CN106507678A - 用于丙酮酸盐衍生产物的生产和控制的发酵方法 - Google Patents
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Abstract
已开发用于通过产乙酸一氧化碳营养型微生物在含有CO的底物发酵期间生产和控制丙酮酸盐衍生产物的方法。所述方法涉及使选自由维生素B1、维生素B5、维生素B7和其混合物组成的群组的至少一种营养物的浓度提高超过微生物的细胞需要。当提高浓度时,2,3‑丁二醇(2,3‑BDO)的产量增加,而其它代谢物的产量几乎不变。所述作用是可逆的,使得当浓度降低时,2,3‑BDO的产量也降低。这允许人们将乙醇:2,3‑BDO的比率控制在希望的值,所述希望的值可从4:1到1:2变化。
Description
相关申请的交叉引用
本申请案要求于2015年5月21日提交的美国申请第14/283,287号的权益,所述申请案的内容以引用方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及用于通过调节在液体营养物培养基中关键营养物的浓度改变发酵***的代谢谱的方法。具体来说,本发明涉及用于提高在发酵方法中的2,3-丁二醇的生产的方法。
背景技术
用于运输的生物燃料是汽油的有吸引力的替代品并且以低浓度共混物形式快速渗透燃料市场。生物燃料(衍生自天然植物来源)比衍生自化石来源的那些(如汽油)更环境可持续,其使用允许降低由于燃料燃烧而释放到大气中的所谓的化石二氧化碳(CO2)气体的含量。此外,生物燃料可在许多地区中本地生产,并且可用以降低对引进的化石能量来源的依赖性。适用作生物燃料的醇包括乙醇、丁醇和2,3-丁二醇。
在全世界,乙醇快速变成主要富氢液体运输燃料。在2002年全世界乙醇的消耗估计为108亿加仑。由于在欧洲、日本、美国和若干发展中国家中对乙醇的兴趣的增加,还预测燃料乙醇工业的全球市场未来会急剧增长。
包括1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇和2,3-丁二醇的丁二醇可被认为具有优于乙醇的多种优点。与乙醇类似,丁二醇可直接用作汽车燃料添加剂。它们还可相对容易地被转化为多种其它潜在较高值和/或较高能量产物。举例来说,2,3-丁二醇可在两步法中容易地转化成可用作航空燃料的八碳二聚体。
2,3-丁二醇由其二官能主链衍生其通用性,即,2个羟基位于邻位C原子处,从而允许分子非常容易地转化成如丁二烯、丁二酮、乙偶姻、甲基乙基酮等物质。这些化合物用作基础分子以制造多种工业生产的化学品。
此外,2,3-丁二醇可用作在内燃发动机中的燃料。在若干方面,相比于它与乙醇,它与汽油更类似。因为对环境可持续的燃料的生产和应用的兴趣已加强,所以对生产2,3-丁二醇(常常被称作生物丁醇)的生物方法的兴趣已提高。
一氧化碳(CO)是如煤或石油和石油衍生的产物的有机材料不完全燃烧的主要副产物。尽管含碳前体的完全燃烧产生CO2和水作为唯一终端产物,但是一些工业方法需要有利于超过CO2的一氧化碳的积聚的高温。一个实例为钢工业,其中需要高温以产生希望的钢质量。举例来说,澳大利亚的钢铁工业据报告每年产生并且向大气中释放超过500,000吨CO。
此外,CO还为合成气的主要成分,其中改变量的CO和H2通过含碳燃料的气化来生成。举例来说,合成气可通过裂解废木材和木料的有机生物质生产以产生用于生产燃料和更复杂化学品的前体。
CO释放到大气中可具有显著的环境影响。此外,可需要付排放税,增加了工业工厂的成本。因为CO为反应性富能分子,它可用作用于生产多种化学品的前体化合物。然而,此有价值的原料尚未用以产生2,3-丁二醇。
已证明,2,3-丁二醇可通过含有碳水化合物的原料的微生物发酵生产(Syu MJ,应用微生物学和生物技术学(Appl Microbiol Biotechnol)55:10-18(2001)、Qin等人,中国化学工程学报(Chinese J Chem Eng)14(1):132-136(2006))。2,3-丁二醇还可通过来自农作物(如甜菜、玉米、小麦和甘蔗)的生物质的微生物发酵生产。然而,这些碳水化合物原料的成本受其价值影响,因为用于2,3-丁二醇生产的人的食品或动物饲料和生产淀粉或蔗糖的农作物的培育不是在所有地区中经济可持续的。因此,关注开发将较低成本和/或更充足的碳来源转化成2,3-丁二醇的技术。
已证明通过包含CO的气态底物的微生物发酵生产2,3-丁二醇。然而,通过这些方法生产2,3-丁二醇已为副产物。生产包括乙醇的其它产物在发酵中受到偏爱。丁二醇具有比在此类发酵中生产的其它产物更高的价值。期望能够以增加生产2,3-丁二醇的方式影响发酵。此前已示出提高的2,3-丁二醇生产率受由微生物培养物的氢消耗速率影响(WO2012131627)。
在本领域仍存在对于提高以经济有益的方式由工业气态底物产生有价值的产物的能力的需要。需要相对于其它产物的生产增强2,3-丁二醇的生产,该产物在通过一氧化碳营养型细菌气态底物的发酵中常规生产。
发明内容
本发明提供对在本领域中的需要的响应。本发明提供用于通过气态底物的微生物发酵控制丙酮酸盐衍生产物的生产的方法。本发明进一步提供用于提高丙酮酸盐衍生产物相对于乙酰基-CoA衍生产物的生产的方法。在具体实施例中,提供用于提高2,3-丁二醇相对于其它发酵产物(如乙醇和乙酸)的生产的方法。
在本发明的第一方面中,提供在微生物发酵期间提高丙酮酸盐的碳通量的方法,所述方法包含:
a)将包含CO的气态底物提供到在液体营养物培养基中包含至少一种产乙酸一氧化碳营养型微生物的培养物的生物反应器以生产至少一种丙酮酸盐衍生产物和至少乙酰基-CoA衍生产物;以及
b)将在液体营养物培养基中的至少一种营养物的浓度提高到高于至少一种产乙酸微生物的细胞需要的浓度,使得丙酮酸盐的碳通量增加,所述营养物选自由以下各者组成的群组:
1)维生素B1;
2)维生素B5;以及
3)维生素B7。
在具体实施例中,在液体营养物培养基中的至少一种营养物的浓度增加以便提高至少一种丙酮酸盐衍生产物的生产。在具体实施例中,提高在液体营养物培养基中的至少一种营养物的浓度进一步增加在生物反应器中的生物质密度。
在具体实施例中,在液体营养物培养基中提高维生素B1、维生素B5或维生素B7或其混合物的浓度。在具体实施例中,在液体营养物培养基中提高维生素B1、维生素B5或维生素B7或其混合物的浓度超过至少一种微生物的细胞需要。在具体实施例中,在液体营养物培养基中提高维生素B1、维生素B5或维生素B7或其混合物的浓度至少两倍高于至少一种微生物的细胞需要。在具体实施例中,在液体营养物培养基中提高维生素B1、维生素B5或维生素B7或其混合物的浓度至少十倍高于至少一种微生物的细胞需要。在具体实施例中,在液体营养物培养基中提高维生素B1、维生素B5或维生素B7或其混合物的浓度不提高在生物反应器中的生物质密度。
在一个实施例中,至少一种丙酮酸盐衍生产物为2,3-丁二醇(2,3-BDO)。另选地,至少一种丙酮酸盐衍生产物选自由以下各者组成的群组:乳酸酯、丁二酸酯、甲基乙基酮(MEK)、2-丁醇、丙二醇、2-丙醇、异丙醇、乙偶姻、异丁醇、柠苹酸、丁二烯和聚乳酸(PLA)。在一个实施例中,至少一种乙酰基-CoA衍生产物选自由以下各者组成的群组:乙醇、乙酸、丙酮、丁醇、异丁烯、3-羟基丙酸酯(3HP)和脂肪酸。在另外的实施例中,至少一种乙酰基-CoA衍生产物为乙醇。
在第二方面中,本发明提供提高通过微生物发酵生产的2,3-丁二醇与乙醇的比率的方法,所述方法包含:
a)将包含CO的气态底物提供到在液体营养物培养基中包含至少一种产乙酸一氧化碳营养型微生物的培养物的生物反应器以至少生产2,3-丁二醇和乙醇;以及
