CN106544434B

CN106544434B - 多交叉扩增结合金纳米生物传感检测单增李斯特菌的方法

Info

Publication number: CN106544434B
Application number: CN201610982015.1A
Authority: CN
Inventors: 叶长芸; 王毅; 王艳
Original assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority date: 2016-11-08
Filing date: 2016-11-08
Publication date: 2020-09-01
Anticipated expiration: 2036-11-08
Also published as: CN106544434A

Abstract

本发明公开了一种多交叉扩增结合金纳米生物传感检测单增李斯特菌的方法，所述方法在多交叉置换扩增中的交叉引物CP1或CP2的5’端标记生物素，在扩增引物C1或C2的5’端标记半抗原，所述方法针对单增李斯特菌lmo0733的扩增产物能被金纳米生物传感器可视化检测。所述方法便捷、快速、敏感、特异，适宜于各种核苷酸片段检测。

Description

多交叉扩增结合金纳米生物传感检测单增李斯特菌的方法

技术领域

本发明公开了一种单增李斯特菌检测方法，属于微生物学领域。

背景技术

单增李斯特菌(Listeria monocytogens，LM)是一种革兰阳性的短杆菌，有运动能力、兼性胞内寄生菌。单增李斯特菌广泛存在于自然界中，是重要的食源性***共患病原菌，食品中存在的单增李斯特菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。单增李斯特菌能够引起人类严重感染。李斯特菌病的易感人群主要为免疫力低下人群和免疫缺陷人群，前者包括老年人、新生儿和孕妇；后者为肿瘤患者、艾滋病患者和器官移植受体等。人类李斯特菌病主要临床症状为败血症、脑膜炎、孕妇流产、死产以及发热性胃肠炎等，该菌可穿越肠道屏障、血脑屏障和胎盘屏障。单增李斯特菌病在人类的感染率不高，但该病的死亡率极高而受到广泛的关注，一度成为欧美国家重大公共卫生问题。国内尚无由单增李斯特菌引起食物中毒暴发的报道，实际存在与否不明，散发病例在多个省市都有报道。因此，为了给予临床病人准确快速的治疗、开展单增李斯特菌的流行病学调查，研发一个省时、省力和特异性较高的单增李斯特菌检测方法成为必要。

目前对于单增李斯特菌分离鉴定主要依赖于传统的增菌培养和生化鉴定，该方法耗时大约5到7天，包括两次增菌、选择培养及后续的生化鉴定，其劣势耗时耗力，生化结果的判读依赖于人的主观判断，导致结果重复差，易错判。随着核酸诊断技术的快速发展，一些以PCR为基础的诊断技术(如普通PCR技术，荧光PCR技术)被用于单增李斯特菌的快速诊断，然而这些方法依赖于昂贵的仪器设备，需要后续的电泳操作，昂贵的探针合成，以及熟练的操作人员。对于一些落后的实验室无法进行，限制了这些技术的运用。目前运用这些检测技术诊断单增李斯特菌的PCR方法和Real-time PCR方法，所选择的目的基因(如hly，prfA，iap)特异性差，极易出现假阳性扩增。此外这些检测技术的灵敏度差，检测过程耗时较长，不利于快速检测和应急检测。因此，为了给予临床病人准确快速的治疗，食源性病原体监测以及单增李斯特菌的流行病学调查，研发一个省时、省力和特异性较高的诊断方法，能够快捷、敏感、特异的鉴定单增李斯特菌成为必要。

为了克服PCR扩增技术的劣势，近年来发展了许多恒温扩增技术。恒温扩增技术较PCR技术而言，不依赖于热循环扩增设备，反应速度快，敏感性好。因此，恒温扩增技术有利于实现快速扩增、便捷检测及现场诊断。到目前为止，已发展的恒温扩增技术有10余种，应用较为广泛的有滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖的恒温扩增(HDA)、环介导恒温扩增(LAMP)、交叉扩增(CPA)等。然而，这些恒温技术实现核酸扩增需要多种酶同时工作，依赖于昂贵的试剂，复杂的操作步骤。因此这些方法的实用性、便捷性、可操作性有待于提高，尤其是在快速诊断领域及欠发达地区。为了克服PCR技术及现有恒温扩增技术的劣势，实现便捷、快速、敏感及特异的扩增核酸序列，在生物、农业、医学等领域，发明人近期已经建立了一种新的核酸扩增技术，命名为多交叉置换扩增(Multiple Cross DisplacementAmplification，MCDA)，相关内容公开于CN104946744A，该专利文件作为现有技术文件构成本申请说明书的一个部分。

