CN106526003A - 一种酵母细胞及酵母抽提物中还原型谷胱甘肽的检测方法 - Google Patents

Abstract

一种酵母细胞及酵母抽提物中还原型谷胱甘肽的检测方法，利用高效液相色谱仪，通过外标法对还原型谷胱甘肽进行定性、定量检测。本方法利用甲醇/水二元流动相(其中水相中添加庚烷磺酸钠、磷酸二氢钾和磷酸)，通过调节溶液pH值或者调节两相配比或者协同调节来调控还原型谷胱甘肽在色谱柱上的保留时间，提高理论塔板数，改善色谱峰型，使得酵母中还原型谷胱甘肽含量检测准确可信。本方法操作简单、高效，为控制酵母细胞发酵生产谷胱甘肽工艺中谷胱甘肽的检测提供了良好的参考，为提高谷胱甘肽原料的质量标准提供了方法依据。

Description

一种酵母细胞及酵母抽提物中还原型谷胱甘肽的检测方法

技术领域

本发明涉及一种酵母细胞及酵母抽提物中还原型谷胱甘肽的检测方法，具体涉及一种酵母发酵产品中还原型谷胱甘肽的测定方法。

背景技术

还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)作为一种重要的药物试剂，在临床上用途极广，同时GSH的抗氧化性能又使得它在食品和化妆品加工业中作为添加剂而受到青睐。如何快速、简单、高效检测还原型谷胱甘肽含量，不但对酵母发酵生产GSH工艺质量控制至关重要，而且对GSH在食药领域相关产品的质量标准控制与提高也显得尤为关键。

目前还原型谷胱甘肽的主要检测方法为DTNB衍生-光度法，因巯基容易对该方法产生假阳性干扰，检测含量偏高，故该方法可信度低，不适合用于还原型谷胱甘肽含量的精确检测。虽然文献已有报道采用HPLC方法检测还原型谷胱甘肽含量，但还原型谷胱甘肽在色谱柱中保留时间过短，容易与酵母细胞中其他化学成分叠加；而且有的方法体系中还原型谷胱甘肽峰形拖尾，不对称；这些都严重干扰还原型谷胱甘肽含量测定。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种酵母细胞及酵母抽提物中还原型谷胱甘肽的检测方法，该方法能够有效地检测酵母细胞中还原型谷胱甘肽的含量，从为富含还原型谷胱甘肽酵母细胞及酵母抽提物的生产工艺质量控制提供有效保障，同时为富营养酵母质量标准制定提供方法依据。

本发明的目的是这样实现的：一种酵母细胞及酵母抽提物中还原型谷胱甘肽的检测方法，包括以下步骤：

(1)选择对照物质：选择谷胱甘肽作为对照物质，纯度>99.9％；

(2)制备标准品溶液：取还原型谷胱甘肽标准品80mg，加入去离子水溶解，定容至10mL，摇匀，得到还原型谷胱甘肽标准储备液(8mg/mL)；依次配制成4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL和0.25mg/mL的储备液；

(3)制备供试品溶液：取安琪酵母股份有限公司生产的酵母粉1g，加入10mL去离子水，80℃下提取15分钟，迅速置于冰水中冷却至室温，4000转下离心10分钟，取上清液，得到供试品溶液；

(4)液相色谱测定：分别取还原型谷胱甘肽标准品溶液注入高效液相色谱仪，记录峰面积，以还原型谷胱甘肽浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标进行线性回归分析，制得线性方程。取稀释n倍的供试品溶液注入高效液相色谱仪(取稀释后还原型GSH浓度介于1.0至3.0mg/mL之间的稀释倍数的供试品溶液注入高效液相色谱仪，进一步优选为取稀释后还原型GSH浓度为2.0mg/mL的稀释倍数的供试品溶液)，供试品色谱图中出峰时间及峰形与对照品溶液色谱图中还原型谷胱甘肽的出峰时间及峰形进行比对，判定供试品溶液含有谷胱甘肽物质。将供试品色谱图中还原型谷胱甘肽峰面积数值(介于还原型谷胱甘肽标准品最小与最大浓度对应的峰面积之间)代入线性方程，即可计算出酵母细胞及酵母抽提物中还原型谷胱甘肽的含量。

