生产色氨酸的微生物及其制备方法
本发明涉及生产色氨酸的微生物及其制备方法。
大家知道色氨酸代谢在目前所研究过的所有微生物中只以一个单一生物合成途径进行(Somerville,R.L.,Herrmann,K.M.,1983,氨基酸,生物合成和基因调控(Aminoacids,Biosynthesisand Genetic Regulation),Addison-Wesley Publishing Company,USA:30l-322和351-378;Aida et al.,1986,氨基酸生产的生物学方法,工业微生物学进展(Biotechnology of aminoacidproduction,progress in industrial microbiology)Vol 24,ElsevierSciencepublishers,Amsterdam:188-206)。色氨酸代谢途径以及与丝氨酸代谢的联系和编码主要酶的基因列在图1中。
已知的色氨酸生产方法是基于一个突变的trpE基因的表达,该基因编码有色氨酸不敏感的邻氨基苯甲酸(anthranilate)合酶,以及基于在合适的可自动复制的载体上的trp操纵子的其他基因的表达。由于这些基因的相对高拷贝数,trp基因的表达也多,对应的色氨酸代谢中的每一种酶的量也增加了。这导致色氨酸的过量生产。
下面举一些这种生产色氨酸方法的例子,有许多微生物用于这个过程,如大肠杆菌:EP0293207,US4,371,614,芽孢杆菌:US4,588,687,棒状杆菌(Corynebacterium)和短杆菌(Brevibacterium):EP0338474。在这个生产过程中,会存在不稳定性、载体丢失或生产菌株生长速度慢等问题。
EP-A-O401735(申请人:Kyowa Hakko Kogyo Co.)描述了以含有重组质粒的棒状杆菌或短杆菌来生产L-色氨酸的方法。在这些质粒中含有合成DAHP合酶,邻氨基苯甲酸合酶,吲哚-3-甘油-P合酶,色氨酸合酶和磷酸甘油脱氢酶的遗传信息。使用了抗反馈邻氨基苯甲酸合酶的等位基因。
进而我们也知道可通过给生产菌株引入许多serA,或serA,B,C野生型基因导致色氨酸代谢去调控来增加色氨酸的生产。因此化学文摘CA111(1989)168688q和CA111(1989)168689r描述了分别引入在质粒上的serA野生型等位基因和丝氨酸代谢的全部野生型基因(serA,serB和serC)的芽孢杆菌菌株能过剩表达它们来生产色氨酸。
在EP-0149539(申请人:Stauffer Chemical Company)中揭示了通过在细胞中防止丝氨酸降解来提高色氨酸产量的方法。在这个专利申请中使用了破坏丝氨酸降解酶(丝氨酸脱氨酶,Serinedeaminase,sda)的大肠杆菌K12突变体,同时还描述了用这类菌株来生产氨基酸。例Ⅷ中描述一个这种类型的菌株,从邻氨基苯甲酸中大量生产色氨酸的方法。和欧洲专利申请所提到的一种具有完整丝氨酸脱氨酶的菌株生产色氨酸相比,色氨酸产量提高的解释是氨基酸前体储量非常高的微生物中丝氨酸或丝氨酸生物合成能力限速色氨酸的生产。
本发明的目的是提供能增加色氨酸产量的微生物和提供使这种微生物制备成为可能的一些方法。
本发明的目的可以通过微生物菌株来实现。这些菌株的特征在于具有一个去调控的(deregulated)色氨酸代谢和一个至少由一个抗反馈serA等位基因而去调控的丝氨酸代谢。
本发明中,抗反馈serA等位基因位点意味着serA基因的突变体,它编码一个对丝氨酸具有敏感性的磷酸甘油脱氢酶,但该酶的丝氨酸敏感性要低于这个菌株相应的野生型磷酸甘油脱氢酶的丝氨酸敏感性。
至少一个抗反馈serA等位基因与去调控的色氨酸代谢的微生物的按本发明结合会导致色氨酸产量的增加。令人惊奇的是和不具有抗反馈serA等位基因的相同微生物在相同的培养条件下产量经比较,前者较后者高出2.6倍。
根据本发明,用本发明的菌株使色氨酸产量的提高是未曾预料到且令人惊奇的,因为抗反馈serA等位基因表明了只有在高细胞内丝氨酸水平上的效应(Tosa T,Pizer L.J.,1971,Journal ofBacteriology Vol.106:972-982;WinicovJ.,Pizer L.J.,1974,Journal of Biological Chemistry Vol.249:1348-1355)。可是,按本领域的现有技术(例如EP-A-O149539),具有去调控的色氨酸代谢的菌株有一个很低的丝氨酸水平。这就是为什么没有预计到按本发明通过给色氨酸代谢去调控菌株引入一个抗反馈serA等位基因可提高色氨酸的生产。
由于在所有已知微生物中色氨酸代谢都是通过图1所示的代谢途径进行的,且制备本发明的菌株的技术原则上是已知的,且可以用于所有的微生物,所以本发明菌株可以从任何希望的微生物中制得。
适合的和优选的用于本发明生产色氨酸的菌株是细菌,特别是革兰氏阴性菌,如大肠杆菌是更适合和更优选的。
本发明的菌株可通过部分或完全将目的色氨酸原养型起始菌株的色氨酸代谢调控进行废除并引入一个抗反馈serA等位基因来获得。
本发明的菌株还可同样地通过对色氨酸营养缺陷型的起始菌株回复其合成色氨酸能力,并去调控回复的色氨酸代谢,再引入抗反馈serA等位基因来获得。