b)将在液体营养物培养基中至少一种营养物的浓度提高到高于至少一种产乙酸一氧化碳营养型微生物的细胞需要的浓度,使得2,3-丁二醇与乙醇的比率提高,所述营养物选自由以下各者组成的群组:
1)维生素B1;
2)维生素B5;
3)维生素B7及其混合物。
在具体实施例中,通过提高2,3-BDO的生产提高在液体营养物培养基中至少一种营养物降低乙醇:2,3-丁二醇的比率。在具体实施例中,乙醇与2,3-BDO的比率从4:1到1:2变化。
在具体实施例中,提高在液体营养物培养基中的至少一种营养物的浓度,使得微生物以至少5g/L/天或至少10g/L/天或至少20g/L/天或至少30g/L/天的生产速率生产2,3-丁二醇。
在具体实施例中,产乙酸一氧化碳营养型微生物选自由以下各者组成的群组:梭菌属、穆尔氏菌属、产醋杆菌属、消化链球菌属、醋酸杆菌属、真杆菌属或丁酸杆菌属。在各种实施例中,微生物选自包含以下各项的群组:自产醇梭菌、扬氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德氏梭菌、粪味梭菌、醋酸梭菌、甲酸乙酸梭菌、大梭菌、食甲基丁酸杆菌、伍氏醋酸杆菌、巴奇产碱菌、长生布劳特菌、淤泥真杆菌、热醋酸穆尔氏菌、卵形鼠孢菌、森林产乙酸鼠孢菌、类球鼠孢菌、普氏产醋杆菌和凯伍热厌氧菌。
在具体实施例中,产乙酸一氧化碳营养型微生物为自产醇梭菌或扬氏梭菌。在一个具体实施例中,微生物为自产醇梭菌。在一个具体实施例中,细菌具有寄存编号DSM10061、DSM19630或DSM23693的识别特征。这些细菌已经保藏在德国生物材料资源中心(DSMZ),其地址为德国布伦瑞克7B,D-38124,DSMZ公司(DSMZ GmbH Inhoffenstraβe,7B,D-38124Braunschweig,Germany)。
本发明还包括单独地或共同地以两个或更多个所述部分、要素或特征中的任何或所有组合形式在本申请的说明书中提及或指示的部分、要素和特征,并且当具有本发明所涉及的领域中的已知等效物的特定整体在本文中被提到时,此类已知等效物被认为如单独地进行阐述一般并入本文中。
附图说明
本发明的这些和其它方面(应被视为在所有其新颖方面中)将从以下仅借助于实例的方式给出的描述参考附图而变得显而易见,在所述附图中:
图1提供在自产醇梭菌中的乙醇和2,3-丁二醇生产路径的示意性表示,并且示出其中维生素B1、维生素B5和维生素B7被用作辅因子。
图2呈现来自实例3的代谢物和生物质浓度的曲线
图3呈现示出对于实验3的气体吸收谱的曲线。
图4呈现对于实例5的代谢物和生物质浓度对时间的曲线。
图5呈现示出对于实例5的气体吸收曲线。
具体实施方式
本发明人已设计用于控制由至少一种产乙酸一氧化碳营养型微生物的培养物生产的代谢产物的方法。具体来说,本发明提供用于提高由通过至少一种一氧化碳营养型产乙酸微生物的气态CO底物的微生物发酵的至少一种丙酮酸盐衍生产物的生产的方法。
定义
术语“2,3-丁二醇”或2,3-BDO应解释成包括化合物的所有对映异构和非对映异构形式,包括(R,R)、(S,S)和内消旋形式,以外消旋部分立体异构纯和/或基本上立体异构纯形式。
术语“生物反应器”包括由一个或多个容器和/或塔或管道布置构成的发酵装置,其包括连续搅拌槽反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、鼓泡塔、气升式发酵罐、静态混合器、循环环流反应器、膜反应器如中空纤维膜生物反应器(HFM BR)或适合于气体-液体接触的其它容器或其它装置。如本文之后所述,在一些实施例中,生物反应器可以包含第一生长反应器和第二发酵反应器。如此,当涉及将底物(例如包含一氧化碳的底物)添加到生物反应器或发酵反应时,应理解包括适当时添加到这些反应器中的任一者或两者。
术语“营养物”包括可在微生物的代谢路径中利用的任何物质。示例性的营养物包括钾、B族维生素、痕量金属和氨基酸。
术语“气态底物”和/或“底物”包括含有由在发酵中作为碳源和任选地能源由微生物所使用的化合物或元素的任何气体。气态底物将通常含有显著比例的CO、CO2、H2或其混合物中的任一种。
术语“包含一氧化碳的底物”和类似术语应理解为包括其中一氧化碳可例如用于一或多种细菌菌株生长和/或发酵的任何底物。
“包含一氧化碳的气态底物”包括含有一定水平的一氧化碳的任何气体。气态底物将通常含有大比例的CO,优选地至少15体积%到95体积%CO。
“包含CO2的底物”包括含有一定水平的二氧化碳的任何底物流。然而,应了解气态底物可以替代形式提供。举例来说,含有CO2的气态底物可溶解于液体中而被提供。基本上,液体被含有二氧化碳的气体饱和,并且然后将该液体添加到生物反应器中。这可以使用标准方法实现。借助于实例,可以使用微泡分布发生器(Hensirisak等人,用于好氧发酵的微泡分布发生器的按比例放大(Scale-up of microbubble dispersion generator foraerobic fermentation);应用生物化学和生物技术(Applied Biochemistry andBiotechnology)第101卷,第3册/2002年10月)。借助于另外的实例,含有CO2和H2的气态底物可吸附到固体载体上。
如本文所使用,术语“产物”旨在涵盖通过微生物发酵生产的物质。产物可包括醇、酸或其它化学品。产物还可包括通过微生物发酵方法生产的气体。
术语“提高效率”、“提高的效率”等在相对于发酵工艺使用时包括(但不限于)提高以下各项中的一个或多个:催化发酵的微生物的生长速率、在较高丁二醇浓度下的生长和/或产物生产速率、每消耗的底物体积所产生的所期望产物的体积、所期望产物的生产速率或生产水平,以及与发酵的其它副产物相比产生的期望产物的相对比例。
术语“生产率”或“生产速率”为产物的体积生产率。在连续***中,体积生产率计算为产物的稳态浓度与液体滞留时间的比率。在分批***中,体积生产率计算为在分批***中的浓度与生产所述浓度需要的时间。体积生产率报告为g/L/天。
除非上下文另有要求,否则如本文中所用的短语“发酵”、“发酵方法”或“发酵反应”等旨在涵盖所述方法的生长期和产物生物合成期两者。
如本文所使用,术语“丙酮酸盐衍生产物”或“衍生自丙酮酸盐的产物”或类似术语旨在涵盖具有丙酮酸盐前体的发酵产物。这些产物包括(但不限于)2,3-丁二醇、乳酸酯、丁二酸酯、甲基乙基酮(MEK)、2-丁醇、丙二醇、2-丙醇、异丙醇、乙偶姻、异丁醇、柠苹酸、丁二烯和聚乳酸(PLA)。
如本文所使用,术语“乙酰基coA衍生产物”或“衍生自乙酰基coA的产物”或类似术语旨在涵盖具有乙酰基coA前体的发酵产物。这些产物包括但不限于乙醇、乙酸、丙酮、丁醇、异丁烯、3-羟基丙酸酯(3HP)和脂肪酸。
在其后的描述中,2,3-BDO用作丙酮酸盐衍生产物的实例,而乙醇用作乙酰基coA衍生产物的实例。应理解本发明不限于这两种特定产物而是涵盖以上列举的所有丙酮酸盐和乙酰基coA衍生产物。
用于包含一氧化碳的气态底物的微生物发酵以生产如乙醇和乙酸酯的产物的方法是本领域中众所周知的。此类方法提供由包含CO的工业废气生产商业上有用燃料的方式。这些方法大体上包括将包含CO的气态底物进料到在液体营养物培养基中包含至少一种产乙酸一氧化碳营养型微生物的培养物的生物反应器。气态底物厌氧发酵以生产醇、酸及其混合物。在生物反应器中使用的液体营养物培养基通常含有各种营养物,其支持至少一种产乙酸一氧化碳营养型微生物的生长,并且在一种或多种微生物的代谢路径中被利用以便生产醇。此类营养物的实例包括MgCl、CaCl、KCl、H3PO4、Fe、Ni、Zn、Mn、B、W、Se等。
