CN106754373A - 耐镉产铁载体菌株的分离方法及应用 - Google Patents

耐镉产铁载体菌株的分离方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于土壤治理技术领域，涉及一种耐镉产铁载体菌株的分离方法及应用。分离方法为：取黑麦草植株，抖落黑麦草根系周围的土壤后，剩下紧密附着在根系上的根际土壤，将根际土壤取下，加无菌水，震荡后静置，吸取上层土壤悬液，涂布于LB+2mg/L Cd2+的固体培养基平板上，恒温倒置培养2‑5d，挑取生长良好的单菌落划线纯化，得到耐镉产铁载体菌株。本发明直接从修复植物黑麦草根际土壤中筛选功能较为全面的细菌，对其进行菌种鉴定与生物学特性研究，可为植物修复技术的开发提供优质的菌种资源。

Description

耐镉产铁载体菌株的分离方法及应用
技术领域
本发明属于土壤治理技术领域，涉及一种耐镉产铁载体菌株的分离方法及应用。
背景技术
治理土壤重金属污染一直是国内外面临的巨大挑战。植物修复因其低成本、无污染、不对土壤造成二次影响、操作简单等特点在众多的土壤重金属修复技术中脱颖而出。然而用于植物修复的大部分超富集植物存在生物量小、生长缓慢、对重金属具有选择性等缺点限制了植物修复技术的发展与应用。
近年来，植物根际促生菌的深入研究为解决这一难题提供了新的思路。植物根际促生菌(PGPR)指生存于植物根际且有利于植物生长的微生物的总称。其中有一类能够产铁载体(Siderophore)的根际细菌，产生的铁载体既能给植物提供铁营养，又能与其他重金属结合，形成利于植物吸收的重金属-铁载体螯合物，增加植物对重金属的富集和吸收，提高植物修复效率。产铁载体细菌在植物修复中的作用主要体现为以下几个方面：(1)为植物提供足量的铁营养，缓解植物因缺铁引起的各种症状；(2)影响土壤中重金属生物有效性，分泌一些有机酸和铁载体直接或间接地活化土壤中的重金属，提高其生物可利用性；(3)产生植物生长调节物质，如3-吲哚乙酸(IAA)、细胞***素和赤霉素等[6]，这些物质在促进植物生长的同时也间接提高了其对重金属的吸收；(4)协助植物获得足量的营养元素，如氮、磷、钾等，以保证植物在逆境条件下的最佳生长条件；(5)生防机制，通过抢占植物根系表面的有利生态位点与病原菌竞争营养(如铁元素)；某些细菌还能通过产生抗生素的方式来抑制各种病原微生物的侵染。
中国专利文献公开了一株新的巨大芽孢杆菌及其应用[申请号：201610081336.4]，保藏号：CCTCC NO：M2016033的巨大芽孢杆菌JD4(Bacillus megateriumJD4)，菌体生长快、酶系丰富，具有良好的产蛋白酶活力，其蛋白酶水解能力(Up)为83.60±4.84，远远高于已报道的同种菌株，能够高效降解有机物，在生物有机肥、饲料添加剂、水质改良剂领域具有较好的应用前景。
目前，已有相当一部分具有促生效果的细菌从土壤中分离得到，并应用于重金属污染土壤的微生物-植物联合修复中。然而，在此过程中仍存在着两个问题，一是大部分促生细菌并非从修复植物本身获得，这可能造成菌株难以在植物体内定殖，也有可能因引进外来微生物资源对当地生态环境造成影响。二是多数研究只是寻求功能单一的促生细菌，而对于促生功能全面、环境适应能力强的土著促生细菌的报道相对较少。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种耐镉产铁载体菌株的分离方法及应用。
为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：一种耐镉产铁载体菌株的分离方法，其特征在于，取黑麦草植株，抖落黑麦草根系周围的土壤后，剩下紧密附着在根系上的根际土壤，将根际土壤取下，加无菌水，震荡后静置，吸取上层土壤悬液，涂布于LB+2mg/LCd2+的固体培养基平板上，恒温倒置培养2-5d，挑取生长良好的单菌落划线纯化，得到耐镉产铁载体菌株。
在上述的耐镉产铁载体菌株的分离方法中，所述的根基土壤与无菌水的重量比为1:10，根基土壤加无菌水后，在150r/min振荡30min后静置10min，吸取上层土壤悬液，涂布于LB+2mg/L Cd2+的固体培养基平板上，25-30℃倒置培养3-4d，挑取生长良好的单菌落划线纯化，得到耐镉产铁载体菌株，-80℃及以下温度保存。
