CN105628631B - 一种氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法，利用发酵后的主产物氢化可的松、副产物表氢化可的松及底物RSA与浓硫酸反应显示不同颜色，根据朗伯比尔定律结合三维数据建模，通过可见光双波长检测，即可间接计算发酵液中氢化可的松的转化率。本发明操作简单快捷，测试时间短、试样用量小，容易实现并行操作，精确性高。重复性误差在10％以内；可检出氢化可的松的转化率在10％‑95％之间，检测方法操作简单快捷，单个样品的测试时间在20min之内，而薄层层析法及高效液相色谱法所需时间较长。

Description

一种氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法
技术领域
本发明属于生物转化制药中药物产量的检验分析领域，涉及一种氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法，适用于药物的生物转化工艺过程研究和检测。
背景技术
氢化可的松是一种肾上腺皮质激素类药物,在临床上应用广泛。同时它还是生产***等其他类高效皮质激素药物的基础原料。
HC的生产是以化合物RS(17-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮)或化合物RSA(17-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯)为底物经过微生物的11β-羟基化反应得到。微生物菌种对HC的转化率和收率影响很大，因此选育高产氢化可的松的优良菌种一直是工业上的研究目标。
工业上选育高产氢化可的松的优良菌种，一般是采用诱变育种方式。诱变育种过程中，经诱变产生高产菌株的频率很低，因此都需要从庞大的菌种库中检出目标菌种。氢化可的松转化率的检测，一般是首先用有机溶剂将摇瓶发酵的发酵液成分萃取出来，再通过薄层层析法，对HC的产量作定性检测。最终通过高效液相色谱法，确定菌种对氢化可的松的转化率。
薄膜层析法和液相色谱法是目前国内绝大多数工厂检测都在使用的方法。薄膜层析法，存在取样量大，萃取剂易挥发，操作繁琐，定量不准确，易受环境干扰等问题；另有液相色谱法测定结果准确，但检验时间过长，程序复杂，仪器价格昂贵，均不适于生产现场快速检验的要求。因此，这些点已远远不能满足现代检测，以及高通量筛选高转化率菌种的要求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种精度和灵敏度都高的氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法。
本发明实现目的的技术方案是：
一种氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法，步骤如下：
⑴利用主产物氢化可的松、副产物表氢化可的松、底物17-羟基孕甾-4-烯-3, 20-二酮-21-醋酸酯遇浓硫酸反应显不同颜色的特性，使用乙酸乙酯将发酵液中成分萃取出来，加入浓硫酸，使其与硫酸发生反应，导致颜色发生相应变化；
⑵先对HC/浓硫酸、EHC/浓硫酸、RSA/浓硫酸进行全波长扫描，得到HC/ 浓硫酸、RSA/浓硫酸的最大吸收峰值分别为474nm、535nm；
⑶根据朗伯比尔定律结合三维数据建模二阶校正得出氢化可的松转化率的计算公式；
⑷通过测定发酵液中的成分与浓硫酸反应在可见光双波长下的OD值，即可计算出待测发酵液中氢化可的松的转化率。
而且，具体步骤如下：
⑴待测菌种发酵产生的发酵液降至3.8以下后，调节pH为6.5,投入0.25％的RSA，继续培养至72h；
⑵将步骤⑴得到的发酵液中加入等量的乙酸乙酯，充分萃取后取6μL上层有机相置于96孔石英酶标板中；
⑶待步骤⑵中96孔石英酶标板中的乙酸乙酯挥发后，加入200μL浓硫酸，反应15min后使用酶标仪检测其在474nm处和535nm处的OD值；
⑷将氢化可的松、表氢化可的松、RSA、RS的标准品加无水乙醇溶解后，分别配置成浓度为0.5mg/mL的贮备液；
⑸将步骤⑷得到的HC、RSA、EHC，按照HC不同转化率，保持总质量为0.025mg，添加不同体积配比的RSA、HC、EHC标准品溶液于96孔石英酶标板中，待无水乙醇挥发后，加入200μL的浓硫酸，反应15min，分别在474nm、535nm波长处测定吸光度；