酵母细胞及酵母抽提物，包括：酵母乳、酵母干粉、酵母粗提物等形式。

所用的高效液相色谱仪中色谱柱为：Venusil XBP C18柱(5μm×10×250mm)；流动相为甲醇-水二元流动相，其中水相包括1L去离子水，2.2g/L庚烷磺酸钠，6.8g/L磷酸二氢钾，pH调节范围为2.0-3.0。甲醇：水相的混合体积比范围为16:80-8:92。流动相使用前经0.45μm滤膜抽滤并脱气；流速：1mL/min；进样体积：10μm；柱温：25℃；检测波长：203nm。

所用的甲醇-水二元流动相中，水相pH调节范围为2.0-3.0。在此范围内，固定甲醇：水相的混合体积比，pH越小，还原型谷胱甘肽的保留时间越长，峰形越尖锐对称，还原型谷胱甘肽含量测定越准确。固定甲醇：水相的混合体积比为16:84，通过调节水相pH值，还原型谷胱甘肽的保留时间可控制在5.0-18.0分钟内。

所用的甲醇-水二元流动相中，甲醇：水相的混合体积比范围为16:80-8:92。在此范围内，固定水相pH，混合体积比越小，还原型谷胱甘肽的保留时间越长，峰形越尖锐对称，还原型谷胱甘肽含量测定越准确。固定水相pH为2.5，通过调节甲醇：水相的混合体积比，还原型谷胱甘肽的保留时间可控制在5.0-18.0分钟内。

通过步骤(4)中供试品溶液所得色谱图中还原型谷胱甘肽的峰面积，按下述计算公式可得到供试品中还原型谷胱甘肽的含量。

计算公式如下：

其中x-供试品峰面积，n-供试品稀释倍数，y-供试品中还原型谷胱甘肽的含量，单位为mg/mL。

通过步骤(4)制得的线性方程相关系数平方R²为0.9997，还原型谷胱甘肽质量浓度在0.25-4.00mg/mL之间呈现良好的线性关系；按信噪比S/N为3计，还原型谷胱甘肽最小检测浓度为6.5μg/mL。

本发明利用甲醇/水二元流动相(其中水相中添加庚烷磺酸钠、磷酸二氢钾和磷酸)来调控还原型谷胱甘肽在色谱柱上的保留时间，提高理论塔板数，改善色谱峰型，使得酵母中还原型谷胱甘肽含量检测准确可信。本发明提供的酵母细胞及酵母抽提物中还原型谷胱甘肽的检测方法，该方法操作简单、高效，可定性或定量检测酵母细胞中还原型谷胱甘肽的含量，为控制富含还原型谷胱甘肽的酵母产品提供了良好的生产质量保障。同时，该方法可用于食药领域中富含还原型谷胱甘肽的含量测定，为此类产品的质量标准提供了方法依据。

附图说明

图1是实施例1标准品溶液在pH 4.5二元流动相下的高效液相色谱图。

图2是实施例2标准品溶液在pH 2.5二元流动相下的高效液相色谱图。

图3是实施例2标准品溶液在高甲醇浓度二元流动相下的高效液相色谱图。

图4是实施例3还原型谷胱甘肽标准曲线图。

图5是实施例4第1批次的酵母乳液样品供试品溶液高效液相色谱图。

具体实施方式

实施例1

高效液相色谱仪分析条件优化

二元流动相为甲醇-水相(其中水相包括1L去离子水，2.2g/L庚烷磺酸钠，6.8g/L磷酸二氢钾，pH值为4.5)，甲醇：水相的混合体积比8:92，在色谱柱Venusil XBP C18柱(5μm×10×250mm)上进行标准品分析实验。结果还原型谷胱甘肽在色谱柱上出峰时间为2.5min，且峰形严重拖尾。图1是标准品溶液在pH 4.5二元流动相下的高效液相色谱图。色谱柱为：Venusil XBP C18柱(5μm×10×250mm)；流动相为甲醇-水二元流动相，其中水相包括1L去离子水，2.2g/L庚烷磺酸钠，6.8g/L磷酸二氢钾，pH值为4.5。甲醇：水相的混合体积比为8:92。流动相使用前经0.45μm滤膜抽滤并脱气；流速：1mL/min；进样体积：10μm；柱温：25℃；检测波长：203nm。