菌株的色氨酸代谢去调控可通过许多不同的本领域已有技术来实现。
色氨酸代谢去调控的一种可能性是修饰邻氨基苯甲酸合酶,该酶催化所有微生物中色氨酸特异性的生物合成途径中的第一步。它的活性受色氨酸的抑制,因此它依赖着色氨酸的量来调节通过色氨酸生物合成途径的代谢物流,该酶由trpE基因编码。
编码邻氨基苯甲酸合酶的突变trpE基因对色氨酸的敏感性低于相应的野生型邻氨基苯甲酸合酶的敏感性,因此也被称为抗反馈trpE等位基因,它可以通过诱变原养型色氨酸起始菌株并继而筛选而得到。为达到这一点,相关菌株应进行处理,诱其突变(MillerJ.H.,1972,Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring HarborLaboratory,USA:113-185)。
被处理过的菌株培养在营养培养基上,该培养基至少含有一种色氨酸拮抗物,其量应足以抑制该菌株的生长。合适的色氨酸拮抗物如4-甲基-色氨酸,5-甲基色氨酸,6-甲基色氨酸,卤化色氨酸,吲唑氨丙酸(tryptazan),吲哚和吲哚丙烯酸。
对抗性克隆株的邻氨基苯甲酸合酶的色氨酸敏感性进行测定。邻氨基苯甲酸合酶的色氨酸敏感性可采用任何以色氨酸存在下测定酶活性的方法进行检测确定。例如,分支酸(chorismate)可以在一个适当的缓冲液中与谷氨酰胺反应,在这个酶促反应中,谷氨酰胺与色氨酸共同作用(Bauerle R.et al.,1987,Methods in EnzymologyVol.142:366-386)。从检测混合物中以动力学方式移出等份,用高效液相色谱法分析确定每单位时间反应后产物邻氨基苯甲酸的量。每单位时间获得的产物邻氨基苯甲酸的量是邻氨基苯甲酸合酶活性的直接测定。为了测定待测邻氨基苯甲酸合酶的敏感性,该方法应在色氨酸存在和不存在两种情况下进行。
也可用直接基因操作获得对色氨酸不敏感的trpE等位基因(Bauerle R.et al.,1987,Methods in Enzymology Vol.142:366-386)。各种微生物均已有描述邻氨基苯甲酸合酶氨基酸序列上许多变化都将导致该酶对色氨酸敏感性的降低(例如沙门氏菌:CaliguiriMG.,Bauerle R.,1991,J.of Biol.Chem.Vol.266:8328-8335;furbrevibacterium,corynebacterium:Matsui K.et al.,1987,J.Bact.Vol.169:5330-5332)。
有一些已知方法已使得在DNA片段上一个特定点诱导突变已成为可能。这类方法在下列公开出版物中特别加以描述:
Sakar G.,Sommerauer S.S.,1990,Bio Techniques 8:404-407中描述了依赖聚合酶链反应的定点诱变。
Ausubel F.M.et al.,1987,Currentprotocols in MolecularBiology,Greenepublishing Associates,描述了依赖M13噬菌体的方法。
Smith M.,1985,Ann.Rev.Genet,19:423-462,描述了其它方法。
含有野生型trpE基因的DNA片段用早期描述的标准方法重组到一个载体上获得重组DNA。使用上述提及的定点诱变法将导致DNA序列上一个或多个核苷酸被修饰,结果由该基因编码的氨基酸序列便与一个对色氨酸不敏感的邻氨基苯甲酸合酶的氨基酸序列相对应。该描述的技术可以被用于将一个或多个突变引入任何目的trpE基因,这将导致编码的邻氨基苯甲酸合酶具有对色氨酸不敏感的氨基酸序列。
此外,本发明菌株的下列特性是希望得到的但不是绝对需要的:缺陷的色氨酸阻遏蛋白(repressor protein),trp操纵子表达的缺陷的衰减控制和缺陷的色氨酸酶,本发明菌株的这些特征可以最简单地通过选择一个已经具有一个或多个适当特征的起始菌株而获得。这种制备和选择可通过下述提及的选择方法组合后进行。
色氨酸阻遏蛋白(repressor protein)是色氨酸生物合成中的一个主要调节蛋白。这个蛋白质和色氨酸一起作为阻遏物蛋白(aporepressor)阻遏trp操纵子基因的表达,该蛋白由trpR基因编码。可从对色氨酸拮抗物(如5-甲基色氨酸)有抗性的突变体中筛选出色氨酸阻遏物突变体。在J.Mol.Biol.44,1969,185-193或Genetics 52,1965,1303-1316文献中已有例子。
除了有由trpR编码蛋白的控制外,trp操纵子还参与了衰减调控。在trp操纵子第一个基因前的DNA区段负责调控。该区段的突变体或缺失体可能导致去调控。这类突变体可从对色氨酸拮抗物(如5-甲基色氨酸)有抗性的突变体中筛选出来。另一方面,这类突变体,特别是缺失体,可用定点诱变的方法在DNA的衰减区域内位点特异性导入这种修饰而获得。通过已叙述的位点特异性诱变技术可把灭活的衰减子区重组到本发明菌株的染色体中以替换天然衰减子区域。
色氨酸酶(tnaA)催化色氨酸降解成吲哚,丙酮酸(pyruvate)和氨。理想的是这种酶在色氨酸生产菌株中是无活性的。缺失这种酶的菌株可以通过对菌株进行突变处理,寻找到那些不再能利用色氨酸作为碳氮源的突变体而获得。在文献J.Bact.85,1965,680-685中给了一个详细的例子,或同等可能用上述技术将导致灭活的点特异性突变体引入tnaA基因。
许多起始菌株的其它突变体很适宜导致色氨酸生产的进一步提高。因此,不仅色氨酸生物合成途径。而且一般的芳香族氨基酸生物合成途莽草酸途径,(shikimic acidpathway)最好也是调控不敏感的。按照本发明,这就是为什么具有调控不敏感性的脱氢***庚酮糖酸合酶(dehydroarabinoheptulosonate synthase)并且其酪氨酸阻遏蛋白(tyrR)经突变或缺失而灭活的菌株优选作为起始菌株用于制备本发明的菌株。同样苯丙氨酸和酪氨酸代谢被削弱的菌株也是优选的。这保证了前体分子分枝酸全部流向色氨酸方向。这种类型的菌株例如具有pheA或/和tyrA基因上的突变或缺失。
许多菌株已知在色氨酸生物合成的一步或多步或莽草酸途径去调控从而大量生产色氨酸。例如,枯草杆菌FermBP-4,FermP1483(DE3123001),黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC 21427(US3,849,251),谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)ATCC 21842-21851(US3,594,279,US3,849,251),黄体微球菌(Micrococcus luteus)ATCC 21102(US3,385,762),大肠杆菌ATCC 31743(CA1182409),这些菌株同样地适合作为起始菌株制备本发明的生产菌株。依本发明它们都表明色氨酸生产菌株可以从很宽范围的微生物群中得到。
除了要求菌株具有去调控的色氨酸代谢以外,还要求用于制备本发明菌株的菌株至少有一个编码磷酸甘油脱氢酶的基因,并且该酶的丝氨酸敏感性要低于对应的野生型菌株的磷酸甘油脱氢酶的丝氨酸敏感性。
磷酸甘油脱氢酶(PGD)由serA基因编码。已知野生型serA基因的序列(Tobey K.L.,Grant G.A.,1986,J.Bac.Vol,261,No.26:1279-1283)。用一个质粒载体大量表达该野生型serA基因产品也同样为人所知(Schuller et al.,1989,J.Biol.Chem.Vol.264:2645-2648)。
用经典的遗传方法制备抗反馈serA等位基因已由Tosa T,PizerL,T.,1971,J.Bac.Vol.106,No.3:972-982描述。在该例中,可通过突变体对丝氨酸类似物丝氨酸异羟肟酸(hydroxamate)的抗性来进行筛选。这些突变体在该文献中没有加以详细鉴定,突变对代谢的影响也未进行研究。
抗反馈serA等位基因也可通过对微生物进行突变诱导来获得。适合的诱变剂为紫外线(UV)和一些化学诱变剂,如甲基磺酸乙酯或N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍。剂量和作用时间通过常规方法对选用的诱变剂进行确定(MillerJ.H.,1972,Experiments inMolecular Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory USA:113-143)。
然后对诱变剂处理的微生物群筛选带有编码丝氨酸不敏感性磷酸甘油脱氢酶的serA基因的克隆株。例如,一个用诱变剂处理的群接种到含有足以抑制非抗性细菌生长量的丝氨酸hydroxamate固体生长培养基上培养。抗性克隆株再对其进行磷酸甘油脱氢酶的丝氨酸敏感性测定。该法由Tosa和pfizer,1971,J.Bact,100,3:972-982提供的例子中已作了描述。
编码对丝氨酸不敏感的磷酸甘油脱氢酶的等位基因同样可以由遗传工程技术获得。
介导丝氨酸调控的PGD区段位于该蛋白的C-末端区。这就是为什么优选在PGD蛋白C-末端25%区段、特别优选在C-末端前50个氨基酸导入一个或多个氨基酸的***,替换或缺失的原因。这些作用导致PGD对丝氨酸的敏感性降低。
编码这类PGDs的等位基因可通过修饰serA基因3′区,即编码所述的PGD C-末端区来实现。为了做到这一点,未突变的serA基因由本领域技术人员熟知的重组DNA技术重组到一个克隆载体上。这种重组DNA过程包括限制性酶切,连接和转化(ManiatisT.,Fritsch E.F.and Sambrook,J.,Molecular Cloning:A LaboratoryManual 1982,Cold Spring Harbor Laboratory)。在结构基因3′端的特殊修饰可通过例如定点诱变技术而获得。
适合在去调控的色氨酸代谢的微生物中表达的对丝氨酸不敏感的PGDs的例子列在表1中,该表显示了它们的C-末端氨基酸序列。除了显示部分外,该酶蛋白序列与野生型序列没有区别。
下面的测定方法被用于检测serA等位基因的产物的PGD活性和丝氨酸敏感性:
PGD活性是按McKitrick,J.C.和LewisJ.p.,1980,J.Bact.141:235-245中介绍的方法检测该酶的正反应和逆反应进行测定的。在该例中酶活性不仅在没有丝氨酸条件下测定,也在不同浓度的丝氨酸条件下进行测定。所说的测定方法适合确定任何磷酸甘油脱氢酶的丝氨酸敏感性。还可同样使用其它方法测定PGD活性。
用于该酶丝氨酸敏感性的测定是Ki值,也就是说,抑制该酶50%活性时丝氨酸的浓度。许多抗反馈serA等位基因和野生型serA基因(serAWT)的Ki值和C-末端氨基酸序列列在表1中。
表1:突变serA等位基因的C-末端氨基酸序列
Ber AWTBerA 5BerA 1508BerA 11BerA 1455 | AEQG V___ _NIA AQYL QTSA QMGY VVID IEAD EDVA EKAL QAMK AIPG TIRA RLLYAEQG V___ _NIA AQYC QTSA QMGY VVID IEAD EDVA EKAL QAMK AIPG TIRA RLL_AEQG VCSR ANIA AQYC QTSA QMGY VVID IEAD EDVA EKAL QAMK AIPG TIRA RLLYAEQG VCSR ANIA AQYC QTSA QMGY VVID IEAD EDVA EkAL QAMK AIPG TIRA RLL_AEQG V___ _NIA AQYC QTSA QMGY VVID IEAD EDVA EKAL QAMK AIPG TIR_ ____ |
K1/mM0.020.23.850100 |
令人惊奇的是按本发明合适和优选地制备的生产菌株serA等位基因的Ki值在100μM和50mM丝氨酸浓度。
为在本发明菌株中表达PGD蛋白可使用任何重组载体,从而导致丝氨酸不敏感serA等位基因的表达。一个适合制备本发明菌株的重组载体至少要有一个具有编码丝氨酸敏感性比野生型敏感性低的PGD的serA基因和能在受体菌株中自动复制的载体部分。
能够在大肠杆菌中自动复制的载体例子列在Pouwels P.H.,Enger-Valk,B.E.,Brammar W.J.1985,Cloning Vectors,Elsevier.Amsterdam。这类载体包括:
具有高拷贝数的质粒,如pBR322;pUC12,
具有中等拷贝数的质粒,如pACYC 184,177,
具有低拷贝数的质粒,如pSC 101,
噬菌体载体,如M13,λ载体。
对大量细菌来说,描述了各种载体(例如EP0401735的捧状杆菌和短杆菌或CA 111(1989)168688q)。
合适和优选的载体为具有中等到低拷贝数的载体;带有p15A复制子的载体,如pAYC 184(ATCC 37033)或pACYC 177(ATCC37031)为最为优选。
对于其它细菌的大量载体在文献中已作了描述(Pouwels et al.,1985,Cloning Vectors,Elsevier Sciencepublishers,Amsterdam)。
合适的重组载体可通过制备重组DNA的标准技术产生。这些技术在下列文献中被详细描述:如,Maniatis T.,Fritsch E.F.andSambrookJ.,1982,Molerular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,USA or Ausubel F.M.et al.,1987,Currentprotocols in Molecular Biology,Greenepublishing Associates,USA。
重组载体的制备是,如,先用限制性核酸内切酶将供体菌DNA消化成片段,该供体菌在染色体或在重组载体上有一个编码对丝氨酸不敏感PGD的serA等位基因。这些切断的片段用常规方法,即用T4DNA连接酶连接到用上述同样限制酶消化的载体分子上。连接反应后,混合物用已知方法,如氯化钙休克或电穿孔,转化色氨酸代谢去调控的受体菌。含有所需要的serA基因的载体可在受体菌中,如,通过上述方法如抗生素抗性选择或serA突变的互补而获得。
获得本发明菌株的另-个实施方案是将serA等位基因作为单拷贝整合到染色体中,这一方面可通过上述的直接用色氨酸去调控的起始菌株进行突变诱导和筛选策略得到,另一方面,也可将已重组在载体上的serA等位基因整合到生产菌株的染色体上,这种类型的整合方法已为大家所熟知。下列出版的文献中可找到这些技术的描述:
λ噬菌体介导的整合:Balakrishnan and Backmann,1988,Gene67:97-103;Simons R.W.et al.,1987,Gene 53:85-89;
rec D-依赖的基因替换:Shervell et al.,1987,J.Bact.141:235-245;
其它方法:Silhavy et al.,1988,Experiments with GeneFusions,Cold Spring Harbor Laboratory。
本发明菌株的发酵令人惊奇地揭示了含有丝氨酸Ki值在100μM和50mM之间的抗反馈serA等位基因以及去调控的色氨酸代谢,含有色氨酸Ki值在0.1mM和20mM之间的trpE等位基因的菌株提供最高的色氨酸产量。
下面的实施例用于进一步说明本发明。附图中:
图1为色氨酸代谢途径以及与丝氨酸代谢的联系和编码主要酶的基因。
图2显示△trp L1突变体(第二类)的位置和突变体trpE0,trpE5,trpE6和trpE8(第一类)的位置。
图3为野生型serA的核酸序列。
图4为重组载体pGC3。
图5为重组后的质粒pGH5。
图6为质粒pKB1321。
图7为质粒pKB1508。
图8为质粒pGH11。
图9为质粒pGH5/Ⅱ。
图10为质粒pGH11/Ⅱ。
图11为质粒pKB1508/Ⅱ。
图12为质粒pGH5/Ⅲ。
图13为质粒pGC3/Ⅰ。
实施例1
筛选抗反馈trpE等位基因并整合这些基因至染色体中。
色氨酸的类同物5-甲基色氨酸被用于寻找抗反馈trpE等位基因。N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NG)被用作诱变剂。使用的起始菌株为大肠杆菌K12 YMC9 ATCC 33927。诱导突变的方法基于Miller的资料(MillerJ.H.,1972,Experiments inMolecular Genetics.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,N.Y.:125-129)。
培养在LB中处于对数生长期的约2×109个YMC9细胞与50μg/ml NG在4ml 0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH5.5)中37C培养30分钟。在进一步用0.1M(pH7.0)磷酸盐缓冲液洗2次后,0.1ml细胞在LB中37℃振荡培养过夜。接着,用0.9%NaCl将0.1ml细胞制成多种浓度(10-3,10-4和10-5)加到含有100μg/ml 5-甲基色氨酸的最低营养培养基平板上。除5-甲基色氨酸外,最低营养基还含有:5g/L葡萄糖,5mg/L维生素B1,3g/L KH2PO4,12g/L K2HPO4,0.3g/LMgSO4×7H2O,0.1g/LNaCl,5g/L (NH4)2SO4,14.7mg/L CaCl2×2H2O,2mg/LFeSO4×7H2O,1g/L柠檬酸三钠和15g/L琼脂。在37℃ 24-48小时后,挑出5-甲基色氨酸抗性克隆,按上述方法重新接种到平板上。
对上述获得的突变体菌株进一步确定trpE基因产品对色氨酸的Ki值(Bauerle R.et al.,1987,Methods in Enzymology Vol.142:366-386)。用这种方式将突变体分成两类是可能的,第一类突变体有抗反馈邻氨基苯甲酸合酶,第二类突变体只有邻氨基苯甲酸合酶活性提高而Ki值不变的酶。
为了在分子水平进行确定,各类突变体相关DNA区被克隆和测序,为此,染色体DNA在每一种情况下要进行分离并用NheⅠ和ClaⅠ两种酶双切。分离出约5kb大小的片段连接到NheⅠ/ClaIpBR322大小为4158bp质粒片段上。连接反应后的混合物被转化到大肠杆菌KB862(DSM7196)trpE菌株上。筛选出能够在无色氨酸的最低营养培养基上生长的克隆。这种互补质粒含有一个5kb大小的NheⅠ和ClaⅠ片段。除有trpE和trpD外,这个5kbNheⅠ/ClaⅠ片段也含有来自trpE上游的DNA区(约0.8kb)和来自trpD下游的DNA区(约1kb)。表2显示4个第一类突变体的氨基酸序列差异和Ki值。突变体的序列与野生型序列上未注明的其它序列相同。
表2:突变的trpE等位基因的氨基酸序列
trpE WTtrpE 0trpE 5trpE 6trpE 8 | 20 50NPTA LFHO LCGD RPAT LLLE SADI DSKD DLKSESF ES E |
K1/mM0.010.13.015>15 |
第二类突变体序列分析表明突变既存在于trp启动子的操纵子区,又存在于编码trp前导肽的DNA区。被称为ΔtrpL1和ΔtrpL2的突变体在编码前导肽的DNA区分别有136bp和110bp缺失区。在EMBL数据库编号为AC V00372号下,在ΔtrpL1突变体的缺失从核苷酸第33位至168位,在ΔtrpL2突变体的缺失从第11位至120位。
为了获得抗反馈trpE等位基因更强的表达,对两类突变体进行了联合。第二类突变体ΔtrpL1被用于此目的。图2示ΔtrpL1突变体(第二类)的位置和突变体trpE0,trpE5,trpE6和trpE8(第一类)的位置。
