CN1236066C - 发酵法生产l－氨基酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有工业优势的用发酵法生产L-氨基酸的方法，其中具有产L-氨基酸能力并携带编码丙氨酸-缬氨酸转氨酶(转氨酶C)的基因avtA的微生物，与其亲本菌株相比该转氨酶活性增强，因此采用该微生物降低在纯化发酵法生产的L-氨基酸时引起问题的副产品氨基酸的量。

Description

发酵法生产L-氨基酸的方法
技术领域
本发明涉及发酵法生产L-氨基酸的方法。支链氨基酸如L-亮氨酸和L-异亮氨酸用于作为食品生产、食物添加剂、合成药物和农业化学药品等等。
背景技术
作为直接发酵生产L-氨基酸的方法，某些方法采用大肠杆菌属(Escherichia)、沙雷氏菌属(Serratia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)或者节杆菌属(Arthrobacter)微生物来生产L-亮氨酸。采用大肠杆菌属微生物生产L-亮氨酸已知的方法包括：采用抗噻吩丙氨酸微生物生产的方法(日本已发表但未经审查的专利申请第72695/81号)、采用抗L-乙基硫氨酸微生物生产的方法(日本已发表但未经审查的专利申请第55194/84号)、采用抗2-丁酮酸微生物生产的方法(日本已发表但未审查的专利申请第9982/96号)、采用抗4-氮杂亮氨酸(4-azaleucine)或者5，5，5-三氟亮氨酸微生物生产的方法(日本已发表但未经审查的专利申请第70879/96号)。
相似的，还有许多采用大肠杆菌属、沙雷氏菌属、棒状杆菌属或者节杆菌属微生物来生产L-亮氨酸的方法。采用大肠杆菌属微生物生产L-异亮氨酸的已知方法包括：采用抗thiaisoleucine、异亮氨酸氧肟酸盐、精氨酸氧肟酸盐、DL-乙基硫氨酸等的微生物生产的方法(日本已发表但未经审查的专利申请号第130882/93号)；采用抗2-丁酮酸微生物生产的方法(日本已发表但未经审查的专利申请第9982/96号)；采用一种在含有同型丝氨酸作为唯一氮源的培养基中快速生长的微生物生产的方法(日本已发表但未经审查的专利申请第322583/96号)。
然而，上述方法都存在的问题是以相当多的量形成了多种作为副产品的其它非所需L-氨基酸。尤其是，因为在纯化的步骤中不容易分离和去除L-缬氨酸，在生产L-亮氨酸或者L-异亮氨酸的方法中，L-缬氨酸的生成导致提高生产成本或者降低了纯化的产率和产物的纯度。
丙氨酸-缬氨酸转氨酶(转氨酶C)催化L-丙氨酸和丙酮酸与2-氧代异戊酸和L-缬氨酸之间可逆的偶联转氨反应，图示如下：
该酶还能催化L-丙氨酸和丙酮酸与2-氧代丁酸和2-氨基丁酸之间可逆的偶联转氨反应，图示如下：
在微生物如大肠杆菌和沙门氏杆菌中已经发现了编码丙氨酸-缬氨酸转氨酶的基因。至于从大肠杆菌中衍生来的丙氨酸-缬氨酸转氨酶，已有关于克隆编码该酶(avtA)的基因和该基因核苷酸序列的报导〔J.Bacteriol.，169，4228(1987)；Gene，65，195(1988)；Science，277，1453(1997)；Genbank，注册号：AE00434(1998)〕。同时有报导指出扩增avtA基因能增加丙氨酸-缬氨酸转氨酶的活性〔J.Bacteriol.，169，5610(1987)〕。
以下是关于丙氨酸-缬氨酸转氨酶生理学作用的报导。
缺乏编码支链氨基酸转氨酶(转氨酶B)的基因ilvE的大肠杆菌菌株表现出对L-异亮氨酸的完全需求，而对L-缬氨酸(渗漏表现型)则不然，这说明丙氨酸-缬氨酸转氨酶涉及催化2-氧代异戊酸成为L-缬氨酸，从而成为替代支链氨基酸转氨酶的第二转氨酶。〔Escherichiacoli and Salmonella typhimurium，American Society forMicrobiology，Washington，D.C.(1987)〕。而且，通过扩增avtA基因使上述变异菌株对L-缬氨酸(渗漏表现型)的部分需求得到补偿〔Escherichia coli and Salmonella typhimurium，AmericanSociety for Microbiology，Washington，D.C.(1987)〕。
然而，目前尚没有通过增强丙氨酸-缬氨酸转氨酶的活性以减少L-缬氨酸生成的报导。
本发明的公开
本发明的一个目的就是以减少副产品氨基酸的生成量来提供生产L-氨基酸的高效并有工业优势的发酵方法。
为了在发酵生产L-氨基酸的过程中降低副产品即非所需氨基酸的生成，本发明者作了深入的研究。他们发现通过加强生产所需的L-氨基酸菌株的丙氨酸-缬氨酸转氨酶的活性可以减少不需要的氨基酸的生成；从而他们完成了本发明。
本发明涉及以下内容，(1)到(11)。
(1)生产L-氨基酸的方法，包括：在培养基中培养可以生产L-氨基酸的微生物，对于它们的亲本菌株来说该微生物丙氨酸-缬氨酸转氨酶的活性加强了；使L-氨基酸形成并在培养物中富集，并且从培养物中回收该L-氨基酸。
(2)根据(1)的方法，其中该微生物选自突变体、融合细胞系、转导体和采用DNA重组技术构建的重组菌株。
(3)根据(2)或者(1)的方法，其中微生物选自大肠杆菌属、沙雷氏菌属、棒状杆菌属或者节杆菌属。
(4)根据(1)至(3)的方法，其中微生物为大肠杆菌H-8719/pAD27(FERM BP-7063)或大肠杆菌H-9156/pAD27。
(5)根据(1)的方法，其中L-氨基酸选自L-亮氨酸和L-异亮氨酸。
(6)根据(1)的方法，其中通过增强微生物细胞中丙氨酸-缬氨酸转氨酶基因表达水平来提高丙氨酸-缬氨酸转氨酶的活性。
(7)根据(1)的方法，其中通过增加微生物细胞中丙氨酸-缬氨酸转氨酶基因的拷贝数来提高丙氨酸-缬氨酸转氨酶的活性。
(8)具有生产L-氨基酸的能力，同时与其亲本菌株相比丙氨酸-缬氨酸转氨酶的活性加强了的微生物。
(9)根据(8)的微生物，选自采用DNA重组技术构建的突变体、融合细胞系、转导体和重组菌株。
(10)根据(8)或者(9)的该微生物，选自大肠杆菌属、沙雷氏菌属、棒状杆菌属或者节杆菌属。
(11)根据(8)至(10)的微生物，为大肠杆菌H-8719/pAD27(FERMBP-7063)或大肠杆菌H-9156/pAD27。
以下是本发明的详细说明。
在本发明中，任何一种微生物只要它与其亲本菌株相比丙氨酸-缬氨酸转氨酶的活性加强了，并具有生产L-氨基酸的能力都可以应用。在这里术语“亲本菌株”是指用于构建转导体或者重组菌株、融合细胞系、突变体的起始微生物。与其亲本菌株相比丙氨酸-缬氨酸转氨酶的活性加强的菌株可能是转导体或者重组菌株、融合细胞系、突变体中的任何一种。微生物实例包括从大肠杆菌属、沙雷氏菌属、棒状杆菌属或者节杆菌属中筛选出来的微生物。优选的实例是所谓棒状杆菌属中产谷氨酸的菌株如谷氨酸棒杆菌、Corynebacteriumlactofermentum与大肠杆菌，它们用于氨基酸发酵生产。
特定的亲本菌株实例是能产L-亮氨酸的大肠杆菌H-8719(抗菌株FERM BP-4704诱导产生的4-氮杂亮氨酸的产L-亮氨酸菌株)，与产L-异亮氨酸的大肠杆菌H-9156(FERM BP-5056)。
上述微生物中丙氨酸-缬氨酸转氨酶的活性可以加强，方法有如下几种。
I.采用诱变剂处理带有丙氨酸-缬氨酸转氨酶基因的微生物，从中选择有增强的丙氨酸-缬氨酸转氨酶活性的突变体。
II.采用体外对丙氨酸-缬氨酸转氨酶基因引入突变的方法，筛选引入突变后编码的丙氨酸-缬氨酸转氨酶活性增强的突变基因并将所选基因引入宿主微生物。
III.细胞内丙氨酸-缬氨酸转氨酶的基因拷贝数增加的方法。
IV.体外修饰负责丙氨酸-缬氨酸转氨酶基因表达的序列区域，以增强该酶基因的表达水平，然后用修饰过的基因取代宿主染色体上编码丙氨酸-缬氨酸转氨酶的基因。
利用诱变剂处理带有丙氨酸-缬氨酸转氨酶基因的微生物，然后从中选择具有增强的丙氨酸-缬氨酸转氨酶活性的突变体的上述方法可以例如下述的方式实施。用已知方法以诱变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍处理带有丙氨酸-缬氨酸转氨酶的微生物，然后从突变剂处理的微生物中选出与其接受诱变的亲本菌株相比丙氨酸-缬氨酸转氨酶活性增强了的微生物。微生物丙氨酸-缬氨酸转氨酶的活性可以测量，例如在合适的培养基中培养该微生物，将培养的细胞离心，根据已知的方法破碎所得细胞而制备粗酶溶液，然后用粗酶液和作为底物的L-丙氨酸或丙酮酸和L-缬氨酸进行酶促反应，检测酶促反应生成的L-缬氨酸或L-丙氨酸的量。
采用体外对丙氨酸-缬氨酸转氨酶基因引入突变，并筛选引入突变后丙氨酸-缬氨酸转氨酶活性增强的突变基因的方法包括以下内容：
3)采用位点特异性诱变将碱基缺失、替代或添加引入丙氨酸-缬氨酸转氨酶基因〔Nucleic Acids Research，10，6487(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，5662(1984)；Science，224，1431(1984)；PCTWO85/00817(1985)；Nature，316，601(1985)；Gene，34，315(1985)；Nucleic Acids Research，13，4431(1985)；Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons(1987-1997)〕从而获得编码活性高于诱导前水平的丙氨酸-缬氨酸转氨酶的基因；
4)采用易错聚合酶链式反应将碱基替代随机引入丙氨酸-缬氨酸转氨酶基因〔Bio/Technol.，9，1073(1991)(从现在起聚合酶链式反应即为PCR)〕从而获得编码活性高于诱导前水平的丙氨酸-缬氨酸转氨酶的基因。
编码丙氨酸-缬氨酸转氨酶基因的拷贝数可以增加，如克隆丙氨酸-缬氨酸转氨酶基因以后：
3)将含有编码丙氨酸-缬氨酸转氨酶基因的DNA片段和在所需的微生物细胞中具有自我复制能力的质粒载体连接起来，并将结果得到的质粒引入到该微生物中；或者
4)将含有编码丙氨酸-缬氨酸转氨酶基因的重组DNA以同源重组或者用噬菌体、转座子的方法整合到宿主菌株的染色体上。
体外修饰负责丙氨酸-缬氨酸转氨酶基因表达的序列区域以增强基因的表达水平，然后用修饰过的基因替代宿主染色体上编码丙氨酸-缬氨酸转氨酶的基因的方法示例包括如下内容：
1)用已知在作为引入和表达该基因的宿主的微生物中具有强启动子活性的启动子代替该基因负责基因表达的序列区域；并且
2)采用上述位点特异性诱变或者易错聚合酶链式反应将碱基缺失、替代或者添加引入到具有负责基因表达的核苷酸序列的DNA中，从突变DNA中筛选与突变前相比编码丙氨酸-缬氨酸转氨酶的基因的表达水平提高的DNA。
用于本发明编码丙氨酸-缬氨酸转氨酶的基因可以来自任何细胞，优选来源于微生物，更优选属于大肠杆菌属或者沙门氏杆菌属的微生物。
编码丙氨酸-缬氨酸转氨酶的基因可以通过例如下述的方法获得。
I.当微生物编码丙氨酸-缬氨酸转氨酶基因的核苷酸序列已知时，如大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌的情况，可以用该微生物的染色体DNA做模板在已知序列的基础上采用PCR的方法得到该基因。〔PCRProtocols，Academic Press(1990)〕
II.细胞具有丙氨酸-缬氨酸转氨酶活性，而编码该基因的核苷酸序列未知时，采用传统的方法建立源于该细胞的cDNA文库或者染色体DNA文库〔Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版(1989)(从现在以后简称为分子克隆，第二版)〕，然后，
1)测量构成文库的每种细胞的丙氨酸-缬氨酸转氨酶的活性，筛选含有编码丙氨酸-缬氨酸转氨酶基因的细胞，或者
2)采用菌落杂交或噬菌斑杂交方法(分子克隆，第二版)以大肠杆菌或者鼠伤寒沙门氏菌中的丙氨酸-缬氨酸转氨酶基因作探针从组成文库的细胞中筛选含有编码丙氨酸-缬氨酸转氨酸的基因的细胞。
III.当已知染色体DNA的全基因序列但未确定编码丙氨酸-缬氨酸转氨酶的基因时，采用分析软件如BLAST〔J.Mol.Biol.，215，403(1990)〕或者FASTA〔Methods in Enzymology，183，63(1990)〕从上述全基因中确定具有与大肠杆菌或者鼠伤寒沙门氏菌中的丙氨酸-缬氨酸转氨酶基因高同源性的核酸序列的基因，然后用PCR得到所需的基因。
克隆avtA基因，即大肠杆菌中编码丙氨酸-缬氨酸转氨酶的基因，可以采用例如以下方式。
首先，以来自大肠杆菌属微生物的丙氨酸-缬氨酸转氨酶的基因序列和其邻近序列〔Genbank，注册号AE00434(1998)〕为基础，设计并合成两种引物DNA作为一对引物，例如一对引物DNA分别含有已知为SEQ ID NOs：1和2的核苷酸序列，同时采用该微生物的染色体DNA作为模板，通过PCR扩增含有avtA基因和其启动子序列的区域(约1.9kb)。
将获得的avtA基因和在引入该基因的微生物细胞中能够自主复制的质粒载体连接起来，采用传统的方法将重组载体引入该微生物细胞，由此克隆avtA基因。
在引入编码丙氨酸-缬氨酸转氨酶基因的微生物细胞中能够自主复制的质粒载体，任何一种都可以在本发明中使用。如果引入该基因的微生物是大肠杆菌，那么任何一种可以在大肠杆菌中自主复制的质粒均可应用。合适的质粒包括ZAP Express〔Stratagene；Strategies，5，58(1992)〕，pBluescript II SK(+)〔Nucleic AcidsResearch，17，9494(1989)〕〕λzap II(Stratagene)，λgt10，λgt11[DNA cloning，A Practical Approach， 1，49(1985)，]λTriplEx(Clontech Laboratories，Inc.)，λBlueMid(ClontechLaboratories，Inc.)，λExCell(Pharmacia)，pT7T318U(Pharmacia)，pcD2[Mol.Cell.biol.， 3，280(1983)]，pUC18[Gen e， 33，103(1985)]，pUC 19[Gene， 33，103(1985)]和它们的衍生物。
将avtA基因连接到在引入该基因的微生物细胞中起作用的启动子的下游位置，来提高编码丙氨酸-缬氨酸转氨酶基因的表达水平是可能的。如果引入基因的微生物是大肠杆菌，在宿主细胞中起作用的任何一种启动子均可应用。合适的启动子包括从大肠杆菌、噬菌体等衍生而来的多种启动子如色氨酸启动子(Ptrp)，乳糖启动子，PL启动子，PR启动子和T7启动子。人工设计和修饰的启动子如两个Ptrps串联联接的(Ptrp×2)启动子，tac启动子，lacT7启动子和letI启动子等也可以使用。
优选使用SD序列(核糖体结合序列)与起始密码子距离恰当的质粒(如6到18个碱基)。
将质粒引入到引入基因的微生物细胞内的方法实例包括：电穿孔即利用强电流将外源DNA引入细胞〔Nucleic Acids Research，16，6127(1988)〕，原生质体法(日本已发表但未经审查的专利申请第248394/88号)。质粒引入大肠杆菌时，采用CaCL2处理提高DNA通透性的方法也有用(分子克隆，第二版)。
携带引入的含有编码丙氨酸-缬氨酸转氨酶基因的质粒的微生物可以采用该微生物质粒中抗药基因产生的药物抗性作为指示筛选出来。接下来通过检测丙氨酸-缬氨酸转氨酶活性，以及检测***质粒的DNA片段的限制酶切图谱或者其核苷酸序列可以鉴定如此获得的转化体。
用如此获得的与宿主菌株相比丙氨酸-缬氨酸转氨酶活性增加的产L-氨基酸菌株，采用发酵生产L-氨基酸的普通培养办法就可以生产L-氨基酸。也就是说，进行培养的培养基中含有碳源、氮源、无机盐、维生素和在合适的温度、pH条件下菌株有氧生长所需的其他各种成分。
碳源实例包括多种碳水化合物如葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、或者含有上述糖类的糖蜜、纤维素水解产物、粗糖水解产物和淀粉水解产物等。
氮源实例包括氨、各种有机或者无机酸的铵盐，如氯化铵、硫酸铵、醋酸铵和磷酸铵、胺和其他含氮化合物、蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、豆蛋白水解物、豆饼水解物和多种发酵的微生物细胞及其消化产物。
无机盐实例包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸铁、硫酸镁、硫酸铜和碳酸钙。
培养在有氧条件下进行，例如在通气条件下摇动或者旋动培养。培养温度最好控制在20℃到40℃之间，培养基pH值控制在5到9之间，优选保持在中性附近。调节pH值采用碳酸钙、有机或者无机酸、碱性溶液、氨或者pH缓冲液等。通常培养1-7天L-氨基酸就会在培养物中生成并积累。
从培养物中回收L-氨基酸可以采用已知的方法例如离子交换树脂、浓缩、盐析和沉淀法。〔The Society of Chemical Engineers.Japan(ed.)，Handbook of Bioseparation Process，KyoritsuShuppan(1996)〕
本发明的实施例表示如下。构建这些实施例并非用来限制本发明的范围。
附图简述
图1表示质粒pAD27的结构
图1中使用的符号代表以下内容：
Ampr：抗氨卡青霉素基因
ori：在大肠杆菌中作用的复制起点
avtA：编码源自大肠杆菌的丙氨酸-缬氨酸转氨酶的基因
实施本发明的最佳方式
实施例1  大肠杆菌avtA基因的克隆
将源于大肠杆菌K-12的菌株W3110(ATCC 27325)涂布在LB琼脂糖平板培养基上〔10g/L胰蛋白胨(Difco Laboratories公司)，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，以及15g/L琼脂，pH 7.5〕，接下来于37℃培养24小时。取一接种环的培养细胞接8ml LB培养基〔10g/L胰蛋白胨(Difco Laboratories公司)，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠、pH 7.5〕，接下来于37℃在大试管(直径：25mm，长：200mm)中振荡培养(振荡速度：300rpm)24小时。将获得的培养物(1.25ml)转移到250ml培养基中，于37℃在2-L锥形瓶中振荡培养(振荡速度：200rpm)24小时。
将获得的培养物在4℃以5,000rpm离心10分钟，收集细胞。将获得的细胞用TE缓冲液(10mmol/L三羟甲基氨基甲烷，1mmol/L乙二胺四乙酸二钠盐，pH 7.5)洗涤并收集。采用Saito-Miura方法〔Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)〕从收获的细胞中分离染色体DNA。
为了以染色体DNA作为模板通过PCR扩增avtA基因，在已知avtA基因及附近的核苷酸序列〔Genbank，注册号AE00434(1998)〕的基础上合成寡聚核苷酸引物，分别含有SEQ ID Nos：1和2中的核苷酸序列。含有SEQ ID Nos：1和2核苷酸序列的DNA是引物，它们含有与avtA基因上游含启动子的序列和下游序列同源或者互补的序列。
采用上述染色体DNA和引物对通过PCR扩增avtA基因，PCR每个循环的条件为94℃1分钟，55℃2分钟，72℃2分钟，共设30个循环。
采用T4DNA聚合酶将PCR扩增得到的DNA片段(1.9kb)补平，采用内切酶EcoR I和Pst I酶切质粒载体pUC19后用T4DNA聚合酶补平，然后将两者用T4DNA连接酶连接。用电穿孔法将上述反应产物转化大肠杆菌H-8719。获得的细胞悬液涂布在含有100mg/L氨苄青霉素的LB琼脂平板培养基上，接下来于37℃培养24小时。挑选长在琼脂平板培养基上的克隆，采用多种限制性内切酶分析转化体携带的***质粒的DNA片段的结构，以此来确认avtA基因存在于***的DNA片段中。
采用下述方式检测上述转化体的丙氨酸-缬氨酸转氨酶的活性。在LB培养基中30℃振荡培养(振荡速度：300rpm)24小时以后，分别用8.5g/L的氯化钠水溶液两次、缓冲液A(25mmol/L磷酸钾缓冲液，pH 7.0，50ml/L甘油，0.1mmol/L乙二胺四乙酸三钠盐，0.2mmol/L二硫苏糖醇，0.2mmol/L磷酸吡哆醛)一次悬浮再离心洗涤培养的细胞。然后重新在同一缓冲液中悬浮细胞，浓度为每升100g湿细胞重。超声波破碎悬浮的细胞，离心制备粗酶液。在缓冲液A中加入10mmol/L的丙酮酸、10mmol/L的L-缬氨酸制得反应液，将获得的粗酶液(20ul)加入到980ul反应液中，于37℃反应30分钟。用高效液相色谱(HPLC)检测生成的L-丙氨酸，来测定丙氨酸-缬氨酸转氨酶的活性。高效液相色谱分析如下。
柱子：YMC ODS-AQ312柱
流动相：2.94g/L柠檬酸三纳，1.42g/L硫酸钠，63ml/L正丙醇，3g/L十二烷基磺酸钠，pH 3.75(用2mol/L的硫酸调节)。
流动相流速：2ml/分钟
反应溶液：18.5g/L硼酸，11g/L氢氧化钠，3ml/L Brig-35，0.6g/L邻苯二醛，2ml/L巯基乙醇
反应溶液流速：1ml/min
荧光检测：激发波长345nm
检测波长455nm
结果发现，转化体丙氨酸-缬氨酸转氨酶的活性比被视为1的大肠杆菌H-8719高出10倍多，如此得到的质粒命名为pAD27(图.1)
上述步骤获得的重组大肠杆菌(Escherichia coli)H-8719/pAD27按照布达佩斯条约以保藏号FERM BP-7063于2000年3月2号保存在日本国立生命科学和人体技术研究所(National Institute ofBioscience and Human-Technology，National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology，Ministry ofEconomy，Trade and Industry，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，305-0046，日本)。
从大肠杆菌H-8719/pAD27的培养细胞中提取质粒pAD27，采用电穿孔法将该质粒转化到产L-异亮氨酸的大肠杆菌H-9156中。
采用先前所述的同种方法筛选抗氨苄青霉素的转化体得到带有pAD27的重组大肠杆菌H-9156/pAD27。测量转化体丙氨酸-缬氨酸转氨酶活性的方法也同前所述。结果证实了转化体丙氨酸-缬氨酸转氨酶的活性比被视为1的大肠杆菌H-9156高出10倍多。
实施例2L-亮氨酸的生产测试
检测大肠杆菌H-8719，携带含avtA基因的质粒pAD27的大肠杆菌H-8719/pAD27以及携带质粒载体pUC19的大肠杆菌H-8719/pUC19生产L-亮氨酸的能力，可以采用下述方法。
将H-8719/pAD27和H-8719/pUC19分别涂布到含有100mg/L氨苄青霉素的LB琼脂糖平板培养基上，同时H-8719涂布到不含有氨苄青霉素的LB琼脂糖平板培养基上。每种菌株均在30℃培养24小时。取一接种环的培养细胞接入6ml种培养基(20g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，2.5g/L氯化钠，以及10g/L碳酸钙，pH 7.4)，接下来于30℃在大试管(直径：25mm，长：200mm)中振荡培养(振荡速度：300rpm)17小时。将获得的培养物(0.1ml)转移到6ml生产培养基(65g/L葡萄糖，2g/L玉米浆，16g/L硫酸铵，2g/L磷酸氢二钾，40g/L磷酸镁，以及10g/L碳酸钙，pH7.0)，然后于30℃在大试管(直径：25mm，长：200mm)中振荡培养(振荡速度：300rpm)48小时。
培养完成以后，采用HPLC来检测生成并富集在培养物中的L-亮氨酸，同时检测副产品L-缬氨酸(方法同实施例1中检测L-丙氨酸)。
上述培养物的检测独立测试20次，所得结果的平均值如表1所示。
表1
  菌株 Leu〔g/L〕  Val〔g/L〕  Val/Leu〔％〕
  H-8719   12.1   0.17   1.40
  H-8719/pUC19   12.4   0.18   1.44
  H-8719/pAD27   12.6   0.08   0.65
                                 平均值(n＝20)
上述三个菌株表现出几乎相同的生产L-亮氨酸的能力。菌株H-8719/pAD27中avtA基因的表达水平提高了，它的作为副产品的L-缬氨酸和L-亮氨酸的比值与宿主菌H-8719的相比有恒定的降低，降低率大约为54％。
上述结果表明，副产品L-缬氨酸的生成会干扰发酵产品L-亮氨酸的纯化，但是产L-亮氨酸菌株中avtA基因编码的丙氨酸-缬氨酸转氨酶活性的提高可以显著降低副产品L-缬氨酸生成。
实施例3L-异亮氨酸的生产检测
检测大肠杆菌H-9156，携带含avtA基因的质粒pAD27的大肠杆菌H-9156/pAD27以及携带质粒载体pUC19的大肠杆菌H-9156/pUC19生产L-异亮氨酸的能力，可以采用下述方法。
将H-9156/pAD27和H-9156/pUC19分别涂布到含有100mg/L氨苄青霉素的LB琼脂糖平板培养基上，同时H-9156涂布到不含有氨苄青霉素的LB琼脂糖平板培养基上。每种菌株均在30℃培养24小时。取一接种环的培养细胞接入6ml种培养基(20g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，2.5g/L氯化钠，以及10g/L碳酸钙，pH 7.4)，接下来于30℃在大试管(直径：25mm，长：200mm)中振荡培养(振荡速度：300rpm)17小时。将获得的培养物(0.1ml)转移到6ml生产培养基(65g/L葡萄糖，2g/L玉米浆，16g/L硫酸铵，2g/L磷酸氢二钾，0.1g/L DL-蛋氨酸，40g/L磷酸镁，以及10g/L碳酸钙，pH 7.0)，然后30℃在大试管(直径：25mm，长：200mm)中振荡培养(振荡速度：300rpm)48小时。
