CN109576349A

CN109576349A - 一种应用多交叉恒温扩增结合纳米生物传感技术检测白色念珠菌的方法

Info

Publication number: CN109576349A
Application number: CN201811580513.9A
Authority: CN
Inventors: 胡守奎; 赵帆; 牛莉娜; 闫琳琳; 农金轻; 郑凤芝; 高乃姝; 朱晓雪; 吴蕾; 王春梅
Original assignee: PEKING UNIVERSITY SHOUGANG HOSPITAL
Current assignee: Shougang Hospital Co.,Ltd.
Priority date: 2018-12-24
Filing date: 2018-12-24
Publication date: 2019-04-05

Abstract

本发明提供了一种应用多交叉恒温扩增结合纳米生物传感技术检测白色念珠菌的方法，提供了所述白色念珠菌ITSII扩增引物组：CP1、CP2、F1、F2、C1、C2、D1、D2、R1和R2，所述方法在多交叉恒温扩增中的扩增引物C1的5’端标记半抗原，在扩增引物D1的5’端标记生物素，所述方法针对白色念珠菌特异序列区间ITSII的扩增产物能被金纳米生物传感器可视化检测，所述方法便捷、快速、敏感、特异，适宜于推广至白色念珠菌的临床检测。

Description

一种应用多交叉恒温扩增结合纳米生物传感技术检测白色念珠菌的方法

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种应用多交叉恒温扩增结合纳米生物传感技术检测白色念珠菌的方法。

背景技术

白色念珠菌(Candida albicans，Ca)是人体肠道菌群中的一员，不会在体外繁殖。同时白色念珠菌也是一种机会致病性酵母。50％以上的人类念珠菌病因它而起。白色念珠菌是侵袭性念珠菌病最常见的病原之一，据报道全身念珠菌病患者的死亡率为40％。根据一份估计报告，在美国，医院感染的侵袭性念珠菌病每年可能导致11,200人死亡。然而，目前用于白色念珠菌检测的金标准方法是基于包括培养、显微镜检查和生化鉴定在内表型鉴定方法，通常需要耗费2天以上。因此，阳性鉴定可能发生在感染的晚期。这种延迟诊断可能导致***性真菌疾病患者预后不良。随着核酸诊断技术的快速发展，一些以PCR为基础的诊断技术(如普通PCR技术，荧光PCR技术)被用于白色念珠菌的快速诊断，然而这些方法依赖于昂贵复杂的仪器设备及高成本的探针合成，且需要后续的电泳步骤及熟练的操作人员。一些基层实验室无法满足上述条件，因此限制了这些技术在基层的应用。此外，目前运用PCR方法和real-time PCR方法检测白色念珠菌的技术，检测过程也要耗时2-4小时，也不利于快速检测和应急检测。因此，为了给予临床病人准确快速的诊断，找出特异的抗菌治疗方法，研发一个省时、省力和特异性较高的检测方法，能够快捷、敏感、特异的鉴定白色念珠菌成为必要。

近年发展起来的多种恒温扩增技术，较PCR技术而言，不依赖于热循环扩增设备，反应速度快，敏感性好。因此，有利于实现快速扩增，便捷检测及现场诊断。到目前为止，应用较为广泛的恒温扩增技术有滚环扩增(RCA)、连置换扩增(SDA)、解旋酶依赖的恒温扩增(HDA)、环介导恒温扩增(LAMP)、交叉扩增(CPA)及多交叉恒温扩增(MCDA)等。

在本发明中，发明人以MCDA为基础，结合纳米生物检测技术开发了一种应用于白色念珠菌的多交叉恒温扩增结合金纳米生物传感的核酸检测技术(detection of nucleicacid sequence by multiple cross displacement amplification coupled with goldnanoparticle-based lateral flow biosensor，MCDA-LFB)。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种应用多交叉恒温扩增结合纳米生物传感技术检测白色念珠菌的方法，能够能够快捷、敏感、特异的鉴定白色念珠菌。

