CN114196767B

CN114196767B - 特异性分子靶标及其检测金黄色葡萄球菌st型的方法

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Publication number: CN114196767B
Application number: CN202111520970.0A
Authority: CN
Inventors: 吴清平; 周宝青; 叶青华; 王楚芳; 代京莎; 陈玲; 张菊梅; 丁郁; 陈谋通; 薛亮; 王涓; 吴诗; 蔡淑珍; 杨宁; 陈惠元
Original assignee: Institute of Microbiology of Guangdong Academy of Sciences; Guangdong Huankai Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Institute of Microbiology of Guangdong Academy of Sciences; Guangdong Huankai Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2021-12-13
Filing date: 2021-12-13
Publication date: 2024-02-23
Anticipated expiration: 2041-12-13
Also published as: CN114196767A

Abstract

本发明涉及微生物检验技术领域，尤其是具体公开金黄色葡萄球菌ST型特异性分子靶标及其检测金黄色葡萄球菌ST型的方法。本发明方法提供了用于鉴别3种金黄色葡萄球菌重要ST型的共6个新特异性分子检测靶标、PCR引物组以及荧光定量PCR、多重PCR快速检测方法。本发明的检测方法有能力一步鉴别金黄色葡萄球菌ST7、ST188、ST398，大大提高了金黄色葡萄球菌MLST分型效率，增强了实用性；本发明的检测方法还具有操作简单、结果判定易、检测时间短、特异性强、成本低的优点。

Description

特异性分子靶标及其检测金黄色葡萄球菌ST型的方法

技术领域

本发明涉及微生物检验技术领域，尤其是涉及三种金黄色葡萄球菌ST型特异性分子靶标及其检测金黄色葡萄球菌ST型的方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌是重要的食源性致病菌之一，也是常见的医院病原体之一。作为一种重要的人畜共患病原菌，金黄色葡萄球菌给人类健康、社会经济建设造成重大危害。研究表明，每年由金黄色葡萄球菌引发的食物中毒事件占食源性微生物食物中毒事件的25％，其产生的毒素可导致呕吐腹泻、化脓性感染、血流感染、上呼吸道感染，甚至威胁人类生命健康。随着抗生素广泛应用于细菌治疗，一系列耐药性(如耐甲氧西林、卡那霉素、氯霉素等)金黄色葡萄球菌也不断被发现，具有分布广泛、流行广泛、感染严重等特征，给临床治疗带来巨大的挑战。因此，建立精准的金黄色葡萄球菌溯源、流行性及危害分析平台具有重要意义。1988年Maiden等建立了多位点测序分型(multilocus sequence typing，MLST)技术，通过测定多个管家基因中长度约为470bp核心片段的核苷酸序列，分析不同的菌株之间序列型的差异，从而揭示菌株间等位基因的多样性，为全球流行病学数据标准化提供依据，广泛应用于细菌的流行病学、致病性和进化学等研究。据报道，金黄色葡萄球菌ST398多数表现多重耐药性，广泛分布于在畜牧养殖场、社区、医院等场所。研究人员对2010-2015年深圳地区临床分离金黄色葡萄球菌进行MLST分型发现，耐红霉素、四环素、妥布霉素的金黄色葡萄球菌主要型别为ST398、ST7、ST188及ST59等。根据本团队前期对全国重点城市的零售食品、巴氏乳中病原微生物污染调研发现，金黄色葡萄球菌ST7、ST188及ST398是重要ST型别。因此，快速准确鉴别上述3种金黄色葡萄球菌重要的ST型，可为金黄色葡萄球菌污染调查、临床监测、流行性及致病性研究提供依据。

根据SN/T 4525.2-2016《出口食品中致病菌的分子分型MLST方法第2部分：金黄色葡萄球菌》技术标准，金黄色葡萄球菌MLST分型方法主要包括：基因组DNA提取、多个管家基因选择及扩增、扩增产物纯化及测序分析、数据上传分析及分型等，整个过程操作繁琐、费时费力、成本也相对较高、不能满足大批量、快速鉴定的需求。另一方面，随着高通量测序技术的普及，通过获取金黄色葡萄球菌的全基因组数据，并将数据上传在线网站：https://pubmlst.org/databases/进行金黄色葡萄球菌MLST分型，该方法同样可对金黄色葡萄球菌进行ST分型，但依旧存在检测成本高、检测周期长等缺点。随着生物信息学及大数据库分析的发展，基于泛基因分析的组学技术广泛应用于细菌遗传变异、基因功能富集和进化分析等研究。因此，基于泛基因组分析技术挖掘金黄色葡萄球菌ST型分子鉴定靶标具有很大的潜力。

