CN114107117B - 一株水稻内生菌及其应用 - Google Patents
一株水稻内生菌及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114107117B CN114107117B CN202111452900.6A CN202111452900A CN114107117B CN 114107117 B CN114107117 B CN 114107117B CN 202111452900 A CN202111452900 A CN 202111452900A CN 114107117 B CN114107117 B CN 114107117B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rice
- endophyte
- cadmium
- strain
- bacillus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 title claims abstract description 46
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 title claims abstract description 46
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 title 1
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims abstract description 45
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 34
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 34
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 14
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 7
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 claims description 6
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 4
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 claims description 2
- 239000002363 auxin Substances 0.000 claims description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 claims 2
- 239000000589 Siderophore Substances 0.000 abstract description 11
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 abstract description 11
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 abstract description 6
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract description 5
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 abstract description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 2
- 241001478887 unidentified soil bacteria Species 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- YKYOUMDCQGMQQO-UHFFFAOYSA-L cadmium dichloride Chemical compound Cl[Cd]Cl YKYOUMDCQGMQQO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 10
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 7
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N Dimethylamine Chemical compound CNC ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 4
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 108010007337 Azurin Proteins 0.000 description 2
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 2
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 229960001425 deferoxamine mesylate Drugs 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- IDDIJAWJANBQLJ-UHFFFAOYSA-N desferrioxamine B mesylate Chemical compound [H+].CS([O-])(=O)=O.CC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCN IDDIJAWJANBQLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 2