在上述的耐镉产铁载体菌株的分离方法中，所述的根基土壤与无菌水的重量比为1:10，根基土壤加无菌水后，在150r/min振荡30min后静置10min，吸取上层土壤悬液1mL，10倍系列稀释，依次制备若干不同稀释度的悬液，各取100μL涂布于LB+2mg/L Cd2+的固体培养基平板上，28℃倒置培养3d，挑取生长良好的单菌落划线纯化，得到耐镉产铁载体菌株，-80℃及以下温度保存。
本发明涉及按分离方法得到的菌株对提高镉胁迫下黑麦草种子发芽率的应用。
本发明涉及按分离方法得到的菌株对土壤溶磷的应用。
本发明涉及按分离方法得到的菌株在土壤中产铁载体的应用。
本发明涉及按分离方法得到的菌株对植物促生的应用。
本发明涉及按分离方法得到的菌株在镉污染土壤的修复中的应用。
本发明涉及按分离方法得到的菌株对土壤中镉的活化的应用。
本发明涉及按分离方法得到的菌株对土壤中铜的活化的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、本发明直接从修复植物黑麦草根际土壤中筛选功能较为全面的细菌，对其进行菌种鉴定与生物学特性研究，可为植物修复技术的开发提供优质的菌种资源。
2、多年生黑麦草(Lolium perenne L.)是禾本科中产量较高的一种牧草，被广泛引种栽培，其具有环境适应性强、能耐受多种重金属的毒害、生长速度快、分蘖力强、生物量大等优点，因此黑麦草十分适合用作重金属污染植物修复材料。
3、本发明从黑麦草根际土壤中分离到镉具有较强耐性的产铁载体菌株，根据生理生化及分子鉴定实验将其鉴定为巨大芽孢杆菌(B.megaterum.)。该菌株属于高产铁载体细菌，同时具备多种植物促生特性，能够分泌IAA，在LB培养液中培养48h后分泌IAA量达到26.5mg/L；在NBRIP培养液中，菌株对磷酸三钙的转化量达到96.3mg/L。在土壤中加入菌株的上清液能够显著提高其中镉的生物有效性，且种子萌发实验表明，接种菌株能使在Cd2+胁迫下的黑麦草种子的发芽率明显提高。综合各项促生能力以及菌株表现出的良好环境耐受性和适应性，可以发现菌株十分全面，在众多的促生细菌里具备相当的竞争力。
综上，表明本发明分离得到的菌株具有良好的植物促生潜力及应用于微生物-植物联合修复重金属污染土壤的价值。
附图说明
图1为本发明提供的菌株LY02扫描电镜细胞形态(11000×)。
图2为本发明提供的菌株LY02基于16S rDNA序列构建的***发育树。
图3为本发明提供的LY02菌悬液对不同浓度镉胁迫黑麦草种子发芽率的影响。
具体实施方式
下述实施例中所用的试剂，如无特殊说明，可以从常规生化试剂商店购买得到。以下实施例中的定量数据，均设置三次重复实验，结果取平均值。
试验所需的试剂的制备方法如下：
(1)LB培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl10.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，121℃、20min高压蒸汽灭菌；
(2)SMA培养基：蔗糖20.0g，L-天冬氨酸2.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，8-羟基喹啉，蒸馏水1000mL，pH 7.0，121℃、15min高压蒸汽灭菌；
(3)无机磷培养基(NBRIP):葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，Ca3(PO4)2 5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.5，121℃、15min高压蒸汽灭菌；
(4)Salkowski’S显色剂：150mL浓硫酸溶于250mL去离子水中，加入7.5mL 0.5molL-1的FeCl3·6H2O溶液；
(5)CAS检测液：将0.079g CAS溶于50mL去离子水中，再加入10mL 1mmol L-1FeCl3溶液(用盐酸配制)，得溶液A。将0.069g十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA)溶于40mL的去离子水中，得溶液B。将A溶液沿烧杯壁缓缓加入B溶液中，搅拌混匀即得100mL CAS蓝色检测液；
