CN109457013B

CN109457013B - 交叉引物扩增结合纳米生物传感器和audg检测核酸的方法

Info

Publication number: CN109457013B
Application number: CN201811371238.XA
Authority: CN
Inventors: 申阿东; 王毅; 孙琳; 李洁琼
Original assignee: Beijing Daai River Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Daai River Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-11-18
Filing date: 2018-11-18
Publication date: 2022-01-11
Anticipated expiration: 2038-11-18
Also published as: CN109457013A

Abstract

本发明公开了一种交叉引物扩增技术结合纳米生物传感器和AUDG检测核酸的方法，所述方法的交叉引物扩增体系中不仅有前置换引物4s、核心交叉引物2s、扩增引物3a、扩增引物1a、后置换引物5a，以及上述引物任选其一标记半抗原的引物，并在生物素化的dCTP、南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶的存在下进行恒温扩增，最后使用包被有亲和素化高分子纳米粒子的生物传感器检测扩增产物。本发明还提供了一组用于上述方法检测肺炎克雷伯菌的rcsA基因的一组核苷酸序列引物组合。本发明提供的方法简便、快速、能够有效去除交叉污染，具有优异的灵敏度，最低可检测到2×10¹拷贝/微升(100fg)，在对23株K.pneumoniae菌和21株非K.pneumoniae菌的检测中显示了100％的特异性。

Description

交叉引物扩增结合纳米生物传感器和AUDG检测核酸的方法

技术领域

本发明公开了一种核酸恒温扩增方法，属于分子生物检测领域。

背景技术

在当代生物学和医学领域，核酸扩增是一种必不可少的生物技术。核酸扩增技术已经广泛运用于临床诊断、基础研究、流行病研究、转基因研究、考古研究等领域。在已经发展的核酸扩增技术中，聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是第一个被建立的体外核酸扩增技术，具有划时代意义。PCR技术已经广泛运用于生物及医学相关领域。然而，运用PCR技术及PCR相关技术(如实时PCR,多重PCR)进行核酸扩增时，受到实验室条件的限制，依赖于复杂昂贵的热循环仪器。除此之外，PCR结果的判定(即扩增产物的检测)比较复杂，需要一套复杂的流程及设备。这些劣势限制了该技术的广泛应用，尤其在经济落后的地区及快速诊断领域。因此，对于生物及医学相关研究领域而言，非常有必要发展简单、快速、敏感的核酸扩增方法。

为了克服PCR相关扩增技术的劣势，应运而生了许多恒温扩增技术。与PCR相关技术比较，恒温扩增技术不依赖于热循环扩增设备，反应速度较快，敏感性好。因此，恒温扩增技术有利于实现快速扩增，现场诊断及便捷检测。到目前为止，已发展的恒温扩增技术有10余种，应用较为广泛的有环介导恒温扩增(LAMP)、交叉引物扩增(CPA)、多交叉置换扩增(MCDA)、滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖的恒温扩增(HDA)等。在这些恒温扩增技术中，CPA作为一种设计简单，检测敏感的技术，已经广泛地运用到细菌、病毒、真菌及寄生虫检测及鉴定。CPA在恒温条件下实现核酸扩增，仅使用一种恒温置换酶、扩增速度快、反应灵敏、特异性高。

交叉引物扩增(CPA)的技术瓶颈在结果的判定，即扩增产物的检测。到目前为止，最常见的产物检测手段主要包括颜色指示剂，电泳，实时浊度。然而，这三种检测技术仅仅适用于单重检测(即单一靶标的检测)。此外，应用颜色指示剂判读CPA扩增产物时，会出现模棱两可的结果；电泳判读CPA结果时耗时较长，容易出现交叉污染，不适合于现场检测；实时浊度判读CPA结果时需要特殊的仪器设备。为了克服这三种检测技术的劣势，使CPA扩增技术在生物、医药及卫生领域应用更广泛、更经济。近期，一些研究以CPA为基础，将CPA扩增技术与生物传感技术相结合，开发了依赖CPA技术、实现快速，敏感检测的生物传感技术。