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 2
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241001091960 Bacillus sp. RE Species 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 244000184734 Pyrus japonica Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000002354 inductively-coupled plasma atomic emission spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000002068 microbial inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 238000002161 passivation Methods 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 244000000000 soil microbiome Species 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
- A01N63/22—Bacillus
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
- B09C—RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
- B09C1/00—Reclamation of contaminated soil
- B09C1/10—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Soil Sciences (AREA)
- Environmental & Geological Engineering (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一株水稻内生菌及其应用，所述水稻内生菌分类命名为芽孢杆菌（Bacillus sp.）RE 35，属于革兰氏阳性菌，保藏号为：CCTCC NO：M 20211333。本发明的水稻内生菌为芽孢杆菌属，其镉抗性可达150mg/L，并对低浓度镉具有稳定的吸附能力，且产IAA和铁载体能力强，具有较强的促生能力，可应用至镉污染的农田中，进行生物修复，相比现有土壤细菌更加有利于开发和应用。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株水稻内生菌及其应用。
背景技术
镉由于其高移动性和高毒性已经被公认为对人类最具威胁的主要有毒重金属之一。水稻是我国重要的粮食作物，镉在水稻的根、茎、叶及籽粒中大量积累，不仅影响水稻产量、品质及整个农田生态***，并通过食物链危及人类健康。
植物-微生物联合修复作为一种生物修复技术，充分利用植物与微生物共生关系，因其环境友好、无二次污染等特点，逐渐成为国内外研究热点。微生物一方面能够通过对重金属的钝化作用，使重金属在土壤中沉淀或被吸附固定，改变其赋存形态，降低植物对重金属的吸收转运；另一方面，微生物能够通过多种途径促进植物生长，提高植物对重金属的耐受性，强化植物的修复效果。因此，利用植物促生菌强化植物固定修复重金属污染土壤，具有较好的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一株水稻内生菌及其应用。
本发明的目的可通过以下技术方案来实现：
第一方面，本发明提供了一株水稻内生菌，其分类命名为芽孢杆菌(Bacillussp.)RE 35，属于革兰氏阳性菌，保藏号为：CCTCC NO：M 20211333。其16S rRNA序列如SEQID NO：1所示。
第二方面，本发明提供了上述水稻内生菌的培养方法，将所述水稻内生菌接种至培养基，在28～30℃条件下培养。
进一步的，所述水稻内生菌在30℃条件下培养。
进一步的，所述水稻内生菌在pH＝6.5～7.5条件下培养；优选7.0条件下培养。
进一步的，所述培养基为Luria-Bertani(LB)培养基，其成分为：10.0g/L蛋白胨，5.0g/L酵母粉，10.0g/L NaCl，其余为水。
第三方面，本发明提供了上述水稻内生菌在产IAA中的应用。对所述水稻内生菌进行发酵培养，生产IAA。
第四方面，本发明提供了上述水稻内生菌在农作物耐镉促生中的应用。
本发明从水稻根内筛选出一株芽孢杆菌属的菌株RE 35，植物体内镉本身浓度通常低于其他环境，因此内生菌通常对镉的耐受或吸附能力较弱，但具有一定的促生性能。本发明的内生菌镉抗性可达150mg/L，并对低浓度镉具有稳定的吸附能力，且产IAA和铁载体能力强，IAA产量可达114mg/L，具有较强的促生能力，可应用至镉污染的农田中，进行生物修复，相对于现有技术中的其他土壤细菌更加有利于开发和应用。
附图说明
图1是本发明中水稻内生菌RE 35的菌落形态。
图2是本发明中水稻内生菌RE 35的***发育关系图。
图3是本发明中水稻内生菌RE 35在添加不同浓度镉的培养基中细胞密度的变化图。
图4是本发明中水稻内生菌RE 35在添加不同浓度镉的培养基中pH的变化图。
图5是本发明中不同镉浓度条件下菌株RE 35对其吸附量变化图。
