CN106635850A - 一种海洋动物匀浆液脱重金属方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种海洋动物匀浆液脱重金属方法，首先对酵母菌进行扩大培养，制备固定化酵母凝胶球，以及制备海洋动物匀浆液，酸解海洋动物匀浆液并进行分离得到上清液和底部沉淀，最后利用酵母凝胶球脱除底部沉淀中的重金属，和利用游离酵母菌吸附上清液中的重金属。本发明针对海洋生物的匀浆液，独创性的提出了将匀浆液离心分为上清和沉淀两部分处理，上清液使用酵母菌泥进行脱重金属处理，沉淀利用固定化酵母凝胶球进行脱除，与全部匀浆液相比能够显著提高重金属的脱除率。本发明将微生物进行固定化处理，既可发挥微生物对重金属的吸附性能又能更好的实现微生物与食品物料的分离，便于工业化利用。
Description
技术领域
本发明涉及一种海洋动物匀浆液脱重金属方法，属于食品生物技术领域。
背景技术
随着工业的发展和人类活动的增加，大气、水、土壤等环境中的重金属污染日趋严重，其中水环境中重金属污染问题十分突出。水环境中的重金属污染使得水生生态***遭到不同程度的破坏，鱼、虾、贝类在内的诸多水生生物对其生长环境中的重金属具有较高的富集作用，导致水产品中重金属污染事件时有发生，重金属污染已成为影响水产品安全性的重要因素之一。重金属在环境中无法降解，而且能够在生物体内积累，并通过食物链不断富集与传递，最后进入人体。重金属是对人类危害最大的污染物之一，其毒理作用主要表现为引起机体的急慢性损伤、造成生殖障碍、阻碍胚胎正常发育等。
目前从水产品中脱除重金属的方法主要有活体暂养净化、壳聚糖法、螯合树脂法、络合法、吸附法等，这些方法有些存在着成本高、能耗大、操作过程繁琐，有些易造成二次污染等缺点，尤其是当重金属离子浓度略超标时，往往由于操作费用过高而难以进行推广应用。
利用微生物的吸附与吸收作用脱除重金属的方法叫做微生物法，研究表明一些可食用的酵母菌、细菌、霉菌等也有较好的重金属脱除效果。微生物法脱重金属具有来源丰富、成本低、安全无毒、处理效率高，适合在复杂食品物料中应用等优点。但是，微生物法也存在脱除剂与脱除料液难以分离的难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种海洋动物匀浆液脱重金属方法，安全无毒，有效脱除海洋动物匀浆液中的重金属，且能够实现工业化推广应用，以弥补现有技术的不足。
本发明具体利用微生物的吸附与吸收功能将重金属离子从动物源食品物料中脱除，并将微生物进行固定化凝胶处理，且在脱除重金属后能够与匀浆液快速有效分离。
为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案是：
一种海洋动物匀浆液脱重金属方法，首先对酵母菌进行扩大培养，制备固定化酵母凝胶球，以及制备海洋动物匀浆液，酸解海洋动物匀浆液并进行分离得到上清液和底部沉淀，最后利用酵母凝胶球脱除底部沉淀中的重金属，和利用游离酵母菌吸附上清液中的重金属。
进一步的，所述酵母菌包括库德毕赤酵母、酿酒酵母、鲁氏酵母、啤酒酵母等的一种或多种混合。
进一步的，上述酵母菌进行扩大培养过程中对酵母菌进行渗透压胁迫处理。
进一步的，所述的渗透压胁迫条件包括氯化钠胁迫或/和糖胁迫。
进一步的，所述糖胁迫优选为蔗糖胁迫。
进一步的，所述酸解过程中的酸溶液包括盐酸、磷酸、乳酸等一种或多种混合。
微生物中存在胁迫条件间的交叉保护现象，即一种胁迫条件能够帮助微生物抵御其他胁迫条件的危害。真核微生物中，生长环境中的胁迫条件可诱导细胞产生对其他不同胁迫条件的交叉保护。对真核微生物进行渗透压胁迫可提高其对镉、锌等重金属的抗性。
所述的脱重金属方法具体实施步骤包括：
1)酵母菌活化及酵母泥的制备