还已知2,3-BDO可在各种浓度下(通常在比乙醇低的多的浓度下)连同乙醇一起被生产。在某些情况下,可能需要生产尽可能多的2,3-BDO,而在其它情况下,可需要生产尽可能多的乙醇。出人意料地,本发明人已发现在启动发酵或在发酵期间的稍后点的任一者处提高在液体营养物培养基中的特定营养物的浓度改变发酵的代谢谱,使得丙酮酸盐衍生产物(例如2,3-BDO)的生产提高同时几乎不影响乙酰基coA衍生产物(例如,乙醇)的生产。尽管已主要以2,3-BDO和乙醇观察影响,但没有理由怀疑其它丙酮酸盐衍生产物和乙酰基coA衍生产物将不类似地受影响。发现当供应超过生长必需的细胞需要时提高丙酮酸盐衍生产物和产物生产的特定营养物选自由以下各者组成的群组:
1)维生素B1;
2)维生素B5;
3)维生素B7及其混合物。
本发明的一个实施例涉及调节(例如,提高)在液体营养物培养基中的B族维生素浓度高于一氧化碳营养型产乙酸微生物的细胞需要。提高维生素B1和维生素B5的水平,用于自产醇梭菌的代谢的两种基本B族维生素具有提高2,3-BDO的生产的影响。这些维生素已经被标识为用于参与在2,3-BDO生产中的中间产物的生物合成的酶的关键辅因子,包括乙酰基CoA、丙酮酸盐和乙酰乳酸盐。作为辅因子的B族维生素的作用在图1中示出。
在本领域中教导一氧化碳营养型微生物(如扬氏梭菌)需要用于维生素B5的生长的50μg/g生产的生物质(例如,WO 2002/08438)。已证明,通过将在液体营养培养基中的维生素B5或维生素B1任一者的浓度从高于细胞需要的2倍提高到80倍(或更多),丙酮酸盐衍生产物的生产提高。在具体实施例中,在液体营养物培养基中的维生素B5的浓度可从2倍提高到80倍或从2倍到60倍或从2倍到40倍或从2倍到30倍或从2倍到20倍或从2倍到10倍或从4倍到80倍或从4倍到60倍或从4倍到40倍或从4倍到30或倍从4倍到20倍或从4倍到15倍或从4倍到10倍或从8倍到80倍或从8倍到60倍或从8倍到40倍或从8倍到30倍或从8倍到20倍或从15倍到80倍或从15倍到60倍或从15倍到40倍或从15倍到30倍或从25倍到80倍或从25倍到60倍或从25倍到40倍或从80倍或从40倍到60倍的细胞需要。根据实际浓度,本发明的广义实施例为其中在液体营养物培养基中的维生素B5浓度为从100μg/g生产的生物质到4000μg/g生产的生物质的实施例。在具体实施例中,在液体营养物培养基中的维生素B5的浓度为从100μg/g到3000μg/g或从100μg/g到2000μg/g或从100μg/g到1500μg/g或从100μg/g到1000μg/g或从200μg/g到4000μg/g或从200μg/g到3000μg/g或从200μg/g到2000μg/g或从200μg/g到1500μg/g或从200μg/g到1000μg/g或从400μg/g到4000μg/g或从400μg/g到3000μg/g或从400μg/g到2000μg/g或从400μg/g到1500μg/g或从600μg/g到4000μg/g或从600μg/g到3000μg/g或从600μg/g到2000μg/g生产的生物质。
在维生素B1的情况下,本发明的广义实施例为其中在液体营养物培养基中的维生素B1浓度从2倍提高到30倍或从2倍到20倍或从2倍到10倍或从4倍到30倍或从4倍到20倍或从4倍到15倍或从6倍到30倍或从6倍到20倍或从6倍到15倍或从8倍到30倍或从8倍到20倍或从10倍到30倍或从15倍到30倍或从20倍到30倍的细胞需要的实施例。根据实际浓度,本发明的广义实施例为其中在液体营养物培养基中的维生素B1浓度为从20μg/g生产的生物质到500μg/g生产的生物质的实施例。在具体实施例中,在液体营养物培养基中的维生素B1的浓度可从20μg/g到400μg/g或从20μg/g到300μg/g或从20μg/g到200μg/g或从40μg/g到500μg/g或从40μg/g到300μg/g或从40μg/g到200μg/g或从60μg/g到500μg/g或从60μg/g到400μg/g或从60μg/g到300μg/g或从60μg/g到200μg/g或从100μg/g到500μg/g或从100μg/g到400μg/g或从100μg/g到300μg/g或从100μg/g到200μg/g生产的生物质变化。
本发明人已证明提高在液体营养物培养基中的维生素B7的浓度产生提高的2,3-BDO生产。此提高是由于提高代谢前体的可用性。维生素B7需要乙酰基-CoA羧化酶和丙酮酸盐羧化酶的活性。出人意料地,本发明人已示出通过提高维生素B7的浓度,使得B7以对微生物的细胞需要过量提供,2,3-BDO的量产提高。有趣的是,已证明B7的提高不影响生物质生产或CO吸收。在具体实施例中,在液体营养物培养基中的维生素B7的浓度可从2倍提高到30倍或从2倍到20倍或从2倍到15倍或从2倍到10倍或从4倍到20倍或从4倍到15倍或从4倍到10倍的细胞需要。在具体实施例中,在液体营养物培养基中的维生素B7的浓度可从100μg/g到4000μg/g或100μg/g到3000μg/g或从100μg/g到2000μg/g或从100μg/g到1500μg/g或从100μg/g到1000μg/g或从200μg/g到4000μg/g或从200μg/g到3000μg/g或从200μg/g到2000μg/g或从200μg/g到1500μg/g或从200μg/g到1000μg/g或从400μg/g到4000μg/g或从400μg/g到3000μg/g或从400μg/g到2000μg/g或从400μg/g到1500μg/g或从600μg/g到4000μg/g或从600μg/g到3000μg/g或从600μg/g到2000μg/g生产的生物质变化。在具体实施例中,提高在液体营养物培养基中的维生素B7的浓度提高乙醇:2,3-BDO的比率,有利于2,3-BDO。
当提高B族维生素中的任一个高于细胞需要时(如上文所描述),提高丙酮酸盐衍生产物(例如,2,3-BDO)的生产和浓度,同时几乎不影响乙酰基coA衍生产物(例如,乙醇)的生产或浓度。因此,本发明的另一个方面为可通过调节在上述范围内的B族维生素中的至少一种的浓度将乙醇:2,3-BDO的比率可控制到一定值或范围。因此,乙醇:2,3-BDO比率可从4:1到1:2或从4:1到1:1或从4:1到2:1或从3:1到1:2或从3:1到1:1或从3:1到2:1变化,其中在较高B族维生素浓度下实现较低比率(较高2,3-BDO浓度/生产)。
在具体实施例中,在发酵过程的开始提高在液体营养物培养基中的至少一种营养物浓度高于细胞需要,并且维持在过量浓度下,即在整个过程中高于细胞需要。另选地,使用包含标准浓度的营养物的液体营养物培养基开始发酵过程,并且在发酵过程期间的特定时间点将营养物的浓度提高到高于细胞需要的希望的浓度。还已发现,当至少一种营养物的浓度从高于细胞需要的浓度降低到细胞需要或两者之间的某处浓度时,2,3-BDO的生产降低。在其中将浓度降低到细胞需要浓度的情况下,2,3-BDO生产基本上返回到初始生产。因此,本发明允许人们在整个发酵过程期间或在各时间段期间调整丙酮酸盐衍生产物(例如,2,3-BDO)和乙酰基coA衍生产物(例如,乙醇)的生产。如果发酵的产物(例如,2,3-BDO和乙醇)用于生产其它化学品(如丁二烯或燃料(例如,喷气燃料)),那么这是特别重要的。