含有ΔtrpL1突变体的1.6kb NruⅠ片段从质粒pΔtrpL(图2)中分离出来,和对应的野生型质粒pE0,pE5,pE6和pE8(图2)的NruⅠ片段交换,所获质粒被分别称为pIE0,pIE5,pIE6和pIE8,并用同源重组方式用于染色体整合。为此,从每一个所说质粒中大小约为5kb的染色体NheⅠ/ClaⅠ片段按实施例2所述的从低融点琼脂糖中分离出来,并以线性形式转化到rec DpD106菌株[ΔtrpLD102]中。使用的转化方法是Cohen等的氯化钙法(Cohen et al.,1972,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69:2110-2114)。菌株pD106于1993年9月11日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC93047,且已按布达佩斯条约,被保藏在德国微生物保藏中心(DSM)保藏号为DSM7195,能够在无色氨酸的最低营养培养基上生长并对氨苄青霉素敏感,即无质粒的菌株被筛选出来。编码各种抗反馈trpE酶,并每一个都结合有ΔtrpL1突变体的trpE等位基因由p1转导从相关菌株被转移到KB862(MillerJ.H.,1972,Experiments in Molecular Genetics.Cold Spring Harbor,N.Y.:201-205)。菌株KB862已于1993年9月11日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC93048,并按布达佩斯条约于1992年7月28日保藏于德国微生物保藏中心(DSM),保藏号为DSM7196,筛选出在无色氨酸最低营养培养基上生长的菌株。这些菌株被称为pD103(trpE0),KB862(trpE5),SV164(trpE8)和SV163(trpE6)。
实施例2:
制备编码对丝氨酸不敏感的磷酸甘油脱氢酶的serA基因。
serA野生型基因从大肠杆菌B株(ATCC23226)克隆到质粒载体pUC18上。
为了获得该菌株的染色体DNA,先将其在37℃下Luria肉汤中培养过夜。然后离心(4000g)收集细菌体细胞,用Ausubel等(Ausubel et al.,1987,2.4.1-2.4.2,Currentprotocols inMolecular Biology,Greenepublishing Associates)提供的方法裂解该细胞并纯化DNA。用分光光度计在260nm波长处测定获得的DNA量。产量约为600μg/100ml。
10μg染色体DNA用SphⅠ限制性酶(Boehringer MannheimGmbH)按制造商提供条件的进行切割。大约3μg片段混合物连接到用上述同一酶SphⅠ切割后的0.2μg能自动复制的质粒载体pUC18上(由Boehringer Mannheim GmbH提供),使用的酶为T4连接酶(由Boehringer Mannheim GmbH提供),反应条件按制造商说明书。将连接后的混合物用于转化serA突变体pC1523(CGSC#:5411;)上(CGSC:E.coli Genetic Stock Center,Department of Biology 255 OML,Yale University,Postbox 6666,New Haven,CT,USA)。使用的转化方法是Cohen等的氯化钙法(Cohen et al.,1972,Proc.Natl,Acad.Sci.USA 69:2110-2114)。转化后的细菌涂布在无丝氨酸的最低营养培养基平皿上。在无丝氨酸情况下能生长的克隆含有在SphⅠ片段(约3.5kb大小)来自大肠杆菌的serA基因。野生型serA基因的核酸序列列于图3中,带有serA基因的重组载体被称为pGC3(图4)。
serA等位基因serA5可通过用限制性内切酶SalⅠ和KpnⅠ(由Boehringer Mannheim GmbH提供)按制造商的资料切割质粒pGC3即可获得。获得的片段用琼脂糖电泳进行分离,大小为2.0kb,含有完整serA基因并远离C-末端8个密码子的SalⅠ-KpnⅠ片段从胶中纯化出来。为了做到这一点,在低融点琼脂糖(由BoehringerMannheim GmbH提供)进行电泳以便仅通过融化琼脂糖就可以收集出DNA。以此片段0.2μg与等摩尔量的HindⅢ/SalⅠ切割的pUC18片段加上一段人工合成的双股寡核苷酸在T4连接酶(由Boehringer Mannheim GmbH提供)的作用下进行连接。这段寡核苷酸的序列为:
5′ 3′
C ATT CGC GCC CGT CTG CTG TAA TA
CTAGG TAA GCG CGG GCA GAC GAC ATT ATT CGA3′ 5’
这段寡核苷酸是serA基因C-末端最后8个密码子中的7个,引入终止的三联体TAA以代替第8个密码子。由这个serA基因编码的磷酸甘油脱氢酶因此由一个C-末端氨基酸截短了顶端,这个改变了的PGD氨基酸序列列在表1中(serA5)。重组后的质粒被称为pGH5(图5),用连接混合物转化serA突变体pC1523。
serA等位基因serA1508按下述方法制备,按制造商资料,质粒pGC3用SphⅠ/SalⅠ(由Boehringer Mannheim GmbH提供)酶切,含有完整serA基因的3kb片段由凝胶电泳纯化并连接到用SphⅠ/SalⅠ酶切的pUC18载体上,获得的质粒称为pK1321(图6)。
pKB1321用限制性核酸内切酶HindⅡ(由BoehringerMannheim GmbH提供)作用,反应条件只允许部分酶切(每μgDNA中加入0.05U酶,消化10分钟,其它反应条件按说明书)。这个步骤尤其是产生在serA基因第1793位中由HindⅡ切开的片段。具有XbaⅠ切点的DNA接头由连接反应***到这个位点上。DNA接头的序列如下:5′ 3′TGC TCT AGA GCAACG AGA TCT CGT3′ 5’