特异性分子检测靶标是保证PCR方法特异性、灵敏度的关键。目前，国内外PCR检测方法一步鉴定金黄色葡萄球菌ST7、ST188、ST398的分子检测靶标及引物相对较少，仅报道针对金黄色葡萄球菌ST398的分子靶标A07、C01和sau1-hsdS1，未有针对金黄色葡萄球菌ST7、ST188的分子检测靶标，难以满足实际快速检测的需要。而且，随着临床治疗过程中金黄色葡萄球菌新ST的不断发现，基于原有的分子靶标的精准鉴定面临了巨大的挑战。寻找新型特异性靶标分子用于3种金黄色葡萄球菌重要ST型(ST7、ST188、ST398)快速、精确检测具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供三种金黄色葡萄球菌ST型特异性分子靶标及其检测金黄色葡萄球菌ST型的方法。通过本发明的特异性分子靶标和引物组，能够精确的区分出金黄色葡萄球菌ST型，特异性较好，精确度较高。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

第一目的，本发明提供用于检测金黄色葡萄球菌的特异性分子靶标，所述分子靶标为：

(a)如SEQ ID NO:1～6所述的任意一种或几种核苷酸序列；或者，

(b)在(a)中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且与(a)中核苷酸具有90％以上同源性的核苷酸序列。

第二目的，本发明提供检测上述特异性分子靶标的引物组，所述引物组为：

针对如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列扩增的PCR引物组1包括：如SEQ ID NO:7所示的正向引物和如SEQ ID NO:8所示的反向引物；

针对如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列扩增的PCR引物组2包括：如SEQ ID NO:9所示的正向引物和如SEQ ID NO:10所示的反向引物；

针对如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列扩增的PCR引物组3包括：如SEQ ID NO:11所示的正向引物和如SEQ ID NO:12所示的反向引物；

针对如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列扩增的PCR引物组4包括：如SEQ ID NO:13所示的正向引物和如SEQ ID NO:14所示的反向引物；

针对如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列扩增的PCR引物组6包括：如SEQ ID NO:17所示的正向引物和如SEQ ID NO:18所示的反向引物；

针对如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列扩增的PCR引物组5包括：如SEQ ID NO:15所示的正向引物和如SEQ ID NO:16所示的反向引物。

本发明设计能够扩增上述特异性分子靶标的引物组，通过引物组可以扩增出目的条带，灵敏度在10³～10⁴CFU/mL。

第三目的，本发明提供一种金黄色葡萄球菌，是(a)、(b)或(c)；

(a)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ST7，含有如SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列；

(b)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ST188，含有如SEQ ID NO:3或SEQID NO:4所示的核苷酸序列；

(c)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ST398，含有如SEQ ID NO:5或SEQID NO:6所示的核苷酸序列。

第五目的，本发明提供上述特异性分子靶标或引物组在筛查金黄色葡萄球菌ST型试剂中的应用。

第六目的，本发明提供上述引物组在鉴别金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ST型中的应用。

作为本发明所述应用的优选实施方式，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ST型包括：ST7、ST188、ST398。

第七目的，本发明提供一种用于鉴别金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ST型的方法，包括以下步骤：

S1、使用上述引物组对样品或待测菌的基因组DNA进行PCR扩增；

S2、观察扩增产物是否出现目的条带，如果出现目的条带则判定该样品含有三种金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ST7、ST188、ST398中的一种。

本发明通过PCR反应，对特异性分子靶标使用检测引物进行扩增，通过观察扩增产物是否在预期位置即可判断是上述哪种金黄色葡萄球菌ST型。

作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤S1中，PCR扩增体系包括：PCR反应缓冲液、Tag酶、任一上述的引物组、dNTP、MgCl₂、模板DNA和灭菌双蒸水。

作为本发明所述方法的优选实施方式，所述PCR扩增体系为：10×PCR反应缓冲液2.5μL，Tag酶1U，10μmol/L任一上述的引物组中的正、反向引物各1μL，2.5mM dNTP 1μL，25mM MgCl₂ 2μL，模板DNA 100ng，灭菌双蒸水补足体积至25μL。

优选地，所述PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；57.5℃退火30s；72℃延伸50s；变性、退火、延伸共进行30个循环；最后72℃延伸10min。

第八目的，本发明提供一种定量检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ST7、ST188、ST398的方法，包括以下步骤：