通过产乙酸一氧化碳营养型微生物包含CO的气态底物的发酵导致在相对高浓度下的作为主发酵产物的乙醇的生产和相对低浓度的2,3-BDO的生产。因此,提供用于通过提高维生素B1、维生素B5或维生素B7中的至少一种的浓度高于其细胞需要,降低通过气态CO底物的微生物发酵生产的乙醇:2,3-丁二醇的比率(即,提高2,3-BDO浓度)的方法。维生素B1、维生素B5和维生素B7的浓度可单独地或以任何组合变化。即,维生素B5可单独提高,维生素B1可单独提高等。另选地,可提高维生素B5和维生素B1同时保持维生素B7恒定;可提高维生素B7和维生素B5同时保持维生素B1恒定或可提高维生素B1和维生素B7同时保持维生素B5恒定。在又一实施例中,提高所有三种B族维生素高于其细胞需要。
在具体实施例中,提高在液体营养物培养基中的以上营养物中的至少一种的浓度高于细胞需要,使得微生物以大于5g/L/天或大于10g/L/天或大于20g/L/天的生产速率生产2,3-丁二醇。
在具体实施例中,微生物能够利用CO以大于10g/L/天或大于15g/L/天或大于20g/L/天或大于30g/L/天或大于40g/L/天的生产速率生产乙醇。
在该方法的具体实施例中,发酵方法为连续方法。在该方法一个实施例中,两种生物反应器***用于2,3-丁二醇和乙醇的生产。在一个实施例中,使用多反应器***。
发酵可在任何合适的生物反应器(如固定化细胞反应器、气升升式反应器、鼓泡塔反应器(BCR)、膜反应器(如中空纤维膜生物反应器(HFMBR))或滴流床反应器(TBR))中进行。另外,在本发明的一些实施例中,生物反应器可包含其中培养微生物的第一生长反应器,和发酵液可从生长反应器进料到其并且其中可生产大多数的发酵产物(例如,乙醇和乙酸酯)的第二发酵反应器。调适本发明的生物反应器以接收选自由CO、CO2、H2及其混合物组成的群组的气态底物。
产乙酸一氧化碳营养型细菌选自梭菌属、穆尔氏菌属、产醋杆菌属、消化链球菌属、醋酸杆菌属、真杆菌属或丁酸杆菌属。在各种实施例中,微生物选自由以下各者组成的群组:自产醇梭菌、扬氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德氏梭菌、粪味梭菌、醋酸梭菌、甲酰乙酸梭菌、大梭菌、食甲基丁酸杆菌、伍氏醋酸杆菌、巴奇产碱菌、长生布劳特菌、淤泥真杆菌、热醋酸穆尔氏菌、卵形鼠孢菌、森林产乙酸鼠孢菌、类球鼠孢菌、普氏产醋杆菌和凯伍热厌氧菌。
在具体实施例中,微生物为自产醇梭菌或扬氏梭菌。在一个具体实施例中,微生物为自产醇梭菌。在一个具体实施例中,自产醇梭菌为具有在德国生物材料资源中心(DSMZ)保藏的菌株的识别特征并且具有寄存编号DSM10061或DSM19630或DSM23693的自产醇梭菌。
应注意,对本文所述的本发明优选实施例的各种改变和修改对本领域的技术人员将是显而易见的。此类改变和修改可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下并且在不减小其伴随优势的情况下作出。因此预期此类改变和修改包括在本发明的范围内。
发酵
如上所述适合在本发明中使用的细菌的实例包括梭菌属的那些,如扬氏梭菌(包括在WO 00/68407、EP 117309、美国专利第5,173,429号、第5,593,886号和第6,368,819号、WO 98/00558和WO 02/08438中所述的那些),食一氧化碳梭菌(Liou等人,国际***和进化微生物学杂志(International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology)33:第2085-2091页)和自产醇梭菌(Abrini等人,微生物学文献集(Archivesof Microbiology)161:第345-351页的菌株。其它合适的细菌包括穆尔氏菌属的那些,包括穆尔氏菌HUC22-1(Sakai等人,生物技术快报(Biotechnology Letters)29:第1607-1612页),和羧基嗜热菌(Carboxydothermus)属的那些(Svetlichny,V.A.等人(1991),***和应用微生物学(Systematic and Applied Microbiology)14:254-260)。这些公开案中的每个的公开内容以引用的方式并入本文中。此外,可通过本领域的技术人员在本发明的方法中使用其它一氧化碳营养型厌氧细菌。还将理解,当考虑本公开时,两种或更多种细菌的混合培养物可用于本发明的方法。
用于本发明的方法的细菌的培养可使用本领域中已知的用于使用厌氧细菌培养和发酵底物的任何数目的方法进行。例示性技术在下文“实例”部分提供。借助于另外的实例,大体上在以下文章中描述的使用用于发酵的气态底物的那些方法可利用:(i)K.T.Klasson等人(1991).用于合成气体发酵资源的生物反应器(Bioreactors forsynthesis gas fermentations resources).节省和再循环(Conservation andRecycling),5;145-165;(ii)K.T.Klasson等人(1991).用于合成气体发酵的生物反应器设计(Bioreactor design for synthesis gas fermentations).燃料(Fuel).70.605-614;(iii)K.T.Klasson等人(1992).将合成气体生物转化成液体或气态燃料(Bioconversionof synthesis gas into liquid or gaseous fuels).酶和微生物技术(Enzyme andMicrobial Technology).14;602-608;(iv)J.L.Vega等人(1989)气态底物发酵的研究:一氧化碳转化成乙酸酯.2.连续培养(Study of Gaseous Substrate Fermentation:CarbonMonoxide Conversion to Acetate.2.Continuous Culture).生物技术与生物工程(Biotech.Bioeng)34.6.785-793;(vi)J.L.Vega等人(1989).气态底物发酵的研究:一氧化碳转化成乙酸酯.1.分批培养(Study of gaseous substrate fermentations:Carbonmonoxide conversion to acetate.1.Batch culture).生物技术和生物工程(Biotech.Bioeng).34.6.774-784;(vii)J.L.Vega等人(1990).用于煤合成气体发酵的生物反应器的设计(Design of Bioreactors for Coal Synthesis Gas Fermentations).资源,节省和再循环(Resources,Conservation and Recycling).3.149-160,其全部内容以引用的方式并入本文。