鉴于存在于微生物中的具体基因存在着广泛的同源性和交叉反应性，因此，将MCDA-LFB方法用于某种特定基因的检测仍然存在着实质性的问题，在扩增靶基因，以及扩增区域和引物设计上仍然存在着极大的不确定性，因此也导致了后续的检测方法难以得到广泛的应用。目前针对白色念珠菌缺乏一种有效的MCDA-LFB检测方法，使得MCDA-LFB的高效特异性扩增难以在白色念珠菌的体外非诊断目的检测中得到应用，也制约了白色念珠菌体外非诊断目的检测的进一步发展。本发明实现了MCDA-LFB技术用于白色念珠菌的检测，建立了针对白色念珠菌的快速、敏感和特异的MCDA-LFB检测体系。

本发明第一方面提供了一种白色念珠菌的多交叉恒温扩增引物组，包括识别白色念珠菌ITSII的10条引物，所述10条引物分别为：如SEQ ID NO：1所示的交叉引物CP1，如SEQID NO：2所示的交叉引物CP2，如SEQ ID NO：3所示的置换引物F1，如SEQ ID NO：4所示的置换引物F2以及如SEQ ID NO：5-10所示的扩增引物C1、C2、D1、D2、R1和R2；

优选的，所述扩增引物组还包括引物C1*或C2*，引物D1*或D2*；所述扩增引物C1或C2的5’端标记半抗原，得到C1*或C2*；所述扩增引物D1或D2的5’端标记生物素，得到D1*或D2*。

更加优选的，所述半抗原为异硫氰酸荧光素或地高辛。

本发明第二方面提供了一种应用多交叉恒温扩增结合纳米生物传感技术检测白色念珠菌的方法，步骤包括：

S1、提取待检测白色念珠菌样品基因组；

S2、提供所述白色念珠菌的多交叉恒温扩增引物组：CP1、CP2、F1、F2、C1、C2、D1、D2、R1和R2，同时提供在扩增引物C1或C2的5’端标记半抗原的扩增引物C1*或C2*，在扩增引物D1或D2的5’端标记生物素的扩增引物D1*或D2*；

S3、在包括步骤S2所述白色念珠菌的多交叉恒温扩增引物组、甜菜碱、MgSO₄、dNTP、10×Bst DNA聚合酶缓冲液和链置换DNA聚合酶的多交叉恒温扩增反应体系下，使用待检测白色念珠菌样品基因组核酸作为模板进行多交叉恒温扩增，所述多交叉恒温扩增条件为：恒温在60～65℃30min，85℃5min，终止反应得到扩增产物；

S4、采用金纳米生物传感器检测步骤S3所得的扩增产物。

优选的，步骤S3中，所述多交叉恒温扩增反应体系中引物浓度分别为：交叉引物CP1的浓度为30pmol，交叉引物CP2的浓度为60pmol，置换引物F1和F2的浓度均为10pmol，扩增引物R1，R2，D1*和D2的浓度均为30pmol，扩增引物C1*和C2的浓度均为20pmol。

更加优选的，步骤S3中，所述多交叉恒温扩增反应体系中还包括10mM的甜菜碱，6mM的MgSO₄，1mM的dNTP，12.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液，10U的链置换DNA聚合酶，1μL的待检测白色念珠菌样品基因组模板，补去离子水至25μL。

优选的，步骤S3中，所述多交叉恒温扩增反应恒温温度为64℃。

优选的，步骤S4中，所述金纳米生物传感器包含样品垫，金标垫，纤维膜，吸水垫及背板；所述样品垫，金标垫，纤维膜及吸水垫依次组装在背板上，所述纤维膜上设置有检测线及控制线；将金纳米粒子偶联的链霉素亲和素、抗异硫氰酸荧光素抗体(或抗地高辛抗体)及生物素偶联的牛血清蛋白分别包被在金标垫、检测线及控制线上。

