CN1067451A - 固定化细胞生产l-苹果酸 - Google Patents

Abstract

本发明为一种用固定化细胞以反丁烯二酸为原 料生产L-苹果酸的方法。将发酵得到的微生物细 胞用多孔珍珠岩粉吸附，再用聚乙烯醇包埋，低温固 化。本方法可减少细胞的漏失，固定化细胞的延胡索 酸酶回收率90％以上，产物对底物的转化率80％以 上，固定化细胞的机械强度好，弹性好。

Description

本发明为用固定化的微生物细胞生产L-苹果酸的方法，更具体的说本发明涉及将含延胡索酸酶的细胞固定化，通过该酶的作用将底物反丁烯二酸转化为L-苹果酸。

L-苹果酸广泛用于食品，医药等领域，在食品工业中用作酸味剂，可配制多种饮料和食品。因其有抑菌和辅助抗氧化作用，还可用作防腐剂。医药上可用于治疗肝功能不全。还可用作除垢剂，驱虫剂。此外可作为萤光增白剂的合成原料。全世界每年产量约3.5万吨，它是国际市场上的畅销货。

延胡索酸酶又称富马酸酶，存在于一些微生物，如酵母、细菌的细胞内，能催化反丁烯二酸转化为L-苹果酸：

已知一些用固定化微生物细胞将反丁烯二酸转化为L-苹果酸的方法。西德专利2450137公布了一种用固定化细胞生产L-苹果酸的方法，用聚丙烯酰胺凝胶包埋产延胡索酸酶的微生物细胞，在柱式反应器中连续转化反丁烯二酸盐为苹果酸盐。Yamamoto等报导用聚丙烯酰胺凝胶包埋产氨短杆菌（Brevibacterium  ammoniagenes）（Europ  J.App  l.Microbiol.3，169-183  1976）连续化生产L-苹果酸，I.Takata等（Enzyme  Microb.Technol.，Vol.2，30-36，1980）报导用卡拉胶包埋黄色短杆菌（B.flavum），连续生产L-苹果酸。杨廉婉等（微生物学报20（3）：296-302，1980）研究了比较用聚丙烯酰胺凝胶，琼脂凝胶和明胶三种胶包埋产延胡索酸酶的皱褶假丝酵母C₉₀，表明用聚丙烯酰胺凝胶包埋优于用琼脂凝胶或明胶，可用于连续化生产L-苹果酸。以上报导的这些固定方法都是用的单一载体，聚丙烯酰胺凝胶中的单体有毒、抑制酶活力，而用卡拉胶包埋细胞，长时间使用固定化细胞易破碎。这些方法存在固定化细胞的延胡索酸酶活力回收率不高，固定化细胞的机械强度不够理想等缺点。

本发明的目的在于提供一种用固定化细胞连续生产L-苹果酸的方法，提高固定化细胞的机械强度，减少细胞漏失，使延胡索酸酶的活力回收率明显提高（在本发明的实验条件下，延胡索酸酶的活力回收率90%以上），制备的固定化细胞机械强度好，弹性强，易于操作。

本发明的特征在于使用混合载体制备含延胡索酸酶的固定化细胞，先用多孔珍珠岩粉吸附细胞，再与聚乙烯醇凝胶混合包理，在低温下固化。

本发明所用的微生物细胞可以是产生胞内的延胡索酸酶的酵母、细菌等，在下述实验条件下，以皱褶假丝酵母（Candida  rugosa）Cr10为好。现以该菌株为例说明本发明的固定化细胞制备过程。

菌种保存在麦芽汁琼脂斜面上，按微生物学常规方法培养细胞，发酵养基为：0.3%NH₄Cl，0.05%KH₂PO₄，0.05%MgSO₄·7H₂O，0.05%酵母膏，6%重液体石蜡和3%CaCO₃，在旋转摇床上30℃培养96小时。然后在4℃，每分钟1万转离心10分钟，收集细胞，称重，加生理盐水制成细胞悬浮液。每毫升细胞悬浮液中含有0.5克湿细胞。

细胞悬浮液中加入多孔珍珠岩粉（一种无机保温材料），细胞悬浮液与多孔珍珠岩粉的比例为每2毫升悬浮液加入0.3-1.0克多孔珍珠岩粉，即湿细胞与多孔珍珠岩粉的比例为1：0.3-1.0，充份搅拌使充份吸附，将聚乙烯醇事先溶解，制成凝胶液，加入聚乙烯醇凝胶溶液，使聚乙烯醇在溶液中的最终浓度为10-18%（按重量计），细胞浓度为10%（按重量计），多孔珍珠岩粉为3-10%。上述混合物在-20--30℃放置18-24小时，即制成固定化细胞。将制得的固定化细胞切成边长2-3mm的小块，用生理盐水洗数次。用1M  pH8.5的反丁烯二酸铵于30℃浸泡固定化细胞24小时后，装在柱式反应器中，催化底物转化为L-苹果酸。

反丁烯二酸用氨水溶解，配成反丁烯二酸铵水溶液，流经柱式反应器。反丁烯二酸铵的浓度为1-1.5M，以1-1.25M为好，pH为8.5，以装有100毫升固定化细胞的反应器为例，流速以5-15毫升/小时为宜，在30℃条件下反应，流出液为转化的产物L-苹果酸铵溶液。溶液经酸化，沉淀出未反应的反丁烯二酸，回收再利用。将L-苹果酸铵溶液中加入氢氧化钙，转化为L-苹果酸钙二水盐，过滤烘干后加水做成悬浮液再加入硫酸溶液，形成硫酸钙沉淀，除去硫酸钙沉淀，得到L-苹果酸水溶液，再经过阳离子交换树脂柱和阴离子交换树脂柱，然后在60℃减压浓缩，最终得到L-苹果酸结晶。过滤掉母液（母液回收套用），即得到L-苹果酸结晶，在50℃烘干，得到白色结晶的L-苹果酸。

测定自然细胞和固定化细胞的延胡索酸酶的表现活力（测定方法按杨廉婉等：微生物学报20（3）：296-302，1980）。固定化细胞的延胡索酸酶活力回收率的计算方法为：固定化细胞的延胡索酸酶的表现活力/自然细胞的延胡索酸酶的表现活力×100%。

L-苹果酸的定量测定用Goodman等人（Anal.Chem.29：283，1957）的方法。

本发明用多孔珍珠岩粉吸附细胞，用聚乙烯醇包埋制备固定化细胞，方法简便易行，成本低，制得的固定化细胞机械强度好，弹性好。该方法可减少细胞的漏失，固定化细胞的延胡索酸酶的活力回收率高，达90%以上，固定化细胞的延胡索酸酶的活力可达12000微克分子/克·小时。用该固定化细胞连续生产L-苹果酸，转化率80%以上，无付产物。

实施例1

将皱褶假丝酵母Cr10按常规方法接种培养，培养液在4℃，1万转/分钟离心10分钟，收集细胞，用生理盐水悬浮，使每毫升菌悬液含0.5克湿细胞。测定自然细胞的延胡索酸酶的表现活力为13569.4微克分子/克·小时

将40毫升上述细胞悬浮液（含20克湿细胞）加入12克多孔珍珠岩粉，充份混合、吸附，再加入18%的聚乙烯醇132克（含聚乙烯醇约24克），加水至200克，搅拌，混合均匀后，置于-30℃，18小时固化，制备成固定化细胞，切成边长2-3mm小块，用生理盐水洗三次，抽滤干，测定制得的固定化细胞的延胡索酸酶的表现活力为12664.9微克分子/克·小时，延胡索酸酶的活力回收率为93.3%。

将固定化细胞在30℃条件下，用1M  pH8.5的反丁烯二酸铵水溶液浸泡24小时，过滤出固定化细胞，量取100毫升固定化细胞，装入5×30厘米的反应柱中，30℃反应，加入pH8.5的1.25M的反丁烯二酸铵水溶液，以不同的速度流经反应柱，分别收集流出的苹果酸铵溶液，测定底物转化为L-苹果酸的转化率。结果列于表1中。

表1  不同流速的反丁烯二酸铵转化为L-苹果酸的转化率

反丁烯二酸铵溶液流速  转化率

（毫升/小时）  （%）

6  85.5

12  83.1

21  73.5

42  67.5

54  56.0

从表中可以看出底物对产物的转化率在流速6毫升/小时达85.5%。

实施例2

按实施例1的方法制备皱褶假丝酵母Cr10的固定化细胞，细胞湿重、多孔珍珠岩粉、聚乙烯醇分别为10%，6%和12%。自然细胞的延胡索酸酶的表现活力为13269.2微克分子/克·小时。固定化细胞酶的表现活力为12061.7微克分子/克·小时。该酶活力的回收率为90.9%。

取100毫升上述制备的固定化细胞，装入5×30厘米的柱式反应器中，在30℃用1.25M  pH8.5的反丁烯二酸铵水溶液以每小时12毫升的流速流经反应柱，连续运转30天，分次取样测定转化率（每隔一天测一次）。底物转化为L-苹果酸的转化率为80-82%，平均81.4%.

取1升柱中流出液，加200毫升浓盐酸沉淀除去未转化的反丁烯二酸（可回收再利用），上清液加Ca（OH）₂，至pH6.8（用掉Ca（OH）₂85.5克），得到苹果酸钙二水盐，抽滤，50℃烘干，得190克L-苹果酸钙二水盐。加入1100毫升蒸馏水制成悬浮液，加入90毫升硫酸水溶液（3份98%的硫酸加入1份水配制），边加边搅拌，形成硫酸钙沉淀，过滤掉硫酸钙沉淀，滤液通过180毫升732阳离子交换树脂柱，再通过180毫升AmberliteIR-45阴离子交换树脂柱，得到L-苹果酸溶液，60℃减压浓缩（浓缩到L-苹果酸溶液的比重为1.37），自然降温到室温，结晶出L-苹果酸，50℃烘干，得到61.8克L-苹果酸结晶。母液回收得到20.8克L-苹果酸结晶，总收率70%，按杨廉婉等的方法（微生物学报20（3）：296-302，1980）对得到的L-苹果酸进行质量鉴定，结果列于表2。

表2  L-苹果酸的质量鉴定

含量（%） 熔点（℃） 比旋光度[α]²⁰ _D纸层析

（在5%水溶液中）  Rf值

99.6  100-105  -2.2  0.46

质量鉴定符合国外文献报导的标准。

Claims (6)

1、一种用固定化细胞生产L-苹果酸的方法，包括将反丁烯二酸经细胞内延胡索酸酶的催化作用转化成L-苹果酸，其特征在于使用多孔珍珠岩粉和聚乙烯醇混合载体制备含延胡索酸酶的固定化细胞。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征是先用多孔珍珠岩粉与细胞悬浮液混合，吸附，再与聚乙烯醇混合包埋，在低温下固化。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于细胞（按湿重算）、多孔珍珠岩粉、聚乙烯醇三者的用量分别为10%，3-10%和10-18%，固化温度为-20--30℃，固化时间为18-24小时。

4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于固定化微生物细胞可以为酵母、细菌，用发酵法制得。

5、根据权利要求3所述的方法，其特征在于所用的固定化细胞为皱褶假丝酵母Cr10，用发酵方法制得。

6、根据权利要求1-5任选一项所述的方法，将pH8.5的1.25M的反丁烯二酸铵水溶液流经固定化细胞填充的反应柱，得到苹果酸铵水溶液，经纯化、分离，得到L-苹果酸白色结晶。