S1、使用上述引物组对待测样品的基因组DNA在Roche 荧光定量扩增仪上进行qPCR扩增；

S2、以标准品的菌株纯培养物浓度的对数为横坐标，以相应的qPCR的实时Ct值为纵坐标，拟合所得曲线分别为定量金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ST7、ST188、ST398的标准曲线；

S3、利用软件SW 1.1分析扩增结果，通过荧光信号值与标准曲线进行比对，确定待测样品中金黄色葡萄球菌ST7、ST188、ST398的含量。

本发明通过qPCR体系，对特异性分子靶标使用检测引物组进行扩增，通过判断体系中荧光信号强度定量检测体系中各金黄色葡萄球菌ST型的浓度。

作为本发明所述方法的优选实施方式，qPCR扩增体系为：2×TB Green Premix反应液10μL，模板DNA 100ng，10μmol/L任一上述的引物组中正、反向引物各1μL，灭菌双蒸水补足体积至20μL。

优选地，所述qPCR扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，变性、退火共进行45个循环。

第九目的，本发明提供一种同时检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ST7、ST188、ST398的多重PCR方法，包括以下步骤：

S1、使用上述引物组1、引物组4、引物组5构建多重PCR，对样品或待测菌的基因组DNA进行多重PCR扩增；

S2、观察扩增产物是否出现目的条带，如果出现目的条带则判定该样品含有三种金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ST7、ST188、ST398中的一种或多种。

作为本发明所述方法的优选实施方式，多重PCR扩增体系为2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，模板DNA 100ng，5μmol/L金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ST7、ST188及ST398的引物组1、引物组4、引物组5的用量分别为2.6μL、1μL和1.6μL，灭菌双蒸水补足体积至20μL。

优选地，所述多重PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；57.5℃退火30s；72℃延伸50s；变性、退火、延伸共进行35个循环；最后72℃延伸10min。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了用于鉴别金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ST7、ST188及ST398的特异性分子靶标，并提供了检测特异性分子靶标相关的引物组，以及对应的PCR检测方法。本发明的检测方法有能力一步鉴别金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ST7、ST188、ST398，大大提高了金黄色葡萄球菌MLST分型效率，增强了实用性；本发明的检测方法针对3种金黄色葡萄球菌重要ST型鉴定具有操作简单、结果判定易、检测时间短、特异性强、成本低、稳定性好等优点。

附图说明

图1为实施例3中金黄色葡萄球菌ST7 PCR检测方法的特异性评价示意图；

图2为实施例4中金黄色葡萄球菌ST188 PCR检测方法的特异性评价示意图；

图3为实施例5中金黄色葡萄球菌ST398 PCR检测方法的特异性评价示意图(A为引物组5，B为引物组6)；

图4为实施例6中用于鉴定3种金黄色葡萄球菌重要ST型(ST7、ST188、ST398)的qPCR定量检测方法示意图；

图5为实施例7中金黄色葡萄球菌ST7加标牛奶qPCR定量检测方法灵敏度评价示意图；

图6为实施例8中金黄色葡萄球菌ST188加标牛奶qPCR定量检测方法灵敏度评价示意图；

图7为实施例9中金黄色葡萄球菌ST398加标牛奶qPCR定量检测方法灵敏度评价示意图；

图8为实施例10中同时鉴别3种金黄色葡萄球菌重要ST型(ST7、ST188、ST398)的多重PCR方法示意图；

图9为实施例11中同时鉴别3种金黄色葡萄球菌重要ST型(ST7、ST188、ST398)的多重PCR方法灵敏度评价示意图；

图10为实施例12中PCR方法对比已报道的金黄色葡萄球菌ST398靶标特异性示意图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1筛选获得3种金黄色葡萄球菌重要ST型的特异性分子靶标

根据NCBI网站中398株金黄色葡萄球菌和107株其他葡萄球菌基因组数据，进行泛基因组分析；筛选得到3种金黄色葡萄球菌重要ST型(ST7、ST188、ST398)的特异性基因片段，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～6所示。

筛选所获得金黄色葡萄球菌ST型的特异性分子靶标均来自金黄色葡萄球菌，靶标基因片段序列对应基因位点如下表1。

表1 3种金黄色葡萄球菌重要ST型的特异性分子靶标基因组位点

实施例2鉴定3种金黄色葡萄球菌ST型的PCR方法

1)引物设计

根据实施例1中的所述序列SEQ ID NO：1～6设计特异性PCR扩增引物(包括正向引物和反向引物)，引物组序列如下表2。

表2特异性PCR检测引物组

2)鉴别3种金黄色葡萄球菌ST型的方法，步骤如下：

S1、DNA模板制备：将待测菌株分别在LB液体培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒分别提取其细菌基因组DNA，作为待检模板；