(6)0.1mol L-1磷酸盐缓冲液(pH 6.8)：Na2HPO4·12H2O 2.427g，NaH2PO4·2H2O0.5905g，KH2PO4 0.075g，NH4Cl 0.250g，NaCl 0.125g，去离子水100mL，使用时稀释10倍。
实施例1
取选取长势较好的黑麦草植株，抖落黑麦草根系周围的土壤后，剩下紧密附着在根系上的根际土壤，将根际土壤取下，装于灭菌袋中备用，取适量根基土壤，加无菌水，震荡后静置，吸取上层土壤悬液，涂布于LB+2mg/L Cd2+的固体培养基平板上，恒温倒置培养2-5d，挑取生长良好的单菌落划线纯化，得到耐镉产铁载体菌株。
优选方案，根基土壤与无菌水的重量比为1:10，根基土壤加无菌水后，在150r/min振荡30min后静置10min，吸取上层土壤悬液，涂布于LB+2mg/L Cd2+的固体培养基平板上，25-30℃倒置培养3-4d，挑取生长良好的单菌落划线纯化，得到耐镉产铁载体菌株，-80℃及以下温度保存。
实施例2
取选取长势较好的黑麦草植株，抖落黑麦草根系周围的土壤后，剩下紧密附着在根系上的根际土壤，将根际土壤取下，装于灭菌袋中备用，称取根际土壤10g，装入三角瓶中并加入100mL无菌蒸馏水，在150r/min振荡30min后静置10min，吸取上层土壤悬液1mL，该土壤悬液的稀释度为10-1，再用无菌蒸馏水10倍系列稀释，依次制备10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释度的悬液，各取100μL涂布于LB+2mg/L Cd2+的固体培养基平板上，28℃倒置培养3d，其中土壤悬液的稀释度为10-1、10-2和10-6的单菌落生长良好，分别挑取土壤悬液的稀释度为10-1、10-2和10-6生长良好的单菌落划线纯化，得到三株耐镉产铁载体菌株，分别命名为LY01、LY02和LY06，-80℃及以下温度的冰箱保存。
对LY02进行形态特征观察、生理生化及分子鉴定。
形态特征观察：利用扫描电镜(飞纳台式扫描电镜Pro)观察细菌形态特征。
生理生化测定：参照《常见细菌***鉴定手册》进行。
16S rDNA序列测定与同源性分析：将待测菌划线至平板上，培养生成单菌落，用10uL枪头挑起单菌落转移至含有20μL ddH2O中，制备成菌悬液，用于提取菌株基因组总DNA。PCR引物为：正向引物8F(5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)，反向引物1513R(5’-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3’)。PCR反应条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延长90s，30个循环；72℃延伸10min。将扩增后的产物进行测序，将测得的16S rDNA序列提交GenBank，与数据库中的基因进行比对，并用Mega5(采用NJ法构建***发育进化树，Bootstrap值设为1000)。
LY02菌株在LB平板上的菌落为乳白色，近圆形，边缘规则，表面光滑，湿润，不透明。在11000倍扫描电镜下观察到的菌株形态为杆状，产近球形芽孢(见图1)
经测定，LY02菌株的生理生化特性见表1。
表1菌株LY02的生理生化特性
注：+为阳性，－为阴性
利用PCR方法对LY02的16S rDNA进行扩增，获得一条约为1500bp的条带，PCR产物经测序后，将所获得序列提交至Genbank数据库，结果显示该菌株与B.megaterium的序列相似性最高，进一步将该细菌的16S rDNA序列与其他相似性较高的菌株的序列构建***发育树(图2)，结合生理生化试验，可推断LY02为巨大芽孢杆菌(B.megaterium)。
应用例1
本应用例提供了一种以实施例1-2得到的耐镉产铁载体菌株对提高镉胁迫下黑麦草种子发芽率的应用。
菌悬液的制备：将供试菌株活化，取50μL菌液接种于100mL的LB液体培养基中，28℃、150r/min培养48h，6000r/min离心10min，弃上清液，再用无菌水冲洗菌体5遍，添加适量无菌水调整菌体浓度为108cfu/mL，所得即为LY02菌悬液。在菌悬液中加入相应的镉溶液，使菌悬液中镉质量浓度分别为0、1、5、10、15mg/L。
黑麦草种子用75％的酒精消毒3min，用无菌去离子水冲洗5遍。选取饱满、均一的种子放置于垫了两层无菌滤纸的培养皿中，每皿50颗，加入上述菌悬液5mL，在温度为25℃，湿度为60％的恒温培养箱中培养萌发。发芽期间每天统计发芽数(以长出1cm的苗长作为发芽标准)，培养7d后统计发芽率。以加入等量的无菌水作为对照。重复三次。