优选的，所述方法检测白色念珠菌的检测限为200fg。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明针对白色念珠菌特异序列区间ITSII设计了一套多交叉恒温扩增引物组CP1、CP2、F1、F2、D1、C1、R1、D2、C2和R2；为了构建可检测产物，在引物C1或C2的5’端标记半抗原，在引物D1或D2的5’端标记生物素(Biotin)，上述两条交叉引物CP1和CP2是介导MCDA扩增的主要引物；置换引物F1和F2置换在MCDA反应中发挥置换作用，置换交叉引物CP1和CP2；六条扩增引物D1*，C1*，R1，D2*，C2*和R2能够加速MCDA反应及增加MCDA产物量。本方法检测白色念珠菌的检测范围可低至200fg，且具备快速的检测速度，且具有优秀的特异性，能够准确的鉴别白色念珠菌。所述方法便捷、快速、敏感、特异，适宜于推广至白色念珠菌的临床检测。

附图说明

图1为MCDA-LFB引物设计的位置和方向示意图；

图2为MCDA扩增原理示意图及金纳米生物传感器检测示意图；其中，图2A为MCDA扩增原理示意图，图2B为金纳米生物传感器检测示意图；

图3为MCDA引物验证结果图谱；其中，A为可视颜色变化法检测结果图，B为电泳检测结果图，C为LFB检测结果图。

图4为标准MCDA-LFB最佳反应温度测试结果图谱；其中，A-F对应反应温度分别为60.0℃、61.0℃、62.0℃、63.0℃、64.0℃、65.0℃。

图5为MCDA-LFB检测白色念珠菌的灵敏度结果图谱；其中，A为可视颜色变化法检测结果图，B为LFB检测结果图，C为电泳检测结果图，D为实时浊度仪可视化读取MCDA扩增结果图。

图6为MCDA-LFB检测白色念珠菌的特异性结果图谱。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

1.实施例中所涉及的试剂及设备：

实施例中所涉及的试剂：抗异硫氰酸荧光素抗体(anti-FITC)，金纳米粒子偶联的链霉素亲和素(SA-G)及生物素偶联的牛血清蛋白(B-BSA)购于Resenbio公司。背板，样品垫，金标垫，纤维膜及吸水垫购于Jie-Yi公司。脱氧核糖核酸恒温扩增试剂盒(IsothermalAmplification Kit)购于北京海泰正元科技有限公司。DNA提取试剂盒(QIAamp DNAminikits)购于德国Qiagen公司。DL1000 DNA Marker购于宝生物工程(大连)有限公司。其余试剂均为市售分型纯产品。

实施例实验中使用的主要仪器：恒温实时浊度仪LA-320C(Eiken Chemical Co.,Ltd,Japan)购于日本荣研公司。PCR仪为Sensoquest Labcycler,德国Sensoquest产品；电泳设备为北京君意东方电泳设备有限公司产品；凝胶成像***为Bio-Rad Gel Dox XR,美国Bio-Rad产品。

本发明实验中所用菌株来自于首钢医院检验科临床分离培养鉴定后的保存菌株(如表2所示)。

2.引物设计

本发明针对白色念珠菌ITSII所在的特异序列区间设计了一套MCDA扩增引物，引物设计示意图见图1。引物序列及修饰见表1。

表1引物序列及修饰表

a:C1*,在5’端异硫氰酸荧光素(FITC)，用于MCDA-LFB检测体系；D1*,在5’端标记生物素(Biotin)，用于MCDA-LFB检测体系。

b：nt，nucleotide核苷酸；mer，monomeric unit单体单元

3.MCDA扩增

采用标准的MCDA反应体系：交叉引物CP1和CP1的浓度为30pmol,交叉引物CP2的浓度为60pmol，置换引物F1和F2的浓度为10pmol，扩增引物R1，R2，D1*和D2的浓度为30pmol，扩增引物C1*和C2的浓度为20pmol，10mM的甜菜碱，6mM的MgSO₄，1mM的dNTP，12.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液，10U的链置换DNA聚合酶，1μL的模板，补加去离子水至25μl。整个反应恒温在62℃30min，85℃5min终止反应。