本发明所述的生物材料，其分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)RE 35，已于2021年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为：CCTCC NO：M 20211333，地址：中国武汉。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施方案对本发明作进一步详细说明。
实施例1
内生菌的分离和筛选
菌株分离自镉污染农田中的水稻根，具体分离方法如下：
(1)根的表面消毒：采集水稻根，用流水冲洗植物表面脏污，吸干水分；用无菌剪刀剪取根，按照75％乙醇浸泡30s——无菌水冲洗3次——0.3％次氯酸钠浸泡6min——无菌水冲洗5次的步骤对水稻根进行表面消毒；置于无菌研钵中加入一定量灭菌水研磨至匀浆。
(2)分离纯化：将上述匀浆以10-3、10-4、10-5倍数进行稀释，分别取100μL稀释液涂布于LB平板上，30℃倒置培养3-4天，挑取单菌落，进行3次划线纯化。
(3)镉抗性菌株筛选：含镉的LB固体培养基配方如下：每升含10.0g蛋白胨，5.0g酵母粉，10.0g NaCl，20.0g琼脂粉，pH 7.0；加入氯化镉母液，使镉终浓度为50mg/L、100mg/L、150mg/L。将纯化获得的单菌落于含镉的LB平板上划线，挑取抗镉能力高于150mg/L的单菌落，获得两株目标菌株，分别命名为内生菌RE 35和内生菌RE 15，本申请针对内生菌RE35做详细阐述。
实施例2
内生菌RE 35的分类鉴定
采用16S rRNA基因序列分析方法对菌株RE 35进行分类鉴定，具体步骤如下：
(1)细菌总DNA的提取：采用宝日医生物技术有限公司(TaKaRa)MiniBEST细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株RE 35的基因组DNA。
(2)菌株RE 35 16S rRNA基因序列的扩增：采用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)/1492R(5’-CGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)，采用南京诺唯赞生物技术有限公司2×Taq Master Mix进行PCR预混样的制备，体系如下：2×Taq Master Mix25μL，F、R引物各1μL，模板DNA1μL，dd H2O补齐至50μL；反应循环参数：预变性95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，35循环；总延伸72℃10min。
(3)PCR产物的克隆测序分析：将菌株送至通用生物***(安徽)有限公司进行测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。将菌株16S rRNA基因序列于美国国立生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行核苷酸序列比对，得到与相关菌株的基因序列同源性的若干核苷酸序列，表明菌株RE 35的16S rRNA序列与芽孢杆菌属(Bacillus)的基因序列同源性在99％以上，分离菌株被鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。
(4)菌株RE 35的形态特征鉴定如下：
芽孢杆菌RE 35属于革兰氏阳性菌，菌落直径约为0.2-0.4cm，LB平板上菌落呈白色，圆形，边缘不整齐，表面干燥。菌株最适生长条件为：pH7.0，温度30℃。
实施例3
菌株RE 35的生长曲线及促生特性研究
(1)不同镉浓度下菌株生长曲线的测定：将氯化镉粉末溶解于去离子水中，配制成浓度为5000mg/L的氯化镉母液，取适量母液加入分装有LB培养基的三角瓶中，使Cd终浓度分别为0mg/L、5mg/L、10mg/L。随后进行高温高压灭菌。无菌条件下将甘油管中保存的RE35菌液于LB平板上划线后30℃培养至单菌落形成，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，于30℃，150rpm条件下培养20h，获取种子液，以5％的接种量转接入上述不同镉浓度的LB培养基中，每2h吸取发酵液测定600nm处吸光值。结果表明，菌株RE 35对数生长期约为2h-16h，镉的添加对菌株生长势无显著影响，但随着镉浓度增加，菌液中絮状物质显著增多，导致OD600产生一定波动。
(2)菌株产生长素(IAA)能力测定：将色氨酸配制成2.5mg/mL的溶液，过滤除菌，将1/5LB液体培养基分装于试管中，1/5LB培养基配方为：每升含2.0g蛋白胨，1.0g酵母粉，2.0g NaCl，pH7.0。高温高压灭菌后加入过滤除菌的色氨酸溶液，使培养基中色氨酸终浓度为0.5mg/mL。将菌株RE 35接种于上述试管中，30℃，150r/min培养3天。取发酵液于7mL离心管中，离心取上清液1mL，加入50μL10mM正磷酸，再加入2mL Sackowski’s显色剂，该显色剂配方为：2mL0.5M FeCl3·6H2O与98mL 35％高氯酸混合，充分混合后室温避光显色30min，于530nm波长条件下测定吸光值。以无菌1/5LB液体培养基代替发酵液同样反应作为空白对照，以浓度为0,10,20,50,100,200mg/L的IAA标准液按照上述方法制备标准曲线，计算发酵液中IAA浓度。结果显示，菌株RE 35产IAA能力较强，达114mg/L，具有较强的促生潜力。
(3)菌株产铁载体能力测定：
①铁载体产量测定：
