CN1500863A - 染色体上fadR基因被敲除的微生物以及通过该突变体发酵生产L-苏氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生产L－苏氨酸的微生物，特征在于其染色体上的fadR基因被敲除；以及一种应用所述突变微生物生产L－苏氨酸的方法。本发明的突变微生物提高了L－苏氨酸的产量。

Description

染色体上fadR基因被敲除的微生物以及 通过该突变体发酵生产L-苏氨酸的方法
发明背景
发明领域
本发明涉及生产L-苏氨酸的微生物及通过用该微生物发酵生产L-苏氨酸的方法。
更具体地，本发明涉及能够高产L-苏氨酸的突变微生物，其染色体上的fadR基因已经通过使用位点特异性的同源重组***如cre基因和loxp位点被“敲除”，这样在L-苏氨酸的生物合成期间aceBAK操纵子的表达就不会受到部分抑制，本发明还涉及通过用该突变体发酵生产L-苏氨酸的方法。
现有技术的描述
L-苏氨酸是一种必需氨基酸，被广泛的用作饲料和食品的添加剂，还被用于药物以及合成某些药品的原料。它已经通过用埃希氏菌属(Escherichia)、棒状杆菌属(Corgneform bateria)、沙雷氏菌属(seratia)和普罗威登斯菌属(Providencia)的人工突变体发酵生产得到。例如，日本专利公开号S56-10037公开了使用埃希氏菌属菌株生产L-苏氨酸的方法，该菌株需要营养物质二氨基庚二酸(diaminopimeric acid)和蛋氨酸，且在苏氨酸生物合成***中具有抗苏氨酸反馈抑制的能力。日本专利特许公开号S58-224684公开了用短杆菌属(Brevibacterium)菌株生产L-苏氨酸的方法，该菌株具有抗S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸和α-氨基-β-羟基戊酸的能力，其需要营养物质L-异亮氨酸和L-赖氨酸。韩国专利申请特许公开号87-8022公开了用必需蛋氨酸的、抗α-氨基-β-羟基戊酸的埃希氏菌属菌株生产L-苏氨酸的方法，该菌株还对至少一种选自利福平、赖氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸和高丝氨酸的物质具有抗性作用，其对L-苏氨酸的分解能力减小。日本专利申请特许公开号H2-219582公开了用普罗威登斯菌属菌株生产L-苏氨酸的方法，该菌株对α-氨基-β-羟基戊酸、L-乙硫氨酸、硫异亮氨酸、羟基硫氨素和磺胺胍具有抗性作用，需要营养物质为L-亮氨酸，及不严格地需要L-异亮氨酸。
然而，上述已知方法存在L-苏氨酸产量不高或者需要加入成本较高的物质如二氨基庚二酸(diaminopimeric)和异亮氨酸作为必需营养物的缺点。换句话说，应用必需二氨基庚二酸(diaminopimeric)的菌株包含额外的二氨基庚二酸(diaminopimeric)发酵过程，这样就增加了L-苏氨酸的生产成本。对于应用需要营养物质异亮氨酸的菌株生产L-苏氨酸的情况来说，需要向发酵介质中加入昂贵的异亮氨酸，因而增加了成本。
为了克服这些缺陷，本发明人开发了一种生产L-苏氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株，该菌株具有抗L-蛋氨酸、L-苏氨酸和L-赖氨酸类似物以及α-氨基丁酸的作用，必需营养物蛋氨酸及不严格地需要异亮氨酸，而且用该菌株发酵生产L-苏氨酸比现有菌株的产率更高。该菌株以及用所述菌株生产L-苏氨酸的方法已经在韩国被授予专利权，韩国专利公开号92-8365。
本发明人继续研究以开发具有更高L-苏氨酸产率的菌株，研究焦点在于脂肪酸分解相关操纵子(fad操纵子)和乙醛酸支路操纵子(aceBAK操纵子)表达的调控因子-fadR基因。众所周知，当细胞内脂肪酸的浓度较高时，FadR蛋白抑制fad操纵子和aceBAK操纵子的表达，而当细胞内脂肪酸的浓度较低时FadR蛋白增加脂肪酸生物合成相关操纵子的表达(J.E.Cronan Jr.和D.Lapore，E.coli and Salmonella，Vol 1，pp 211-214)。AceBAK操纵子参与由丙酮酸生物合成草酰乙酸的过程该过程包括柠檬酸循环(TCA循环)的中间体异柠檬酸转化为乙醛酸、乙醛酸转化为苹果酸和苹果酸转化为草酰乙酸的过程。同时，柠檬酸循环还通过八(8)通路参与丙酮酸生物合成草酰乙酸，且在此过程中，中间体被转化为其它代谢中间体包括二氧化碳。在这种情况下，当aceBAK操纵子的表达减少时，乙醛酸循环则受到抑制，因而增加了碳源通过柠檬酸循环转化为其它代谢中间体的转化率，导致等量碳源生产L-苏氨酸的产量的降低。
因此，为了开发出能够通过增加aceBAK表达而生产高浓度L-苏氨酸的菌株，必须将fadR基因敲除。
另外，当抗生素标记整合到染色体中之后，该标记就不能再用于敲除另一个基因。因此还要求将标记从染色体上除去，因而本发明人将位点特异性重组***cre/loxp应用于fadR基因的敲除。
发明概述
本发明人通过敲除菌株染色体上fadR基因而开发出一种高产L-苏氨酸的菌株，并通过用所述菌株发酵成功的获得显著提高的L-苏氨酸的产率。
首先，本发明提供一种生产L-苏氨酸的微生物，该微生物染色体上的fadR被敲除。
第二，本发明提供一种生产生产L-苏氨酸的微生物的方法，包括构建fadR基因或其DNA片段的敲除盒，将该构建物导入提到的生产L-苏氨酸的微生物中，使该外来构建物与该微生物染色体上的fadR基因进行重组，并筛选fadR基因被敲除的突变微生物。
第三，本发明提供一种通过发酵生产L-苏氨酸的方法，包括培养染色体上fadR基因被敲除的微生物，及纯化培养物中的L-苏氨酸。
第四，本发明提供fadR或其DNA片段的敲除盒，该盒通过将两端侧翼连接loxp位点的抗生素标记***fadR基因而构建，而loxp位点用于由表达编码loxp位点特异性重组酶的cre基因而去除整合突变体的染色体上的抗生素标记。
附图的简要说明
图1描述了本发明的重组质粒pT7Blue/fadR的构建。
图2描述了由重组质粒pT7fadR∷loxpcat构建DNA片段ΔfadR∷loxpcat。
图3通过DNA印迹分析显示本发明的fadR基因的染色体重组。
发明详述
根据本发明，用于发酵的微生物表征为fad操纵子和aceBAK操纵子表达的调控因子fadR基因被敲除。具体地，本发明应用该突变微生物发酵生产L-苏氨酸，该微生物染色体上的fadR基因已经通过同源重组被敲除，这样aceBAK操纵子的表达就不会受到fadR蛋白的抑制，而在L-苏氨酸的生物合成中有利地进行。
一些具有生产L-苏氨酸能力的原核和真核微生物可以用于本发明。合适微生物的代表性实例包括但不限于属于埃希氏菌属、棒状杆菌属、沙雷氏菌属和普罗威登斯菌属的菌株，现有技术已经应用这些菌属菌株的发酵生产L-苏氨酸。在本发明的优选实施方案中，微生物包括但不限于生产L-苏氨酸的大肠杆菌菌株，该菌株抗L-蛋氨酸、L-苏氨酸、和L-赖氨酸类似物以及α-氨基丁酸，并且需要营养物质蛋氨酸，不严格地需要异亮氨酸。在本发明的另一个优选的实施方案中，微生物包括突变体，在该突变体中，除了含有编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)和苏氨酸操纵子所包含的酶类的内源基因外，至少一个拷贝的选自外源ppc基因和苏氨酸操纵子所包含的thrA、thrB以及thrC基因的基因被另外引入染色体DNA中。
位于生产L-苏氨酸的微生物的染色体上的fadR基因的敲除可以通过本领域技术人员公知的合适的敲除突变技术实现。此处所述的“敲除突变”指在体外以遗传工程破坏天然染色体DNA，一般在蛋白质编码区，从而使能够方便地但非必须地提供显性选择性标记的外来DNA片段被***到天然序列中。在蛋白编码区进行敲除突变可以防止野生型蛋白的表达，而这常导致丧失该蛋白正常功能。
敲除的操作步骤可以通过将敲除盒与能够摄取DNA的生产L-苏氨酸的微生物的培养物进行混和而进行。
由于微生物可以自然地被转化，因此优选通过适当的方法使细胞具备DNA摄取功能(参见例如LeBlanc等的Plasmid 28，130-145，1992；Pozzi等的J.Bacteriol.178，6087-6090，1996)。“敲除盒”指具有外来DNA片段的天然染色体DNA片段，该外来DNA片段可以提供选择性的标记。在一个实施方案中，“敲除突变盒”通过用外来DNA序列断开基因组DNA片段，并以敲除盒置换野生型染色体序列拷贝实现。在该实施方案中，敲除流程包括将外来DNA片段克隆到目标DNA中，以使含有目标位点DNA的“尾”保留敲除盒的5’和3’端。该尾巴至少具有50个碱基对，优选多于200至500个碱基对，以产生高效的重组和/或基因转换。为方便起见，克隆至目标DNA的外来基因也提供选择性的标记，例如，抗生素抗性基因。目标DNA上***抗生素抗性基因后，转化株的筛选在含有适量的合适抗生素的琼脂平板上进行。转化后，部分摄取了敲除盒的细胞将在盒的基因组DNA尾部进行同源重组或者基因转换，结果使野生型基因组序列被敲除盒所置换。敲除重组的发生可以很容易地通过例如DNA印迹杂交或更方便地通过PCR进行鉴定。
在一个实施方案中，本发明的敲除突变包括以下步骤：从具有生产L-苏氨酸的能力的菌株中分离基因组DNA，以基因组DNA为模板，用常规技术进行PCR以扩增fadR基因，从而获得PCR扩增产物，将fadR基因克隆至合适的质粒或其它载体，所得重组载体通过转导被引入宿主细胞例如大肠杆菌。转化株在培养基中生长增生后，将带有fadR基因的重组载体提取出来。将抗生素抗性基因片段***提取的载体的fadR基因中，构建成敲除重组载体，该敲除重组载体通过转化被引入宿主细胞，将宿主细胞在合适的培养基中进行培养。然后，将增殖的重组载体从所得的转化株中分离出来，经过合适的限制性酶处理获得fadR基因的敲除盒片段。然后，通过常规的技术例如电穿孔将该片段导入能够生产L-苏氨酸的宿主中。结果，通过抗生素抗性分离出在反复生长中获得具有敲除fadR基因特征的宿主，宿主染色体上的野生型fadR基因已被含抗生素标记的fadR基因取代。
熟练的技术人员都知道本发明的敲除盒和DNA节段或其片段可以通过一般的克隆方法制得。优选用针对此处公开的任何序列的任何合适区域的寡核苷酸引物的PCR扩增方法。PCR扩增的方法在本领域广为人知。参见例如PCRProtocols：A Guide to Method and Application，Ed.M.Innis等，AcademicPress(1990)或美国专利号4889818，此处引用作为参考。PCR包括基因组DNA、合适的酶、引物和缓冲液，并在DNA热循环仪中方便地进行(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，Conn.USA)。阳性PCR结果可以通过例如进行琼脂糖凝胶电泳后检测合适大小的DNA片段而鉴定。
在优选的实施方案中，本发明应用生产L-苏氨酸的大肠杆菌菌株作为生产L-苏氨酸的微生物，该菌株抗L-蛋氨酸、L-苏氨酸和L-赖氨酸类似物以及α-氨基丁酸，并需要营养物质蛋氨酸，及不严格地需要异亮氨酸。
L-蛋氨酸类似物包括但不限于D，L-乙硫氨酸、正亮氨酸、α-甲基蛋氨酸和L-蛋氨酸-D，L-硫代亚胺。L-苏氨酸类似物包括但不限于α-氨基-β-羟基戊酸和D，L-苏氨酸hydroxamate。
L-赖氨酸类似物包括但不限于S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸和δ-甲基-L-赖氨酸。
在特别优选定实施方案中，本发明应用新的大肠杆菌突变体KCCM 10236作为生产L-苏氨酸的微生物，该突变体染色体的fadR基因已被敲除，该突变体比其母菌株KCCM10236具有更高的L-苏氨酸生产力。该突变体通过电穿孔将敲除盒ΔfadR∷loxpcat转化至大肠杆菌KCCM10236而制得，该菌株抗L-蛋氨酸、L-苏氨酸和L-赖氨酸类似物以及α-氨基丁酸，并需要营养物质蛋氨酸，及不严格地需要异亮氨酸。敲除盒ΔfadR∷loxpcat被从重组质粒构建物pT7fadR∷loxpcat中切出，该pT7fadR∷loxpcat由重组质粒构建物pT7blue/fadR衍生而来。该新的突变体被称为大肠杆菌(Escherichia coli)FTR1201，并根据布达佩斯条约于2002年9月13日保藏于韩国微生物保藏中心，登记号为KCCM-10422。
大肠杆菌KCCM10236由大肠杆菌KCCM TF4076(KFCC 10718)突变而来，后者需要营养物质蛋氨酸并抗L-苏氨酸类似物(例如，α-氨基-β-羟基戊酸)、L-赖氨酸类似物(例如，S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸)、L-异亮氨酸类似物(例如，α-氨基丁酸)、蛋氨酸类似物(例如，乙硫氨酸)等。
大肠杆菌KCCM TF4076已在韩国专利公开号92-8365中进行描述，此处引用作为参考。大肠杆菌KCCM10236与大肠杆菌KCCM TF4076的不同点在于其具有两个磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)基因和两个L-苏氨酸(thr)操纵子。源于大肠杆菌KCCM TF4076染色体的ppc基因和thr操纵子通过聚合酶链式反应进行扩增并另外整合到大肠杆菌KCCM TF4076中而生成大肠杆菌KCCM10236。
ppc基因催化磷酸烯醇丙酮酸形成草酰乙酸。这样，磷酸烯醇丙酮酸就是苏氨酸生物合成通路中间体的草酰乙酸的前体。因此大肠杆菌KCCM 10236的特征在于其可以增强ppc基因以及涉及从天门冬氨酸生物合成苏氨酸的三个基因thrA、thrB和thrC的表达，这些基因分别编码天门冬氨酸激酶、I/高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合成酶，从而提高L-苏氨酸的产量。
基因组DNA从大肠杆菌KCCM 10236中提取得到。以基因组DNA为模板对fadR基因进行PCR扩增。PCR产物上样于琼脂糖凝胶进行电泳。这样将分离得到的fadR基因或DNA片段克隆到合适的载体。将产生抗生素抗性的基因DNA片段***到所构建的重组载体上的fadR基因区域来诱导fadR基因的敲除。
包括抗生素抗性DNA片段的敲除fadR基因盒从所得重组载体上分离出来。将分离得到的敲除fadR基因盒通过常规方法如电穿孔转化到生产L-苏氨酸的微生物如大肠杆菌KCCM 10236，从而获得具有高产L-苏氨酸能力的突变菌株。
在敲除fadR基因或其片段的制备中用到的术语“载体”是指能够携带外来fadR基因或其DNA片段的核酸分子，该载体被连接在fadR基因或其DNA片段上并能将其引入宿主细胞中。载体的实例有天然来源或重组合成的质粒、粘粒、病毒和噬菌体。利用本发明的染色体上fadR基因被敲除的生产L-苏氨酸的突变微生物生产L-苏氨酸，可以用普通培养宿主细胞例如细胞和酵母的方法进行。作为生产L-苏氨酸培养基，只要含有适当的碳源、氮源、无机物质和微量菌株必需的营养，任何合成的培养基和天然培养基都可以被应用。
碳源的实例包括碳水化合物，如葡萄糖、果糖、乳糖、糖浆、纤维素水解物、粗制砂糖水解物和淀粉水解物，有机酸例如丙酮酸、乙酸、富马酸、苹果酸和乳酸，以及醇类如甘油和乙醇。氮源的实例包括氨、各种无机盐(例如氯化铵、硫酸铵、醋酸铵和磷酸铵)，有机酸的铵盐、胺、蛋白胨、肉类提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、豆饼水解物，各种发酵的细胞或其被消化的物质。
无机物质的实例包括KH2PO4，K2HPO4，MgCl2，NaCl，Fe3(SO4)2，MgSO4，CuSO4，CaCl2和CaCO3。
培养在有氧的环境下进行，例如在有氧的条件下进行震荡培养或自旋器培养。培养温度在20-40℃范围内，优选28-37℃。培养基的pH范围为pH5-9，优选中性左右条件。pH通过用碳酸钙、有机或无机酸、碱液、铵、pH缓冲液等进行调节。
通常，经过1-7d的培养即可在培养物中形成和富集L-苏氨酸。可选的培养过程包括例如任何连续的操作或半连续操作以及分批操作。
培养完成后，除掉培养物中的沉降物例如细胞，结合使用离子交换色谱、浓缩、除盐等方法可以回收出L-苏氨酸。例如，通过以下方法从培养液中回收L-苏氨酸：除去培养液中的细胞，用盐酸调节至pH2，然后通过强酸离子交换树脂，吸附物用稀氨水进行洗脱，蒸馏除去氨，浓缩残留液。然后浓缩物中加入乙醇，然后冷却形成晶体，收集晶体即得L-苏氨酸。
现在通过一些具体的实施例对本发明进行说明，但这不能被认为是限定。
实施例1
构建重组质粒以及敲除fadR基因
应用QIAGEN Genomic-tip***从生产苏氨酸的大肠杆菌KCCM10236菌株中提取基因组DNA。将包括fadR基因的ORF(开放读框)的DNA片段(约0.8kb)用提取的基因组DNA作模板和一对寡核苷酸5’-TCG CGG AAG AGT ACA TTATTG-3’(正向引物)和5’-ATC GGC GCA AAG AAG TCC-3’(反向引物)通过PCR进行扩增。PCR进行30次循环，各包括依次的在94℃下变性30秒，在55℃退火30秒和在72℃扩增60秒。
将PCR产物上样于1.0％琼脂糖凝胶进行电泳。从凝胶上切下0.8kb的fadR基因条带进行洗脱。将所得的fadR基因连接到克隆载体pT7Blue(Novagen Inc.USA)的EcoRV位点上于16℃过夜，从而构建重组质粒pT7Blue/fadR(参见图1)。将所得质粒构建物转化至大肠杆菌NM522。转化的菌株涂布在含50mg/L的羧苄青霉素的固体培养基上于37℃培养过夜。
用铂环挑取形成的克隆并转接至3ml含羧苄青霉素的液体培养基中。培养过夜后，用QIAGEN Mini Prep Kit从培养物中提取质粒DNA。所提取的质粒DNA用限制酶SacII消化，确定fadR基因已被克隆。已确认的质粒pT7Blue/fadR基因用SacII进行切割，如此形成的DNA片段于0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳。从凝胶上切下约3.8kb条带进行洗脱。将该3.8kb的DNA片段通过Klenow酶处理进行末端平端化。将所得DNA片段与包括loxp区的约1.1kb的氯霉素抗性基因片段进行平端连接，后者由HincII限制酶消化质粒ploxpcat2(Gosset等人，A family of removable cassettes designed to obtain Al-resistance-freegenomic modification of E.coli，Gene 247，pp255-264)得到，从而构建得到约5.0kb的重组质粒pT7ΔfadR∷loxpcat(见图2)。
将重组质粒pT7ΔfadR∷loxpcat转化大肠杆菌NM522。将所得转化株在含50mg/L的羧苄青霉素和15mg/L氯霉素的固体培养基板上划线培养，于32℃培养过夜。用铂环挑取克隆并转接至3ml含羧苄青霉素和氯霉素的液体培养基中。
培养过夜后，用QIAGEN Mini Prep Kit提取质粒DNA。将提取的质粒DNA用KpnI和PstI限制酶消化，如此形成的DNA片段于0.7％琼脂糖凝胶进行电泳。从凝胶中切下约2.2kb条带进行洗脱(见图2)。将所得的约2.2kbDNA片段ΔfadR∷loxpcat通过电穿孔转化至大肠杆菌KCCM 10236中，将转化的大肠杆菌KCCM 10236在含氯霉素的琼脂培养基上划线培养。将筛选的克隆产物于烧瓶中进行L-苏氨酸生产试验。
实施例2
利用筛选的菌株在锥形瓶中生产L-苏氨酸
将从实施例1中筛选的三十个克隆产物于载有下表1所示的苏氨酸滴定培养基(threonine titration medium)的锥形瓶中进行培养，并将L-苏氨酸产物进行对比。
表1
成分 浓度(每升)
葡萄糖  70g
硫酸铵  28g
 KH2PO4  1.0g
 MgSO4.7H2O  0.5g
 FeSO4.7H2O  5mg
 MnSO4.8H2O  5mg
 碳酸钙  30g
 L-蛋氨酸  0.15g
酵母提取物  2g
 pH7.0
每个克隆产物在LB琼脂培养基上于32℃震摇培养。
用铂环将培养物转接到25ml滴定培养基中并于32℃和250/min的条件下进行震摇培养48h。滴定结果见下表2。
表2
 L-苏氨酸 23g/L  24g/L  25g/L  26g/L
菌株序号 1  23  5  1
从结果可以看出本发明的转化株的L-苏氨酸产量约24-25g/L。因此，本发明的fadR基因被敲除的转化大肠杆菌KCCM10236比原型菌株KCCM 10236的23g/L L-苏氨酸的产量更高。而且，可以观测出本发明转化的微生物与原型菌株相比发酵培养基的L-苏氨酸的产出提高达约8％。其中一个菌株被称为大肠杆菌FTR1201(KCCM-10422)。
实施例3
通过DNA印迹确证fadR基因被敲除。
通过Southern印迹确证fadR基因是否已经从选自实施例2的菌株中被敲除。将原型菌株KCCM10236和本发明的菌株FTR1201在3ml含氯霉素的液体培养基中培养过夜。用QIAGEN基因组Kit20从培养物中提取基因组DNA。
将提取的基因组DNA用XmnI限制酶切割过夜。在0.7％的琼脂糖凝胶上进行电泳分离合适大小的产物DNA片段。电泳完成后，琼脂糖凝胶中DNA分子通过毛细转移法(Molecular Cloning vol.1.pp6.31-6.38)转移至尼龙膜上(YOUNG Sci.Biodyne B Membrane)。将膜干燥，DNA分子通过UV照射(120mJ/cm2，SpectroLinkerTM)被固定在干燥的膜上。
将该膜用预杂交溶液I(#1093657)在55℃下处理2h。加入变性DNA探针后，在55℃的烘箱(BAMBINO230300)中杂交过夜。
所用变性DNA探针的生产方法如下：用HincII限制酶消化分离的质粒ploxpcat2，通过QIAGEN Kit获得约1.1kb的含loxp区的氯霉素抗性基因DNA片段。所得DNA片段于100℃水浴加热5min，立即在冰上冷却5min即得单链DNA分子，用DIG标记和检测试剂盒(Roche #1093657)在37℃下将其进行DIG标记，即制得DIG-UDP标记的DNA探针。
杂交完成以后，用洗涤溶液I和II(Roche #1093657)除去膜上非特异杂交的DNA分子。室温下在膜上覆盖一层预杂交缓冲液2(Roche #1093657)保持30min，将膜于室温下与能与DIG-UTP特异结合的抗-DIG抗体反应30min。
用洗涤液III(Roche #1093657)将与膜非特异结合的抗-DIG抗体除去，用上述标记和检测试剂盒(Roche #1093657)将膜进行染色处理(chromatized)以将条带显示出来。用FLA-5000成像***(FUJIFLIM)对图像进行扫描。结果见附图3。原型菌株KCCM 10236(第3泳道)没有显示出条带，因为其不具备氯霉素抗性基因。相比之下，本发明菌株FTR1201(KCCM 10422)(第2泳道)显示出预期的约2.8kb的条带。据悉该条带包括1.7kb长度的fadR基因和约1.1kb的氯霉素抗性基因DNA片段。
实施例4
在发酵槽中生产L-苏氨酸
在5L的发酵槽中用本发明的菌株FTR1201(KCCM-10422)生产L-苏氨酸，将其与原型菌株KCCM 10236进行比较。接种培养基的成分见下表3。
表3
成分 浓度(每升)
葡萄糖  50g
 KH2PO4  4g
(NH4)2SO4  6g
酵母提取物  3g
 MgSO4.7H2O  2g
 L-蛋氨酸  1g
 FeSO4.7H2O  40mg
 MnSO4.8H2O  10mg
 CaCl2.2H2O  40mg
 CoCl2.6H2O  4mg
 H3BO3  5mg
 Na2MoO4.2H2O  2mg
 ZnSO4.7H2O  2mg
 pH7.0
在LB培养基中补充10g/L的葡萄糖和0.1g/L的L-蛋氨酸，作为种子培养基。将发酵槽中初始接种体积调节为起始培养基的3％至5％。在葡萄糖的耗尽点补充葡萄糖共6次。每次补充后，葡萄糖的浓度为5％。在补充葡萄糖时，同时加入1％重量的单钾磷酸盐(KH2PO4)。起始和终止培养物体积分别为1.5L和3.0L，至发酵结束时所有加入的葡萄糖的浓度为250g/L。发酵在以0.5vvm流速通氧、1000rpm转速搅拌和32℃温度条件下进行90小时。pH通过自动进气口通入25％至28％的氨气进行调节使其维持在7.0。
结果见下表4。
表4
菌株 L-苏氨酸浓度(g/L) 产率(％)
原型KCCM 10236  93.5  37.4
FTR1201 KCCM 10422  102  41
原型菌株10236生产出93.5g/L的L-苏氨酸，以消耗的葡萄糖计算产率为37.4％。相比之下，本发明菌株FTR1201生产出102g/L的L-苏氨酸，以消耗的葡萄糖计算产率为41％，因此与原型菌株相比L-苏氨酸的产率增加了约9％。
本发明的fadR基因被敲除的生产L-苏氨酸的突变微生物提高了L-苏氨酸的产量。

Claims (9)

1.生产L-苏氨酸的突变微生物，其特征在于其染色体上存在的fadR基因被敲除。
2.根据权利要求1的突变微生物，其为大肠杆菌。
3.根据权利要求2的突变微生物，其抗L-蛋氨酸、L-苏氨酸和L-赖氨酸类似物以及α-氨基丁酸，且需要营养物质蛋氨酸，及不严格地需要异亮氨酸。
4.根据权利要求1的突变微生物，其染色体DNA含有下列基因的至少一个额外拷贝：ppc基因和包含于苏氨酸操纵子的thrA、thrB以及thrC基因。
5.根据权利要求1至4任意一项的突变微生物，其为大肠杆菌FTR1201(KCCM-10422)。
6.开发生产L-苏氨酸的突变微生物的方法，其包括构建fadR基因或其DNA片段的敲除，将该DNA构建物导入指定的生产L-苏氨酸的菌株以使外来DNA构建物与该微生物染色体上存在的fadR基因进行同源重组，和筛选fadR基因被敲除的突变微生物。
7.fadR基因或其DNA片段的敲除盒，其特征在于将抗生素标记***fadR基因使其被敲除。
8.根据权利要求7的盒，其中被敲除的fadR基因盒的DNA片段为ΔfadR∷loxpcat。
9.生产L-苏氨酸的方法，其包括培养权利要求1的突变微生物以及从培养物中分离L-苏氨酸。
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