⑹将步骤⑸测得不同HC转化率对应474nm和535nm处的OD值整理，根据 (A474nm-A535nm)/A474nm计算出当X＝0.6时的数值K0；再通过singmapolt软件拟合成三维立体平面图，并由此得出转化率X与A474nm、A535nm之间的函数关系；
⑺将步骤⑸中待测试样在474nm、535nm处的OD值代入公式K＝(A474nm-A535nm) /A474nm，根据计算出的K值，将转化率在0-0.6之间的与0.6-1之间的分开，再步骤⑹得到的转化率X与A474nm、A535nm之间的函数关系，即可计算出待测发酵液中 HC的转化率，进而快速检测出发酵液中HC的含量。
而且，所述的步骤⑴中投料RSA要用80％的工业酒精助溶。
而且，所述的步骤⑵中发酵液和等量的乙酸乙酯浓硫酸要充分萃取，再室温下静置一段时间。
而且，所述的步骤⑶中标品与浓硫酸反应的时间准确控制在15min。
本发明的优点和积极效果是：
1、本发明操作简单快捷，测试时间短、试样用量小，容易实现并行操作，精确性高。重复性误差在10％以内；可检出氢化可的松的转化率在10％-95％之间，检测方法操作简单快捷，单个样品的测试时间在20min之内，而薄层层析法及高效液相色谱法所需时间较长。
2、本发明提出的方法能快速检测发酵液中HC的转化率，极大的提高菌种筛选效率，为高通量筛选高效菌株，提高甾体药物氢化可的松的转化效率提供了可靠的保证。
3、本发明提供的检测方法检测试样用量小，容易实现并行操作；检测方法的精确性高，几乎不受环境条件影响，重复性误差在5％以内。精度和灵敏度均高于薄层层析法。
4、本发明提供的检测方法适用于高产氢化可的松的菌株的高通量筛选，克服了传统筛选优良菌种方法中操作困难、筛选工作量大且效率低下的缺点，大大缩短了筛选周期，提高了工作效率。
附图说明
图1是氢化可的松转化率小于60％的三维双波长吸光度数据图；
图2是氢化可的松转化率大于60％的三维双波长吸光度数据图；
图3是1号菌株发酵液成分的HPLC检测结果；
图4是2号菌株发酵液成分的HPLC检测结果；
图5是3号菌株发酵液成分的HPLC检测结果。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明公开了一种氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法，利用主产物氢化可的松(HC)、副产物表氢化可的松(EHC)、底物17-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(RSA)遇浓硫酸反应显不同颜色的特性，使用乙酸乙酯将发酵液中成分萃取出来，以适当的比例加入浓硫酸，使其与硫酸发生反应，导致颜色发生相应变化。先对HC/浓硫酸、EHC/浓硫酸、RSA/浓硫酸进行全波长扫描，得到HC/浓硫酸、RSA/浓硫酸的最大吸收峰值分别为474nm、535nm；再根据朗伯比尔定律结合三维数据建模二阶校正得出HC转化率的计算公式。
实验结果表明：采用可见光双波长检测法，根据朗伯比尔定律结合三维数据建模，通过测定发酵液中的成分与浓硫酸反应在可见光双波长下的OD值，即可计算粗略出待测发酵液中HC的转化率。
具体的氢化可的松的转化率的快速检测方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
⑴菌株斜面用无菌水制成孢子悬液，取1mL接种于盛有30mL种子培养基的250mL三角瓶中，28℃、180r/min摇床振荡培养20h。
⑵将步骤⑴中得到的种子培养液，接种于盛有50mL发酵培养基的500mL 三角瓶中,摇床振荡培养。
⑶检测步骤⑵中的发酵液降至3.8以下后，调节pH为6.5,投入0.25％的 RSA，继续培养至72h。
⑷将步骤⑶得到的发酵液中加入等量的乙酸乙酯。充分萃取后取6μL上层有机相置于96孔石英酶标板中。
⑸待步骤⑷中96孔石英酶标板中的乙酸乙酯挥发后，加入200μL浓硫酸，反应15min后使用酶标仪检测其在474nm处和535nm处的OD值。
⑹将氢化可的松、表氢化可的松、RSA、RS的标准品加无水乙醇溶解后，分别配置成浓度为0.5mg/mL的贮备液。
⑺将步骤⑹得到的HC、RSA、EHC，按照HC不同转化率，保持总质量为0.025mg，添加不同体积配比的RSA、HC、EHC标准品溶液于96孔石英酶标板中，待无水乙醇挥发后，加入200μL的浓硫酸，反应15min，分别在474nm、535nm波长处测定吸光度。