酵母菌首先进行固体活化，即将酵母菌接种于固体斜面培养基中，恒温培养箱中培养；随后进行液体活化，将斜面活化的酵母菌接种于液体培养基中，振荡培养；再取一定体积液体活化的酵母菌悬液加入含氯化钠和/或糖的液体培养基中，振荡培养；培养结束后，将发酵液离心、絮凝或者膜过滤，清洗后得到酵母菌泥；
2)固定化酵母凝胶球的制备
取海藻酸钠溶入水溶液中，超声脱气处理，制备海藻酸钠溶液；将步骤1)制备的酵母菌泥与海藻酸钠混合均匀后，采用造粒技术制备固定化酵母凝胶球，凝胶介质优选为氯化钙溶液，静置、无菌水或者无菌氯化钠溶液或者氯化钙清洗，得到固定化酵母凝胶球备用；
3)海洋动物匀浆液的酸解处理
将海洋动物按常规方法预处理后匀浆，得到海洋动物匀浆液；加入pH0.5～pH6的酸溶液搅拌或者振荡，海洋动物匀浆液与酸溶液的质量体积(g/ml)比为1:1～1:20，反应结束后，再静置，然后离心或膜过滤，分别收集上清液和底部沉淀；
4)海洋动物匀浆液上清液中重金属的脱除
将步骤1)获得的酵母菌泥加入步骤3)制备的海洋动物匀浆液上清液中，调节上清液的pH为2～10，10～35℃、振荡或者搅拌5～240min，离心或者絮凝或者膜过滤除去酵母菌，得到脱除重金属后的上清液；
5)海洋动物匀浆液底部沉淀中重金属的脱除
将步骤2)制备的固定化酵母凝胶球加入到步骤3)得到的海洋动物匀浆液底部沉淀中，加水搅拌，调节pH为2～10，10～35℃、振荡培养0.2～8h，收集固定化酵母凝胶球并清洗，采用等电点法或絮凝法回收脱除液和凝胶球清洗液中的蛋白等营养物质。
进一步的，所述步骤1)中清洗酵母菌泥选用无菌水或者无菌氯化钠溶液。
进一步的，所述步骤1)中氯化钠的浓度为0.1wt％～40wt％，糖浓度为0.1wt％～50wt％；氯化钠的浓度优选为8wt％。
进一步的，所述步骤2)中海藻酸钠的浓度为0.5wt％～5wt％，氯化钙浓度为0.1wt％～6wt％。
进一步的，所述步骤3)中酸溶液优选为盐酸，其pH优选为3。
进一步的，所述步骤4)和步骤5)中进行脱除的pH优选为8。
本发明的优点是：本发明针对海洋生物的匀浆液呈酱状流动性差的特点，独创性的提出了将匀浆液处理后进行离心，分为上清和沉淀两部分处理，上清液使用酵母菌泥进行脱重金属处理，沉淀利用固定化酵母凝胶球进行脱除。该方法既能够有效脱除重金属，又能够便于过滤脱除和重复利用，适用于对于酱状流动性差食品物料中重金属的脱除，并且分上清液和底部沉淀两部分各自进行脱除的效果比完整匀浆液的脱除效果要更好，脱除结束后，干物质得率较高，较大程度地避免了营养物质的损失。
另外，本发明将匀浆液进行酸解并且在酸性条件下浸提重金属，操作简单成本低，脱除率高；本发明在酵母菌培养过程中进行胁迫处理，能够显著增强酵母菌的重金属脱除效率。酵母是从特定食品中分离出来，安全无毒，是一株抗盐、抗酸、抗渗透压、抗高温等多抗性酵母，同时具有多种重金属吸附能力，能在复杂的食品物料中吸附重金属离子；而本发明选取库德毕赤酵母，其对于重金属的良好脱除效果属于本发明首次发现。本发明使用的海藻酸钠和氯化钙均为食品级，安全无毒，可确保食品安全性。本发明将微生物进行固定化处理，既可发挥微生物对重金属的吸附性能又能更好的实现微生物与食品物料的分离，便于工业化利用。本发明具有操作简单、安全无毒、成本低并有利于工业化应用等特点。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图；
图2为本发明制得的固定化酵母凝胶球示意图；
图3为海洋动物匀浆液酸解过程中盐酸浓度对匀浆液重金属脱除效果图；
图4为库德毕赤酵母氯化钠浓度和pH对匀浆液重金属脱除效果图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步详细描述。
实施例1
牡蛎匀浆液中脱重金属方法，具体步骤如下：
1)库德毕赤酵母的培养及酵母菌泥的制备
斜面活化：将4℃保藏的菌株接种到YPD斜面培养基，28℃恒温培养箱中培养24h；