MCDA在恒温条件下实现核酸扩增，仅使用一种恒温置换酶、扩增速度快、反应灵敏、特异性高。在本发明中，为了使该技术在生物、医药及卫生领域应用更广泛、更经济，发明人以MCDA为基础，将MCDA技术与纳米生物检测技术相结合，开发了依赖MCDA技术、实现快速，敏感检测的纳米生物传感技术，该技术被命名为多交叉扩增结合金纳米生物传感的核酸诊断技术(Multiple cross displacement amplification coupled with goldnanoparticle-based lateral flow biosensor，MCDA-LFB)，并将该技术运用于单增李斯特菌的检测。

本发明针对单增李斯特菌的特异基因lmo0733设计一套MCDA扩增引物，旨在验证、评价MCDA-LFB技术及建立针对单增李斯特菌病原体的快速、敏感和特异的MCDA-LFB检测体系。

发明内容

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种应用多交叉扩增结合金纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)自所述目的基因片段的3’端起，设定第一任意序列F1s，第二任意序列P1s，自所述目的基因片段的5’端起，设定第三任意序列F2，第四任意序列P2，在所述第二任意序列P1s的5’端设定第五任意序列C1，和/或在所述第四任意序列P2的3’端设定第六任意序列C2s，在序列C1的3’端和5’端分别设定第七任意序列D1和第八任意序列R1,在序列C2s的5’端和3’端分别设定第九任意序列D2s和第十任意序列R2s；

(2)提供置换引物F1，所述引物F1含有与序列F1s互补的序列，提供交叉引物CP1，所述引物CP1自5’端依次含有序列C1和与序列P1s互补的序列P1，提供置换引物F2，所述引物含有序列F2，提供交叉引物CP2，所述引物CP2自5’端依次含有序列C2s互补的序列C2和序列P2，同时提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有生物素的交叉引物CP1*或CP2*；

(3)提供扩增引物，所述扩增引物包括含有序列C1的扩增引物C1，和/或含有与序列C2s互补的扩增引物C2，含有序列D1的扩增引物D1，含有序列R1的扩增引物R1，含有与序列D2s互补的扩增引物D2和含有与序列R2s互补的扩增引物R2，同时提供在所述扩增引物C1或C2的5’端标记半抗原的扩增引物C1*或C2*；

(4)在链移位型聚合酶(Bst)、解链温度调节剂、引物存在下，使用目的基因片段作为模板恒温扩增DNA；

(5)使用金纳米生物传感器检测步骤(4)的扩增产物。

在一个优选的技术方案中，在所述扩增引物C1*或C2*的5’端所标记的半抗原为地高辛。

更为优选地，在交叉引物CP1*的5’端标记生物素，在所述扩增引物C1*5’端标记地高辛。

在一个更为优选的技术方案中，所述金纳米生物传感器包括一背板，在所述背板上依次设置装有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，在所述硝酸纤维素膜上依次设置检测线及控制线，在金标垫、检测线及控制线区域依次包被有金纳米粒子偶联的链霉素亲和素、抗地高辛抗体及生物素偶联的牛血清蛋白。

在一个优选的技术方案中，所述恒温扩增是在60-63℃的环境中进行的。

在一个更为优选的技术方案中，所述恒温扩增是在61℃的环境中进行的。

在一个优选的技术方案中，所述目的基因为单增李斯特菌的lmo0733。

优选地，所述置换引物F1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述置换引物F2的序列如SEQ ID NO:2所示；所述交叉引物CP1的序列如SEQ ID NO:3所示，在所述交叉引物CP1的5’端标记有生物素的所述交叉引物CP1*的序列如SEQ ID NO:4所示，所述交叉引物CP2的序列如SEQ ID NO:5所示，引物C1的序列如SEQ ID NO:6所示，在所述引物C1的5’端标记有地高辛的引物C1*的序列如SEQ ID NO:7所示，引物C2的序列如SEQ ID NO:8所示，引物D1的序列如SEQ ID NO:9所示，引物D2的序列如SEQ ID NO:10所示，引物R1的序列如SEQ ID NO:11所示，引物R2的序列如SEQ ID NO:12所示。