⑻将步骤⑺测得不同HC转化率对应474nm和535nm处的OD值整理，根据 (A474nm-A535nm)/A474nm计算出当X＝0.6时的数值K0；再通过singmapolt软件拟合成三维立体平面图，并由此得出转化率X与A474nm、A535nm之间的函数关系。
⑼将步骤⑸中待测试样在474nm、535nm处的OD值代入公式K＝(A474nm-A535nm) /A474nm，根据计算出的K值，将转化率在0-0.6之间的与0.6-1之间的分开，再步骤⑻得到的转化率X与A474nm、A535nm之间的函数关系，即可计算出待测发酵液中 HC的转化率，进而快速检测出发酵液中HC的含量。
所述的步骤⑴中孢子悬液的浓度控制在n/mL-1＝3×106到3×107之间。
所述的步骤⑵中接种量在5％-10％之间，摇床培养条件为28℃、180r/min；培养时间约为72h。
所述的步骤⑶中投料RSA要用80％的工业酒精助溶。
所述的步骤⑷中发酵液和等量的乙酸乙酯浓硫酸要充分萃取，再室温下静置一段时间。
所述的步骤⑸中标品与浓硫酸反应的时间准确控制在15min。
所述的步骤⑹中贮备液的配置按以下步骤操作：
精确称取氢化可的松标准品5mg，加无水乙醇溶解后定容于10mL容量瓶中，配置成浓度为0.5mg/mL的贮备液，在4℃下冷藏保存。RSA、RS、表氢化可的松标准品溶液的配置同上。
所述的步骤⑺中不同体积配比的RSA、HC、EHC标准品溶液，可按照以下配比进行(其中HC的含量百分比即为HC的转化率)：
所述的步骤⑻中根据K＝(A474nm-A535nm)/A474nm,计算出当X＝0.6时的数值K0，并分别对转化率在0-60％之间，及转化率在60％-95％之间的数据进行拟合，得出两个转化率X与A474nm、A535nm之间的函数关系公式。
所述的步骤⑼中将待测试样在474nm、535nm处的OD值代入公式：K＝ (A474nm-A535nm)/A474nm；当K<K0，转化率在0-0.6之间，选择转化率在0-60％之间的公式一，计算出HC的转化率；当K>或＝K0，转化率在0.6-1之间，选择转化率在 60％-95％之间的公式二，计算出HC的转化率；进而快速测定发酵液中HC的转化率。
实施例1
⑴取具有不同HC转化率的1号、2号、3号菌株的新鲜斜面用无菌水制成孢子悬液，,取1mL接种于盛有30mL种子培养基的250mL三角瓶中，28℃、180 r/min摇床振荡培养20h。
⑵将得到的种子培养液，接种于盛有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中, 摇床振荡培养。
⑶当发酵液的pH降至3.8以下后，调节pH为6.5,投入0.25％的RSA，继续培养至72h。
⑷将步骤⑶得到的发酵液中加入等量的乙酸乙酯。充分萃取后取6μL上层有机相置于96孔石英酶标板中。每一份待测试样对应三个平行样。
(5)精确称取氢化可的松标准品5mg，加无水乙醇溶解后定容于10mL容量瓶中，配置成浓度为0.5mg/mL的贮备液，在4℃下冷藏保存。RSA、RS、表氢化可的松标准品溶液的配置同上。
⑹按照HC不同转化率，保持总质量为0.025mg，添加不同体积配比的RSA、 HC、EHC标准品溶液于96孔石英酶标板中。RSA、HC、EHC标准品溶液的体积配比见表1。对于同一HC转化率的样品平行三份。
表1 RSA、HC、EHC标准品的含量百分比
⑺待步骤⑷中的乙酸乙酯、步骤⑹中的无水乙醇完全挥发后，同时加入200 μL的浓硫酸，反应15min，分别在474nm、535nm波长处测定吸光度，结果如表2。
表2不同含量百分比的混合标品吸光度测定数据
⑻将表2中不同HC转化率对应474nm和535nm处的OD值整理，通过 singmapolt软件拟合成三维立体平面图，并由此得出转化率X与A474nm、A535nm之间的函数关系。HC转化率在0-0.6之间的拟合模型见图1,得到的公式一为： X＝4.4686+0.9341*A474nm-19.1657*A535nm-0.1161*(A474nm)2+19.5822*(A535nm)2。HC转化率在0.6-1之间的拟合模型见图2,得到的公式二为：X＝0.2275+8.5673*A474nm -16.6402*A535nm+3.8789*(A474nm)2+15.831*(A535nm)2。
⑼根据(A474nm-A535nm)/A474nm计算出当X＝0.6时的数值K0＝0.53126。将表2 中待测试样在474nm、535nm处的OD值代入公式K＝(A474nm-A535nm)/A474nm，根据计算出的K值与K0比较，将转化率在0-0.6之间的与0.6-1之间的分开,通过公式一、公式二即可计算出待测发酵液中HC的转化率，结果如表3。进而快速检测出发酵液中HC的转化率。