液体培养基活化：接种环刮取斜面活化后的菌体少量接种到YPD液体培养基中，恒温振荡培养箱中28℃、180r/min培养24h，为种子液；
氯化钠胁迫培养：取活化好的酵母菌种子液1ml，接种到含8％氯化钠的YPD液体培养基中28℃、180r/min培养20h。
收集菌泥：氯化钠胁迫培养20h后，使用血球计数板定量。取一定体积的酵母菌悬液离心，弃上清液，用无菌水清洗两次，得到菌泥备用。
2)酸解牡蛎匀浆液
新鲜牡蛎去壳，匀浆5min，得到牡蛎匀浆液。将牡蛎匀浆液与pH3的盐酸溶液按质量与体积1:5的料液比混合，25℃下振荡或者超声波处理1h。静置或者离心，分别收集上清液与底部沉淀。取上清液进行湿法消解，用ICP-MS测镉含量。
3)脱上清液中的镉
取酸解牡蛎匀浆液并离心后得到的上清液，调整上清液的pH不超过8，按1.3*108个/ml的添加量加入酵母菌泥。28℃、180r/min处理2h。吸附结束后离心，取上清液和底物沉淀进行湿法消解，用ICP-MS测镉含量。
取一定质量的牡蛎匀浆液进行湿法消解，用ICP-MS测镉含量，从而算出脱除率。
牡蛎匀浆液经酸解离心后，底物沉淀中镉含量达到标准要求，此时只需继续用酵母菌泥脱上清液中的镉，脱除率为53.05％，脱除后镉浓度为1.039mg/kg，符合标准要求。
结果如下表1所示：
表1牡蛎匀浆液经过酸解-酵母吸附脱除镉前后对比
| 项目 | 脱除前 | 脱除后 | 脱除率 |
| 镉(mg/kg) | 2.213 | 1.039 | 53.05％ |
实施例2
海参肠匀浆液中脱重金属的方法，具体步骤如下(如图1所示)：
1)库德毕赤酵母的培养及酵母菌泥的制备
斜面活化：将4℃保藏的菌株接种到YPD斜面培养基，28℃恒温培养箱中培养24h；
液体培养基活化：接种环刮取斜面活化后的菌体少量接种到YPD液体培养基中，恒温振荡培养箱中28℃、180r/min培养24h，为种子液；
氯化钠胁迫培养：取活化好的酵母菌种子液1ml，接种到含8％氯化钠的YPD液体培养基中28℃、180r/min培养20h。
收集菌泥：氯化钠胁迫培养20h后，使用血球计数板定量。取一定体积的酵母菌悬液离心，弃上清液，用无菌水清洗两次，得到菌泥备用。
2)固定化酵母凝胶球的制备
将步骤1)得到的酵母菌泥与4％海藻酸钠溶液混合均匀，滴加到1％氯化钙溶液中，酵母菌悬液与海藻酸钠的体积比为4:1。静置20min固定后，无菌水清洗2～3遍，得到固定化酵母凝胶球，如图2所示。
3)酸解海参肠匀浆液
海参肠去沙洗净，匀浆5min，得到海参肠匀浆液。将海参肠匀浆液与pH3的盐酸溶液按质量与体积1:5的料液比混合，25℃下振荡处理20min。离心，分别收集上清液与底部沉淀。取上清液和底部沉淀进行湿法消解，用ICP-MS测重金属含量。
4)脱上清液中的重金属
取酸解海参肠匀浆液并离心后得到的上清液，调整上清液的pH不超过8，按2.5*108个/ml的添加量加入酵母菌泥。28℃、180r/min振荡处理30min。吸附结束后离心，取上清液进行湿法消解，用ICP-MS测重金属含量。若上清液重金属含量不达标，则继续上述步骤直至达标。若底部沉淀中重金属超标，则进入下一步骤。
5)底部沉淀中重金属的脱除
取酸解海参肠匀浆液并离心后得到的底部沉淀，加入适量超纯水并调节pH不超过8，加入步骤2)制备的固定化酵母凝胶球，每1g底物沉淀中加入15ml酵母菌悬液制成的固定化酵母凝胶球。28℃、180r/min吸附2h。吸附结束后，采用过滤的方法将固定化酵母凝胶球与物料分离，并对其进行湿法消解，用ICP-MS测重金属含量。
取一定质量的海参肠匀浆液进行湿法消解，用ICP-MS测重金属含量，从而算出脱除率。
海参肠中砷的脱除率为61.93％，镉的脱除率为52.63％，营养物质回收率为89％，极大避免了营养物质的损失。
结果如下表2所示：
表2海参肠匀浆液经过酸解-酵母吸附脱除重金属前后对比
实施例3