这种***将导致PGD在这一点上带有4个额外的氨基酸,它的序列列在表1。带有***段的质粒称为pKB1508(图7),然后再转化到serA突变体pC1523中。
serA等位基因serA11是用SalⅠ和KpnⅠ酶(由Boehringer mannheim GmbH提供)按制造商提供的反应条件通过酶切pGH5质粒得到的,并在低融点琼脂糖凝胶电泳后从消化混合物中纯化出2.8kb大小的片段。这个片段含有来自pUC18的载体部分和来自serA5的C-末端区。质粒pKB1508也同样用SalⅠ/KpnⅠ酶切,将大小为2.0kb的DNA片段从低融点琼脂糖凝胶中分离出来。该片段含有带***突变体的serA等位基因serA1508,但没有C-末端的8个密码子。将上述2个片段连接到一起,用于转化serA突变体pC1523,获得的重组质粒被称为pGH11(图8)。这个编码的磷酸甘油脱氢酶将serA1508的***突变体serA5缺失突变体结合起来。在编码的氨基酸序列中带有突变体的区域展示在表1。
为了在生产菌株表达突变的serA等位基因,它们被克隆到载体pACYC184(ATCC37033)上,这个载体为中等拷贝数。为做到这些,用SalⅠ/HindⅢ酶切质粒pGH5和质粒pGH11,从低融点琼脂糖凝胶上分离出每个质粒消化后大小约为2kb并含有serA等位基因serA5和serA11的DNA片段。这两种片段在不同的反应液中用来自大肠杆菌的DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段(由Boehringer Mannheim GmbH提供)按产品说明书进行处理,其目的是将限制性内切酶消化切割的凸出的5′端变成钝端。为此,每个片段各1μg中加入含有5U Klenow酶,0.5mM dATP,dGTP,dTTP和dCTP的20μl反应混合液,按制造商建议的缓冲液37℃反应15分钟。
每个钝端的DNA片段再连接到用pvuⅡ酶切过的pACYC184载体上,这个连接混合物被用于转化serA突变体pC1523,这种增补后的质粒分别被称为pGH5/Ⅱ和pGH11/Ⅱ(图9和图10)。质粒pKBl508用SalⅠ/SphⅠ酶切。将含有serA等位基因serA1508 3.0kb片段用凝胶电泳纯化。这个片段按上述制备成钝端,然后和pvuⅡ酶切的pACYC184连接,连接混合物转化到大肠杆菌pC1523,这个被增补后的质粒称为pKB1508/Ⅱ(图11)。
质粒pGH5/Ⅱ(serA5),pGH11(serA11)和pKB1508Ⅱ用于转化pD103(trpE0),KB862(trpE5),SV164(trpE8)和SV163(trpE6)。
实施例3
用重组λ原噬菌体构建一个染色体编码的抗反馈的serA5等位基因。
为了将serA5等位基因整合到染色体λ吸附位点(attλ),将该等位基因克隆到质粒pRS551(Simons et al.,1987,Gene 53:85-96)。为此,将含有serA5的Hind Ⅲ/SalⅠ片段(约2kb)从质粒pGH5中分离出来。5′凸出端按产品说明书用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段填满,在将EcoRⅠ接头连接后(Maniatis etal.,1982,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.:396-397),这个2kb片段连接到EcoRⅠ酶切过的载体pRS551上。重组质粒被筛选出来并称为pRS5。
用λRS45噬菌体裂解在平皿上的含有pRS5 rec A+菌株(如 YMC 9 ATCC 33927),再用同源重组(Simons et al.,1987,Gene 53:85-96)将一个除λRS45噬菌体以外也含有重组serA5的λRS45衍生物的异源λ裂解物在体内产生。
serApC1523菌株(CGSC#:5421)被用于筛选重组λRS45衍生物。为此,用异源λ裂解物(见上)感染pC1523,然后铺于含有卡那霉素(25mg/L)的LB平板上。形成的溶源性的卡那霉素抗性克隆被检查它们在无丝氨酸的最低营养平皿上的生长能力。筛选出丝氨酸-原养型的克隆并用于制备一株同源serA5λ裂解物(采用紫外线诱导方法,Simons et al.,1987 Gene 53:85-96)。
这种同源serA5λ裂解物用来感染色氨酸生产菌株SV164。获得的SV164 attλ∷serA5菌株按实施例4所述进行发酵,这种特殊培养基在这种情况下用25mg/L卡那霉素替代四环素作为筛选剂。
色氨酸的产量约为12.5g/L,和没有serA5的相同菌株产生3.5g/L相比高出许多。
实施例4
用棒状杆菌进行色氨酸生产
