CN107365715A - 一种高产2‑苯乙醇的产甘油假丝酵母工程菌的制备方法及应用 - Google Patents

一种高产2‑苯乙醇的产甘油假丝酵母工程菌的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高产2‑苯乙醇的产甘油假丝酵母工程菌的制备方法及应用，属于基因工程技术领域。产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes CCTCC M 93018)是一株二倍体菌株，与单倍体菌株相比具有生长速度快，生活能力强，遗传稳定，防止致死或有害突变的优势。同时产甘油假丝酵母作为一株优良的2‑苯乙醇生产菌株，且拥有耐受高浓度2‑苯乙醇(4g/L)的特性为菌株的代谢改造提供了有利的基础。本发明利用基因敲除技术，敲除了二倍体产甘油假丝酵母菌株2‑苯乙醇合成竞争途径的乙醛脱氢酶基因ALD3。与原始的产甘油假丝酵母菌株相比，ALD3敲除突变菌株2‑苯乙醇产量提高了18.5％，达到3.65g/L。

Description

一种高产2-苯乙醇的产甘油假丝酵母工程菌的制备方法及 应用
技术领域
本发明涉及一种高产2-苯乙醇的产甘油假丝酵母工程菌的制备方法及应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
2-苯乙醇，具有淡雅、细腻而持久的玫瑰香气，是大多数香精的香基，在香精香料界备受重视。近几年，2-苯乙醇广泛应用于医药、食品、化妆品、烟草和日化用品等产业中，市场需求量不断增大。2-苯乙醇在自然界主要存在于玫瑰、茉莉、水仙等植物精油中，天然含量较低，现常用水汽蒸馏法提取但损失较大，往往不能满足人们的需求。
2-苯乙醇的化学合成法存在危害人类健康和环境安全、产物纯化困难等诸多弊端。随着生活水平的提高和对健康的关注，人们越来越重视食品的安全性，更崇尚“绿色”和“天然”，食品生产也越来越倾向使用天然添加剂。在美国和欧洲，能被标记为“天然”的调味剂和芳香剂必须是采用物理方法从天然材料中提取和酶催化或者微生物发酵法生产。因此随着人们对绿色、安全、天然添加剂的需求日益升温，开发微生物生产天然2-苯乙醇成为一种新趋势。
目前微生物合成苯乙醇的方法主要集中在利用酵母菌对L-苯丙氨酸进行生物转化。L-苯丙氨酸合成2-苯乙醇首先由氨基酸转氨酶催化生成苯丙酮酸，再由苯丙氨酸脱羧酶催化生成苯乙醛，最后在乙醇脱氢酶作用下生成2-苯乙醇，即艾利希途径。但苯乙醛也可在乙醛脱氢酶的催化下生成乙酸苯酯(代谢途径见图1)，因此在竞争途径存在下会影响2-苯乙醇的生成。然而高浓度的2-苯乙醇对微生物细胞有一定的毒性。研究表明2.5g/L 2-苯乙醇能使得酿酒酵母生物量降低75％，3g/L 2-苯乙醇几乎能完全抑制酿酒酵母菌株生长(Seward RJ,Willets MG,Dinsdale,et al.The effects of ethanol,hexan-1-ol,and 2-phenylethanol on cider yeast growth,viability,and energy status；Synergisticinhibition[J].J I Brewing.1996,102(6):439-443.)。因此2-苯乙醇对菌体的毒性在很大程度上阻碍了通过代谢改造提高2-苯乙醇产量的策略。
产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes CCTCC M 93018)是一株二倍体菌株，与单倍体菌株相比具有生长速度快，生活能力强，遗传稳定，防止致死或有害突变的优势。同时产甘油假丝酵母作为一株具有优良发酵2-苯乙醇性能的菌株，具有耐受高浓度2-苯乙醇(4g/L)的特点，为代谢改造菌株提高2-苯乙醇的产量提供了有利的基础。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高产2-苯乙醇的产甘油假丝酵母工程菌株，敲除2-苯乙醇合成竞争途径的乙醛脱氢酶基因ALD3。