海参卵匀浆液中脱重金属的方法，具体步骤如下：
1)库德毕赤酵母的培养及酵母菌泥的制备
斜面活化：将4℃保藏的菌株接种到YPD斜面培养基，28℃恒温培养箱中培养24h；
液体培养基活化：接种环刮取斜面活化后的菌体少量接种到YPD液体培养基中，恒温振荡培养箱中28℃、180r/min培养24h，为种子液；
氯化钠胁迫培养：取活化好的酵母菌种子液1ml，接种到含8％氯化钠的YPD液体培养基中28℃、180r/min培养20h。
收集菌泥：氯化钠胁迫培养20h后，使用血球计数板定量。取一定体积的酵母菌悬液离心，弃上清液，用无菌水清洗两次，得到菌泥备用。
2)固定化酵母凝胶球的制备
将步骤1)得到的酵母菌泥与2％海藻酸钠溶液混合均匀，滴加到3％氯化钙溶液中，酵母菌悬液与海藻酸钠的体积比为4:1。静置20min固定后，无菌水清洗2～3遍，得到固定化酵母凝胶球。
3)酸解海参卵匀浆液
海参卵去沙洗净，匀浆5min，得到海参卵匀浆液。海参卵匀浆液与pH3的盐酸溶液按质量与体积1:5的料液比混合，25℃下振荡处理20min。离心，分别收集上清液与底部沉淀。取上清液和底部沉淀进行湿法消解，用ICP-MS测重金属含量。
4)脱上清液中的重金属
取酸解海参卵匀浆液并离心后得到的上清液，调整上清液的pH不超过8，按2.5*108个/ml的添加量加入酵母菌泥。28℃、180r/min振荡处理30min。吸附结束后离心，取上清液进行湿法消解，用ICP-MS测重金属含量。
5)底部沉淀中重金属的脱除
取酸解海参卵匀浆液并离心后得到的底部沉淀，加入适量超纯水并调节pH不超过8，加入步骤2)制备的固定化酵母凝胶球，每1g底物沉淀中加入15ml酵母菌悬液制成的固定化酵母凝胶球。28℃、180r/min吸附2h。吸附结束后，采用过滤的方法将固定化酵母凝胶球与物料分离，并对其进行湿法消解，用ICP-MS测重金属含量。
取一定质量的海参卵匀浆液进行湿法消解，用ICP-MS测重金属含量，从而算出脱除率。
结果如下表3所示：
表3海参卵匀浆液经过酸解-酵母吸附脱除重金属前后对比
| 项目 | 脱除前 | 脱除后 | 脱除率 |
| 砷(mg/kg) | 2.727 | 0.678 | 75.14％ |
对比例1：
海参卵匀浆液中脱重金属的方法，具体步骤如下：
1)库德毕赤酵母的培养及酵母菌泥的制备
斜面活化：将4℃保藏的菌株接种到YPD斜面培养基，28℃恒温培养箱中培养24h；
液体培养基活化：接种环刮取斜面活化后的菌体少量接种到YPD液体培养基中，恒温振荡培养箱中28℃、180r/min培养24h，为种子液；
氯化钠胁迫培养：取活化好的酵母菌种子液1ml，接种到含8％氯化钠的YPD液体培养基中28℃、180r/min培养20h。
收集菌泥：氯化钠胁迫培养20h后，使用血球计数板定量。取一定体积的酵母菌悬液离心，弃上清液，用无菌水清洗两次，得到菌泥备用。
2)固定化酵母凝胶球的制备
将步骤1)得到的酵母菌泥与2％海藻酸钠溶液混合均匀，滴加到3％氯化钙溶液中，酵母菌悬液与海藻酸钠的体积比为4:1。静置20min固定后，无菌水清洗2～3遍，得到固定化酵母凝胶球。
3)酸解海参卵匀浆液
海参卵去沙洗净，匀浆5min，得到海参卵匀浆液。将海参卵匀浆液与pH3的盐酸溶液按质量与体积1:5的料液比混合，25℃下振荡处理20min。
4)脱酸解液中的重金属
取酸解得到的海参卵匀浆液，加入适量的超纯水并调整pH不超过8，加入步骤2)制备的固定化酵母凝胶球，每10g酸解液中加入15ml酵母菌悬液制成的固定化酵母凝胶球。28℃、180r/min吸附2h。吸附结束后，采用过滤的方法将固定化酵母凝胶球与物料分离，并对其进行湿法消解，用ICP-MS测重金属含量。
取一定质量的海参卵匀浆液进行湿法消解，用ICP-MS测重金属含量，从而算出脱除率。
结果如下表5所示：
表5海参卵匀浆液经过酸解-酵母吸附脱除重金属前后对比