为了将CPA扩增产物适用于生物传感技术，传统的策略是在CPA扩增体系中同时添加两条标记的引物，一条引物在5’端标记生物素，另一条引物在5’端标记半抗原。当CPA扩增完毕，双标的扩增产物被构建(该双标的产物起源于两条标记的引物)，一端标记生物素，另一端标记半抗原。然而，传统策略构建双标记的CPA产物容易导致假阳性结果，甚至不需要扩增就能导致假阳性结果。该假阳性结果来源于标记引物之间的杂交。因此，为了克服传统标记策略的劣势，本发明设计了一种新的检测策略，该技术只需一条标记的引物就能构建双标的扩增产物，从而将扩增产物适用于生物传感技术。

为了将CPA扩增产物适用于生物传感技术的检测，打开CPA反应管是一个必须的步骤，然而，该步骤导致大量的扩增产物以气溶胶的形式挥发，从而导致交叉污染，产生假阳性结果。为了克服传统标记策略，交叉污染导致的假阳性结果，在本发明中，发明人利用单标记的引物和南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶，以CPA技术为基础，开发了CPA结合纳米传感及南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶核酸诊断技术(Cross-priming amplificationcombined with nanoparticles-based lateral flow biosensor,antarctic thermalsensitive uracil-DNA-glycosylase for detection of nucleic acid and preventionof carryover contamination；CPA-AUDG-LFB)。为了验证CPA-AUDG-LFB技术的可行性，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,K.pneumoniae)被应用于CPA-AUDG-LFB技术，建立检测K.pneumoniae的CPA-AUDG-LFB方法。

发明内容

基于上述目的，本发明首先提供了一种交叉引物扩增技术结合纳米生物传感器和AUDG检测核酸的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提取待检测样品的核酸；

(2)提供前置换引物4s、核心交叉引物2s、扩增引物3a、扩增引物1a以及后置换引物5a，另外，还提供在5’端被标记半抗原的上述任选的一种引物，命名为4s*、2s*、3a*、1a*或者5a*；

(3)在南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶、链移位型DNA聚合酶Bst、引物、dNTP，以及生物素化的dCTP(Biotin-14-dCTP)存在下，使用待检测样品的核酸作为模板进行交叉引物扩增DNA；

(4)使用包被有亲和素化高分子纳米粒子的生物传感器检测步骤(3)的扩增产物。

在一个优选的实施方案中，所述被标记的引物为3a*。

在一个更为优选的实施方案中，所述被标记的半抗原为FITC。

更为优选地，，所述高分子纳米生物传感器包括一背板1，在所述背板1上依次设置装有样品板2、结合板3、硝酸纤维素膜4及吸水板5，在所述硝酸纤维素膜4上依次设置检测线41及控制线42，在结合板3、检测线41、及控制线42区域依次包被有色基团修饰的，亲和素化的高分子纳米粒子6、抗FITC抗体7及生物素偶联的牛血清蛋白8。

在一个优选的实施方案中，步骤(3)所述扩增的温度为63-65℃。

在一个更为优选的实施方案中，步骤(3)所述扩增的温度为64℃。

在一个优选的实施方案中，所述扩增的目的基因为K.pneumonia的rcsA。

在一个更为优选的实施方案中，所述前置换引物4s的序列如SEQ ID.NO.1所示，核心交叉引物2s的序列如SEQ ID.NO.2所示，扩增引物3a的序列如SEQ ID.NO.3所示，扩增引物1a的序列如SEQ ID.NO.4所示，以及后置换引物5a的序列如SEQ ID.NO.5所示。

其次，本发明还提供了一组用于多交叉引物恒温扩增K.pneumonia的rcsA基因的引物，所述引物包括：序列如SEQ ID.NO.1所示的前置换引物4s，序列如SEQ ID.NO.2所示的核心交叉引物2s，序列如SEQ ID.NO.3所示的扩增引物3a，序列如SEQ ID.NO.4所示的扩增引物1a，以及序列如SEQ ID.NO.5所示的后置换引物5a。

本发明提供的方法简便、快速，全部扩增可以在63-65℃的恒温环境下完成，反应时间仅为1小时。AUDG的加入能够有效去除交叉污染。在对K.pneumoniae菌的检测中，本发明显示了优异的灵敏度，最低可检测到2×10¹拷贝/微升(100fg)，在对23株K.pneumoniae菌和21株非K.pneumoniae菌的检测中显示了100％的特异性。