本发明还提供了一种构建高产2-苯乙醇的产甘油假丝酵母工程菌株的方法，敲除2-苯乙醇合成竞争途径的乙醛脱氢酶基因ALD3，获得高产苯乙醇的产甘油假丝酵母工程菌株。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种发酵生产苯乙醇的方法。内容如下：
(1)挑取1环产甘油假丝酵母接入种子培养基(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量为水)中，在30℃，200r/min条件下，振荡培养18h，得到液态种子。
(2)将步骤(1)得到的液态种子按5％(v/v)的接种量接入发酵培养基(L-苯丙氨酸7g/L，葡萄糖90g/L，KH2PO4 5g/L，酵母粉1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，余量为水)中，控制发酵温度为30℃，转速为200r/min，时间为72h，发酵结束。
本发明的有益效果：
1.产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes CCTCC M 93018)是一株二倍体菌株，与单倍体菌株相比具有生长速度快，生活能力强，遗传稳定，防止致死或有害突变的优势。
2.本发明所选的产甘油假丝酵母菌株是一株具有优良2-苯乙醇发酵性能的菌株，且与其他2-苯乙醇生产菌株相比可以耐受更高浓度的2-苯乙醇(4g/L)，有效克服了2-苯乙醇在发酵过程中对菌株的毒害作用，为代谢改造菌株提高2-苯乙醇的产量提供了有利的基础。
3.本发明所选的产甘油假丝酵母菌株已敲除了2-苯乙醇合成竞争途径的乙醛脱氢酶基因ALD3，与原始的产甘油假丝酵母菌株相比，ALD3敲除菌株2-苯乙醇产量提高了18.5％，达到3.65g/L。
附图说明
图1 L-苯丙氨酸生物转化合成2-苯乙醇途径的概要。
图2质粒pADHuha。
图3质粒pADHuhb。
图4乙醛脱氢酶基因ALD3敲除原理示意图。
图5基因工程菌株摇瓶发酵合成2-苯乙醇。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进一步详细描述。
实施例1
ALD基因单拷贝敲除的杂合子突变株的构建
(1)敲除片段的合成
PCR扩增2.5kb的ALD3基因片段，该片段中包括ALD3基因上游500bp-0bp的核酸序列(PloALDa，SEQ ID No.2)，ALD3基因及ALD3基因下游0p-500bp的核酸序列(TloALDa，SEQID No.3)。并与pMD19-T simple连接，得到重组质粒19T-ALDa。然后以19T-Ald3a为模板，反向PCR获得含有两段同源臂的PloALDa-19T-TloALDa片段，通过酶切位点与筛选标记HisG-URA5-HisG(HUH)片段连接，获得敲除质粒19T-PloALDa-HUH-TloALDa，命名为质粒pADHuha，限制性内切酶BamH I切割质粒pADHuha得到线性化的敲除片段
(2)ALD3基因第一条链的敲除
挑取一环产甘油假丝酵母菌株接种在液体YPD培养基，30℃过夜培养。取100μL过夜培养液转接到新鲜YPD中，30℃培养4-6小时，使培养液OD600达到0.8-1.2，离心收集菌体。用醋酸锂转化法，将上述得到的线性化的敲除片段转化产甘油假丝酵母菌株制成的感受态细胞中，转化后涂布在MM平板，30℃培养2-3天获得单菌落。挑取单菌落提取基因组进行PCR验证正确后，获得ALD3基因单拷贝敲除的杂合子突变株。
(3)筛选标记的剔除
将ALD3基因单拷贝敲除的杂合子突变株在YPD培养基中培养到OD600到1.0时，离心收集菌体，用无菌去离子水清洗，涂布2×FOA平板，30℃培养2-3天出现单菌落。挑取单菌落提取基因组PCR验证，将获得的URA5标记基因剔除的突变株进行保藏，作为第二条链敲除的转化宿主菌。
实施例2
ALD3基因双拷贝敲除的纯合子突变株的构建
(1)敲除片段的合成