4.生物检测器(LFB)的设计及原理

LFB的设计：如图2B所示，LFB包含五个部分，样品垫，金标垫，纤维膜，吸水垫及背板。首先将样品垫，金标垫，纤维膜及吸水垫依次组装在背板上。然后将SA-G(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)，anti-FITC(抗异硫氰酸荧光素抗体)及B-BSA(生物素偶联的牛血清蛋白)分别包被在金标垫，检测线及控制线(CL)，待干燥后备用。

LFB的检测原理：将MCDA产物0.2μL直接滴加到LFB的样品垫区域，然后将120μL的检测缓冲液加到样品垫区域，MCDA产物在虹吸作用下，从下往上运动(从样品垫向吸水垫方向运动)。当MCDA产物达到金标垫后，双标产物的一端(即生物素标记端)与SA-G(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)反应。当产物继续运动，双标产物的另一端(即异硫氰酸荧光素标记端)与检测线区域的抗体结合，将双标产物固定在检测线区域。随着产物在检测线区域的积累，通过另一端的SA-G(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)进行显色反应，从而对MCDA产物进行可视化检测。此外，过剩的SA-G(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)可与CL(质控线)区域的B-BSA(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)，进行直接显色反应，判断LFB的功能是否正常。

试验结果

1.通过MCDA扩增构建可检测产物

MCDA反应体系包括10条引物，识别靶序列的10个区域，包括2条交叉引物，即CP1和CP2(Cross Primer，CP)，2条置换引物，即F1和F2，6条扩增引物，即D1，C1，R1，D2，C2和R2。为了构建可检测产物，在引物C1或C2的5’端标记半抗原如异硫氰酸荧光素(FITC)，在引物D1或D2的5’端标记生物素(Biotin)，新标记的引物被命名为C1*，C2*，D1*和D2*。CP1包含Cls(C1区域的互补序列)和P1，即5′-Cls-P1；CP2包含C2s(C2区域的互补序列)和P2，即5′-C2s-P2。两条交叉引物CP1和CP2是介导MCDA扩增的主要引物；置换引物F1和F2置换在MCDA反应中发挥置换作用，置换交叉引物CP1和CP2；六条扩增引物D1*，C1*，R1，D2*，C2*和R2能够加速MCDA反应及增加MCDA产物量，见图2A。

为了便于理解，CP2和C2*引物在扩增示意图中被略去。在既定的恒温条件下，双链DNA在处于半解离和半结合的动态平衡状态中，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。首先在Bst DNA聚合酶的作用下，以CP1引物P1区段的3′末端为起点，与对应的DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。F1引物与C1s前端F1s序列互补，以3′末端为起点，通过链置换活性DNA聚合酶的作用，首先置换出CP1引物合成的DNA链，同时合成自身DNA。最终F1引物合成而得的DNA链与模板DNA形成双链。然而由交叉引物CP1先合成的DNA链被F1引物进行链置换产生一单链，该单链的D1s，C1s，R1s，P2s，F2s区域能够依次与扩增引物D1*，C1*，R1，交叉引物CP2及置换引物F2结合，并发挥链置换扩增作用(步骤1,2)。C1*引物扩增并置换D1*的扩增链，生成短片段C1s-D1产物，该产物能够与C1*和CP1引物结合，启动链置换扩增，进入循环扩增1(步骤3和循环1)。R1引物扩增并置换C1*的扩增链，生成短片段C1s-C1产物，该产物能够与C1*和CP1引物结合，启动链置换扩增，进入循环扩增1(步骤4和循环2)。在循环扩增2中，随着MCDA扩增的进行，大量的双标产物被形成，C1*端标记生物素，D1*端标记异硫氰酸荧光素(图2A)。该双标的产物能被金纳米生物传感器检测，从而进行可视检测(图2B)。此外，由于CP2和C2*的扩增过程与CP1和C1*的扩增过程相似，在MCDA扩增体系中，同样能够形成大量的双标的可检测产物。C2*端标记异硫氰酸荧光素，D2*端标记生物素。该双标的产物也能被金纳米生物传感器(LFB)检测，从而进行可视检测。因此，在利用MCDA-LFB技术进行靶序列检测时，可利用C1*和D1*引物构建可检测产物，也可利用C2*和D2*引物构建可检测产物。