种子萌发是植物生长的起点和关键时期，此时种子对外界环境的感知十分敏感。有研究表明，重金属环境会使植物的很多萌发指标如发芽率、发芽势、胚芽、胚根等发生改变。其中发芽率可以非常直观的体现出苗的好坏，农业上通常根据发芽率来计算需要的种子量。黑麦草种子在添加了LY02菌悬液的不同浓度镉胁迫环境中的发芽率如图3所示。从图3中可以看出，在Cd2+浓度为1mg/L条件下，黑麦草种子发芽率与对照相比，差异不显著。随着Cd2+浓度的增大，无论是否添加菌悬液，黑麦草发芽率均不断降低，但添加菌悬液(实验组)的黑麦草发芽率降低缓慢，不添加菌悬液(对照组)的黑麦草发芽率降低迅速，对应的实验组与对照组发芽率差异均为极显著。可见，高浓度的Cd2+能够抑制黑麦草种子的发芽率，但是经LY02菌悬液处理后可以极显著消除Cd2+对种子萌发的抑制作用。
应用例2
本应用例提供了一种以实施例1-2得到的耐镉产铁载体菌株对对植物促生的应用。
铁元素与磷元素皆为植物生长的必需元素，然而土壤中的铁与磷大部分都以难溶态的形式存在，植物很难直接利用。产铁载体细菌能在缺铁环境中合成对铁离子具有极高亲和力的铁载体以螯合铁离子形成螯合物，某些微生物能通过产酶或产酸等形式来溶解各种难溶性磷，显著改善植物的磷素营养；既满足微生物自身对铁营养的需要，也能促进植物对铁离子的吸收利用，达到改善植物的铁营养的效果。IAA是植物生长过程中十分重要的一种生长激素，它能调控植物根、茎、叶的生长，各组织的形成发育等。由微生物产生的IAA也能促进植物的生长，并调控植物体其他的生命活动。
产IAA检测：取含有L-色氨酸(100mg/L)的LB培养液50mL分装于250mL的三角瓶中，将供试菌株接种于上述培养液中，摇床振荡培养2d。取5mL菌液于离心管中，6000r/min离心10min后，取1mL上清液，加2mL Salkowski’S显色剂，充分混合，黑暗条件下显色30min，测定530nm波长下吸光值，以未接种菌株的培养液为对照调零，每组三个重复。同法以浓度为5、10、15、20、30、40、50mg/L的IAA标准液作标准曲线，计算培养液中IAA的浓度。
溶磷能力检测：将供试菌株接种于NBRIP培养液中，28℃、150r/min培养7d，6000r/min离心10min后取上清液1mL，采用钼锑抗比色法测定上清液中磷含量。以不接菌的培养液为对照，重复三次。
产铁载体能力检测：
定性检测：采用改进的CAS平板覆盖法检测细菌产生铁载体的能力。取50μL菌液点接于限铁MSA培养基平板，置于28℃生化培养箱中培养2d。当灭菌后的CAS检测液冷却至60℃左右时，将其缓缓倒入MSA限铁培养基平板，放置1h观察每个平板中菌落周围颜色变化，每株菌三次重复。
定量检测：吸取50μL菌液接入到MSA液体培养基，28℃、150r/min培养48h，10000r/min离心10min，取上清液3mL与等量CAS检测液充分混匀，静置1h，在630nm波长处测定吸光值(As)，并取双蒸水作为对照调零，用相同方法测定未接菌株的各培养液的吸光值作为参比值(Ar)，重复三次，根据公式SU＝[(Ar-As)/Ar]×100％，计算铁载体活性单位SU，SU的值越大，表明菌株产铁载体能力越强。
本应用例对以上LY01、LY02和LY06三株镉耐性菌株的促生潜力进行了应用试验(参见表2)。发现三株菌都能合成铁载体，其中LY02的铁载体活性单位达到86.1％，属于高产铁载体细菌，三株细菌均可以产生IAA，LY02的IAA产量为26.5mg/L，显著高于LY03的15.4mg/L。三株菌都具备一定的溶解无机磷能力，以LY02的溶磷性最强，达到了96.3mg/L，其次为LY03。从三株菌的促生特性可以发现LY02的促生潜力优于另外两株菌。
表2 LY01、LY02和LY06三个菌株的促生特性
铁元素与磷元素皆为植物生长的必需元素，然而土壤中的铁与磷大部分都以难溶态的形式存在，植物很难直接利用。产铁载体细菌能在缺铁环境中合成对铁离子具有极高亲和力的铁载体以螯合铁离子形成螯合物，某些微生物能通过产酶或产酸等形式来溶解各种难溶性磷，显著改善植物的磷素营养；既满足微生物自身对铁营养的需要，也能促进植物对铁离子的吸收利用，达到改善植物的铁营养的效果。IAA是植物生长过程中十分重要的一种生长激素，它能调控植物根、茎、叶的生长，各组织的形成发育等。由微生物产生的IAA也能促进植物的生长，并调控植物体其他的生命活动。