S2、PCR扩增：使用实施例2中所述的引物组对待测样品DNA进行PCR扩增

①PCR检测体系：

②PCR扩增程序：

S3：取PCR扩增产物进行凝胶电泳；

S4：观察各引物组对应产物大小的位置是否存在单一扩增条带。如果存在，说明样品中含有3种金黄色葡萄球菌ST型中一种；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有对应的金黄色葡萄球菌ST型。

实施例3金黄色葡萄球菌ST7 PCR检测方法的特异性评价

取金黄色葡萄球菌ST7共23株，非目标菌71株，按照实施例2的方法进行PCR检测。其中，S1 DNA模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA；S2 PCR扩增时，使用的引物为引物组1。设置空白对照，空白对照的模板为不含基因组的水溶液。

所用各细菌的菌株及检测结果如下表3所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。PCR产物电泳结果如图1所示(A为引物组1、B为引物组2)；图中编号1为23种金黄色葡萄球菌ST7；编号2～74为非目标金黄色葡萄球菌ST7；M为2000Maker，C为质阴性质控，P为阳性质控。

表3本发明金黄色葡萄球菌ST7靶标特异性评价试验结果

由图1和表3可得，引物组的检测结果均只有金黄色葡萄球菌ST7显示出特异性扩增条带，其他非目标金黄色葡萄球菌ST7均无特异性条带，说明本发明鉴定方法特异性高。

实施例4金黄色葡萄球菌ST188 PCR检测方法的特异性评价

取金黄色葡萄球菌ST188共23株，非目标菌71株，按照实施例2的方法进行PCR检测。其中，S1 DNA模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA；S2PCR扩增时，使用的引物为引物组1。设置空白对照，空白对照的模板为不含基因组的水溶液。

所用各细菌的菌株及检测结果如下表4所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。PCR产物电泳结果如图2(A为引物组3、B为引物组4)所示；图中编号1为23种金黄色葡萄球菌ST188；编号2～74为非目标金黄色葡萄球菌ST188；M为2000Maker。C为质阴性质控，P为阳性质控。

表4本发明金黄色葡萄球菌ST188靶标特异性评价试验结果

由图2和表4可得，引物组的检测结果均只有金黄色葡萄球菌ST188显示出特异性扩增条带，其他非目标金黄色葡萄球菌ST188的均无特异性条带，说明本发明鉴定方法特异性高。

实施例5金黄色葡萄球菌ST398 PCR检测方法的特异性评价

取金黄色葡萄球菌ST398共81株，非目标菌71株，按照实施例2的方法进行PCR检测。其中，S1 DNA模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA；S2PCR扩增时，使用的引物为引物组1。设置空白对照，空白对照的模板为不含基因组的水溶液。

所用各细菌的菌株及检测结果如下表5所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。PCR产物电泳结果如图3(A为引物组5、B为引物组6)所示；图中编号1为81种金黄色葡萄球菌ST398；编号2～74为非目标金黄色葡萄球菌ST398；M为2000Maker。C为质阴性质控，P为阳性质控。

表5本发明金黄色葡萄球菌ST398靶标特异性评价试验结果

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由图3和表5可得，引物组的检测结果均只有金黄色葡萄球菌ST398显示出特异性扩增条带，其他非目标金黄色葡萄球菌ST398的均无特异性条带，说明本发明鉴定方法特异性高。

实施例6用于鉴定3种金黄色葡萄球菌重要ST型的qPCR定量检测方法

1)引物选择

使用实施例2中所述的引物组1、引物组3、引物组5对待测样品DNA进行PCR扩增；

2)鉴定3种金黄色葡萄球菌ST型的方法，步骤如下：

S1 DNA模板制备：将金黄色葡萄球菌ST7、ST188、ST398菌株在LB液体培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒分别提取其细菌基因组DNA，作为待检模板；

S2 PCR扩增：使用所述的引物组对待测样品DNA进行qPCR扩增；

①qPCR检测体系：

②qPCR扩增程序：

S3：取qPCR扩增体系于Roche 荧光定量扩增仪上进行；

S4：利用软件SW 1.1分析扩增结果是否符合预期。在空白对照不存在信号前提下，如果产生荧光扩增曲线和对应的溶解曲线，说明样品中含有金黄色葡萄球菌ST7、ST188及ST398中的一种或多种；如果不产生信号，则样品中不含有3种金黄色葡萄球菌ST型中任何一种。