配制CAS检测液，取10mmol/L十六烷基三甲基溴化铵溶液6.0mL加入100mL容量瓶并用双蒸水适度稀释；将1.5mL1mmol/L FeCl3溶液与7.5mL 2mmol/L铬天青溶液混合后转入上述容量瓶中；称取4.307g无水双二甲胺溶解于约30mL双蒸水中，再加入6.25mL 12mol/L的HCl，即得pH＝pKa＝5.6缓冲液，将此缓冲液转入上述容量瓶中，定容。测定铁载体所有器皿经5％硝酸浸泡24h。将供试菌株活化后接种于MKB液体培养基中，MKB培养基配方为：每升含酪蛋白氨基酸5.0g，甘油15.0mL，K2HPO4 2.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，pH7.0。30℃，150r/min培养48h，取发酵液于7mL离心管中，离心取1.5mL上清液，加入等量CAS检测液，混匀后避光反应1h，于630nm波长条件下测定吸光值(A)。以2-20μmoL/L的甲磺酸去铁胺(DFOM)制作标准曲线。结果显示，菌株RE 35产铁载体量为24.08μmoL/L，具有较强的促生潜力。
②铁载体活性测定：
配制CAS检测液，取10mmol/L十六烷基三甲基溴化铵溶液6.0mL加入100mL容量瓶并用双蒸水适度稀释；将1.5mL 1mmol/L FeCl3溶液与7.5mL 2mmol/L铬天青溶液混合后转入上述容量瓶中；称取4.307g无水双二甲胺溶解于约30mL双蒸水中，再加入6.25mL 12mol/L的HCl，即得pH＝pKa＝5.6缓冲液，将此缓冲液转入上述容量瓶中，定容。测定铁载体所有器皿经5％硝酸浸泡24h。将供试菌株活化后接种于MKB液体培养基中，MKB培养基配方为：每升含酪蛋白氨基酸5.0g，甘油15.0mL，K2HPO4 2.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，pH7.0。30℃，150r/min培养48h，取发酵液于7mL离心管中，离心取1.5mL上清液，加入等量CAS检测液，混匀后避光反应1h，于630nm波长条件下测定吸光值(A)。另取1.5mL未接菌的MKB液体培养基与等量CAS检测液混合反应，同法测定吸光值，即为参比值(Ar)。铁载体含量测定根据公式：铁载体活性单位(％)＝(Ar-A)/Ar×100％计算铁载体产量。结果显示，菌株RE 35铁载体活性达66.93％，具有较强的促生潜力。
实施例4
菌株RE 35对不同浓度镉的吸附能力分析
(1)液体吸附试验：将氯化镉粉末溶解于去离子水中，配制成浓度为5000mg/L的氯化镉母液，取适量母液加入分装有上述LB培养基的三角瓶中，使Cd终浓度分别为1mg/L、5mg/L、10mg/L。随后进行高温高压灭菌。无菌条件下将甘油管中保存的RE 35菌液于LB平板上划线后30℃培养至单菌落形成，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，于30℃，150rpm条件下培养至菌株对数生长末期，获取种子液，以5％的接种量转接入上述不同镉浓度的LB培养基中，置于30℃，150rpm条件下振荡培养7天。
(2)镉胁迫下菌株生长状况及pH变化：分别于0,1,2,3,5,7天，每个三角瓶分别取3mL发酵液加入7mL离心管中待测。取300μL发酵液加入96孔板中，采用酶标仪测定发酵液OD600处吸光值；其余溶液采用pH计测定发酵液pH。由图4可知，菌株接种后发酵液pH呈碱性，pH最高达9.3。
(3)菌株对镉的吸附量测定：分别于0,1,2,3,5,7天取8mL发酵液于离心管中，离心取上清液，酸化后采用ICP-OES分析溶液中镉浓度，计算菌体吸附率，计算公式如下：
吸附率＝(Ci-Cf)/Ci×100％
式中，Ci为对照样品上清液中镉浓度，mg/L；
Cf为接种菌株RE 35样品上清液中镉浓度，mg/L。
由图5可见，培养7天后，菌株RE 35对1mg/L、5mg/L、10mg/L的镉吸附率分别达80.6％、63.8％、46.0％，说明该内生菌对镉存在较稳定的吸附效果。
实施例5
菌株RE35对水稻种子萌发的影响
以常农粳为材料，选取饱满的种子用5％NaClO浸泡10min消毒，用蒸馏水冲洗3～5次，在30℃培养箱中暗处催芽12h。菌剂处理组：将催芽12h的水稻种子转移至菌株RE 35的菌液(108CFU/mL)中暗处浸种12h；不接菌对照组：将催芽12h的种子继续在30℃培养箱中暗处放置12h。随后将种子转移至铺有双层滤纸、直径9cm的培养皿中，每皿100粒，培养皿中加入10mL不同浓度的CdCl2溶液(浓度分别为0、1、5、10mg/L)，随机排列，重复三次。将上述培养皿置于光照培养箱中培养置于光照14h黑暗10h，光强3000lx，温度28℃/20℃，湿度70％的光照培养箱中培养7d。培养结束后记录种子萌发数，并随机选择10个种子，记录根长，计算发芽率、活力指数及耐性指数，计算公式如下：
发芽率(G)＝(发芽种子数/供试种子数)×100％
活力指数(VI)＝S×(Gt/Dt)
耐性系数(TI)＝RLm/RLc
式中，Gt为的发芽数，Dt为发芽日数，S为幼苗总根长；
RLm为各处理中根系的长度，RLc为不接菌不添加镉的对照的根系长度。
实验结果如表1所示：
表1菌株RE35对水稻种子萌发的影响
注：图中*表示接菌与不接菌对照有显著性差异(P<0.05),**表示表示接菌与不接菌对照有极显著差异(P<0.01)。
由表2可见，培养7天后，在5mg/L及10mg/L条件下，菌株RE 35的接种能够显著增加水稻种子的活力指数及耐性指数，其中10mg/L条件下对水稻种子活力指数的增加达极显著(P<0.01)水平。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一株水稻内生菌及其应用
<130> xb21120105
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1620
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌RE 35(Bacillus sp. RE 35)
<400> 1
gcgagttacg acggcagtgc agcttgcatg cctgcaggtc gacgattggt taccttgtta 60