应用例3
本应用例提供了是实施例1-2得到的菌株对土壤中镉的活化的应用。
将待测菌株活化，取50μL菌液接种于LB液体培养基中，28℃，150r/min培养24h，6000r/min离心10min，取10mL上清液添加到5g受重金属镉污染的土样中，充分混匀，重复3次，置于28℃下保湿培养7d后，将该土壤溶液6000r/min离心10min，用电感耦合等离子发射光谱仪(ICP-OES,PerkinElmer7000DV)检测上清液中Cd的含量[16]。以未接种的LB培养液为对照。重复三次。
许多微生物可通过自身的生命活动或产生的代谢产物影响重金属形态，提高其生物可利用态。经测定，产铁载体菌株LY02的代谢产物对镉、铜均具备一定的活化效果。在重金属污染土壤中添加LY02的上清液后，土壤中的可溶性镉含量达到6.5mg/kg，对照组的土壤中有效态Cd的含量则为4.2mg/kg，活化效果明显。由于菌株LY02具备很强的产铁载体能力，同时铁载体又能吸附和转化某些重金属，使重金属的生物有效性增加，因此推测菌株对镉的活化效果很可能与其高产铁载体的能力有关。土壤中重金属的低生物有效性是限制植物修复技术发展的原因之一，而铁载体能够与多种重金属螯合，实现不同重金属形态之间的转换，提高其生物可利用性。
应用例4
本应用例提供了是实施例1-2得到的菌株在镉污染土壤的修复中的应用。
根据实施例2的方法，从黑麦草根际土壤中分离到1株对镉具有较强耐性的产铁载体细菌LY02，根据生理生化及分子鉴定实验将其鉴定为巨大芽孢杆菌(B.megaterum.)。LY02属于高产铁载体细菌，同时具备多种植物促生特性，能够分泌IAA，在LB培养液中培养48h后分泌IAA量达到26.5mg/L；在NBRIP培养液中，菌株对磷酸三钙的转化量达到96.3mg/L。在土壤中加入LY02的上清液能够显著提高其中镉的生物有效性，且种子萌发实验表明，接种LY02能使在Cd2+胁迫下的黑麦草种子的发芽率明显提高。可以发现菌株LY02十分全面，在众多的促生细菌里具备相当的竞争力。综上，表明菌株LY02具有良好的植物促生潜力及应用于微生物-植物联合修复重金属污染土壤的价值。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (10)

1.一种耐镉产铁载体菌株的分离方法，其特征在于，取黑麦草植株，抖落黑麦草根系周围的土壤后，剩下紧密附着在根系上的根际土壤，将根际土壤取下，加无菌水，震荡后静置，吸取上层土壤悬液，涂布于LB+2mg/L Cd2+的固体培养基平板上，恒温倒置培养2-5d，挑取生长良好的单菌落划线纯化，得到耐镉产铁载体菌株。
2.根据权利要求1所述的耐镉产铁载体菌株的分离方法，其特征在于，所述的根基土壤与无菌水的重量比为1:10，根基土壤加无菌水后，在150r/min振荡30min后静置10min，吸取上层土壤悬液，涂布于LB+2mg/L Cd2+的固体培养基平板上，25-30℃倒置培养3-4d，挑取生长良好的单菌落划线纯化，得到耐镉产铁载体菌株，-80℃及以下温度保存。
3.根据权利要求1所述的耐镉产铁载体菌株的分离方法，其特征在于，所述的根基土壤与无菌水的重量比为1:10，根基土壤加无菌水后，在150r/min振荡30min后静置10min，吸取上层土壤悬液1mL，10倍系列稀释，依次制备若干不同稀释度的悬液，各取100μL涂布于LB+2mg/L Cd2+的固体培养基平板上，28℃倒置培养3d，挑取生长良好的单菌落划线纯化，得到耐镉产铁载体菌株，-80℃及以下温度保存。
4.根据权利要求1-3任意一项得到的菌株对提高镉胁迫下黑麦草种子发芽率的应用。
5.根据权利要求1-3任意一项得到的菌株对土壤溶磷的应用。
6.根据权利要求1-3任意一项得到的菌株在土壤中产铁载体的应用。
7.根据权利要求1-3任意一项得到的菌株对植物促生的应用。
8.根据权利要求1-3任意一项得到的菌株在镉污染土壤的修复中的应用。
9.根据权利要求1-3任意一项得到的菌株对土壤中镉的活化的应用。
10.根据权利要求1-3任意一项得到的菌株对土壤中铜的活化的应用。
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