荧光扩增曲线及对应的溶解曲线如图4所示，当样品含有金黄色葡萄球菌ST7、ST188及ST398三种时，可同时出现三条明显的荧光扩增曲线及对应3条独立的溶解曲线，而空白对照均不出现荧光曲线和溶解曲线。

实施例7金黄色葡萄球菌ST7加标牛奶qPCR定量检测方法灵敏度评价

液体牛奶采用紫外杀菌后加入生理盐水制备无菌样品，经NA营养琼脂平板培养后结果显示处理后无微生物存在，保证后续实验中微生物均来源于人工污染。

将培养至浓度为8.6×10⁸CFU/mL的金黄色葡萄球菌ST7分离株42-0使用去离子水按照10倍梯度稀释后加标支牛奶样本中，得到最终浓度为10¹，10²，10³，10⁴，10⁵，10⁶，10⁷，10⁸CFU/mL的混合物，按照实施例6进行DNA模板的提取，即为金黄色葡萄球菌ST7加标牛奶样本，按照实施例6进行qPCR反应，每个模板分别进行三次平行实验。

绘制标准曲线：以加标牛奶样本中金黄色葡萄球菌ST7浓度的对数为横坐标，以相应的qPCR的实时Ct值为纵坐标，拟合所得曲线即为金黄色葡萄球菌ST7定量的标准曲线。

标准曲线如图5所示，本发明引物的检测限为8.6×10³CFU/mL，所述金黄色葡萄球菌ST7的拟合标准曲线为y＝-3.2062x+32.99，相关系数R²为0.9961。

实施例8金黄色葡萄球菌ST188加标牛奶qPCR定量检测方法灵敏度评价

准备浓度为1.2×10⁸CFU/mL的金黄色葡萄球菌ST188分离株126-0，按照实施例7中加标牛奶样本方法制备对应的人工加标样本。按照实施例6进行DNA模板的提取，即为金黄色葡萄球菌ST188加标牛奶样本，按照实施例6进行qPCR反应，每个模板分别进行三次平行实验。

按照实施例7中曲线拟合方式建立对应的人工加标样本标准曲线。

标准曲线如图6所示，本发明引物的检测限为1.2×10³CFU/mL，所述金黄色葡萄球菌ST188的拟合标准曲线为y＝-3.435x+33.96，相关系数R²为0.99488。

实施例9金黄色葡萄球菌ST398加标牛奶qPCR定量检测方法灵敏度评价

准备浓度为6.4×10⁸CFU/mL的金黄色葡萄球菌ST398分离株67-0，按照实施例7中加标牛奶样本方法制备对应的人工加标样本。按照实施例6进行DNA模板的提取，即为金黄色葡萄球菌ST398加标牛奶样本，按照实施例6进行qPCR反应，每个模板分别进行三次平行实验。

标准曲线如图7所示，本发明引物的检测限为6.4×10³CFU/mL，所述金黄色葡萄球菌ST398的拟合标准曲线为y＝-2.7914x+32.36，相关系数R²为0.97823。

实施例10同时鉴别3种金黄色葡萄球菌重要ST型的多重PCR方法

1)引物选择

使用实施例2中所述的引物组1、引物组4、引物组5对待测样品DNA进行多重PCR扩增；

2)同时鉴定3种金黄色葡萄球菌ST型的多重PCR方法，步骤如下：

S1 DNA模板制备：取3株金黄色葡萄球菌ST7、3株金黄色葡萄球菌ST188和3株金黄色葡萄球菌ST398，将所有菌株分别在LB液体培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒分别提取其细菌基因组DNA，作为待检模板；

S2 PCR扩增：使用实施例2中所述的引物组对待测样品DNA进行多重PCR扩增；

①多重PCR检测体系：

②多重PCR扩增程序：

S3：取多重PCR扩增产物进行凝胶电泳；

S4：观察各引物组对应产物大小的位置的扩增条带情况。如果同时存在一条或多条对应的目标条带，说明样品中含有3种金黄色葡萄球菌ST型中一种或多种；如果没有出现相应的扩增条带，则样品中不含对应的金黄色葡萄球菌ST型。