本发明在另一方面还提供了一组用于多交叉扩增单增李斯特菌lmo0733基因的引物序列，所述序列包括：如SEQ ID NO:1所示的置换引物F1，如SEQ ID NO:2所示的置换引物F2，如SEQ ID NO:3所示的交叉引物CP1，如SEQ ID NO:5所示的交叉引物CP2，如SEQ ID NO:6所示的扩增引物C1，如SEQ ID NO:8所示的扩增引物C2，如SEQ ID NO:9所示的扩增引物D1，如SEQ ID NO:10所示的扩增引物D2，如SEQ ID NO:11所示的扩增引物R1，如SEQ ID NO:12所示的扩增引物R2，同时提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有生物素的交叉引物CP1*或CP2*，以及在所述扩增引物C1或C2的5’端标记半抗原的扩增引物C1*或C2*。

在一个优选的技术方案中，在交叉引物CP1*的5’端标记生物素，在扩增引物C1*的5’端标记有地高辛。

本发明提供的多交叉扩增结合金纳米生物传感检测目的基因单增李斯特菌lmo0733的方法具有优异的检测灵敏度，其检测范围为10ng～10fg，而且也具有较快的检测速度，仅需20分钟，即可获得能供可视化LFB检测的扩增产物。

以常见的致病菌及条件致病菌DNA(单增李斯特菌、沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌、蜡样芽胞杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌等)为模板评价MCDA-LFB技术的特异性。本发明提供的MCDA-LFB技术能准确的鉴别单增李斯特菌，说明MCDA-LFB方法的特异性良好，也证明本发明提供的用于MCDA的引物序列具有优异的特异性和扩增效果。

附图说明

图1.MCDA-LFB扩增原理及金纳米生物传感器结构示意图；

图2.MCDA-LFB引物设计的位置和方向示意图；

图3.MCDA-LFB引物验证及MCDA-LFB检测结果图谱；

图4.标准MCDA-LFB最佳反应温度测试结果图谱；

图5.MCDA-LFB检测单增李斯特菌的灵敏度结果图谱；

图6.MCDA-LFB技术的最佳反应时间测试结果图谱；

图7.MCDA-LFB技术的特异性检测评价图谱

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

1.MCDA-LFB扩增原理

(1)通过MCDA扩增构建可检测产物

MCDA反应体系包括10条引物，识别靶序列的10个区域，包括2条交叉内引物，即CP1和CP2(Cross Primer，CP)，2条置换引物，即F1和F2，6条扩增引物，即D1，C1，R1，D2，C2和R2。为了构建可检测产物，交叉引物CP1或CP2在5’端标记生物素(Biotin),扩增引物C1或C2在5’端标记地高辛(Dig)，新标记的引物被命名为CP1*，CP2*，C1*和C2*。CP1*包含Cl(C1s区域的互补序列)和P1，即5′-Cl-P1；CP2包含C2(C2s区域的互补序列)和P2，即5′-C2-P2。两条交叉引物CP1和CP2是介导MCDA扩增的主要引物；置换引物F1和F2置换在MCDA反应中发挥置换作用，置换交叉引物CP1和CP2；六条扩增引物D1，C1，R1，D2，C2*和R2能够加速MCDA反应及增加MCDA产物量，扩增原理参见图1A。