附图说明

图1.针对rcsA基因设计CPA引物的设计示意图；

图2.CPA扩增原理示意图；

图3.高分子纳米生物传感器结构及检测流程示意图；

图4.CPA引物验证结果图谱；

图5.CPA引物最佳温度检测结果图谱；

图6.CPA-LFB方法的灵敏度评价结果图谱；

图7.CPA-AUDG消除污染子原理示意图；

图8.AUDG消除交叉污染的评价结果图谱；

图9.CPA-AUDG-LFB特异性评价结果图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

本发明中所涉及的试剂：

核酸提取试剂盒(QIAamp DNA minikits；Qiagen,Hilden,Germany)购于德国Qiagen公司。恒温扩增试剂(

amplification kit)和显色剂(Machal Green,MG)购买自北京海泰正元生物科技有限公司。生物素化的脱氧胞嘧啶(Biotin-14-dCTP)、脱氧尿嘧啶(dUTP)购买自Thermo Scientific公司。南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶(AUDG)、脱氧胞嘧啶(dCTP)、脱氧胸腺嘧啶(dTTP)、脱氧腺嘌呤(dATP)和脱氧鸟嘌呤(dGTP)购买自New England Biolabs公司。背板、样品垫、金标垫、纤维膜及吸水垫购于Jie-Yi公司。抗荧光素抗体(Anti-FITC)、生物素化的小牛血清(B-BSA)购于Abcam公司。有色基团(***)修饰的，亲和素化的高分子纳米粒子(Dye streptavidin coated polymernanoparticles，SA-PNPs，129nm)购买于Bangs Laboratories。DL50 DNA Marker购于宝生物工程(大连)有限公司。其余试剂均为市售分型纯产品。

本发明实验中使用的主要仪器：恒温实时浊度仪LA-320C(Eiken Chemical Co.,Ltd,Japan)购于日本荣研公司。电泳设备为北京君意东方电泳设备有限公司产品；凝胶成像***为Bio-Rad Gel Dox XR,美国Bio-Rad产品。

实施例1：结合纳米生物传感器和AUDG的多交叉核酸扩增方法的建立1.引物设计及扩增原理

为了验证、评价CPA-AUDG-LFB技术及建立针对K.pneumoniae病原体的快速、敏感和特异的CPA-AUDG-LFB检测体系，本发明针对K.pneumonia(肺炎克雷伯菌)的特异基因rcsA设计CPA扩增引物，旨在验证CPA-AUDG-LFB技术的可行性、敏感性、特异性及可靠性。

rcsA特异基因序列存在于所有的K.pneumoniae成员中，其特异性好，可以将K.pneumoniae与其他密切相近的菌属鉴别分开。利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计CPA引物，并将获得的特异性引物在NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行序列比对分析，以排除引物与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，最终获得优化后的CPA扩增引物(图1和表1)，该引物针对K.pneumoniae所有成员进行检测。图1是针对rcsA基因设计CPA引物的设计示意图，正向箭头代表引物序列，反向箭头代表引物反向互补序列。

表1.引物序列及修饰

^a nt,nucleitid(核苷酸)；mer,monomeric(单体单元)。

^b FITC,fluorescein isothiocyanate(异硫氰酸荧光素)；3a*,5’端标记FITC的引物3a(该引物用于CPA-LFB检测体系)。

CPA反应体系包括5条引物，识别靶序列的5个区域，包括前置换引物4s、核心交叉引物2s、扩增引物3a和1a、后置换引物5a。为了构建可检测产物，可选择5条引物中任意一条引物，在5’端标记半抗原(FITC，荧光素)，新标记的引物被命名为4s*、2s*、3a*、1a*和5a*。在本发明中，以3a*为例阐明本发明的原理。

在既定的恒温扩增条件下，反应体系中的双链核酸模板处于半解离和半结合的动态平衡状态中，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。首先在Bst 2.0 DNA聚合酶的作用下，以2s引物的3′末端为起点，与对应的DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成(图2，步骤1)。处在上游的4s引物置换2s引物扩增形成的产物，该产物能够同时结合3条引物(3a*,1a和5a，步骤2)。当3a*引物退火到目标序列时，生物素化的脱氧胞嘧啶(Biotin-14-dCTP)被Bst 2.0 DNA酶整合到扩增子。随着CPA扩增的进行，形成大量的双标产物(一端标记半抗原，中间标记生物素)，双标产物起源于标记的3a*引物和渗入到扩增子中生物素化的脱氧胞嘧啶(Biotin-11-dCTP)。该双标的产物能被纳米生物传感器检测，从而进行可视检测。图2是CPA扩增原理示意图，显示了利用3a*引物(FITC修饰)介导的CPA扩增原理。