在一个实施例中,微生物选自包含自产醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌(Clostridiumragsdalei)、食一氧化碳梭菌、德氏梭菌、粪味梭菌、醋酸梭菌、甲酸乙酸梭菌、大梭菌的一氧化碳营养型梭菌的群组。在另外的实施例中,微生物为来自包含自产醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌和相关分离株的种的一氧化碳营养型梭菌的群。这些微生物包括但不限于菌株自产醇梭菌JAI-1T(DSM10061)(Abrini,Naveau和Nyns 1994);自产醇梭菌LBS1560(DSM19630)(WO/2009/064200);自产醇梭菌LBS1561(DSM23693);扬氏梭菌PETCT(DSM13528=ATCC 55383)(Tanner,Miller和Yang 1993);扬氏梭菌ERI-2(ATCC 55380)(美国专利5,593,886);扬氏梭菌C-01(ATCC 55988)(美国专利6,368,819);扬氏梭菌O-52(ATCC 55989)(美国专利6,368,819);拉氏梭菌P11T(ATCC BAA-622)(WO 2008/028055);相关分离株,例如“科斯卡塔梭菌(C.coskatii)”(US20110229947)和“梭菌”(Tyurin)和Kiriukhin 2012);或突变菌株,例如扬氏梭菌OTA-1(Tirado-Acevedo O.使用扬氏梭菌从合成气产生生物乙醇(Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridiumljungdahlii).北卡罗来纳州大学博士论文(PhD thesis,North Carolina StateUniversity),2010)。这些菌株在梭菌rRNA簇I内形成子簇,并且其16S rRNA基因超过99%一致,具有约30%的类似低GC含量。然而,DNA-DNA重缔合和DNA指纹识别实验显示,这些菌株属于不同种(WO 2008/028055)。
上述群的所有种类具有类似形态和大小(对数增长细胞在0.5至0.7×3μm至5μm之间),为嗜温性(理想生长温度在3037间)和严格厌氧生物(Abrini等人,1994;Tanner等人,1993)(WO 2008/028055)。此外,其都具有相同的主要***发生特性,例如相同的pH范围(pH 4至7.5,最佳初始pH是5.5至6),具有类似生长速率的依靠含CO气体的强自养生长,以及具有乙醇和乙酸作为主要发酵最终产物以及在某些条件下形成的少量2,3-丁二醇和乳酸的类似代谢谱。(Abrini等人,1994;等人,2011;Tanner等人1993)(WO 2008/028055)。在所有三个物种下同样观察到吲哚产生。然而,种间区别在于各种糖(例如鼠李糖、***糖)、酸(例如葡糖酸盐、柠檬酸盐)、氨基酸(例如精氨酸、组氨酸)或其它底物(例如甜菜碱、丁醇)的底物利用。此外,发现一些种对某些维生素(例如硫胺、生物素)是营养缺陷型的,而其它的不是。已经发现引起气体吸收的Wood组织和数目在所有种中相同,尽管核酸和氨基酸序列有差异(等人2011)。另外,在一系列这些生物中已显示羧酸还原为其对应的醇(Perez、Richter、Loftus和Angenent,2012)。因此这些特性不是像自产醇梭菌或扬氏梭菌一种生物专有的,但是相反地是一氧化碳营养型、醇合成梭菌的常用特性,并且可预期在这些菌株上机理工作类似,但可存在性能不同(Perez,2012)
发酵可在任何合适的生物反应器中进行。在本发明的一些实施例中,生物反应器可包含其中培养微生物的第一生长反应器和发酵液从生长反应器进料到其中并且其中生产大部分发酵产物(例如,乙醇和乙酸酯)的第二发酵反应器。
含CO底物
包含一氧化碳的底物,优选地包含一氧化碳的气态底物用于本发明的发酵反应。气态底物可为作为工业工艺的副产物获得的废气,或来自一些其它来源(如来自内燃机(例如,机动车))的废气。在某些实施例中,工业工艺是选自由以下各者组成的群组:铁类金属产品制造(如在钢厂中进行)、非铁类产品制造、石油精炼工艺、煤炭气化、电力生产、碳黑生产、氨生产、甲醇生产以及焦炭制造。在这些实施例中,使用任何方便的方法在其排到大气中之前从工业工艺捕获含CO气体。
在具体实施例中,包含CO的底物衍生自钢制造工艺。在钢制备过程中,挤压并粉化铁矿,经历预处理(如烧结或粒化),并且然后传递到其中熔炼它的高炉(BF)。在熔炼过程中,焦炭充当碳源,其起还原剂作用以还原铁矿。焦炭充当用于加热和熔融该材料的热源。热金属在碱性氧气熔炉(BOF)中通过向热金属的表面喷射高速度喷出的纯氧来脱碳。氧直接与在热金属中的碳反应以产生一氧化碳(CO)。因此,具有高CO含量的气流从BOF排出。根据本发明的某些实施例,此流用于进料一个或多个发酵反应。然而,如本领域的技术人员将显而易见,CO可在钢制备过程内的其它处产生,并且根据本发明的各种实施例,此类替代的来源可代替来自BOF的废气使用或与其组合使用。根据来源(即,在钢制备过程内的特定阶段),排出的气体的CO含量由此可变化。另外,特别在批处理工厂中,可存在当在一个或多个此类流中存在间断时的时间段。
通常,流从包含高浓度的CO和低浓度的H2的钢厂脱碳工艺排出。虽然此类流可以极少或无另外处理直接传递到生物反应器,但是可能需要使底物流的组成达到最佳,以便达到较高的醇生产效率和/或整体碳捕获。举例来说,可在该流传递到生物反应器之前提高在底物流中的H2的浓度。
根据本发明的具体实施例,来自两个或更多个来源的流可合并和/或掺合以生产期望和/或优化的底物流。举例来说,包含高浓度的CO的流(如,来自钢厂转换器的废料)可与包含高浓度的H2的流(如来自钢厂焦炉的废气)合并。
钢制备过程的早期阶段通常涉及使用焦炭还原铁矿。焦炭为用于熔融和还原铁矿的固体碳燃料来源,并且通常在钢厂现场生产。在焦炭制备过程中,将烟煤进料到一系列烘箱中,该烘箱在不存在氧的情况下密封并且高温加热,通常循环持续14小时到36小时。在烘箱中剩余的固体的碳为焦炭。将其放入急冷塔,其中它用水喷雾或通过循环惰性气体(氮气)冷却,然后筛选并送到高炉。
大体上处理在此过程期间产生的挥发性化合物,以在该气体用作加热烘箱的燃料之前去除焦油、氨、萘、酚、轻质油和硫。由于焦炭生产所生产的气体通常具有高H2含量(典型组成:55%H2、25%CH4、6%CO、3%N2、2%其它烃)。如此,焦炉气体的至少一部分可分流到发酵过程用于与包含CO的流掺合,来改进醇生产率和/或总碳捕获。可有必要在将它传递到发酵罐之前处理焦炉气体以去除可对培养物有毒的副产物。
在其它实施例中,包含CO的底物可衍生自重组烃的流。烃(如天然气烃)可在高温下重组以根据下式产生CO和H2:
CnHm+nH2O→nCO+(m/2+n)H2
借助于实例,重组甲烷流涉及使流与甲烷反应以在镍催化剂存在下在高温(700℃至1100产生CO和H2。所得流(对于每mol转化的CH4包含1mol CO和3mol H2)可直接传递到发酵罐或与来自另一个来源的底物流掺合,以在发酵过程中提高乙醇生产率和/或总碳捕获。醇(如甲醇)还可重组以产生可以类似方式使用的CO2和H2。
在一些实施例中,含CO的气态底物可来源于有机物质(如甲烷、乙烷、丙烷、煤、天然气、原油、来自石油精炼厂的低价值残留物(包括石油焦炭或石油焦)、固体的城市废料或生物质)的气化。生物质包括在食料(如来自甘蔗的糖,或来自玉米或谷粒的淀粉)或通过林业工业生成的非食品生物质废物的提取和处理期间得到的副产物。这些含碳材料中的任一种可气化,即用氧部分燃烧,以生产合成气体(包含显著量的H2和CO的合成气)。气化方法通常生产具有0.4:1到1.2:1的H2与CO的摩尔比的合成气体,连同较小量的CO2、H2S、甲烷和其它惰性物质。生产的气体的比率可通过本领域中已知的方式变化并且详细地描述于WO200701616中。然而,借助于实例,可变化以下气化炉条件以调节CO:H2产物比率:原料组成(特别地C:H比率)、操作压力、温度分布(影响产物混合物的淬灭)和采用的氧化剂(空气、富含氧的空气、纯O2或流;其中流倾向于产生较高CO:H2比率)。因此,可调节气化炉的操作条件,以提供具有用于发酵或与一个或多个其它流掺合的期望组成的底物流,以在发酵过程中提供用于提高醇生产率和/或总碳捕获的优化的或期望的组成。