为了便于理解，CP2*和C2*引物在扩增示意图中被略去。在既定的恒温条件下，双链DNA在处于半解离和半结合的动态平衡状态中，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。首先在Bst DNA聚合酶的作用下，以CP1*引物P1区段的3′末端为起点，与对应的DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。F1引物与P1s前端F1s序列互补，以3′末端为起点，通过链置换活性DNA聚合酶的作用，首先置换出CP1引物合成的DNA链，同时合成自身DNA。最终F1引物合成而得的DNA链与模板DNA形成双链。然而由交叉引物CP1*先合成的DNA链被F1引物进行链置换产生一单链，该单链的D1s，C1s，R1s，P2s，F2s区域能够依次与扩增引物D1，C1*，R1，交叉引物CP2及置换引物F2结合，并发挥链置换扩增作用(步骤1，2)。C1*引物扩增并置换D1的扩增链，生成短片段C1s-D1产物，该产物能够与C1*和CP1*引物结合，启动链置换扩增，进入循环扩增1(步骤3和循环1)。R1引物扩增并置换C1*的扩增链，生成短片段C1s-C1*产物，该产物能够与C1*和CP1*引物结合，启动链置换扩增，进入循环扩增1(步骤4和循环2)。在循环扩增2中，随着MCDA扩增的进行，大量的双标产物被形成，CP1*端标记生物素，C1*端标记地高辛(图1A)。该双标的产物能被金纳米生物传感器检测，从而进行可视检测。后续的MCDA扩增，包括步骤5和6，详见发明人的前期专利CN104946744A。此外，由于CP2*和C2*的扩增过程与CP1*和C1*的扩增过程相似，在MCDA扩增体系中，同样能够形成大量的双标的可检测产物。CP2*端标记生物素，C2*端标记地高辛。该双标的产物也能被金纳米生物传感器(LFB)检测，从而进行可视检测。因此，在利用MCDA-LFB技术进行靶序列检测时，可利用CP1*和C1*引物构建可检测产物，也可利用CP2*和C2*引物构建可检测产物。

(2)生物传检测器(LFB)的设计及对扩增产物的检测

生物检测器(LFB)的设计见图1B。LFB包含五个部分，样品垫1，金标垫2，纤维膜3，吸水垫4及背板5，首先将样品垫、金标垫、纤维膜及吸水垫依次组装在背板上，然后将SA-G(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)，anti-Dig(抗地高辛抗体)及Biotin-BSA(生物素偶联的牛血清蛋白)分别包被在金标垫、检测线(TL)6、及控制线(CL)7，待干燥后备用。

LFB的检测原理：将MCDA靶基因扩增物直接滴加到LFB的样品垫区域(所述靶基因扩增物已被生物素和地高辛同时标记)，然后将120μl的检测缓冲液加到样品垫区域，MCDA产物在虹吸作用下，从下往上运动(从样品垫向吸水垫方向运动)。当MCDA产物达到金标垫后，双标产物的一端(即生物素标记端)与SA-G(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)反应。当产物继续运动，双标产物的另一端(即地高辛标记端)与检测线区域的抗体结合，将双标产物固定在检测线区域。随着产物在检测线区域的积累，通过另一端的SA-G(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)进行显色反应，从而对MCDA产物进行可视化检测。此外，过剩的SA-G(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)可与控制线区域的Biotin-BSA(生物素偶联的牛血清蛋白)，进行直接显色反应，判断LFB的功能是否正常。

LFB结果的判读(图1C)：仅仅控制线区域出现红色条带，表示阴性对照，没有阳性产物；控制线及检测线区域均出现红色条带，表示针对靶标的检测为阳性结果；当LFB不出现红线条带时，表示LFB失效；仅当测试线出现红色条带时，CL无红色条带,代表结果不可行，需要重新检测。

2.本发明中实施例所涉及的试剂和仪器：

抗地高辛抗体(anti-Dig)，金纳米粒子偶联的链霉素亲和素(SA-G)及生物素偶联的牛血清蛋白(B-BSA)购于Resenbio公司。背板、样品垫、金标垫、纤维膜及吸水垫购于Jie-Yi公司。Loopamp Kit(Eiken Chemical Co.Ltd.,Tokyo,Japan)购于日本荣研公司。DNA提取试剂盒(QIAamp DNA minikits；Qiagen,Hilden,Germany)购于德国Qiagen公司。PCR反应体系混合物MIX(Taq DNA聚合酶，dNTP和缓冲液)购于北京康为世纪生物科技有限公司。DL50DNA Marker购于宝生物工程(大连)有限公司。其余试剂均为市售分析纯产品。