实施例2

二元流动相中水相pH值的影响

用磷酸分别调节二元流动相中水相的pH为4.5,4.0,3.5,3.0,2.5，甲醇：水相的混合体积比8:92，在色谱柱Venusil XBP C18柱(5μm×10×250mm)上进行标准品分析实验。结果表明：二元流动相中水相pH值对还原型谷胱甘肽在色谱柱上的保留时间有重要影响。pH值越小，保留时间越长，峰形越尖锐对称。

用磷酸分别调节二元流动相中水相的pH为2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9，甲醇：水相的混合体积比8:92，在色谱柱Venusil XBP C18柱(5μm×10×250mm)上进行标准品分析实验。结果表明：当水相pH为2.5时，洗脱出来的还原型谷胱甘肽保留时间为16min，峰形尖锐对称；其他pH下，洗脱出来的还原型谷胱甘肽峰形多为前伸或拖尾。图2是标准品溶液在pH2.5二元流动相下的高效液相色谱图。色谱柱为：Venusil XBP C18柱(5μm×10×250mm)；流动相为甲醇-水二元流动相，其中水相包括1L去离子水，2.2g/L庚烷磺酸钠，6.8g/L磷酸二氢钾，pH值为2.5。甲醇：水相的混合体积比为8:92。流动相使用前经0.45μm滤膜抽滤并脱气；流速：1mL/min；进样体积：10μm；柱温：25℃；检测波长：203nm。

当二元流动相为甲醇-水相(其中水相包括1L去离子水，2.2g/L庚烷磺酸钠，6.8g/L磷酸二氢钾，pH值为2.5)，甲醇：水相的混合体积比16:84，在色谱柱Venusil XBP C18柱(5μm×10×250mm)上进行标准品分析实验，该方法理论塔板数最高，还原型谷胱甘肽在色谱柱上的保留时间为8min。图3是标准品溶液在高甲醇浓度二元流动相下的高效液相色谱图。色谱柱为：Venusil XBP C18柱(5μm×10×250mm)；流动相为甲醇-水二元流动相，其中水相包括1L去离子水，2.2g/L庚烷磺酸钠，6.8g/L磷酸二氢钾，pH值为2.5。甲醇：水相的混合体积比为16:84。流动相使用前经0.45μm滤膜抽滤并脱气；流速：1mL/min；进样体积：10μm；柱温：25℃；检测波长：203nm。

实施例3

还原型谷胱甘肽标准曲线与回归方程制作

取还原型谷胱甘肽标准品80mg，加入去离子水溶解，定容至10mL，摇匀，得到还原型谷胱甘肽标准储备液(8mg/mL)；依次配制成4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL和0.25mg/mL的储备液；进行HPLC测定，记录峰面积，以还原型谷胱甘肽浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标进行线性回归，得线性为：y＝12506660x+905874，R²＝0.9997(其中x为还原型GSH浓度，y为相应的峰面积)；结果表明还原型谷胱甘肽质量浓度在0.25-4mg/mL之间呈现良好的线性关系；按信噪比S/N为3计，还原型谷胱甘肽最小检测浓度为6.5μg/mL。

实施例4

还原型谷胱甘肽样品精密度与准确度测定

分别配置高中低三种不同浓度的还原型谷胱甘肽样品，按实施例3“还原型谷胱甘肽标准曲线与回归方程制作”项下操作，日内测定5次，日间测定3天，记录峰面积带入还原型谷胱甘肽标准曲线，计算回收率和日内、日间相对标准差。结果见表1。

表1精密度和准确度测定结果

实施例5

供试品中还原型谷胱甘肽含量检测

取安琪酵母股份有限公司生产的不同批次酵母粉各1g，加入10mL去离子水，80℃下提取15分钟，迅速置于冰水中冷却至室温，4000转下离心10分钟，取上清液，稀释5倍得到供试品溶液，进行还原型谷胱甘肽含量(mg/mL)检测。依据公式，转化成酵母细胞中还原型谷胱甘肽含量(mg/g)。结果见表2。

