种并孵育(37℃孵育20h)，将得到的孵育液用D-Hanks液冲洗后，加入至Ficoll-Paque PREMRUM细胞分离液后于600转/分钟的条件下离心12分钟，所得含有目的细胞的悬液层利用α-MEM培养重悬；

S63：将重悬后的细胞用链蛋白酶E处理20分钟后，利用0.5％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化10分钟，使用D-Hanks液冲洗后，使用PBS冲洗液冲洗，再利用0.5％胰蛋白酶和0.02％EDTA进行消化10分钟，得到待诱导细胞；

S64：将所得的待诱导细胞收集于离心管内，在3℃，1200r/min下离心8min，弃上清，加α-MEM培养基稀释后接种于细胞培养板中(细胞培养板事先分别置1cm²的玻片和牙片)，并向细胞培养板内加入1,25(OH)₂D₃(最终浓度为10^-8M)，置35℃，3％CO₂培养箱内培养，隔天换液1次。

本实施例中，牙片和玻片的制备方法如下：将新鲜人牙纵切成110μm，用金刚砂石磨薄至12μm，超声波清洗后浸泡于含青霉素1200μg/ml、链霉素700μg/ml的D-Hanks液中，换液2次后置入含青霉素80μg/ml、链霉素70μg/ml的D-Hanks液置换2次，再置于α-MEM培养液中浸泡后，得到牙片；

将1cm²的玻片于酸中浸泡10小时后用自来水冲洗干净，再用蒸馏水洗4-6遍，干热消毒灭菌后得到玻片。

实施例7

本实施例中的试剂盒与实施例6一致，在此不做赘述，仅对制备方法进行进一步的说明。

S71：与实施例6的步骤S61一致；

S72：将所述骨干置于α-MEM培养基，并在该培养基中加入胎牛血清(体积占比为15％)、青霉素和链霉素(加入后的浓度分别为1200微克/毫升和1000微克/毫升)，将所述骨干纵行剖开，轻刮骨的髓腔表面直至颜色变白，用吸管反复多次吹洗骨髓腔和骨干的内表面，取出骨片，吸取悬液置离心管内，离心(4℃，1000r/min离心10min)后取沉淀物并加入α-MEM培养液吹打均匀，接种并孵育(37℃孵育25h)，将得到的孵育液用D-Hanks液冲洗后，加入至Ficoll-Paque PREMRUM细胞分离液后于800转/分钟的条件下离心10分钟，所得含有目的细胞的悬液层利用α-MEM培养重悬；

S73：将重悬后的细胞用链蛋白酶E处理20分钟后，利用0.5％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化5分钟，使用D-Hanks液冲洗后，使用PBS冲洗液冲洗，再利用0.5％胰蛋白酶和0.02％EDTA进行消化15分钟，得到待诱导细胞；

S74：将所得的待诱导细胞收集于离心管内，在5℃，1400r/min下离心8min，弃上清，加α-MEM培养基稀释接种于细胞培养板中，并向细胞培养板内加入1,25(OH)₂D₃(最终浓度为10^-8M)，置37℃，5％CO₂培养箱内培养，隔天换液1次；

与实施例的牙片和玻片的制备方法如下：

将新鲜人牙纵切成120μm，用金刚砂石磨薄至15μm，超声波清洗后浸泡于含青霉素1400μg/ml、链霉素900μg/ml的D-Hanks液中，换液3次后置入含青霉素90μg/ml、链霉素80μg/ml的D-Hanks液置换3次，再置于α-MEM培养液中浸泡后，得到牙片；

将1cm²的玻片于酸中浸泡12小时后用自来水冲洗干净，再用蒸馏水洗4-6遍，干热消毒灭菌后得到玻片。

实施例8

本实施例中的试剂盒与实施例6一致，在此不做赘述，仅对制备方法进行进一步的说明。

S81：与实施例6的步骤S61一致；

S82：与实施例7的步骤S72一致；

S83：将重悬后的细胞用链蛋白酶E处理15分钟后，利用0.5％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化10分钟，使用D-Hanks液冲洗后，使用PBS冲洗液冲洗，再利用0.5％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化10分钟，得到待诱导细胞；

S84：将所得的待诱导细胞收集于离心管内，在5℃，1200r/min下离心10min，弃上清，加α-MEM培养基稀释接种(接种密度为2.5-3×10⁶个/cm²)于细胞培养板中(培养板内事先放入1cm²的玻片和牙片)，并向细胞培养板内加入1,25(OH)₂D₃(最终浓度为10^-8M)，置37℃，5％CO₂培养箱内培养，隔天换液1次；

本实施例中玻片和牙片的制备方法如下：

将新鲜人牙纵切成115μm，用金刚砂石磨薄至13μm，超声波清洗后浸泡于含青霉素1300μg/ml、链霉素800μg/ml的D-Hanks液中，换液3次后置入含青霉素85μg/ml、链霉素75μg/ml的D-Hanks液置换3次，再置于α-MEM培养液中浸泡后，得到牙片；