本发明实验中使用的主要仪器：恒温实时浊度仪LA-320C(Eiken Chemical Co.,Ltd,Japan)购于日本荣研公司。PCR仪为Sensoquest Labcycler,德国Sensoquest产品；电泳设备为北京君意东方电泳设备有限公司产品；凝胶成像***为Bio-Rad Gel Dox XR,美国Bio-Rad产品。

3.本发明中实施例所涉及的方法

基因组提取：单增李斯特菌及其他细菌的基因组DNA的提取使用Qiagen公司的DNA提取试剂盒(QIAamp DNA minikits；Qiagen,Hilden,Germany)，按照说明书进行操作。利用紫外分光光度计测定基因组DNA的浓度和纯度，单增李斯特菌的DNA用GE缓冲液连续稀释(从10ng、10pg、10fg、1fg到0.1fg/微升)。各种基因组DNA均少量分装，-20℃保存备用。

连续稀释的单增李斯特菌DNA用于MCDA扩增的最佳温度的探索及扩增体系的建立。以常见的致病菌及条件致病菌DNA为模板评价L.monocytogenes-MCDA-LFB技术的特异性。菌株信息见表2。

4.本发明实施例所涉及的引物设计

为了验证、评价MCDA-LFB技术及建立针对单增李斯特菌病原体的快速、敏感和特异的MCDA-LFB检测体系。本发明针对单增李斯特菌的特异基因lmo0733设计一套MCDA扩增引物，旨在验证MCDA-LFB技术的可行性、敏感性、特异性及可靠性。

lmo0733存在于所有的单增李斯特菌中，其特异性好，可以将单增李斯特菌与其他密切相近的菌种区分开。利用引物设计软件PrimerExplorer V4(Eiken Chemical)(http://primerexplorer.jp/e/)和引物设计软件Primer Premier 5.0设计MCDA引物，并将获得的特异性引物在NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行序列比对分析，以排除引物与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，最终获得优化后的MCDA扩增引物。引物设计的位置和方向见图2，序列及修饰见表1。

表1引物序列及修饰

^a CP1*，该引物用于MCDA-LFB检测体系，在5’端标记生物素；C1*，该引物用于MCDA-LFB检测体系，在5’端标记地高辛；^b Dig，地高辛；Biotin，生物素；^c mer，monomericunit(单体单元)；nt，nucleotide(核苷酸)。

实施例1.MCDA-LFB扩增的可行性

标准的MCDA反应体系：交叉引物CP1*和CP1的浓度为30pmol,交叉引物CP2的浓度为60pmol，置换引物F1和F2的浓度为10pmol,扩增引物R1，R2，D1和D2的浓度为30pmol，扩增引物C1*和C2的浓度为20pmol，10mM的Betain，6mM的MgSO₄，1mM的dNTP，12.5μL的10×BstDNA聚合酶缓冲液，10U的链置换DNA聚合酶，1μL的模板，补加去离子水至25μL。整个反应恒温在65℃1小时，85℃5min终止反应。

MCDA扩增之后，三种检测方法用于MCDA扩增判别，首先，在反应混合物中加入可视染料(如FD试剂，朗普荧光可视试剂)，阳性反应管的颜色从浅灰色变为绿色，阴性反应管则保持原来的浅灰色。其次，MCDA产物可以通过琼脂糖电泳后检测扩增子，由于产物中包含了不同大小的扩增片段，因此阳性扩增产物的电泳图呈特异性阶梯状，阴性反应不出现任何条带。更为直接简单的方法为通过LFB对产物进行检测。

可视颜色变化法：MCDA在合成DNA的同时产生大量的焦磷酸根离子，该离子能够夺取与钙黄绿素结合的锰离子，使钙黄绿素恢复游离状态而发荧光。该发光混合物能够与反应中产生的镁离子结合，使荧光得到增强。可以通过荧光目视检测颜色变化判读结果，阳性反应管从浅灰色变为绿色，阴性反应保持浅灰色不变，见图3A。A1表示阳性扩增(反应管中加入10pg的单增李斯特菌模板，作为阳性对照)，A2表示阴性扩增(反应管中加入10pg的Gram⁺伊氏李斯特菌模板，作用阴性对照)，A3表示阴性扩增(反应管中加入10pg的Gram-沙门菌模板，作用阴性对照)，A4表示空白对照反应(1微升的双蒸水代替10pg的模板，作为空白对照应)。只有阳性对照出现阳性扩增，说明针对lmo0733设计的检测单增李斯特菌的MCDA引物可用。