生产含有CO的流的气体的重组或生物质的气化(例如,合成气的生产)描述在美国专利申请公开案第US2013/0210096A1号;第US2013/0203143A1号;第US2013/0045517A1号和美国专利第8,376,736号中,其中所有以全文引用方式并入。
根据包含一氧化碳的气态底物的组成,还可期望在将其引入到发酵之前对其进行处理以去除任何非所需杂质,如尘粒。举例来说,气态底物可以使用已知方法过滤或洗涤。
含CO底物将通常含有较大比例的CO,如至少约15体积%到100体积%CO、15体积%到70体积%CO、40体积%到95体积%CO、40体积%到60体积%CO和45体积%到55体积%CO。在具体实施例中,底物包含25体积%、或30体积%、或35体积%、或40体积%、或45体积%、或50体积%、或55体积%或60体积%CO。具有较低浓度的CO(如,6%)的底物也可为适当的,特别当还存在H2和CO2时。在一些实施例中,底物包含5%到70%CO。
不管包含CO的气态流的来源,它将通常含有多种其它气体(如CO2、H2、N2、CH4等)。举例来说,CO2可以1体积%到80体积%或1体积%到30体积%或5%到30%的浓度存在。在一个广义实施例中,传递到生物反应器的底物将通常具有20%到80%CO、0%到30%H2和0%到40%CO2的浓度。
通常,一氧化碳将以气态状态添加到发酵反应。然而,本发明不应认为限于以此状态的底物添加。举例来说,一氧化碳可以液体提供。举例来说,液体可用含有一氧化碳的气体饱和,并且然后将液体添加到生物反应器。这可以使用标准方法实现。借助于实例,可以使用微泡分布发生器(Hensirisak等人,用于好氧发酵的微泡分布发生器的按比例放大(Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation);应用生物化学与生物技术(Applied Biochemistry and Biotechnology)第101卷,第3册/2002年10月)。
另外,通常需要增加底物液流中的CO浓度(气态底物中的CO分压)并且由此增加其中CO是底物的发酵反应的效率。提高在气态底物中的CO分压提高到发酵培养基中的CO质量转移。用于进料发酵反应的气流的组成可以对所述反应的效率和/或成本具有显著影响。举例来说,O2可降低厌氧发酵工艺的效率。在发酵之前或之后发酵工艺阶段中对非所需或不必要的气体的处理可能会增加对此阶段的负担(例如其中气流在进入生物反应器之前经压缩,不必要的能量可以用于压缩在发酵中非所需的气体)。因此,可能需要处理底物流,尤其是来源于工业来源的底物流,从而去除非所需组分并且增加所需组分的浓度。
从底物流去除不需要的气态组分可通过常规技术(如低温分馏、分子筛、吸附、变压吸附或吸附)携带。无论使用任何过程,都可执行气体分离以从气流分离以下组分中的一种或多种的至少一部分:H2、O2、CO2和CO。另外地或可替代地,根据本发明的实施例的气体分离可用于从气流(例如,N2、O2)去除一个或多个部分,使得可如在生物反应器中更高效地使用剩余部分。
吸附为气体、液体或溶解物在固体或液体的表面上的累积。吸附为通过其一种物质(如固体或液体)通过在其分子之间的细小的孔或空间吸收另一种物质(如液体或气体)的过程。
变压吸附(PSA)为绝热过程,其可用于纯化气体以去除由通过在高压下在包含于压力容器中的固定床中的合适的吸附剂吸附的随附杂质。吸附剂的再生通过逆流降压和通过以此前回收的接近产品质量气体在低压下冲洗来实现。为了得到产物的连续流,优选地提供至少两种吸附器,使得至少一种吸附器接收气流(如废料/废气/沼气气流),并且实际上生产希望纯度的产物。同时,通过(一或多种)其它吸附器执行降压、冲洗和再增压回到吸附压力的后续步骤。常见吸附剂可容易地由本领域的技术人员根据待吸附和去除的杂质的类型选择。合适的吸附剂包括沸石分子筛、活性碳、硅胶或活性氧化铝。可在彼此顶部上使用吸附剂床的组合,由此将吸附器内容物划分成多个不同的区。变压吸附涉及参数(如气态和吸附相的压力、温度、流量和组成)的摆动。
使用PSA的气体的纯化或分离一般在接近环境进料气体温度下进行,从而选择性吸附待去除的组分。吸附应理想地足够可逆,以在类似环境温度下实现吸附剂的再生。PSA可用于处理和/或纯化包括CO、CO2和H2的最常见气体。变压吸附技术的实例详细地描述于Ruthven,Douglas M.等人,1993《变压吸附(Pressure Swing Adsorption)》,约翰·威利父子出版公司(John Wiley and Sons)中。
分子筛为含有用作用于气体和液体的吸附剂的精确且均匀大小的微小孔的材料。吸附足够小以穿过孔的分子,而不吸附较大分子。分子筛类似于普通过滤器,但是在分子水平上操作。分子筛常常由铝硅酸盐矿石、粘土、多孔玻璃、微孔炭、沸石、活性碳或具有小分子(如氮气和水)可通过其扩散的开口结构的合成化合物构成。用于再生分子筛的方法包括压力改变(例如,在氧气浓缩器中)和用运载气体加热和冲洗。
举例来说,可使用膜以从像氮气和甲烷的气体分离氢气,以回收氢气,以从沼气分离甲烷,或以去除水蒸气、CO2、H2S或挥发性有机液体。可选择包括多孔膜和非多孔膜的不同膜,以服务如本领域的技术人员在考虑本公开时将显而易见的期望的目的。举例来说,钯膜允许运输单独的H2。在一个具体实施例中,可使用CO2渗透膜将CO2与流分离。与该流分离的CO2可传递到CO2去除器(如先前讨论的气化炉)。
低温分馏涉及压缩气流并且将它冷却到足够低的温度以允许通过蒸馏分离。它可用于例如去除CO2。某些组分(例如,水)通常在执行低温分馏之前从流去除。
相同的技术还可用于从气态流去除氧气以产生富CO和/或CO2的厌氧流。此外,氧气可通过例如将燃烧废气传递到含有兼性好氧微生物、降低的碳底物和微生物必需的营养物的密封发酵罐中。兼性好氧微生物可消耗氧气以建立富CO和/或CO2厌氧流。
用于从气态流分离或去除O2的替代方法在本领域中也为众所周知的。然而,借助于实例,氧气可使用热铜或催化转换器简单地降低和/或去除。
调适特定来源的气体的气体分离过程可使得另外非商业可行生物转化过程是商业可行的。举例来说,在与汽车排气流的CO的适当分离的情况下,可从该流获得可用的能量来源,并且可降低不需要的气体排放。根据本发明的一个实施例,气态底物包含含有CO和H2的合成气,并且执行气体分离以从该流去除氢气,使得它可分离并且用作在发酵过程外的燃料。CO可用于进料发酵反应。
用于发酵过程的发酵液的pH可根据需要调节。适当的pH将取决于考虑使用的营养培养基和微生物的特定发酵反应需要的条件,如由本发明涉及的领域的一般技术人员将了解的。在一个优选实施例中,在利用自产醇梭菌的含有CO的气态底物的发酵中,可将pH调节到大约4.5到6.5。另外的实例包括使用热醋酸穆尔氏菌用于生产乙酸的pH5.5到6.5,使用丙酮丁醇梭杆菌用于生产丁醇的pH 4.5到6.5,和使用生氢氧化碳羧基嗜热菌(Carboxydothermus hygrogenaformans)用于生产氢气的pH 7。本领域的技术人员应了解用于将生物反应器维持在需要的pH下的合适的方式。然而,借助于实例,水性碱(如NaOH)和水性酸(如H2SO4)可用于提高和降低发酵培养基的pH和维持希望的pH。
本发明的附加益处在于,因为不存在或只有极少在其在发酵反应中使用之前对废气执行的洗涤和/或其它处理工艺,气体将含有由工业工艺产生的额外材料,额外材料可至少部分用作用于发酵反应的原料。
流的掺合
可能需要将包含CO和H2的重组的底物流与一个或多个另外的流掺合,以便提高发酵反应的效率、醇生产和/或全碳捕获。不希望受理论所束缚,在本发明的一些实施例中,一氧化碳营养型细菌根据下式将CO转化成乙醇:
6CO+3H2O→C2H5OH+4CO2
然而,在H2的存在下,总转化可如下:
6CO+12H2→3C2H5OH+3H2O
因此,具有高CO含量的流可与包含CO和H2的重组底物液流掺合,以提高CO:H2比率以使发酵效率达到最佳。借助于实例,工业废料流(如来自钢厂的废气)具有高CO含量,但是包括极少或无H2。如此可期望在将掺合的底物流提供到发酵罐之前,将包含CO和H2的一个或多个流与包含CO的废料流掺合。发酵的总效率、醇生产率和/或总碳捕获将取决于在掺合的流中的CO和H2的化学计量。然而,在具体实施例中,掺合的流可基本上包含以下摩尔比的CO和H2:20:1、10:1、5:1、3:1、2:1、1:1或1:2。
此外,可能需要在发酵的不同阶段以特定的比率提供CO和H2。举例来说,具有相对高H2含量(如1:2CO:H2)的底物液流可在启动和/或快速微生物生长期期间提供到发酵阶段。然而,当生长期减缓时,使得培养物维持在基本上稳定的微生物密度下,可提高CO含量(如至少1:1或2:1或更高,其中H2浓度可大于或等于零)。
流的掺合还可具有另外的优点,特别在其中包含CO的废料流在本质上间的情况下。举例来说,包含CO的间歇废料流可与包含CO和H2的基本上连续的重组底物流掺合,并且提供到发酵罐。在本发明的具体实施例中,基本上连续掺合的流的组成和流动速率可根据间歇流变化,以便维持基本上连续的组成和流动速率的底物流提供到发酵槽。
培养基
应了解,为了一种或多种微生物和底物到乙醇和/或乙酸酯发酵的生长发生,除了存在底物外,将需要将合适的营养物培养基进料到生物反应器。营养物培养基将含有足以允许使用的微生物的生长的如维生素和矿石的组分。仅借助于实例,适合于自产醇梭菌生长的厌氧培养基为本领域中已知的,如例如由Abrini等人(自产醇梭菌新种,一种由一氧化碳生产乙醇的厌氧细菌(Clostridium autoethanogenum,sp.Nov.,An AnaerobicBacterium That Produces Ethanol From Carbon Monoxide);微生物学集刊(Arch.Microbiol.),161:345-351(1994))所描述。在下文中“实例”部分提供合适培养基的另外的实例。
生物反应器
发酵可在任何合适的生物反应器(如固定化细胞反应器、气升式反应器、鼓泡塔反应器(BCR)、膜反应器(如中空纤维膜生物反应器(HFMBR))或滴流床反应器(TBR))中进行。另外,在本发明的一些实施例中,生物反应器可包含其中培养微生物的第一生长反应器,和发酵液可从生长反应器进料到其并且其中可生产大多数的发酵产物(例如,乙醇和乙酸酯)的第二发酵反应器。本发明的生物反应器适于接收CO2、H2和任选地含有CO的底物。
发酵条件
用于由气态底物生产乙醇和其它醇的方法为已知的。示例性方法包括例如在WO2007/117157、WO2008/115080、WO2009/022925、WO2009/064200、US 6,340,581、US 6,136,577、US 5,593,886、US 5,807,722和US 5,821,111中描述的那些,其中的每个以引用的方式并入本文中。
发酵应在对于底物发生乙醇和/或乙酸酯发酵的适当条件下进行。反应条件应被视为包括温度、压力、培养基流动速率、pH、培养基氧化还原电势、搅拌速率(如果使用连续搅拌槽反应器)、接种物含量、最大底物浓度和底物引入到生物反应器的速率以确保底物含量不成为限制,和最大产物浓度以避免产物抑制。
最优反应条件将部分取决于使用的特定微生物。然而,一般来说,优选的是发酵在比环境压力高的压力下执行。在增加的压力下操作允许从气相向液相的CO转移速率显著增加,在液相中其可被微生物作为用于生产乙醇的碳源吸收。这又意味着当在高压而非大气压下维持生物反应器时可以缩短滞留时间(被定义为生物反应器中的液体体积除以输入气体流速)。
此外,由于给定的CO到产物的转化速率在某种程度上是底物滞留时间的函数,并且获得所需滞留时间又指示生物反应器的所需体积,故使用加压***可以大大减小所需生物反应器的体积,并且因此减少发酵设备的资金成本。根据美国专利第5,593,886号中给出的实例,反应器体积可以与反应器操作压力增加成线性比例减小,即,在10大气压的压力下操作的生物反应器仅需要在1大气压的压力下操作的生物反应器的体积的十分之一。
已经在其它地方描述了在高压力下进行气体到产物发酵的益处。举例来说,WO02/08438描述了在200kPag(29psig)和520kPag(75psig)的压力下执行的气体到乙醇发酵,分别得到150g/l/天和369g/l/天的乙醇产率。然而,发现使用类似培养基和输入气体组合物在大气压下执行的例示性发酵每天每升产生少10与20倍之间的乙醇。因此,发酵过程可从常压(0kPag)到600kPag下进行。
适合于包含CO的底物的厌氧发酵的发酵条件的实例在WO2007/117157、WO2008/115080、WO2009/022925和WO2009/064200中详述。认为其中报告的发酵条件可根据本发明的方法容易地修改。
发酵产物
可在生产时使用丙酮酸盐衍生产物和乙酰基coA衍生产物两者,或它们可在其它化学品的生产(如塑料、药物和农用化学品的生产)中使用。在一个实施例中,发酵产物用于生产汽油范围烃(8个碳)、柴油烃(12个碳)或喷射燃料烃(12个碳)。乙醇和乙酸酯可然后反应到一起以产生包括酯的化学产物。在本发明的一个实施例中,通过发酵生产的乙醇和乙酸酯一起反应以生产乙酸乙酯。乙酸乙酯可具有用于大量其它工艺的价值,如包括表面涂层和稀释剂以及在制造药物和调味剂和香精中的溶剂的生产。
在2,3-BDO的情况下,它可转化成可用作航空燃料的八碳二聚体。2,3-BDO还可转化成选自由(一或多种)丁烯、丁二烯、甲基乙基酮(MEK)及其混合物组成的群组的化合物。2,3-BDO转化成各种化学化合物公开于美国专利第8,658,408号中。
本发明还提供通过发酵生产的烃产物的至少一部分在流重组工艺中再使用。这可执行,因为非CH4的烃能够经催化剂与流反应以产生H2和CO。在一个具体实施例中,乙醇再循环以用作用于流重组工艺的原料。在一个另外的实施例中,烃原料和/或产物在用于流重组工艺之前穿过预重组器。穿过预重组器部分完成流重组工艺的重整步骤,这可提高氢气生产的效率和降低流重组熔炉需要的容量。
产物回收
发酵反应的产物可使用已知的方法回收。例示性方法包括在WO07/117157、WO08/115080、US 6,340,581、US 6,136,577、US 5,593,886、US 5,807,722和US 5,821,111中描述的那些。然而,简单来说并且借助于实例,乙醇可通过如分馏或蒸发和萃取发酵的方法从发酵液回收。
从发酵液蒸馏乙醇产生乙醇和水的共沸混合物(即,95%乙醇和5%水)。通过使用分子筛乙醇脱水技术可随后得到无水乙醇,这在本领域中也是众所周知的。
萃取发酵程序涉及使用对发酵生物呈现低毒性风险的水可混溶的溶剂,以从稀发酵液回收乙醇。举例来说,油烯醇为可用于这种类型的提取过程的溶剂。将油烯醇连续引入到发酵罐,于是这一溶剂上升,在发酵罐的顶部形成层,其被连续提取并且通过离心机进料。然后容易地分离水和细胞与油烯醇,并且返回到发酵罐,同时负载乙醇的溶剂供应到闪蒸单元中。大部分乙醇气化并且冷凝,而油烯醇为非挥发性并且被回收以供在发酵中再使用。
乙酸酯,其可在发酵反应中作为副产物生产,还可为
表1:发酵培养基
实例1-提高维生素B5浓度对2,3-BDO生产的影响