2.验证MCDA引物的可行性

MCDA扩增之后，三种检测方法用于MCDA扩增结果的判别(图3)，首先，在反应混合物中加入可视染料(如孔雀石绿(Malachite green，MG)试剂)，阳性反应管从无色或浅蓝色变为蓝色，阴性反应保持无色或浅蓝色不变。其次，MCDA产物可以通过琼脂糖电泳后检测扩增子，由于产物中包含了不同大小的扩增片段，因此阳性扩增产物的电泳图呈特异性阶梯状，阴性反应不出现任何条带。更为直接简单的方法为通过LFB对产物进行检测。

可视颜色变化法：MCDA在合成DNA的同时产生大量的焦磷酸根离子，该离子能够夺取与钙黄绿素结合的锰离子，使钙黄绿素恢复游离状态而发荧光。该发光混合物能够与反应中产生的镁离子结合，使荧光得到增强。可以通过荧光目视检测颜色变化判读结果，阳性反应管从无色或浅蓝色变为蓝色，阴性反应保持无色或浅蓝色不变，见图3A。A1表示阳性扩增(反应管中加入10pg的白色念珠菌模板，作为阳性对照)，A2表示阴性扩增(反应管中加入10pg的铜绿假单胞菌，作用阴性对照)，A3表示阴性扩增(反应管中加入10pg的肺炎克雷伯菌模板，作用阴性对照)，A4表示空白对照反应(1微升的双蒸水代替10pg的模板，作为空白对照)。只有阳性对照出现阳性扩增，说明针对特异序列设计的检测白色念珠菌的MCDA引物可用。

电泳检测法：将图3A的产物进行电泳检测，由于MCDA的扩增产物包含了许多大小不一的短片段及一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显现不同大小区带组成的阶梯式图谱，见图3B。通过电泳检测法判读MCDA扩增结果，阳性反应出现了预期的结果，而阴性反应和空白对照未出现任何扩增条带，进一步验证了本研究所设计的MCDA引物可行，能用于靶序列扩增检测。

LFB检测：将图3A的产物进行LFB检测。由于针对白色念珠菌检测的MCDA引物标记的半抗原为FITC(异硫氰酸荧光素)，因此，当TL和CL出现红色条带时表示为白色念珠菌检测阳性。通过LFB检测法判读MCDA扩增结果，阳性反应出现了预期的结果，而阴性反应和空白对照仅出现CL红色条带，验证了本研究所设计的LFB，MCDA-LFB技术及MCDA引物可行，能够用于目的靶序列的检测(图3C)。

3.确定MCDA技术的最佳反应温度

在标准反应体系条件下，加入针对白色念珠菌DNA模板的对应MCDA引物，其模板浓度为10pg/ul。反应在不同的恒温条件下进行(60-65℃)，结果运用实时浊度仪进行检测，可得到MCDA引物的扩增动态曲线图(图4)。如图4所示，在不同的温度下均可见到稳健的扩增曲线。根据扩增曲线峰出现的最早时间，推荐64℃作为适宜于本次专利涉及的MCDA引物扩增的最佳反应温度。

4.MCDA-LFB检测白色念珠菌的灵敏度

运用连续稀释好的白色念珠菌基因组DNA进行标准的MCDA扩增反应后，4种检测方法用于MCDA扩增结果判别。

首先，采用可视染料法检测MCDA扩增结果。在反应混合物中加入可视染料(如孔雀石绿(Malachite green，MG)试剂)，如反应液从无色变为蓝色为阳性反应，仍保持原来的无色则为阴性反应。检测显示：白色念珠菌-MCDA的检测范围可低至200fg，阳性扩增管变为蓝色，(5A1-5A5)。而当反应体系中白色念珠菌基因组含量为20fg及以下，或无白色念珠菌基因组模板时，反应液不出现颜色变化，仍然为无色，表示阴性结果(5A6-5A8)。图5A运用染料法可视化读取MCDA扩增结果：5A1到5A7表示白色念珠菌的模板量为2ng,20pg,2pg,500fg,200fg，20fg，2fg；5A8表示空白对照(1微升双蒸水)。

其二，运用LFB检测MCDA产物。结果显示：白色念珠菌-MCDA-LFB的检测范围可低至200fg，LFB在TL和CL区域出现红色线(5B1-5B5)。而当反应体系中白色念珠菌基因组含量为20fg及以下，或无白色念珠菌基因组模板时，LFB仅在CL区域出现红色线，表示阴性结果(5B6-5B8)。图5B运用LFB可视化读取MCDA扩增结果：5B1-5B7表示白色念珠菌的模板量为2ng,20pg,2pg,500fg,200fg，20fg，2fg；5B8表示空白对照(1微升双蒸水)。

其三，通过琼脂糖凝胶电泳检测MCDA产物。由于产物中包含了大小不同的扩增片段，因此阳性扩增产物的电泳图呈阶梯状，而阴性反应则不出现任何条带。电泳检测显示：白色念珠菌-MCDA的检测范围可低至200fg，阳性反应出现阶梯状条带(5C1-5C5)。而当反应体系中白色念珠菌基因组含量为20fg及以下，或无白色念珠菌基因组模板时，则不出现特异的阶梯状条带，为阴性结果(5C6-5C8)。图5C运用电泳法检测MCDA扩增结果；5C1到5C7表示白色念珠菌的模板量为2ng,20pg,2pg,500fg,200fg，20fg，2fg；5C8表示空白对照(1微升双蒸水)。

其四，实时浊度仪用于分析MCDA扩增(图5D)。连续稀释好的白色念珠菌基因组DNA进行标准的MCDA扩增反应同时，运用实时浊度仪实时监测扩增情况，结果显示：白色念珠菌-MCDA的检测范围可低至200fg，阳性扩增浊度曲线被观察到(5D1-5D5)。而当反应体系中白色念珠菌基因组含量为20fg及以下，或无白色念珠菌基因组模板时，不出现阳性扩增浊度曲线，表示阴性结果(5D6-5D8)。图5D运用实时浊度仪可视化读取MCDA扩增结果；5D1到5D7表示白色念珠菌的模板量为2ng,20pg,2pg,500fg,200fg，20fg，2fg；5D8表示空白对照(1微升双蒸水)。

5.测定MCDA-LFB技术的特异性

以常见的致病菌及条件致病菌DNA(鲍曼不动杆菌、产气肠杆菌、化脓性链球菌、铜绿假单胞菌等)为模板评价MCDA-LFB技术的特异性。菌株信息详见表2。

表2特异性测定试验所用菌株信息表

特异性检测结果见图6，图6中1-13号为白色念珠菌检测结果，14-39号依次为：鲍曼氏不动杆菌，维罗纳气单胞菌，柯氏枸橼酸杆菌，粪产碱杆菌，奇异变形杆菌，普通变形杆菌，弗劳地枸橼杆菌，布氏枸橼酸杆菌，产气肠杆菌，阴沟肠杆菌，粪肠球菌，屎肠球菌，大肠埃希氏菌，产酸克雷伯氏菌，肺炎克雷伯菌，化脓性链球菌，热带念珠菌，铜绿假单胞菌，恶臭假单胞菌，粘质沙雷氏菌，多食鞘氨醇杆菌，金黄色葡萄球菌，山羊葡萄球菌，表皮葡萄球菌，溶血葡萄球菌和人葡萄球菌的检测结果。从图中可以看出MCDA-LFB技术能准确的鉴别白色念珠菌，说明MCDA-LFB方法的特异性良好。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 北京大学首钢医院