电泳检测法：将图3A的产物进行电泳检测，由于MCDA的扩增产物包含了许多大小不一的短片段及一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显现不同大小区带组成的阶梯式图谱，见图3B。通过电泳检测法判读MCDA扩增结果，阳性反应出现了预期的结果，而阴性反应和空白对照未出现任何扩增条带，进一步验证了本研究所设计的MCDA引物可行，可用于靶序列扩增检测。

LFB检测：将图3A的产物进行LFB检测。由于针对单增李斯特菌检测的MCDA引物标记的半抗原为Dig(地高辛)，因此，当TL和CL出现红色条带时表示为单增李斯特菌检测阳性。通过LFB检测法判读MCDA扩增结果，阳性反应出现了预期的结果，而阴性反应和空白对照仅出现CL红色条带，验证了本研究所设计的LFB，MCDA-LFB技术及MCDA引物可行，能够用于目的靶序列的检测(图3C)。

实施例2.测定MCDA技术的最佳反应温度

在标准反应体系条件下，加入单增李斯特菌DNA模板及针对lmo0733所设计的对应的MCDA引物，其模板浓度为10pg/μl。反应在恒温条件下进行(60-67℃)，结果运用实时浊度仪进行检测，在不同的温度下得到不同的动态曲线图，见图4。60-63℃被推荐作为MCDA引物的最佳反应温度。在该温度区间内，扩增速度最快。本发明中的后续验证选择61℃作为恒温条件进行MCDA扩增。图4表示针对lmo0733设计的检测单增李斯特菌的MCDA引物温度动态曲线图。

实施例3.MCDA-LFB检测单一靶标的灵敏度

运用连续稀释好的单增李斯特菌基因组DNA进行标准的MCDA扩增反应后，运用LFB检测显示：MCDA-LFB的检测范围为10ng～10fg，LFB在TL和CL区域出现红色线(图5A)。当反应体系中基因组模板量降低至10fg以下时，LFB仅在CL区域出现红色线，表示阴性结果(图5A4-A5)。图5A运用LFB可视化读取MCDA扩增结果；图5A1到A5表示单增李斯特菌的模板量为10ng、10pg、10fg、1fg和0.1fg，图5A6、A7、A8分别表示伊氏李斯特菌(10pg)、沙门氏菌模板(10pg)、空白对照(1微升双蒸水)。

为了进一步验证MCDA-LFB检测单增李斯特菌的敏感性，另外3种检测方法用于MCDA扩增结果判别。首先，在反应混合物中加入可视染料(如FD试剂，朗普荧光可视试剂)，阳性反应管的颜色从浅灰色变为绿色，阴性反应管则保持原来的浅灰色。检测显示：L.monocytogenes-MCDA的检测范围为10ng～10fg，阳性扩增管变为绿色(图5B1-B3)。当反应体系中基因组模板量降低至10fg以下时，反应不出现绿色，仍然为浅灰色，表示阴性结果(图5B4-B5)。图5B运用可视法读取MCDA扩增结果：图5B1到B5表示单增李斯特菌的模板量为10ng、10pg、10fg、1fg和0.1fg，图5B6、B7、B8分别表示伊氏李斯特菌模板(10pg)、沙门氏菌模板(10pg)、空白对照(1微升双蒸水)。其二，MCDA产物可以通过琼脂糖电泳后检测扩增子，由于产物中包含了不同大小的扩增片段，因此阳性扩增产物的电泳图呈特异性阶梯状，阴性反应不出现任何条带。检测显示：L.monocytogenes-MCDA的检测范围为10ng～10fg，阳性反应出现阶梯条带(图5C1-C3)。当反应体系中基因组模板量降低至10fg以下时，不出现特异的阶梯条带，表示阴性结果(图5C4-C5)。图5C运用电泳法读取MCDA扩增结果；图5C1到C5表示单增李斯特菌的模板量为10ng、10pg、10fg、1fg和0.1fg，图5C6、C7、C8分别表示伊氏李斯特菌(10pg)、沙门氏菌模板(10pg)、空白对照(1微升双蒸水)。其三，实时浊度仪用于分析MCDA扩增(图5D)。运用连续稀释好的单增李斯特菌基因组DNA进行标准的MCDA扩增反应后，运用实时浊度仪进行结果判定，检测显示：L.monocytogenes-MCDA的检测范围为10ng～10fg，阳性扩增浊度曲线被观察到(图5D1-D3)。当反应体系中基因组模板量降低至10fg以下时，不出现阳性扩增浊度曲线，表示阴性结果(图5D4-D5)。图5D运用实时浊度仪可视化读取MCDA扩增结果；图5D1到D5表示单增李斯特菌的模板量为10ng、10pg、10fg、1fg和0.1fg，D6、D7、D8分别表示伊氏李斯特菌(10pg)、沙门菌模板(10pg)，空白对照(1微升双蒸水)。