cgacttcacc ccaatcatct gtcccacctt aggcggctgg ctccaaaaag gttaccccac 120
cgacttcggg tgttacaaac tctcgtggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac 180
gtattcaccg cggcatgctg atccgcgatt actagcgatt ccagcttcat gtaggcgagt 240
tgcagcctac aatccgaact gagaacggtt ttatgagatt agctccacct cgcggtcttg 300
cagctctttg taccgtccat tgtagcacgt gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga 360
tttgacgtca tccccacctt cctccggttt gtcaccggca gtcaccttag agtgcccaac 420
ttaatgatgg caactaagat caagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca 480
cgacacgagc tgacgacaac catgcaccac ctgtcactct gctcccgaag gagaagccct 540
atctctaggg ttttcagagg atgtcaagac ctggtaaggt tcttcgcgtt gcttcgaatt 600
aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcc cccgtcaatt cctttgagtt tcagccttgc 660
ggccgtactc cccaggcgga gtgcttaatg cgttaacttc agcactaaag ggcggaaacc 720
ctctaacact tagcactcat cgtttacggc gtggactacc agggtatcta atcctgtttg 780
ctccccacgc tttcgcgcct cagtgtcagt tacagaccag aaagtcgcct tcgccactgg 840
tgttcctcca tatctctacg catttcaccg ctacacatgg aattccactt tcctcttctg 900
cactcaagtc tcccagtttc caatgaccct ccacggttga gccgtgggct ttcacatcag 960
acttaagaaa ccacctgcgc gcgctttacg cccaataatt ccggataacg cttgccacct 1020
acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt agccgtggct ttctggttag gtaccgtcaa 1080
ggtgccagct tattcaacta gcacttgttc ttccctaaca acagagtttt acgacccgaa 1140
agccttcatc actcacgcgg cgttgctccg tcagactttc gtccattgcg gaagattccc 1200
tactgctgcc tcccgtagga gtctgggccg tgtctcagtc ccagtgtggc cgatcaccct 1260
ctcaggtcgg ctacgcatcg ttgccttggt gagccgttac ctcaccaact agctaatgcg 1320
acgcgggtcc atccataagt gacagccgaa gccgcctttc aatttcgaac cacgtggttc 1380
aaaatgttat ccggtattag ccccggtttc ccggagttat cccagtctta tgggcaggtt 1440
acccacgtgt tactcacccg tccgccgcta acttcataag agcaagctct taatccattc 1500
gctcgacttg catgtattag gcacgccgcc agcgttcatc ctgagccagg atcaaactct 1560
aatctctaag aaggatcccc gggtaccgaa gctcgaaatc cgactgcagt tgcaagtcgt 1620
Claims (10)
1.一株水稻内生菌，其特征在于，分类命名为芽孢杆菌（Bacillus sp.）RE 35，保藏号为：CCTCC NO：M 20211333。
2. 根据权利要求1所述的水稻内生菌，其特征在于，其16S rRNA序列如SEQ ID NO：1所示。
3.权利要求1~2任一项所述水稻内生菌的培养方法，其特征在于，将所述水稻内生菌接种至培养基，在28~30℃条件下培养。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述水稻内生菌在30℃条件下培养。
5.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述水稻内生菌在pH=6.5~7.5条件下培养。
6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述水稻内生菌在pH=7.0条件下培养。
7. 根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述培养基为LB培养基，其成分为：10.0 g/L蛋白胨，5.0 g/L酵母粉，10.0 g/L NaCl，其余为水。
8.权利要求1~2任一项所述水稻内生菌在产生长素（IAA）中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，对所述水稻内生菌进行发酵培养，生产IAA。