多重PCR方法可行性结果如图8所示，泳道1-3：3株金黄色葡萄球菌ST7，泳道4-6：3株金黄色葡萄球菌ST188，泳道7-9：3株金黄色葡萄球菌ST398，泳道10-12：3株金黄色葡萄球菌ST7分别与3株金黄色葡萄球菌ST398混合物，泳道13-15：3株金黄色葡萄球菌ST7分别与3株金黄色葡萄球菌ST188混合物，泳道16-18：3株金黄色葡萄球菌ST188分别与3株金黄色葡萄球菌ST398混合物，泳道19-21：3株金黄色葡萄球菌ST7、ST188与ST398的共同混合物，泳道C为阴性对照，泳道M为2000bp DNA Maker。结果显示样品中分别存在金黄色葡萄球菌ST7、ST188和ST398三种目标菌时的一重、两重或三重时，均可实现准确地检测，说明本发明建立的多重PCR方法可实现同时检测金黄色葡萄球菌ST7、ST188和ST398中任意一种或多种。

实施例11同时鉴别3种金黄色葡萄球菌重要ST型的多重PCR方法灵敏度评价

按照实施例7、8、9中程序准备金黄色葡萄球菌ST7(42-0)、ST188(126-0)、ST398(67-0)纯菌液，按照实施例7中加标牛奶样本方法制备对应的人工加标样本。按照实施例6进行DNA模板的提取，即为金黄色葡萄球菌ST7、ST188、ST398加标牛奶样本，按照实施例10进行多重PCR反应。

多重PCR方法灵敏度检测结果如图9所示，泳道1-8分别为10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10¹CFU/mL的3种金黄色葡萄球菌ST型DNA混合物，M为2000bp DNA Maker。本发明针对金黄色葡萄球菌ST7、ST188、ST398引物的多重PCR方法检测限分别为8.6×10⁴CFU/mL、1.2×10⁵CFU/mL、6.4×10⁴CFU/mL。

实施例12基于已报道金黄色葡萄球菌ST398靶标的PCR检测方法的特异性评价

按照实施例5中步骤，取金黄色葡萄球菌ST398共81株，非目标菌71株，按照实施例2的方法进行PCR检测。其中，S1：DNA模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA；S2：PCR扩增时，使用的引物为已报道特异性检测金黄色葡萄球菌ST398的PCR引物组A07和C01。设置空白对照，空白对照的模板为不含基因组的水溶液。

表6已报道特异性检测金黄色葡萄球菌ST398的PCR引物组

所用各细菌的菌株及检测结果如图10所示，图中所有编号与实施例5一致。

由图10-A可得，已报道靶标A07对应引物组的检测结果发现，针对81株目标菌扩增时2株目标金黄色葡萄球菌ST398未出现特异性扩增条带，而在71株其他非目标金黄色葡萄球菌ST398扩增时发现6株非目标菌扩增出特异性条带。同样地，如图10-B可得，已报道靶标C01对应引物组的检测结果发现，针对81株目标菌扩增时有1株目标金黄色葡萄球菌ST398未出现特异性扩增条带，而在71株其他非目标金黄色葡萄球菌ST398扩增时20株非目标菌扩增出特异性条带。结果表明，已报道的靶标A07和C01存在一定的假阳性和假阴性，无法实现对目标菌准确、特异地鉴定。而如实施例5中图3所示，本发明所挖掘的针对金黄色葡萄球菌ST398靶标表现出良好的准确度和特异性，实用性更强。

实施例13实际样本中金黄色葡萄球菌ST型检测结果

从广州当地超市采集12份液态奶运回实验室。在洁净工作台中，无菌操作下进行样本处理，具体步骤参照GB/4789.10-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》进行，然后将鉴定为金黄色葡萄球菌的菌株制备模板提取基因组DNA，具体按照实施例6进行DNA模板的提取。最后按照实施例6、实施例10分别进行qPCR方法及多重PCR方法进行实验。以标准SN/T 4525.2-2016《出口食品中致病菌的分子分型MLST方法第2部分：金黄色葡萄球菌》为对照，对鉴定出的金黄色葡萄球菌进行MLST分型。同时，为了保证结果的准确性，分别选择已知的3种金黄色葡萄球菌ST型(ST7、ST188、ST398)各一种加标液态奶中，按照SN/T 4525.2-2016进行鉴定。

检测结果如表7，表中“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。

表7实际样本中金黄色葡萄球菌ST型检测结果

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由表7可得，与标准MLST分型方法比较，在检测的12份液态奶样本中，利用本发明的qPCR及多重PCR方法进行样本中金黄色葡萄球菌ST型检测，3种ST型检出准确率均为100％，3个阳性对照样本准确率100％。