2.横向测流纳米生物传感器(LFB)设计及检测原理。

横向测流纳米生物传感器(LFB)的设计见图3。LFB包含五个部分：背板、样品垫、结合垫、纤维膜及吸水垫。首先将样品垫、结合垫、纤维膜及吸水垫依次组装在背板上。然后将SA-PNPs，抗FITC抗体及生物素化的小牛血清(B-BSA)分别包被在金标垫，检测线1(TL1)及控制线(CL)，待干燥后备用。

LFB的检测原理：将CPA产物滴加到LFB的样品垫区域，然后将缓冲液滴加到LFB的样品垫区域。CPA产物在虹吸作用下，从下往上运动(从样品垫向吸水垫方向运动)。当CPA产物达到结合垫后，标记到产物上的生物素与SA-PNPs(亲和素修饰的高分子纳米粒子)反应。当产物继续运动时，双标产物的一端(半抗原标记端，即FITC标记端)与TL(检测线)区域的抗体(即抗FITC抗体)结合，将双标产物固定在检测线区域。随着产物在检测线区域的积累，通过结合的SA-PNPs进行显色反应，从而对CPA产物进行可视化检测。此外，过剩的SA-PNPs可与CL(质控线)区域的B-BSA反应，进行直接显色反应，判断LFB的功能是否正常。

图3是高分子纳米生物传感器结构及检测流程示意图。图3中，Biotin:生物素；BSA为牛血清蛋白，FITC:荧光素；PNPs:有色基团(***)修饰的高分子纳米粒子；SA:链霉素亲和素；SA-PNPs:有色基团(***)修饰的，亲和素化的高分子纳米粒子。

CPA扩增检测流程：(1)向LFB加样区域加入CPA扩增物；(2)向LFB加样区域加入缓存液；(3)LFB结果显示。图4、6和8都显示了LFB的实际检测结果。

LFB结果的判读：仅仅CL区域出现红色条带，表示阴性对照，没有阳性产物(图4B的2、3、4泳道)；CL及TL区域同时出现红色条带，表示针对靶标的检测为阳性结果(图4B的1泳道)；当LFB不出现红线条带时，表示LFB失效；当TL出现红色条带时，CL无红色条带,代表结果不可行，需要重新检测。

3.CPA扩增体系

标准的CPA反应体系：前置换引物4s的浓度为10pmol，核心交叉引物2s的浓度为60pmol,扩增引物3a和1a的浓度为30pmol，后置换引物5a的浓度为20pmol。2M的Betain，8mM的MgSO₄，2.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液，1.4mM的dATP，0.7mM的dTTP，0.7mM的dUTP，1.38mM的dCTP，0.02mM的biotin-14-dCTP，1.4mM的dGTP，10U的链置换DNA聚合酶，1μL的模板，补加去离子水至25μl。整个反应恒温在64℃1小时，80℃5min终止反应。

CPA-AUDG反应体系：标准的CPA反应体系：前置换引物4s的浓度为10pmol，核心交叉引物2s的浓度为60pmol,扩增引物3a*和1a的浓度为30pmol,后置换引物5a的浓度为20pmol。2M的Betain，8mM的MgSO₄，2.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液，1.4mM的dATP，0.7mM的dTTP，0.7mM的dUTP，1.38mM的dCTP，0.02mM的biotin-14-dCTP，1.4mM的dGTP，10U的链置换DNA聚合酶，1U的南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶，1μL的模板，补加去离子水至25μl。整个反应恒温在64℃1小时，80℃5min终止反应。

4.验证CPA引物的可行性

CPA扩增之后，两种检测方法被用于CPA扩增结果的判别。首先，在反应混合物中加入可视染料(如MG试剂)，阳性反应管的颜色从无色变为亮绿色，阴性反应管则保持原来的无色(图4A)；其次，CPA产物通过LFB对产物进行检测(图4B)。

可视颜色变化法：CPA在合成DNA的同时产生大量的焦磷酸根离子，该离子能够夺取与反应体系中的镁离子结合，形成不可溶的物质，从而改变溶液的pH值，使反应混合的颜色发生改变。可以通过目视检测颜色变化判读结果，阳性反应管从无色变为亮绿色，阴性反应保持无色不变，见图4A(上图)和4B(下图)。