10.权利要求1~2任一项所述水稻内生菌在水稻耐镉促生中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111452900.6A CN114107117B (zh) | 2021-12-01 | 2021-12-01 | 一株水稻内生菌及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111452900.6A CN114107117B (zh) | 2021-12-01 | 2021-12-01 | 一株水稻内生菌及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114107117A CN114107117A (zh) | 2022-03-01 |
| CN114107117B true CN114107117B (zh) | 2024-02-23 |
Family
ID=80369447
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111452900.6A Active CN114107117B (zh) | 2021-12-01 | 2021-12-01 | 一株水稻内生菌及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114107117B (zh) |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102391973A (zh) * | 2011-11-24 | 2012-03-28 | 南京农业大学 | 一种耐重金属的植物内生细菌及其应用 |
| CN104371956A (zh) * | 2014-11-14 | 2015-02-25 | 四川省兰月科技有限公司 | 对镉具有阻隔效应的芽孢杆菌及用途 |
| CN105191715A (zh) * | 2015-08-12 | 2015-12-30 | 中国科学院武汉植物园 | 利用耐镉微生物降低镉污染稻田中水稻籽粒镉含量的方法 |
| CN105925507A (zh) * | 2016-06-02 | 2016-09-07 | 华南农业大学 | 具有重金属钝化和促进植物生长功能的蜡样芽孢杆菌及应用 |
| CN106754373A (zh) * | 2017-02-08 | 2017-05-31 | 浙江农林大学 | 耐镉产铁载体菌株的分离方法及应用 |
| CN107488618A (zh) * | 2017-09-30 | 2017-12-19 | 南京农业大学 | 巨大芽孢杆菌h3及其在促进作物生长和减少作物吸收重金属的应用 |
| CN110904001A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-03-24 | 中国科学院东北地理与农业生态研究所 | 一株耐盐碱解磷的野生稻根际细菌及其应用 |
| CN111004760A (zh) * | 2020-01-07 | 2020-04-14 | 山东农业大学 | 一株苏云金芽孢杆菌及其应用 |
| CN111235078A (zh) * | 2020-04-29 | 2020-06-05 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 水稻内生芽孢杆菌及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101569737B1 (ko) * | 2014-05-28 | 2015-11-18 | (주) 제일그린산업 | 벼 근권에서 분리된 신규 식물 내생세균 바실러스 오리지콜라 및 이를 이용한 천연식물 보호 및 식물 강화제 개발 |
-
2021
- 2021-12-01 CN CN202111452900.6A patent/CN114107117B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102391973A (zh) * | 2011-11-24 | 2012-03-28 | 南京农业大学 | 一种耐重金属的植物内生细菌及其应用 |
| CN104371956A (zh) * | 2014-11-14 | 2015-02-25 | 四川省兰月科技有限公司 | 对镉具有阻隔效应的芽孢杆菌及用途 |
| CN105191715A (zh) * | 2015-08-12 | 2015-12-30 | 中国科学院武汉植物园 | 利用耐镉微生物降低镉污染稻田中水稻籽粒镉含量的方法 |
| CN105925507A (zh) * | 2016-06-02 | 2016-09-07 | 华南农业大学 | 具有重金属钝化和促进植物生长功能的蜡样芽孢杆菌及应用 |
| CN106754373A (zh) * | 2017-02-08 | 2017-05-31 | 浙江农林大学 | 耐镉产铁载体菌株的分离方法及应用 |
| CN107488618A (zh) * | 2017-09-30 | 2017-12-19 | 南京农业大学 | 巨大芽孢杆菌h3及其在促进作物生长和减少作物吸收重金属的应用 |
| CN110904001A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-03-24 | 中国科学院东北地理与农业生态研究所 | 一株耐盐碱解磷的野生稻根际细菌及其应用 |
| CN111004760A (zh) * | 2020-01-07 | 2020-04-14 | 山东农业大学 | 一株苏云金芽孢杆菌及其应用 |