本发明的qPCR及多重PCR方法针对实际样本中3种金黄色葡萄球菌重要ST型(ST7、ST188、ST398)，有能力一步完成鉴别，大大提高了针对金黄色葡萄球菌ST7、ST188、ST398分型效率，增强了实用性；本发明的检测方法还具有操作简单、结果判定易、检测时间短、特异性强、成本低的优点。后续通过设计多重PCR体系并结合微流控芯片等生物传感器，有望实现高通量检测。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）、广东环凯生物科技有限公司

<120> 特异性分子靶标及其检测金黄色葡萄球菌ST型的方法

<130> 2021.12.10

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgaagagca tagaaattaa atctgtatta aattcaaatt tagcagttac atcagatcaa 60

gcagagataa tatataaatt attatctgat tctataaaaa aaggggaaaa tattgaggtt 120

aatttcgaag gaatcacagt cttaaccact gcttttctaa atgcagctat aggtagacta 180

tatgatattg ctgatagtaa acaattaaat gagtatgtta agataaatac attacattta 240

aataattcac attttaataa aatcaaaatg gttatgagta acagtagaga gaaacgagag 300

gctaaccaag ttctgatgga aagagtttta aatgatggct attga 345

<210> 2

<211> 888

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atggaaactt ataaaatcaa aatgccatat tatatcaatc aaaattcata ttatataaat 60

gaattaaatc aaagtatgca tagagcttta gagaaagtaa aagaaaacga tagaatcata 120

ttagacttca caaatactga gtggtttaat gctgaattga cagtactatt gtctgactat 180

atcgaaacgt ttcatgaaaa gaatattcat gttgaagttt caggattaaa aaaagcaatt 240

gagataatct taaggaaaaa tcattttttt acttattatc aagtttttga atctttacca 300

gataaatata acacgactat cagttttaca atccataatt ttaacgatat agaaaaaata 360

gatgactata tacaagattc attatttaca agtttaagta aaacgataaa taatgatttt 420

gtgcaataca ttaaagaaaa tttgtttgaa gttattcata atataagaga tcattcaaat 480

tcaaataaag tctttatgtg cggacaattt tatcccaata aagatagatt aacatttgct 540

attagtgata taggtatagg attatccaaa aagataaaag agtctaacaa gcatattaaa 600

acaaatgaag atgcaatatt atggagtttt gaaaaaggta actctaccaa agaatcatta 660

gatgctgggt taggtctata cgaattacat tcacgtctta gaaataaagg tagtttgata 720

attttgacag aaaatgcttt ttttaaacta aataaaaacg gacaatatga ctttgtagaa 780

cttgaagatt cattgatagg aactgttatt attattaact ttaatataaa tgattgttta 840

caggctaaca gctttgctat aataaataat gaaaacttag aatggtag 888

<210> 3

<211> 417

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

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gaaaaagcga tagaaattgc gaatgcaatg ttgagagaag gatatcttga aaaagatgtt 120

attcctatcg caacgaaaaa agcaaaagat tggtatcgaa cgctatcgaa agaagaaatc 180

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gtggatagtg aagatgcaac aactgataat gaaaaacgta ttcaagaagt atcaaatcaa 300

aataagtcaa aatttaatat tgaaccaaat gaaagtgaaa gtagtggcgt tcgccaaaga 360

gagtcaatta ttgatggtcc acatgcaaaa gctgtgggat catttaaaga cttataa 417

<210> 4

<211> 423

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atgccctata actttacgac gcagaataaa ggtttaatgt ctgtgatgaa tcaaggtgag 60

acatttattc atcagtcacc cgttaatgat gaactaagtg ctttgattaa gttacttatt 120

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ggtgtaacgc aaatgaaaat cgatgaagtg atgagttata atcatctaga tttattttca 240

gaggaagaaa gagtgacctt agaatttgct gaaaaattaa atgcgattaa agattttaaa 300

aaattcgata ttatcgaaag gctaaaaata ttttatgatg aagagcaaat tacagattta 360

gtattcgtgg taaatcaaat caatagttgg aatcgattga acattattag tgaaaattta 420

tag 423

<210> 5

<211> 303

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

atggaaaatg gcatggtcat ggaagaaaac gccttctacg atgccttagc ttcacatgat 60

acagctgagc atgttctagg tgatgataca ttaaaaatca ttgctcatga actaactcag 120

tctattaaag aaaatatgag tattgattgg aacttatgcg aatcagcacg tgcaaaaatg 180

cgagttatcg taagacgcct attgaaaaag tacggatatc caccagaaat cagtaaacaa 240

gcagtagaaa ccgtcattga acaagcagag ctgatgtcag agcagctggc gatggaatta 300

taa 303

<210> 6

<211> 921

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ttgaataacc aattaaaaga atttaaaaat actataaagg ttgagagatc taaattactt 60