实施例4.测定MCDA-LFB技术的最佳反应时间

在标准应体系条件下，加入针对单增李斯特菌DNA模板及所设计的对应的MCDA引物，运用连续稀释好的单增李斯特菌基因组DNA作为模板。反应在恒温条件下进行(61℃)，恒温时间分别10分钟、15分钟、20分钟和25分钟。运用LFB检测显示：MCDA-LFB技术在检测单增李斯特菌时，最佳反应时间为20分钟(图6)。当MCDA体系在扩增步骤恒温20分钟时，最低检测限水平的模板能够被检出(图6C)。图6C中，LFB检测范围为10ng～10fg，LFB在TL和CL区域出现红色线(LFB1-LFB3)。当反应体系中基因组模板量降低至10fg以下时，LFB仅在CL区域出现红色线，表示阴性结果(LFB4-LFB5)。图6运用LFB可视化读取MCDA体系从10分钟到25分钟的扩增结果；LFB1到LFB5表示单增李斯特菌的模板量为10ng、10pg、10fg、1fg和0.1fg，LFB6、LFB7、LFB8分别表示伊氏李斯特菌模板(10pg)，沙门菌模板(10pg)，空白对照(1微升双蒸水)。

实施例5.测定MCDA-LFB技术的特异性

以常见的致病菌及条件致病菌DNA(单增李斯特菌、沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌、蜡样芽胞杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌等)为模板评价MCDA-LFB技术的特异性。(菌株信息详见表2)。MCDA-LFB技术能准确的鉴别单增李斯特菌，说明MCDA-LFB方法的特异性良好(见图7)。图7中，LFB1-12：单增李斯特菌模板；LFB13-39，非单增李斯特菌模板；LFB40,空白对照。结果表明，MCDA-LFB能够正确的检测靶序列。

表2.菌株信息

^a U，unidentified serotype(未鉴别的血清型)；ATCC，American Type CultureCollection(美国模式培养物保藏所)；Slcc,Seeliger’s Special Listeria CultureCollection(西利格李斯特培养保藏中心)；NCTC,National Collection of Type Culture(英国标准菌种收藏中心)。ICDC，National Institute for Communicable DiseaseControl Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control andPrevention(中国疾病预防控制中心传染病预防控制所)。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120> 多交叉扩增结合金纳米生物传感检测单增李斯特菌的方法

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Listeria monocytogenes

<400> 1

aaggactttc gcaagaaga 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Listeria monocytogenes

<400> 2

ggcggtcttt ctttgagc 18

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> Listeria monocytogenes

<400> 3

aggaactgac agtccttgct atcaaactga atgtggtgc 39

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> Listeria monocytogenes

<400> 4

aggaactgac agtccttgct atcaaactga atgtggtgc 39

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> Listeria monocytogenes

<400> 5

cactttgctt ggagaaactg ttatgaagtt tataatctcc agtttttcgg 50

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Listeria monocytogenes

<400> 6

aggaactgac agtccttgct 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Listeria monocytogenes