<120> 一种应用多交叉恒温扩增结合纳米生物传感技术检测白色念珠菌的方法

<141> 2018-11-29

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atcgatgcga gaaccaagag atcaacttgt cacaccagat 40

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

cgtgaatcat cgaatctttg aacgcacgct caaacaggca tg 42

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gaggtctaaa cttacaacc 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

agcggtttga gggagaaa 18

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

atcgatgcga gaaccaagag atc 23

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

cgtgaatcat cgaatctttg aacgc 25

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

cgttgttgaa agttttgac 19

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

attgcgccct ctggtatt 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

catttcgctg cgttcttc 18

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

cgatacgtaa tatgaattgc ag 22

Claims

1.一种白色念珠菌的多交叉恒温扩增引物组，其特征在于：包括识别白色念珠菌ITSII的10条引物，所述10条引物分别为：如SEQ ID NO：1所示的交叉引物CP1，如SEQ ID NO：2所示的交叉引物CP2，如SEQ ID NO：3所示的置换引物F1，如SEQ ID NO：4所示的置换引物F2以及如SEQ ID NO：5-10所示的扩增引物C1、C2、D1、D2、R1和R2。

2.如权利要求1所述的白色念珠菌的多交叉恒温扩增引物组，其特征在于：还包括引物C1*或C2*，以及引物D1*或D2*；所述扩增引物C1或C2的5’端标记半抗原，得到C1*或C2*；所述扩增引物D1或D2的5’端标记生物素，得到D1*或D2*。

3.如权利要求2所述的白色念珠菌的多交叉恒温扩增引物组，其特征在于：所述半抗原为异硫氰酸荧光素或地高辛。

4.一种应用多交叉恒温扩增结合纳米生物传感技术检测白色念珠菌的方法，步骤包括：

S1、提取待检测白色念珠菌样品基因组；

S4、采用金纳米生物传感器检测步骤S3所得的扩增产物。

5.如权利要求4所述的应用多交叉恒温扩增结合纳米生物传感技术检测白色念珠菌的方法，其特征在于：步骤S3中，所述多交叉恒温扩增反应体系中引物浓度分别为：交叉引物CP1的浓度为30pmol，交叉引物CP2的浓度为60pmol，置换引物F1和F2的浓度均为10pmol，扩增引物R1，R2，D1*和D2的浓度均为30pmol，扩增引物C1*和C2的浓度均为20pmol。

6.如权利要求5所述的应用多交叉恒温扩增结合纳米生物传感技术检测白色念珠菌的方法，其特征在于：步骤S3中，所述多交叉恒温扩增反应体系中还包括10mM的甜菜碱，6mM的MgSO₄，1mM的dNTP，12.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液，10U的链置换DNA聚合酶，1μL的待检测白色念珠菌样品基因组模板，补去离子水至25μL。

7.如权利要求4所述的应用多交叉恒温扩增结合纳米生物传感技术检测白色念珠菌的方法，其特征在于：步骤S3中，所述多交叉恒温扩增反应恒温温度为64℃。

8.如权利要求4所述的应用多交叉恒温扩增结合纳米生物传感技术检测白色念珠菌的方法，其特征在于：步骤S4中，所述金纳米生物传感器包含样品垫，金标垫，纤维膜，吸水垫及背板；所述样品垫，金标垫，纤维膜及吸水垫依次组装在背板上，所述纤维膜上设置有检测线及控制线；将金纳米粒子偶联的链霉素亲和素、抗异硫氰酸荧光素抗体或抗地高辛抗体、以及生物素偶联的牛血清蛋白分别包被在金标垫、检测线及控制线上。

9.如权利要求4所述的应用多交叉恒温扩增结合纳米生物传感技术检测白色念珠菌的方法，其特征在于：所述方法检测白色念珠菌的检测限为200fg。