| CN111235078A (zh) * | 2020-04-29 | 2020-06-05 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 水稻内生芽孢杆菌及其应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Bioaccumulation of cadmium by Enterobacter sp. and enhancement of rice seedling growth under cadmium stress;Soumik Mitra等;Ecotoxicology and Environmental Safety;20180320;第156卷;第183-196页 * |
| Cadmium-resistant rhizobacterium Bacillus cereus M4 promotes the growth and reduces cadmium accumulation in rice (Oryza sativa L.);Changrong Wang等;Environmental Toxicology and Pharmacology;20190919;第72卷;第1-11页 * |
| 分泌吲哚乙酸的蒌蒿内生耐镉细菌的筛选与鉴定;周小梅;赵运林;胥正钢;董萌;库文珍;;生态环境学报;20141218;第23卷(第12期);第1980-1985页 * |
| 水稻根际促生菌的筛选鉴定及促生能力分析;刘泽平等;农业资源与环境学报;20180310;第35卷(第02期);第119-125页 * |
| 苏云金芽胞杆菌对镉胁迫下水稻种苗生长发育的影响;饶文华等;农业生物技术学报;20151125;第23卷(第11期);第1458-1464页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114107117A (zh) | 2022-03-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110616164A (zh) | 一种可活化难溶性磷、镉的阴沟肠杆菌y16及其应用 | |
| CN108070541B (zh) | 一种促进植物生长的枯草芽孢杆菌sicau-pv1及其应用 | |
| CN116144529B (zh) | 一株水稻科萨克氏菌oor3-1菌株及其应用 | |
| CN114875016B (zh) | 一种适合荧光假单胞菌的制剂化载体及其菌剂 | |
| Rathaur et al. | Isolation and characterization of nickel and cadmium tolerant plant growth promoting rhizobacteria from rhizosphere of Withania somnifera | |
| CN116254192B (zh) | 一株产铁载体的水稻太平洋芽孢杆菌菌株及其应用 | |
| CN115029276B (zh) | 一株烟草青枯菌耐酸性拮抗菌及其应用 | |
| CN114196591B (zh) | 一种对重金属镉具有钝化作用的黄质中华单胞菌菌株ky592及其应用 | |
| CN113699059B (zh) | 一株耐镉促生类芽孢杆菌菌株及其应用 | |
| CN113755389B (zh) | 一种贝莱斯芽孢杆菌及其应用 | |
| CN114107123B (zh) | 一株剑菌及其应用 | |
| CN116121147B (zh) | 一株土荆芥种子内生拉里摩尔土壤杆菌及其应用 | |
| Aung et al. | Isolation of endophytic bacteria from green gram and study on their plant growth promoting activities | |
| CN114107117B (zh) | 一株水稻内生菌及其应用 | |
| CN104805018B (zh) | 一株可同时降解多种邻苯二甲酸酯的壤霉菌(Agromyces sp．)MT‑E | |
| CN114934000B (zh) | 耐盐性解淀粉芽孢杆菌及其筛选与应用 | |
| CN115029277B (zh) | 一株耐酸抗青枯病的假蕈状芽孢杆菌 | |
| Afify et al. | Isolation and identification of dominant N2 fixing cyanobacterial strains from different locations | |
| CN115820496A (zh) | 一株耐镉的水稻内生草螺菌及其应用 | |
| CN106754496B (zh) | 一种铁载体高产菌制剂及其在污染土壤重金属修复方面的应用 | |
| CN111471608B (zh) | 一种吸附锰且对植物具有促生性能的菌株及其应用 | |
| Keshavarz-Tohid et al. | Phylogeny, phenotypic characteristics and pathogenicity of Sphingomonas sp. and Erwinia persicina as bacterial causal agents of lettuce diseases in southwest of Iran | |
| Vaidya et al. | Diverse novel bacterial endosymbionts and their plant growth promoting traits in association with banana plant | |
| CN115725465B (zh) | 一株增加水稻产量的菌株及其应用 | |
| CN116179431B (zh) | 一种花生根瘤菌株系hm13及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |