CN1083532A - 酶法生产没食子酸的工艺 - Google Patents
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Abstract
酶法生产没食子酸的工艺,涉及用酶的方法制取
芳环化合物衍生物的技术,目的是提供一种提高产品
收率、降低原料单耗、合理利用资源的工艺。本发明
的工艺将发酵制酶与水解制酸分别在不同容器中相
对分开进行,同时分别控制两步反应的最适温度,pH
值、溶氧量等条件及反应时间,让两步反应均达到最
佳状态,使单宁全部水解。用本发明的工艺生产没食
子酸,产品得率高,原料消耗少,可改善生产环境,简
化流程,对原料的适应性广,可大幅度地提高经济效
益。
Description
本发明涉及使用酶的方法来制取芳环化合物衍生物的技术,具体而言,涉及酶法生产没食子酸的工艺。
没食子酸又名倍酸、五倍子酸(gallic acid),化学名称为3,4,5-三羟基苯甲酸(3,4,5-trihydroxy benzoic acid),分子式为(OH)3C6H2COOH·H2O,结构式为:
白色针状结晶,是一种用途广泛的精细化工产品。工业上常用五倍子(chinese nut galls)或塔拉(tara,刺云实)为原料,通过化学水解法或微生物发酵法制取没食子酸。其中,化学水解法是以强酸或强碱为催化剂,使五倍子单宁水解生成没食子酸。然后,经过过滤、浓缩、脱色、干燥等一系列化工过程制得产品。
使用硫酸水解法,由于浓硫酸具有强氧化性,在反应过程中会破坏单宁中的一部份苯环结构,而且有副反应;因此,水解转化率仅85%,总收率为69%,原料未充分利用,产品经济效益不高。
用碱水解法(CN1057255A)产品收率比酸水解法高,但须使用大量的碱作为催化剂,而后又用硫酸中和反应产物。用五倍子作原料的碱法工艺(U.S.Patent 2723992.1955),需使用大量有机溶剂进行萃取分离,再经过溶剂回收、脱色、干燥等过程得到产品。溶剂萃取法设备投资大,有机溶剂成本高,溶剂萃取及回收技术复杂,在国内不宜采用。
微生物发酵法(CN87103987)的原理是利用微生物在含单宁的水溶液中进行发酵,以单宁酸水解后的葡萄糖作为碳源,供微生物生长、繁殖,与此同时微生物在溶液中经诱导产生酶,单宁又经酶的催化水解作用生成没食子酸。这种方法的生产周期长,水解不完全,发酵结束后还有15%~20%单宁未水解转化。
本发明的目的是提供一种克服上述缺点的没食子酸生产工艺,用以提高产品收率,降低原料单耗,简化工艺流程,经济、合理地利用植物单宁资源。
长期的科研与生产实践早已证明:很多种霉菌在一定条件下与诱导物作用都能生成单宁酶(tannase),其中,以黑曲霉菌使用得最多、最成熟,已经有一百多年的应用历史。单宁酶又称单宁乙酰基水解酶(tannin acyl enzyme),属于孢外诱导酶(induced enzyme),是一种具有水解催化性能的生物催化剂。在适宜条件下,它能专一、高效、定向裂解单宁中的酯键、糖苷键和缩酚键水解生成没食子酸。
人们经过多年的生产实践和研究(Agr.Biol.Chem.,Vol.32.No.7,P.803~809,1968),发现生成单宁酶的最佳条件与酶水解单宁的最佳条件,包括温度、pH值、溶氧量、诱导物浓度、培养基成分等,大部份不相同。在一般发酵法生产工艺中,单宁酶的生成和水解单宁的反应,都是在同一个反应器(发酵罐)中进行。由于两个反应要求的最佳条件不同,在发酵过程中,总是顾此失彼、相互制约,两者都不能达到最佳反应状态。这就是导致单宁水解不完全的主要原因。
为解决发酵法工艺中的这一难题,发明人提出的解决方案是:将发酵制酶与水解制酸两个反应分别用两个容器相对地分开进行,使二者都达到最佳状态。这样,单宁水解转化率可达98%以上,已经接近或达到定量转化。必须说明,制酶和制酸二者既有区别,又有联系,相辅相成,各有所侧重,并不是绝对的划分。在制酶过程中,以生成大量含酶菌丝球为主,与此同时也培养出大量健壮黑曲霉孢子;在制酸过程中以水解单宁为主,同时又继续进行发酵,产生一部份酶,促使单宁完全水解,因此也同样需要供给足够的溶解氧。
在发酵制酶过程中,各项发酵参数及培养基的配比十分重要,必须严格控制。适宜温度为27~33℃,最适温度为30℃;起始pH值为5~6.5,反应过程中加碱调节在pH3~5之间,以pH3.5~4.5为最好;溶氧量控制在3.5~5.0gO2/L·h之间。采用黑曲霉No.316(aspergillus neiger No.316)作为产酶菌种。
制酶培养基中,C/N比为5~15,单宁浓度为1%~8%;单宁以外碳源加入量为单宁量的0.3~1倍。外加碳源包括蔗糖、葡萄糖、蜂糖等均可使用;外加氮源可以用任何无机铵盐或硝酸盐,如硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、硝酸钠、硝酸钾等均可使用。培养基中还应有少量的硫、磷、钾、钠、锌、镁的无机盐和酵母膏或维B族化合物作为营养添加剂。
用上述发酵条件和培养基配比制成的单宁酶溶液可用于水解制酸,制酸适宜温度为30~37℃,最适温度为34~35℃;在反应过程中加入氨水调节pH在4~7之间,以pH5.5~6.5为最好;溶氧量为3.5~5.0gO2/L·h。用五倍子为原料,单宁浓度为6%~10%(W/V);用塔拉粉为原料,加入量为12%~20%(W/V)。
使用本发明的酶法生产没食子酸的工艺有以下优点:(1)反应时间比发酵法短,产品得率高,原料单耗低。用含单宁不等的五倍子和塔拉分别作为原料,产品得率分别为原料的47%~52%和28%~33%,总收率可达到80%~90%。与酸水解法相比,用本发明的工艺每年生产1吨产品可节约0.3~0.4吨五倍子或0.6~0.9吨塔拉。(2)改善了生产环境。本发明的工艺反应条件缓和,无高温、高压操作,“三废”污染小,容易治理;酸、碱及活性炭的消耗量比化学水解法明显降低。(3)原料适应性广。既可使用五倍子或塔拉为原料;也可用单宁含量低和果胶质高的五倍子花(又称倍花)作为原料。(4)工艺流程简单。与现有生产方法比较,“水解”前省去浸提工段;“水解”后省去结晶和脱色操作各一次。
附图为本发明的工艺流程示意图。经过菌种种子预培养,然后转入经灭菌后的培养基溶液中发酵制酶,经测定酶活性合格后,即用于水解制酸。水解反应结束后,加硫酸或盐酸调节pH,经过过滤除去滤渣,然后将滤液浓缩,冷却后得到粗结晶。将粗晶分离,重新溶于水,加活性炭脱色,重结晶。然后再次分离,回收母液,最后经干燥和粉碎即可得到没食子酸产品。
以下实施例可以更清楚地说明本发明:
制酶实施例1 按以下成份配比配制培养基:
单宁 10~100g/L
蔗糖 14g/L
NH4Cl 3g/L
KH2PO41g/L
MgSO4·7H2O 0.5g/L
ZnSO4·7H2O 0.3g/L
酵母膏 0.5g/L
将配制好的培养基分装在几个500ml振荡烧瓶中,灭菌。为避免单宁高温水解,单宁在灭菌后加入,用5mol NaOH调节溶液起始pH值为5~6.5,接着立即接入黑曲霉菌No.316菌种,放置在THZ-82A恒温振荡器上反应。设定温度30℃,调节转速为130~140r/min,使反应液中溶解氧保持在3.5~5.0O2g/L·h用5mol NaOH调节数次,使反应液的pH值保持在3.5~4.5之间,连续反应40小时以上,直至测定酶的活性达到最大值为止,即用于制酸。
制酶实施例2 按以下成份比例配制培养基:
单宁 10~100g/L
葡萄糖 16g/L
NH4NO32.2g/L
KH2PO41g/L
MgSO4·7H2O 0.5g/L
ZnSO4·7H2O 0.3g/L
复合维B 10mg
将配制好的培养基分别装入振荡烧瓶中,灭菌后加入单宁。余下步骤按制酶实施例1进行。
制酸实施例1 将五倍子粉装入带有半自动加氨装置和外接酸度计、溶氧仪的特制反应瓶中,加入适量热水溶解,使溶液单宁浓度为8%(W/V)。冷却至室温后加入10%~20%(V/V)新制好的酶溶液。将反应瓶放在THZ-82A恒温振荡器上反应,设定温度34℃,转速调节在140~150r/min,使反应液溶氧量保持在4.5~5.0gO2/L·h。在反应过程中连续加入10mol氨水,保持溶液pH为5.5。连续反应35小时以上,直至单宁全部水解为止。反应产物用盐酸或硫酸调节至pH值1~2,经过粗结晶、脱色、重结晶后得到产品。原料含单宁64.8%,产品得率为原料的47.7%,纯度98%。
制酸实施例2 将塔拉粉装入反应瓶(与制酸实施例1相同),加入适量热水溶解,使溶液中原料量为15%(W/V),冷却后加入20%(V/V)新制好的酶溶液,放到恒温振荡器上反应。设定温度35℃,转速为140~150r/min,溶氧量4.5~5gO2/L·h。反应过程中连续加氨水使反应液pH值为6.0。反应时间40小时以上,直至单宁水解完全为止。反应产物经过同制酸实施例1的调pH、粗结晶、脱色、重结晶过程得到产品。原料含单宁41.13%,产品得率为原料的27%,纯度为98.5%。
Claims (5)
1、用微生物在特定培养基中制得单宁酶,使五倍子或塔拉中的单宁水解,再经过滤、浓缩、结晶、脱色、干燥而制得没食子酸的工艺,本发明提供的酶法生产没食子酸工艺的特征在于:将发酵制酶与水解制酸两步反应分别用两个容器分开进行。
2、按照权利要求1所述的工艺,其特征在于发酵制酶过程中,控制的温度为27~33℃,以30℃为最适宜;起始pH值控制为5~6.5,然后加碱调至pH3~5,以3.5~4.5为最好;溶氧量控制在3.5~5.0gO2/L·h之间。
3、按照权利要求1和2所述的工艺,其特征在于所用的菌种为黑曲霉菌No.316。
4、按照权利要求1和2所述的工艺,其特征在于所用的培养基中,C/N比值为5~15,单宁浓度为1%~8%,单宁以外的碳源加入量为单宁量的0.3~1倍。
5、按照权利要求1所述的工艺,其特征在于水解制酸中,反应温度控制在30~37℃,以34~35℃为最好;pH值用氨水调至4~7,以5.5~6.5最好,溶氧量为3.5~5.0g/L·h。水解时五倍子单宁浓度为6%~10%(W/V);塔拉粉用量为12%~20%(W/V)。
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