质粒pGH5用限制性内切酶SalⅠ和HindⅢ(由BoehringerMannheim GmbH提供)酶切,大小为2kb含有serA5基因的DNA片段从低融点琼脂糖凝胶中分离出来。再用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段(由Boehringer Mannheim GmbH提供),将该片段制备成钝端。用SmaⅠ(由Boehringer Mannheim GmbH提供)酶切载体pWST1并连接到钝端DNA片段。pWST1载体是能够在大肠杆菌和棒状杆菌中复制并能在这两菌之间穿梭的载体,这个载体的棒状杆菌复制子来自谷氨酸棒状杆菌ATCC19223菌株。pWST1载体的制备在US-A4,965,197中已作了描述。该连接反应后的混合物被用于转化大肠杆菌pC1523菌株。增补后的质粒称为pGH5/Ⅲ(图12)。
pGH5/Ⅲ质粒被用于转化产色氨酸谷氨酸棒状杆菌ATCC21851,转化采用电穿孔技术进行,该技术已由Wolf H.et al.,1989,App1.Microbiol.Biotechnol.30:283-289描述。含有重组质粒pGH5/Ⅲ的克隆可通过质粒编码的卡那霉素抗性在含有25mg/L卡那霉素琼脂板上筛选出来。
用限制性内切酶SphⅠ和SalⅠ酶切质粒pGC3。含有野生型serA等位基因的3kbDNA片段纯化后,以上述的方法连接到pWST1载体上。获得的载体pGC3/Ⅰ(图13)用于转化谷氨酸棒状杆菌ATCC21851。
在一个质粒上含有serA等位基因1455的谷氨酸棒状杆菌ATCC21581菌株按类同的方法制备。
发酵揭示在一个质粒上含有serA5等位基因的菌株可获得最高色氨酸产量。
实施例5
各种质粒编码的serA等位基因对各种trpE菌株色氨酸生产的影响。
在10ml LB培养基(1%胰胨,0.5%酵母浸液,0.5%NaCl)中加入四环素使成15mg/l,再转入100ml锥形瓶中,按表3列的各种色氨酸生产菌株按种入内。30℃以150rpm旋转振荡8-9小时后,这种预培养物转100ml SM1培养基。SM1培养基是由5g/L葡萄糖,3g/L KH2PO4,12g/L K2HPO4,0.1g/L (NH4)2SO4,0.3g/L MgSO4×7H2O,15mg/L CaCl2×2H2O,2mg/L FeSO4×7H2O,1g/L柠檬酸三钠×2H2O,1ml/L微量元素溶液(参见下),40mg/L L-苯丙氨酸,40mg/L L-酪氨酸,5mg/L维生素B1和15mg/L四环素组成。微量元素溶液组成如下:0.15g/L Na2MoO4×2H2O,2.5g/L H3BO3,0.7g/LCoCl2×6H2O,0.25g/L CuSO4×5H2O,1.6g/L MnCl2×4H2O和0.3g/L ZnSO4×4H2O。培养物在1升的锥形瓶中以150rpm旋转震荡30℃下12-16小时,之后测定其OD600值为2-4,进一步发酵是在由Braun-Melsungen提供的BIOSTATRM研究用发酵罐中进行的。培养物的总体积为2升。
该培养基含有17.5g/L葡萄糖,5g/L(NH4)SO4,0.5g/LNaCl,0.3g/L MgSO4×7H2O,15mg/L CaCl2×2H2O,75mg/LFeSO4×7H2O,1g/L柠檬酸三钠×2H2O,1.5g/L KH2PO4,1ml/L微量元素溶液(参见上),5mg/L维生素B1(硫胺素),0.75g/L-苯丙氨酸,0.75g/L L一酪氨酸,2.5g/L酵母抽提物(Difco),2.5g/L胰胨(Difco)和20mg/L四环素。
发酵罐中的葡萄糖用泵从700g/L (W/V)葡萄糖溶液(已高压灭菌)中泵入,使发酵液中葡萄糖浓度达到17.5g/L,在培养前,发酵中加入四环素使其终浓度为20mg/L。此外,用泵从25%NH4OH溶液泵入罐内使pH保持在6.7。
100ml预培养物泵入发酵容器中培养,起初体积约为1升,培养物开始以400rpm搅拌,用灭菌滤器压入灭菌空气(流速为1.5vvm),30℃进行发酵。
用25%NH4OH由自动校正仪保持pH值在6.7,在发酵液中氧饱和度在发酵期间的任何时候都不应低于20%,在发酵时氧饱和度的控制由搅拌速度而定。
隔2-3小时,营养液的葡萄糖含量,光密度值和色氨酸产量都应不断测量。葡萄糖含量是用由YSI提供的葡萄糖分析仪酶法测定。通过连续灌流装置将葡萄糖浓度保持在5-20g/L之间。发酵后培养基中的色氨酸含量用高效液相色谱(HPLC)测定。该培养物在一个Nucleosil 100-7/C8柱层析分离(250/4mm,Macherey-Nagel),该柱以2ml/分的流速恒溶剂操作进行,使用的流动相为水/乙腈(83/17),每升中再加入0.1ml H3PO4(85%)。检测或用一二极管阵列检测器,或用一个215或275nm固定的紫外光波长检测。在44-50小时时发酵停止。48小时后在这一个发酵中产生的色氨酸是以g/L计算列于表3中。
表3:各种serA/trpE组合的色氨酸产量
serAWT serA5 serA1508 serA11 serA1455trpE0 15.7 20.2 n.d. n.d. 6.7trpE5 12.5 18.9 15.0 20.0 7.5trpE6 11.6 24.1 13.8 24.0 4.0trpE8 7.5 18.0 n.d. 11.5 3.9n.d.未测定