ccaagtccat ttgatatggt atataaaaac tttgaaaaat taggatatca caaacagaat 120

gagcaatttt tctacgataa tgccagtata attattgatg aacttagaaa tcagagctgg 180

attgaattta aaaaaataga gaaagagttt tcgaaaaagc tttattctca tctattagat 240

caagatagtg aaaattataa aaacatgact gttaaagaag ggattgaaaa attcacatct 300

aaacatactg acgaaatata tgctttacaa ttatctaata cacaaagtag aagatccaga 360

gctggaaaag aatttgaatc aataatagaa ttggtgttaa tgggagccaa cattgaattt 420

gtaactcaag gttcgattgg gagcggagtt tttgaatctt cagaactagc aaaattagtt 480

gattgtgtag tgcctggagc tgcagaatat aacttaaata aaagaaatac cagtttaatt 540

agcacaaaga ccagtttgag agaaagatgg caagaagtcg gcgatgagat gtctaggact 600

aaagctaaag aaatgtattt ggtaacctta gatgaaagta taagtgaaaa aacattaaag 660

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ctaaatagtt caaatgttat tagttttgaa gatatgttaa atgaattaca tatacagtta 780

ttacaatgga ataactatgg ctatccagca acagaactta ataataaaaa ggaattatat 840

caaactttaa tagaaaaata tgatggaaat atgtttgtta gaaactatta tgaaaatatg 900

ttgagtaata taaatgtgta g 921

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gttacatcag atcaagcaga g 21

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

gcatttagaa aagcagtgg 19

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

cgactatcag ttttacaatc c 21

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

cgtatagacc taacccagc 19

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gatgttattc ctatcgcaac g 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

gaacgccact actttcactt t 21

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

gccctataac tttacgacgc ag 22

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

ccaactattg atttgattta ccacg 25

<210> 15

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

attggtgtta atgggagcc 19

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

atctcatcgc cgacttcttg 20

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

cttctacgat gccttagc 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

tgttcaatga cggtttct 18

Claims

1.用于检测金黄色葡萄球菌的分子标记的引物组，其特征在于，所述引物组为：

针对如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列扩增的PCR引物组1包括：如SEQ ID NO:7所示的正向引物和如SEQ ID NO:8所示的反向引物；或，

针对如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列扩增的PCR引物组2包括：如SEQ ID NO:9所示的正向引物和如SEQ ID NO:10所示的反向引物；或，

针对如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列扩增的PCR引物组3包括：如SEQ ID NO:11所示的正向引物和如SEQ ID NO:12所示的反向引物；或，

针对如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列扩增的PCR引物组4包括：如SEQ ID NO:13所示的正向引物和如SEQ ID NO:14所示的反向引物；或，

针对如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列扩增的PCR引物组6包括：如SEQ ID NO:17所示的正向引物和如SEQ ID NO:18所示的反向引物；或，

2.如权利要求1所述的引物组在制备筛查金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ST型试剂中的应用。

3.如权利要求1所述的引物组在非疾病诊断和治疗目的的鉴别金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ST型中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ST型为ST7、ST188、ST398。

5.一种用于鉴别金黄色葡萄球菌ST型的非疾病诊断和治疗目的的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、使用任一如权利要求1所述的引物组对样品或待测菌的基因组DNA进行PCR扩增；

S2、观察扩增产物是否出现目的条带，如果出现目的条带则判定该样品含有三种金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ST7、ST188、ST398中的一种。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S1中，PCR扩增体系包括：PCR反应缓冲液、Tag酶、任一如权利要求1所述的引物组、dNTP、MgCl₂、模板DNA和灭菌双蒸水。

7.一种同时检测金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ST7、ST188、ST398的非疾病诊断和治疗目的的多重PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、使用如权利要求1所述的引物组1、引物组4和引物组5构建多重PCR，对样品或待测菌的基因组DNA进行多重PCR扩增；

S2、观察扩增产物是否出现目的条带，如果出现目的条带则判定该样品含有三种金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ST7、ST188、ST398中的一种或多种。