将2cm²的玻片于酸中浸泡12小时后用自来水冲洗干净，再用蒸馏水洗4-6遍，干热消毒灭菌后得到玻片。

试验例

按照上述实施例所列举的方法进行体外破骨细胞的培养，其中，实施例1-实施例5中加入实施例6所示玻片和牙片，所有实施例在诱导培养10天之后，取出玻片，利用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色，观测破骨细胞培养结果以及骨吸收陷窝分析，结果如下表1所示：

表1试验例试验结果

综上所述，该方法是建立在组织中不同细胞贴壁能力不同而使细胞加以纯化。在该试剂盒中，其针对破骨细胞不同的培养阶段，特定选择了不同的处理试剂，将细胞的纯化、分离、消化以及诱导等特定地进行了结合，而且所用的试剂也是特定选择的，其为体外快速获得破骨细胞提供了便利。另外，利用0.5％胰蛋白酶和0.02％EDTA联合消化的方法以及将成熟细胞分离与诱导破骨细胞相结合的方法可获得高产量和高纯度的破骨样细胞，可为破骨细胞的体外研究提供丰富的细胞来源。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种破骨细胞培养试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有平衡盐溶液、1,25(OH)₂D₃、α-MEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶、EDTA、Ficoll-Paque PREMRUM细胞分离液、链蛋白酶E和PBS冲洗液。

2.根据权利要求1所述的破骨细胞培养试剂盒，其特征在于，所述平衡盐溶液为D-Hanks液。

3.根据权利要求2所述的破骨细胞培养试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括牙片、玻片；且所述平衡盐溶液中含有青霉素和链霉素，青霉素和链霉素的浓度为100-1200微克/毫升。

4.根据权利要求3所述的破骨细胞培养试剂盒，其特征在于，所述牙片和所述玻片的尺寸均为1-2cm²。

5.根据权利要求1-4任一项所述的破骨细胞培养试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括盒体以及用于固定装有试剂的试剂瓶的支撑物，所述支撑物设置于所述盒体内。

6.根据权利要求5所述的破骨细胞培养试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有TRAP染色试剂。

7.一种权利要求1-6任一项所述的破骨细胞培养试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将各试剂或者载片分别封装于单独的封装装置内，再将封装装置设置于支撑物后装于盒体中。

8.根据权利要求7所述的的制备方法，其特征在于，所述方法还包括制备牙片和玻片步骤，具体包括：

将新鲜人牙纵切成110-120μm，用金刚砂石磨薄至12-15μm，超声波清洗后浸泡于含青霉素1200-1400μg/ml、链霉素700-900μg/ml的D-Hanks液中，换液2-4次后置入含青霉素80-90μg/ml、链霉素70-80μg/ml的D-Hanks液置换2-4次，再置于α-MEM培养液中浸泡后，得到牙片；

将1-2cm²的玻片于酸中浸泡10-12小时后用自来水冲洗干净，再用蒸馏水洗4-6遍，干热消毒灭菌后得到玻片。

9.一种根据权利要求1-6任一项所述的破骨细胞培养试剂盒培养破骨细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、取新生兔的四肢长骨后于平衡盐溶液中去除软组织和软骨骺，得到骨干；

2)、将所述骨干置于α-MEM培养基，并在该培养基中加入胎牛血清、青霉素和链霉素，将所述骨干纵行剖开，轻刮骨的髓腔表面直至颜色变白，用吸管反复多次吹洗骨髓腔和骨干的内表面，取出骨片，吸取悬液置离心管内，离心后取沉淀物并加入α-MEM培养液吹打均匀，接种并孵育，将得到的孵育液用D-Hanks液冲洗后，加入至Ficoll-Paque PREMRUM细胞分离液后于800-900转/分钟的条件下离心6-8分钟，所得含有目的细胞的悬液层利用α-MEM培养重悬；

3)、将重悬后的细胞用链蛋白酶E处理后，利用胰蛋白酶和EDTA消化之后，使用D-Hanks液冲洗后，使用PBS冲洗液，再利用胰蛋白酶和EDTA进行消化处理，得到待诱导细胞；

4)、将所述待诱导细胞利用1,25(OH)₂D₃诱导，得到体外培养的破骨细胞。

10.根据权利要求9所述的培养破骨细胞的方法，其特征在于，在步骤4)中，具体包括：

将步骤3)中所得的待诱导细胞收集于离心管内，在3-5℃，1200-1400r/min下离心8-9min，弃上清，加α-MEM培养基稀释接种于细胞培养板中，并向细胞培养板内加入1,25(OH)₂D₃，置35-38℃，3-6％CO₂培养箱内培养，隔天换液1次；

其中，细胞培养板内分别置玻片和牙片。