表2不同批次酵母乳中还原型谷胱甘肽含量测定结果

不同生产批次酵母乳液	第1批次	2	3
				供试品溶液浓度(mg/mL)	1.23	1.03	1.17
还原型GSH含量(mg/g)	61.5	51.5	58.5

Claims (7)

1.一种酵母细胞及酵母抽提物中还原型谷胱甘肽的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)选择对照物质：选择还原型谷胱甘肽作为对照物质，纯度>99.9％；

(2)制备标准品溶液：取还原型谷胱甘肽标准品80mg，加入去离子水溶解，定容至10mL，摇匀，得到还原型谷胱甘肽标准储备液(8mg/mL)；再依次将标准储备液分别配制成4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL和0.25mg/mL的储备液；

(3)制备供试品溶液：取安琪酵母股份有限公司生产的酵母粉1g，加入10mL去离子水，80℃下提取15分钟，迅速置于冰水中冷却至室温，4000rpm/min下离心10分钟，取上清液，得到供试品溶液；

(4)液相色谱测定：分别取还原型谷胱甘肽标准品溶液注入高效液相色谱仪，记录峰面积，以还原型谷胱甘肽浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标进行线性回归分析，制得线性方程，取稀释一定倍数(稀释后还原型GSH浓度介于1.0至3.0mg/mL之间的稀释倍数为最佳稀释倍数)的供试品溶液注入高效液相色谱仪，供试品色谱图中出峰时间及峰形与对照品溶液色谱图中还原型谷胱甘肽的出峰时间及峰形进行比对，判定供试品溶液含有谷胱甘肽物质，将供试品色谱图中还原型谷胱甘肽峰面积数值代入线性方程，即可计算出酵母细胞及酵母抽提物中还原型谷胱甘肽的含量。

2.根据权利要求1所述的酵母细胞及酵母抽提物中还原型谷胱甘肽的检测方法，其特征在于：酵母细胞及酵母抽提物，包括：酵母乳、酵母干粉或酵母粗提物。

3.根据权利要求1所述的酵母细胞及酵母抽提物中还原型谷胱甘肽的检测方法，其特征在于：所用的高效液相色谱仪中色谱柱为：Venusil XBP C18柱(5μm×10×250mm)；流动相为甲醇-水二元流动相，其中水二元流动相包括1L去离子水，2.2g/L庚烷磺酸钠，6.8g/L磷酸二氢钾，pH调节范围为2.0-3.0，甲醇：水二元流动相的混合体积比范围为16：80-8：92，流动相使用前经0.45μm滤膜抽滤并脱气；流速：1mL/min；进样体积：10μm；柱温：25℃；检测波长：203nm。

4.根据权利要求1所述的酵母细胞及酵母抽提物中还原型谷胱甘肽的检测方法，其特征在于：通过步骤(4)中供试品溶液所得色谱图中还原型谷胱甘肽的峰面积，按下述计算公式可得到供试品中还原型谷胱甘肽的含量。

计算公式如下：

$y=\frac{x-905874}{12506660}\×n$

其中x-供试品峰面积，n-供试品稀释倍数，y-供试品中还原型谷胱甘肽的含量，单位为mg/mL。

5.根据权利要求1所述的酵母细胞及酵母抽提物中还原型谷胱甘肽的检测方法，其特征在于：取稀释后还原型GSH浓度介于1.0至3.0mg/mL之间的稀释倍数的供试品溶液注入高效液相色谱仪。

6.根据权利要求2所述的酵母细胞及酵母抽提物中还原型谷胱甘肽的检测方法，其特征在于：所用的甲醇-水二元流动相中，水二元流动相pH调节为2.5。

7.根据权利要求2所述的酵母细胞及酵母抽提物中还原型谷胱甘肽的检测方法，其特征在于：所用的甲醇-水二元流动相中，甲醇：水相的混合体积比范围为16:84。