| 项目 | 脱除前 | 脱除后 | 脱除率 |
| 砷(mg/kg) | 2.727 | 1.756 | 35.61％ |
对比例1中海参卵匀浆液经酸解后，没有再离心成两部分分别处理，而是直接加入固定化酵母凝胶球吸附重金属，脱除率仅有35.61％，实施例3中海参卵匀浆液酸解后，离心分成两部分分别处理，即分别用酵母菌泥和固定化酵母凝胶球吸附上清液和底物沉淀中的重金属，脱除率可达75.31％，比对比例中提高了一倍，可见本发明提供的脱除方法能明显提高重金属的脱除率。
从图2中可以看出固定化酵母凝胶球为乳白色，直径约为2mm的凝胶球，很容易进行脱除后的分离。
从图3中可以看出，当盐酸溶液的pH在2.5～3.5之间时，酸解海洋动物匀浆液后重金属的脱除率可达到90％以上，盐酸浓度过低时，重金属脱除率明显下降。
从图4中可以看出，调整上清液pH为8时，脱除率明显增高，可能原因是pH过低时，不利于酵母菌生长，也不利于酵母菌吸收重金属。在pH为8的条件下，库德毕赤酵母采用8％氯化钠预培养后，脱除率最高。
实施例2中海参肠匀浆液经酸解—酵母吸附脱重金属后营养物质得率为89％，显著高于常规脱重金属方法的回收率(一般低于50％)，极大减少了营养物质的损失。
Claims (9)
1.一种海洋动物匀浆液脱重金属方法，其特征在于，首先对酵母菌进行扩大培养，制备固定化酵母凝胶球，再制备海洋动物匀浆液；酸解海洋动物匀浆液并进行固液分离处理，最后利用酵母凝胶球脱除分离后沉淀中的重金属，和利用游离酵母菌吸附分离后上清液中的重金属。
2.如权利要求1所述的脱重金属方法，其特征在于，所述酵母菌包括库德毕赤酵母、酿酒酵母、鲁氏酵母、啤酒酵母的一种或多种混合。
3.如权利要求1所述的脱重金属方法，其特征在于，上述酵母菌进行扩大培养过程中对酵母菌进行渗透压胁迫处理，渗透压胁迫条件包括氯化钠胁迫或/和糖胁迫。
4.如权利要求3所述的脱重金属方法，其特征在于，所述糖胁迫为蔗糖胁迫。
5.如权利要求1所述的脱重金属方法，其特征在于，所述酸解过程中的酸溶液包括盐酸、磷酸、乳酸一种或多种混合。
6.如权利要求1所述的脱重金属方法，其特征在于，其具体实施步骤包括：
1）酵母菌活化及酵母泥的制备
酵母菌依次进行固体活化和液体活化，取液体活化后的酵母菌悬液加入含氯化钠和/或糖的液体培养基中，震荡培养；培养结束后，将发酵液进行离心、絮凝或者膜过滤处理，并清洗后得到酵母菌泥；
2）固定化酵母凝胶球的制备
制备海藻酸钠溶液，再将步骤1）制备的酵母菌泥与海藻酸钠混合均匀后，采用造粒技术制备固定化酵母凝胶球，凝胶介质为氯化钙溶液，静置清洗，得到固定化酵母凝胶球备用；
3）海洋动物匀浆液的酸解处理
海洋动物按常规方法预处理后匀浆，得到海洋动物匀浆液；加入pH0.5~pH6的酸溶液搅拌，海洋动物匀浆液与酸溶液的质量体积比为1:1~1:20，反应结束后，再静置，然后离心或膜过滤，分别收集上清液和底部沉淀；
4）海洋动物匀浆液上清液中重金属的脱除
将步骤1）获得的酵母菌泥加入步骤3）制备的海洋动物匀浆液上清液中，调节上清液的pH为2~10，10~35℃、搅拌5～240min，除去酵母菌，得到重金属脱除后的上清液；
5）海洋动物匀浆液底部沉淀中重金属的脱除
将步骤2）制备的固定化酵母凝胶球加入到步骤3）得到的海洋动物匀浆液底部沉淀中，加水搅拌，调节pH为2~10，10~35℃、震荡培养0.2~8h，去除固定化酵母凝胶球，回收营养物质。
7.如权利要求6所述的脱重金属方法，其特征在于，所述步骤1）中氯化钠的浓度为8wt%。
8.如权利要求6所述的脱重金属方法，其特征在于，所述步骤3）中酸溶液为盐酸，其pH为3。
9.如权利要求6所述的脱重金属方法，其特征在于，所述步骤4）和步骤5）中进行脱除重金属的pH为8。
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