PCR扩增1.5kb的ALD3基因片段，并与pMD19-T simple连接，得到重组质粒19T-ALD3b。然后以19T-Ald3b为模板，反向PCR获得含有两段同源臂的PloALDb-19T-TloALDb片段，通过酶切位点与筛选标记HisG-URA5-HisG(HUH)片段连接，获得敲除质粒19T-PloALDb-HUH-TloALDb，命名为质粒pADHuhb，限制性内切酶BamH I切割质粒pADHuhb得到线性化的敲除片段。
(2)ALD3基因第二条链的敲除
挑取一环ALD3基因单拷贝敲除的杂合子突变株接种在液体YPD培养基，30℃过夜培养。取100ul过夜培养液转接到新鲜YPD中，30℃培养4-6小时，使培养液OD600达到0.8-1.2，离心收集菌体。用醋酸锂转化法，将上述得到的线性化的敲除片段转化ALD3基因单拷贝敲除的杂合子突变株制成的感受态细胞中，转化后涂布在MM平板，30℃培养2-3天获得单菌落。挑取单菌落提取基因组进行PCR验证正确后，获得ALD3基因双拷贝敲除的纯合子突变株。
实施例3
分别挑取1环原始的产甘油假丝酵母、ALD3基因双拷贝敲除的纯合子突变株接入种子培养基(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量为水)中，在30℃，200r/min条件下，振荡培养18h，得到液态种子。将得到的液态种子按5％(v/v)的接种量接入接入含有30mL发酵培养基(L-苯丙氨酸7g/L，葡萄糖90g/L，KH2PO4 5g/L，酵母粉1g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，余量为水)的250mL锥形瓶中，控制发酵温度为30℃，转速为200r/min，时间为72h，发酵结束。
发酵液中2-苯乙醇的测定方法，采用高效液相色谱法(HPLC)分析，具体如下：将发酵液进行离心，10,000r/min，离心后再用0.45μm微孔滤膜过滤处理，滤液立即上高效液相色谱仪(Agilent,USA)，色谱柱为C18柱(250mm×4.6mm,10μm；Ailite,中国)，流动相为甲醇:水＝50:50(v/v)，流动相流速0.7mL/min，柱温30℃，检测波长260nm，进样10μL。发酵结束后所得的发酵液进行2-苯乙醇含量的检测。与原始的产甘油假丝酵母菌株相比，ALD3敲除突变株菌株2-苯乙醇产量提高了18.5％，达到3.65g/L。
序列表
江南大学
一种高产2-苯乙醇的产甘油假丝酵母工程菌的制备方法及应用
7
1
1509
DNA
1
ATGATGTCAGCACTGTTCAGAACCATTGAGACTCCAAACGGTAAAACCCTGGAACAACCACTGGGTCTCTTCATCGACAATGAGTGGGTGAAAACAAACCGTACTTTTGAGACCATTAATCCGTCCACAGGTGAGGCGATCTGTCATGTTTACCGTGCTGGGGTCCAGGAGGTGAACGACGCTGTCGAAGCTGCAAATAGAGCATTTAGAAACGAATCTTGGTCAGGTCTAACTGGTTCTCAACGTGGCGATTTACTGTATCGCATGTACCAAGTTATCAAAAGAGACGCCGAGAGCATTGCATCGATTGAGTCCATGGATAATGGTAAACCGTATGCTGCAGAATGCCTAGATGGAGATTTAGGTGAAGCTGCTGACGTTTTCAAATATTATGCCGGTTGGGCCGACAAGATCACCGGTGAACTCATTGGCTCGAGTGTATTAGGTAAGAATAAGATGTGTTATGTCGAGCCTACACCACTGGGTGCCGTTGGCGGTATAGTCCCTTGGAATTTCCCGTTTACCATGATGGCATGGAAAATTGCCCCGGCACTGGCGACGGGTTGTACAGTGGTTATGAAGTCAAGTGAAGTCACACCGTTGACGGCATTATGGTATGGCAAGATTGCACTTGAAGTGGGTCTACCTAAAGGTGTACTTAACATCCTCTCCGGTTTTGGATCGGATGTTGGATCGGCCATGGCTTCACATCCAAAGTTGGCTAAGATAGCGTTCACTGGCTCAACTGCAACTGGTAAAAAAATCATGGAAGCAGCAGGTGGTTCCAACTTGAAAAAGGTTACACTAGAGTGTGGTGGTAAATCTCCTTACATTGTTTTTGATGATGCTGACTTAGAATTGGCAGTAGAATGGGCATATTGGGGTATTTGGTATAACAAAGGTGAGGTTTGTACTTCAACTTCGAGATTTTTGATTCAGGAAGACATTTACGATAAGTTTGTTGAGAGTTTTGTTGAGTTGACCAAGACGAGAGCAATCACTGCTGATCCGTTTGATGATAGATGCACTATCGGGCCTTTGGTTTCTAGCTCACAGTACGAAAAAGTCAAAAAGTACGTTGAAATAGGTAAAAATGAAGGAGCAAAGCTACTAACTGGCAAATTCATCGACGGGCCAGGCTATTTCTATGAGCCATTTATCTTCAGTGAATGCACTGACGATATGACAATCATGAAAGAGGAAATCTTTGGCCCTGTTGTGGGGATTACTAAATTCTCAACGGTTAAAGAGGCGATCGAGAGAGCCAATGCTACGACTTACGGTTTAGGAGCTGCGTTGTTTTCCTCTAACATAACAAAGGCACATTCTGTGGCTGCCAAGTTGGAGGCTGGAATGGTGTGGATCAATTCTAATGGTGATTCTGATATCCACATTCCATTTGGTGGTTCCAAAATGAGTGGTATAGGTAGGGAGTTGGGGCCATACGCACTAGACTTGTTTACTGAGAAAAAGGCAGTTCATGTCAACTTATCGCTTCCGGTCAAGTGA
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3
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1611
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7
1145
DNA
7
TTCCAGTGGTGCATGAACGCATGAGAAAGCCCCCGGAAGATCATCTTCCGGGGGCTTTTTTTTTGGCGCGCGATACAGACCGGTTCAGACAGGATAAAGAGGAACGCAGAATGTTAGACAACACCCGCTTACGCATAGCTATTCAGAAATCAGGCCGTTTAAGCGATGATTCACGAGAATTGCTGGCCCGCTGCGGCATAAAAATTAATTTACACACTCAGCGCCTGATTGCGATGGCGGAAAACATGCCGATTGATATCCTGCGCGTGCGTGATGATGACATTCCGGGTCTGGTAATGGATGGCGTGGTCGATCTCGGTATTATCGGCGAAAACGTGCTGGAAGAAGAGCTACTCAACCGCCGCGCACAGGGCGAAGATCCACGCTATTTAACCCTGCGCCGTCTTGACTTCGGCGGCTGCCGTTTATCGCTGGCAACACCGGTTGACGAAGCCTGGGACGGCCCGGCCGCGCTGGACGGTAAACGTATCGCTACCTCATATCCGCACCTCCTCAAACGCTACCTCGACCAGAAAGGCGTCTCTTTTAAATCGTGTCTGTTAAATGGTTCTGTCGAAGTCGCGCCGCGCGCGGGGCTGGCCGACGCTATCTGCGATTTGGTCTCTACCGGCGCGACGCTTGAAGCTAACGGCCTGCGTGAAGTCGAAGTTATCTACCGCTCTAAAGCCTGTCTGATTCAGCGCGACGGTGAGATGGCACAGAGCAAGCAAGAGCTGATCGATAAATTGCTGACCCGTATTCAGGGCGTGATTCAGGCGCGCGAATCGAAATACATCATGATGCACGCGCCAAGTGAACGCCTGGAAGAGGTTATCGCCCTGCTGCCAGGCGCCGAAAGGCCGACAATTCTGCCGCTGGCAGGCGAGCAACAGCGCGTGGCGATGCACATGGTCAGCAGCGAAACGTTGTTCTGGGAAACCATGGAGAAACTGAAAGCGCTTGGCGCCAGCTCGATTCTGGTACTGCCGATCGAGAAGATGATGGAGTGATCTGACGCCTGATGGCGCTGCGCTTATCAGGCCTACGTAATGCGTTGATATTTTGGGTTCTGTAGGCCGGATAAGGCGGAACCCTGTGATGGAGTAAAGACCATGAGCTTCAATACCCTGATTGACTGGAACAGC

Claims (6)

1.一种高产2-苯乙醇的产甘油假丝酵母工程菌的制备方法，其特征在于，敲除产甘油假丝酵母基因组的ALD3基因(SEQ ID No.1)。
2.如权利1所述的一种高产2-苯乙醇的产甘油假丝酵母工程菌的制备方法，其特征在于，所用的产甘油假丝酵母为二倍体菌株，实现二倍体菌株的敲除包括如下步骤。
步骤1:将编码ALD3基因上游500bp-0bp的核酸序列(PloALDa，SEQ ID No.2)及编码ALD3基因下游0p-500bp的核酸序列(TloALDa，SEQ ID No.3)与筛选标记连接，获得ALD3基因第一条链的敲除框。
步骤2:通过醋酸锂(LiAC)转化法将步骤1中所得敲除框导入二倍体产甘油假丝酵母，通过MM平板筛选，挑取单菌落进行PCR验证，获得ALD3基因单拷贝敲除的杂合子突变株。
步骤3:将步骤2的ALD3基因单拷贝敲除的杂合子突变株在YPD中摇瓶培养后取25μL涂布2×FOA平板，30℃培养2-3天后挑取单菌落进行PCR验证筛选标记的剔除。
步骤4:将编码ALD3基因的开放阅读框的0bp-500bp的核酸序列(PloALDb，SEQ IDNo.4)及1000bp-1509bp的核酸序列(TloALDb，SEQ ID No.5)与筛选标记连接，获得ALD3基因第二条链的敲除框。
步骤5:通过醋酸锂(LiAC)转化法将步骤4中所得敲除框导入步骤3已剔除筛选标记的ALD3基因单拷贝敲除的杂合子突变株中，通过MM平板筛选，挑取单菌落进行PCR验证，获得ALD3基因双拷贝敲除的纯合子突变株。
3.如权利2所述的制备方法，其特征在于，产甘油假丝酵母为尿嘧啶营养缺陷型菌株，筛选标记为营养缺陷型标记URA5(SEQ ID No.6)。
4.如权利2所述的制备方法，其特征在于，筛选标记的剔除来源于在URA5基因两段分别***一段沙门氏菌的HisG(SEQ ID No.7)重复序列，并通过URA5基因两端的HisG重复序列的同源重组实现的。
5.如权利2所述的方法构建的高产2-苯乙醇的产甘油假丝酵母工程菌。
6.如权利5所述的产甘油假丝酵母工程菌在2-苯乙醇生产中的应用，步骤如下：
步骤1：挑取1环产甘油假丝酵母接入种子培养基(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量为水)中，在30℃，200r/min条件下，振荡培养18h，得到液态种子。
步骤2：将步骤(1)得到的液态种子按5％(v/v)的接种量接入发酵培养基(L-苯丙氨酸7g/L，葡萄糖90g/L，KH2PO4 5g/L，酵母粉1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，余量为水)中，控制发酵温度为30℃，转速为200r/min，时间为72h，发酵结束。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN107723300A (zh) * 2017-11-29 2018-02-23 江南大学 过表达CgGsh1基因提高产甘油假丝酵母2‑苯乙醇耐受性及产量
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CN110079468A (zh) * 2019-05-09 2019-08-02 江南大学 一种增强产甘油假丝酵母2-苯乙醇耐受性的方法
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