4A表示针对K.pneumoniae的CPA引物的验证，4A1表示阳性扩增(反应管中加入2×10³拷贝(10皮克)的K.pneumoniae模板，作为阳性对照)，4A2表示阴性扩增(反应管中加入金黄色葡萄球菌模板，作为阴性对照测定是否存在交叉反应)，4A3表示阴性扩增(反应管中加入肺炎链球菌模板，作为阴性对照)，4A4表示阴性扩增(1微升的双蒸水代替模板，作为空白对照)。只有阳性对照出现阳性扩增，说明针对K.pneumoniae特异rcsA序列设计的检测K.pneumoniae的CPA引物可用。

LFB检测：将4A(上图)的产物进行LFB检测，由于针对K.pneumoniae检测的CPA引物(3a*)标记的半抗原为FITC，因此，当TL和CL出现红色条带时表示为K.pneumoniae检测阳性。通过LFB检测法判读CPA扩增结果，阳性反应出现了预期的结果，而阴性反应和空白对照仅出现CL红色条带，验证了本发明所设计的CPA-LFB技术、CPA引物可行，能够用于目的靶序列的检测。

实施例2：测定CPA技术的最佳反应温度

在CPA标准反应体系条件下，加入K.pneumoniae模板及所设计的对应的CPA引物，其模板浓度为2×10³拷贝/微升(10皮克/微升)。反应在恒温条件下进行(59-68℃)，结果运用实时浊度仪进行检测，在不同的温度下得到不同的动态曲线图(见图5)。63-65℃被推荐作为CPA引物的的最佳反应温度。本发明中的后续验证选择64℃作为恒温条件进行CPA扩增。

实施例3：评价CPA-LFB检测的灵敏度

运用连续稀释好质粒(10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg和10fg～2×10⁶、2×10⁵、2×10⁴、2×10³、2×10²、2×10¹和2×10⁰拷贝/微升)进行CPA扩增反应后，运用LFB检测显示结果。针对K.pneumoniae检测，CPA-LFB的检测范围为2×10⁶～2×10¹拷贝/微升，LFB在TL和CL区域出现红色线(图6中A的1-5)。当反应体系中基因组模板量降低至2×10⁰拷贝以下时，LFB仅在CL区域出现红色线，表示阴性结果(图6中A的6-8)。图6中A的1-7表示K.pneumoniae的模板量为10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg和10fg/微升，图6中A的8表示空白对照(1微升双蒸水)。运用LFB可视化读取CPA的扩增结果与可视检测(图6中的B)判定的结果一致。

实施例4：南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶(AUDG)去除交叉污染

在CPA反应体系中，由于加入了脱氧尿嘧啶(dUTP)，随着CPA扩增的进行，所有的扩增产物都被渗入脱氧尿嘧啶(dUTP)(图7，阶段1)。当扩增产物(渗入脱氧尿嘧啶的扩增子)进入扩增体系时，AUDG在常温条件下(如室温)移除单链或双链中脱氧尿嘧啶，从而使单链或双链DNA出现缺口(图7)。由于天然的模板不包含脱氧尿嘧啶，因此AUDG对天然的DNA无催化作用。当进行CPA扩增时，温度较高(大于60℃)，带有缺口的单链或双链DNA在热力作用下降解，因此不能作为模板进行扩增，从而消除了反应体系的污染产物，达到去除交叉污染的目的(图7，阶段2)。此外，AUDG在温度大于50℃时，会立即失活，从而不能降解新合成的扩增产物，即使扩增产物中包含脱氧尿嘧啶。因此本发明中选择的AUDG酶既能用于消除交叉污染，又不影响CPA的正常扩增。

为了证实AUDG能够作为有效的工具消除dUTP渗入的扩增产物，CPA反应的扩增产物被连续稀释(1×10^-12、1×10^-13、1×10^-14、1×10^-15、1×10^-16、1×10^-17、1×10^-18和1×10^-19克/微升)。这个稀释度扩增产物被用作模板，用于CPA反应。在反应体系中无AUDG存在的情况下，CPA能够检测污染子的能力为1×10^-18克/微升(图8A,上图为运用可视检测判读CPA的结果，下图为运用LFB判读CPA的结果)；在反应体系中AUDG存在的情况下，CPA能够检测污染子的能力为1×10^-15克/微升(图8B，上图为运用可视检测判读CPA的结果，下图为运用LFB判读CPA的结果)。在常规情况下，扩增产物导致的，能够产生交叉反应的污染子浓度通常为1×10^-18克/微升。本发明中，AUDG的降解能达1×10^-15克/微升。因此本发明中的CPA-AUDG方法能够有效的消除污染子。