培养完成以后，采用HpLC检测生成并富集在培养物中的L-亮氨酸，同时检测副产品L-缬氨酸。检测条件同实施例2所述。
上述培养物的检测独立测试20次，取得的平均值如表2所示。
表2
  菌株   Ile〔g/L〕 Val〔g/L〕   Val/Ile〔％〕
  H-9156   13.4   3.6   26.6
  H-9156/pUC19   13.4   3.4   25.7
  H-9156/pAD27   13.0   1.8   13.9
                                     平均值(n＝20)
上述三个菌株表现出几乎相同的生产L-异亮氨酸的能力。菌株H-9156/pAD27中avtA基因的表达水平提高了，它的作为副产品的L-缬氨酸和L-异亮氨酸的比值与宿主菌H-9156的相比有恒定的降低，降低率大概为48％。
上述结果表明，副产品L-缬氨酸的生成会干扰发酵产品L-异亮氨酸的纯化，但是产L-异亮氨酸菌株中avtA基因编码的丙氨酸-缬氨酸转氨酶活性的提高可以显著降低副产品L-缬氨酸生成。
工业适用性
根据目前的情况，采用丙氨酸-缬氨酸转氨酶(转氨酶C)活性提高并具有产L-氨基酸能力的微生物，降低发酵过程中生成干扰发酵产品L-氨基酸纯化的副产品氨基酸是可能的，如此以来能够提供具有工业优势的生产L-氨基酸的方法。
无序列文本
SEQ ID NO：1-人工序列的描述：合成的DNA
SEQ ID NO：2-人工序列的描述：合成的DNA
                          序列表
<110>KYOWA HAKKO KOGYO CO.，LTD
<120>发酵法生产L-氨基酸的方法
<130>11290WO1
<140>
<141>
<150>JP 00/83648
<151>2000-3-24
<160>2
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的DNA
<400>1
tcgactgtct ggcgcagatg gatacgacct                               30
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的DNA
<400>2
cctgataagc gtagcgcatc aggcaatttt                               30

Claims (6)

1.生产L-亮氨酸或L-异亮氨酸的方法，包括：在培养基中培养属于大肠杆菌属微生物的重组菌株，其能产生L-异亮氨酸或L-亮氨酸且由重组菌株细胞内丙氨酸-缬氨酸转氨酶基因表达水平提高使其丙氨酸-缬氨酸转氨酶的活性增强；使L-异亮氨酸或L-亮氨酸形成并在培养物中积累，以及从培养物中回收该L-异亮氨酸或L-亮氨酸；其中相对于其亲本菌株，该重组菌株能生产的L-异亮氨酸或L-亮氨酸中作为L-异亮氨酸或L-亮氨酸副产品的L-缬氨酸比例下降。
2.根据权利要求1的方法，其中重组菌株为大肠杆菌H-8719/pAD27(FERM BP-7063)或大肠杆菌H-9156/pAD27。
3.根据权利要求1的方法，其中通过增加该重组菌株细胞中丙氨酸-缬氨酸转氨酶基因的拷贝数来增强该微生物的丙氨酸-缬氨酸转氨酶的活性。
4.具有生产L-异亮氨酸能力的大肠杆菌属微生物的重组菌株，其中由于重组菌株细胞内丙氨酸-缬氨酸转氨酶基因表达水平提高使其丙氨酸-缬氨酸转氨酶的活性增强，且其中该重组菌株的亲本菌株能生产L-异亮氨酸。
5.根据权利要求4的微生物，其中大肠杆菌为H-9156/pAD27。
6.大肠杆菌H-8719/pAD27(FERM BP-7063)。
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