<400> 7

aggaactgac agtccttgct 20

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> Listeria monocytogenes

<400> 8

cactttgctt ggagaaactg ttatg 25

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Listeria monocytogenes

<400> 9

cccatttaga gattgtttgt c 21

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> Listeria monocytogenes

<400> 10

caaaggttga tgatgtaaaa gc 22

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> Listeria monocytogenes

<400> 11

ggagattaac atatcggaat c 21

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Listeria monocytogenes

<400> 12

gaagtgcttg aaacaccagt 20

Claims

1.一种非诊断目的的应用多交叉扩增结合金纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）自所述目的基因片段的3’端起，设定第一任意序列F1s，第二任意序列P1s，自所述目的基因片段的5’端起，设定第三任意序列F2，第四任意序列P2，在所述第二任意序列P1s的5’端设定第五任意序列C1，在所述第四任意序列P2的3’端设定第六任意序列C2s，在序列C1的3’端和5’端分别设定第七任意序列D1和第八任意序列R1, 在序列C2s的5’端和3’端分别设定第九任意序列D2s和第十任意序列R2s；

（2）提供置换引物F1，所述引物F1含有与序列F1s互补的序列，提供交叉引物CP1，所述引物CP1自5’端依次含有序列C1和与序列P1s互补的序列P1，提供置换引物F2，所述引物含有序列F2，提供交叉引物CP2，所述引物CP2自5’端依次含有与序列C2s互补的序列C2和序列P2，同时提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有生物素的交叉引物 CP1*或CP2*，所述置换引物F1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述置换引物F2的序列如SEQ ID NO:2所示；所述交叉引物CP1的序列如SEQ ID NO:3所示，在所述交叉引物CP1的5’端标记有生物素的所述交叉引物CP1*的序列如SEQ ID NO:4所示，所述交叉引物CP2的序列如SEQ ID NO:5所示；

（3）提供扩增引物，所述扩增引物包括含有序列C1的扩增引物C1，含有与序列C2s互补的扩增引物C2，含有序列D1的扩增引物D1，含有序列R1的扩增引物R1，含有与序列D2s互补的扩增引物D2和含有与序列R2s互补的扩增引物R2，同时提供在所述扩增引物C1或C2的5’端标记半抗原的扩增引物C1*或C2*；引物C1的序列如SEQ ID NO:6所示，在所述引物C1的5’端标记有地高辛的引物C1*的序列如SEQ ID NO:7所示，引物C2的序列如SEQ ID NO:8所示，引物D1的序列如SEQ ID NO:9所示，引物D2的序列如SEQ ID NO:10所示，引物R1的序列如SEQ ID NO:11所示，引物R2的序列如SEQ ID NO:12所示；

（4）在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物存在下，使用目的基因片段作为模板恒温扩增DNA；

（5）使用金纳米生物传感器检测步骤（4）的扩增产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金纳米生物传感器包括一背板，在所述背板上依次设置装有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，在所述硝酸纤维素膜上依次设置检测线及控制线，在金标垫、检测线及控制线区域依次包被有金纳米粒子偶联的链霉素亲和素、抗地高辛抗体及生物素偶联的牛血清蛋白。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述恒温扩增是在60-63℃的环境中进行的。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述恒温扩增是在61℃的环境中进行的。

5.根据权利要求1所述方法步骤（2）和（3）提供的一组用于恒温扩增单增李斯特菌lmo0733基因的引物，其特征在于，所述引物包括：如SEQ ID NO:1所示的置换引物F1，如SEQID NO:2所示的置换引物F2，如SEQ ID NO:3所示的交叉引物CP1，如SEQ ID NO:5所示的交叉引物CP2，如SEQ ID NO:6所示的扩增引物C1，如SEQ ID NO:8所示的扩增引物C2，如SEQID NO:9所示的扩增引物D1，如SEQ ID NO:10所示的扩增引物D2，如SEQ ID NO:11所示的扩增引物R1，如SEQ ID NO:12所示的扩增引物R2，同时提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有生物素的交叉引物 CP1*或CP2*，以及在所述扩增引物C1或C2 的5’端标记半抗原的扩增引物C1*或C2*。

6.根据权利要求5所述的引物，其特征在于，在交叉引物 CP1*的5’端标记生物素，在扩增引物 C1*的5’端标记有地高辛。