实施例5：测定CPA-AUDG-LFB技术的特异性

以K.penumoniae及常见的细菌基因组核酸为模板评价CPA-AUDG-LFB技术的特异性(表2)。CPA-AUDG-LFB技术能准确地检测K.penumoniae成员，说明CPA-AUDG-LFB方法的特异性良好(见表2和图9)。

表2，菌株及特异性检测结果

^a ATCC,American Type Culture Collection(美国模式培养物保藏所)；GZ-CDC,Guizhou Center for Disease Control and Prevention(贵州省疾病预防控制中心).CP-CDC,Changping District Center for Disease Control and Prevention(昌平区疾病预防控制中心).

^b P,positive(CPA-AUDG-LFB检测阳性)；N,negative(CPA-AUDG-LFB检测阴性).表2中检测结果说明，只有属于K.pneumoniae的成员，经CPA-AUDG-LFB检测产生阳性结果，说明所建立的方法准确的鉴定K.pneumonia,无假阳性及假阴性结果产生。在对23株K.pneumoniae菌和21株非K.pneumoniae菌的检测中显示了100％的特异性。

序列表

<110> 首都医科大学附属北京儿童医院

<120> 交叉引物扩增结合纳米生物传感器和AUDG检测核酸的方法

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Klebsiella pneumoniae

<400> 1

cactgtacgt cgtgttgc 18

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> Klebsiella pneumoniae

<400> 2

tctggcgaat aatgccatta ctttcgcggt ggtgtttctg aatg 44

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Klebsiella pneumoniae

<400> 3

catcatgcac gaaacagtct 20

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Klebsiella pneumoniae

<400> 4

tctggcgaat aatgccatta ctttc 25

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Klebsiella pneumoniae

<400> 5

aaagataaca aacagcgtcg 20

Claims

1.一种交叉引物扩增技术结合纳米生物传感器和AUDG检测核酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）提取待检测样品的核酸；

（2）提供前置换引物4s、核心交叉引物2s、扩增引物3a、扩增引物 1a以及后置换引物5a，另外，还提供在5’端被标记半抗原的上述任选的一种引物，命名为4s*、2s*、3a*、1a*或者5a*，所述前置换引物4s的序列如SEQ ID.NO.1所示，核心交叉引物2s的序列如SEQID.NO.2所示，扩增引物3a的序列如SEQ ID.NO.3所示，扩增引物 1a的序列如SEQ ID.NO.4所示，以及后置换引物5a的序列如SEQ ID.NO.5所示；

（3）在南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶、链移位型DNA聚合酶Bst、引物、dNTP，以及生物素化的dCTP存在下，使用待检测样品的核酸作为模板进行交叉引物扩增DNA；

（4）使用包被有亲和素化高分子纳米粒子的生物传感器检测步骤（3）的扩增产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述被标记的引物为3a*。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述被标记的半抗原为FITC。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述高分子纳米生物传感器包括一背板（1），在所述背板（1）上依次设置装有样品板（2）、结合板（3）、硝酸纤维素膜（4）及吸水板（5），在所述硝酸纤维素膜（4）上依次设置检测线（41）及控制线（42），在结合板（3）、检测线（41）、及控制线（42）区域依次包被有色基团修饰的，亲和素化的高分子纳米粒子（6）、抗FITC抗体（7）及生物素偶联的牛血清蛋白（8）。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述扩增的温度为63-65℃。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述扩增的温度为64℃。

7.一组用于多交叉引物恒温扩增K. pneumonia的rcsA基因的引物，其特征在于，所述引物包括：序列如SEQ ID.NO.1所示的前置换引物4s，序列如SEQ ID.NO.2所示的核心交叉引物2s，序列如SEQ ID.NO.3所示的扩增引物3a，序列如SEQ ID.NO.4所示的扩增引物 1a，以及序列如SEQ ID.NO.5所示的后置换引物5a。