表3可见光双波长检测法发酵液中氢化可的松转化率的测定结果
⑽将步骤⑷中得到的发酵液进行高效液相色谱检测HC的转化率，色谱条件：采用C18柱(4.6×250mm,5μm)，流动相为V(甲醇):V(水)＝70:30，流量0.5 mL/min，进样量20μL，柱温25℃；UV 242nm检测。检测结果如图3、图4、表4。
表4高效液相色谱法与可见光双波长检测氢化可的松的转化率测定结果
菌株 可见光双波长检测HC的转化率 HPLC检测HC转化率 误差％
1号 69.80％ 71.90％ 2.9％
2号 54.40％ 52.81％ 2.9％
3号 32.70％ 30.94％ 5.7％
结果显示，所建立的方法—可见光双波长检测法可以粗略测定发酵液中HC 的转化率。与药典方法高效液相色谱法相比，测定结果基本一致，。该法操作简便，节约时间，效率高，适用于发酵液中氢化可的松转化率的快速检验，为高通量筛选高产氢化可的松的菌株提供了是一种快速、有效的检测方法。

Claims (4)

1.一种氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法，其特征在于：步骤如下：
⑴利用主产物氢化可的松、副产物表氢化可的松、底物17-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯遇浓硫酸反应显不同颜色的特性，使用乙酸乙酯将发酵液中成分萃取出来，加入浓硫酸，使其与硫酸发生反应，导致颜色发生相应变化；
⑵先对HC/浓硫酸、EHC/浓硫酸、RSA/浓硫酸进行全波长扫描，得到HC/浓硫酸、RSA/浓硫酸的最大吸收峰值分别为474nm、535nm；
⑶根据朗伯比尔定律结合三维数据建模二阶校正得出氢化可的松转化率的计算公式；通过singmapolt软件拟合成三维立体平面图；
⑷通过测定发酵液中的成分与浓硫酸反应在可见光双波长下的OD值，即可计算出待测发酵液中氢化可的松的转化率。
2.根据权利要求1所述的氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法，其特征在于：具体步骤如下：
⑴待测菌种发酵产生的发酵液pH降至3.8以下后，调节pH为6.5,投入0.25％的RSA，继续培养至72h；
⑵将步骤⑴得到的发酵液中加入等量的乙酸乙酯，充分萃取后取6μL上层有机相置于96孔石英酶标板中；
⑶待步骤⑵中96孔石英酶标板中的乙酸乙酯挥发后，加入200μL浓硫酸，反应15min后使用酶标仪检测其在474nm处和535nm处的OD值；
⑷将氢化可的松、表氢化可的松、RSA、RS的标准品加无水乙醇溶解后，分别配置成浓度为0.5mg/mL的贮备液；
⑸将步骤⑷得到的HC、RSA、EHC，按照HC不同转化率，保持总质量为0.025mg，添加不同体积配比的RSA、HC、EHC标准品溶液于96孔石英酶标板中，待无水乙醇挥发后，加入200μL的浓硫酸，反应15min，分别在474nm、535nm波长处测定吸光度；
⑹将步骤⑸测得不同HC转化率对应474nm和535nm处的OD值整理，根据(A474nm-A535nm)/A474nm计算出当X＝0.6时的数值K0；再通过singmapolt软件拟合成三维立体平面图，并由此得出转化率X与A474nm、A535nm之间的函数关系；
⑺将步骤⑸中待测试样在474nm、535nm处的OD值代入公式K＝(A474nm-A535nm)/A474nm，根据计算出的K值，将转化率在0-0.6之间的与0.6-1之间的分开，再步骤⑹得到的转化率X与A474nm、A535nm之间的函数关系，即可计算出待测发酵液中HC的转化率，进而快速检测出发酵液中HC的含量。
3.根据权利要求2所述的氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法，其特征在于：所述的步骤⑴中投料RSA要用80％的工业酒精助溶。
4.根据权利要求2所述的氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法，其特征在于：所述的步骤⑵中发酵液和等量的乙酸乙酯要充分萃取，再室温下静置一段时间。
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