此实验根据上述一般发酵方法进行。在发酵实验的过程期间,提高气体流量和搅拌以最小化乙酸酯生产和最大化乙醇生产。调节稀释率和细菌稀释率,使得第5.0天,这些分别为1.8天-1和0.85天-1。这些值维持剩余部分的发酵。在第6.0天至第8.0天之间,稳定数据以198μg/g生产的细胞的B5进料速率实现。在此稳定时间段期间实现的结果概括在表2中。
表2:以维生素B5的198μg/g生产的细胞的发酵结果
测量 | 浓度 |
生物质 | 10.62g/L |
CO吸收 | 8.4mol/L/天 |
乙醇 | 18.69g/L |
乙酸酯 | 7.75g/L |
2,3-BDO | 4.8g/L |
比2,3-BDO产生速率 | 0.81g 2,3-BDO/g生物质/天 |
比乙醇产生速率 | 3.17g乙醇/g生物质/天 |
乙醇:2,3-BDO比率 | 3.8:1 |
在第8.1天,在所有其它操作参数保持相同的情况下,在培养基中的维生素B5的浓度提高10倍。在此时间期间,生物质生产速率稍微下降,所以维生素B5进料速率仅提高超过十倍到2180μg/g生产的细胞。在提高维生素B5浓度后,在其它参数保持稳定的情况下,提高比2,3-BDO生产速率和浓度。结果概括在下表3中。
表3:以维生素B5的2180μg/g生产的细胞的发酵结果
这是出人意料的结果,因为它是比2,3-BDO生产速率和2,3-BDO的浓度增加而其它代谢物(例如,乙醇和生物质)的生产速率保持相同。
实例3-从发酵的开始提高维生素B5对2,3-BDO生产的影响
以上实例可与当在整个发酵中过量的B5维生素存在于发酵培养基时的结果相比。在此发酵实验期间,提高气体和搅拌以最小化乙酸酯生产和最大化乙醇生产。在第4.0天将稀释率和细菌稀释率分别调节到1.7天-1和0.65天-1。在这种情况下,2,3-BDO浓度达到9g/L,其中乙醇:2,3-BDO比率为2:1(图2),并且CO吸收为9.4mol/L/天(图3)。在整个发酵中B5维生素的进料速率>2000μg/g生产的细胞。在第6.0天到第7.0天期间,因为生物质和2,3-BDO生产变平,所以B5维生素的进料速率为2011μg/g生产的细胞。比2,3-BDO生产速率为1.2g/天/g生物质,比乙醇生产速率为2.4g/天/g生物质。
实例4-提高/降低维生素B1浓度对2,3-BDO生产的影响
发酵使用一般发酵方法开始,其中提高气体和搅拌以最小化乙酸酯生产和最大化乙醇生产。在第4.0天将稀释率和细菌稀释率分别调节到第2.0天-1和1.2天-1。这些值维持剩余部分的发酵。在第10.0天至第14.0天之间实现稳定数据,在此时间期间B1的进料速率为303μg/g生产的细胞。实现的数据概括在表4中。
表4:过量维生素B1(303μg/g生产的细胞)的结果
第14.1天,在所有其它操作参数保持恒定的情况下,降低在培养基中的B1的浓度以降低比B1进料速率。在第14.1天到第22.0天之间,存在2,3-BDO的生产的降低,并且乙醇:2,3-BDO的比率从4.7:1提高到12:1。在此时间期间比B1进料速率从303μg/g生产的细胞降低到61μg/g生产的细胞。结果概括在表5中。
表5:降低的维生素B1(61μg/g生产的细胞)的结果
测量 | 浓度 |
乙醇:2,3-BDO | 12:1 |
2,3-BDO滴度 | 1.6g/L |
生物质 | 6.75g/L |
乙醇 | 18.23g/L |
CO吸收 | 8.0mol/L/天 |
比2,3-BDO产生速率 | 0.47g 2,3-BDO/g生物质/天 |
比乙醇产生速率 | 5.4g乙醇/g生物质/天 |
这是出人意料的结果,因为降低B1浓度降低2,3-BDO的生产同时乙醇生产不受影响并且同时保持CO吸收恒定。在本领域中已报告限制用于生长的B1的浓度,并且乙酸酯生产为6.5μg/g生产的细胞。因此,供应充分超过细胞生长最低需要的B1提供控制2,3-BDO的生产和乙醇:2,3-BDO的比率的方式。
实例5:提高B7浓度对2,3-BDO生产的影响
在此实例中,使用根据一般发酵方法的发酵生长测试B7对2,3-BDO的生产的影响。在发酵的过程期间,提高气体和搅拌以最小化乙酸酯生产和最大化乙醇生产。调节稀释率和细菌稀释率,使得在第8.0天这些分别为1.8天-1和0.75天-1。这些值维持剩余部分的发酵。以90μg/g生产的细胞的B7进料速率实现稳定数据。在那时实现的结果在以下概括;
表6:以维生素B7的90μg/g生产的细胞的发酵结果
测量 | 浓度 |
生物质 | 9.42g/L |
CO吸收 | 8.0mol/L/天 |
乙醇 | 15.63g/L |
乙酸酯 | 8.13g/L |
2,3-BDO | 4.94g/L |
比2,3-BDO产生速率 | 1.19g 2,3-BDO/g生物质/天 |
比乙醇产生速率 | 3.78g乙醇/g生物质/天 |
乙醇:2,3-BDO比率 | 3.2:1 |
在第8.69天,在所有其它操作参数保持恒定的情况下,在培养基中的B7的浓度提高10倍。在此时间期间,生物质生产速率保持稳定,因此提高B7进料速率超过十倍到980μg/g生产的细胞。在提高B7进料后,提高比2,3-BDO生产速率和2,3-BDO的浓度。从第13天到第14天获得的数据在以下概括;
表7:以维生素B7的980μg/g生产的细胞的发酵结果
测量 | 浓度 |
生物质 | 9.23g/L |
CO吸收 | 7.6mol/L/天 |
乙醇 | 14.92g/L |
2,3-BDO | 7.34g/L |
比2,3-BDO产生速率 | 1.97g 2,3-BDO/g生物质/天 |
比乙醇产生速率 | 3.85g乙醇/g生物质/天 |
乙醇:2,3-BDO比率 | 1.91:1 |
当2,3-BDO浓度到达峰值(第14.04天),在培养基中的B7降低10倍,使得比B7进料速率降低回至90μg/g生产的细胞。观察测量变量的数据非常接近在提高B7浓度之前观察的那些值,和在以下概括。
表8:当维生素B7浓度降低到90μg/g生产的细胞时发酵的结果
测量 | 浓度 |
生物质 | 10.53g/L |
CO吸收 | 7.6mol/L/天 |
乙醇 | 15.70g/L |
2,3-BDO | 4.76g/L |
比2,3-BDO产生速率 | 1.1g 2,3-BDO/g生物质/天 |
比乙醇产生速率 | 3.59g乙醇/g生物质/天 |
乙醇:2,3-BDO比率 | 3.3:1 |
这是出人意料的结果,因为它是比2,3-BDO生产速率和2,3-BDO的浓度增加而不是任何其它代谢物和或生物质。该结果还示出提高B7的影响为可逆的,并且提高B7不影响比乙醇生产速率。改变B7浓度的结果呈现在图4和图5中。
本文中已经参考某些优选实施例描述本发明,以便读者无需过度实验就能实践本发明。本领域的技术人员将了解本发明除特别描述的那些内容以外可以大量变化和修改实践。应了解,本发明包括所有此类变化和修改。此外,提供标题、小标题等以辅助读者对本文件的理解,并且不应被解读为限制本发明的范围。所有本文中提出的申请、专利和公开案的全部公开内容以引用的方式并入本文中。
更具体地说,如由在本领域的技术人员将了解,本发明的实施例的实施方案可包括一个或多个附加要素。仅在其各种方面理解本发明必需的那些要素可已在具体实例中或在描述中示出。然而,本发明的范围不限于描述的实施例,并且包括包括一个或多个附加步骤和/或一个或多个取代步骤的***和/或方法和/或省略一或多个步骤的***和/或方法。
本说明书中对任何现有技术的提及不是并且不应理解为对在任何国家的本职领域中现有技术形成公共常识的一部分的认可或任何形式的暗示。
除非上下文另有要求,否则在整个本说明书和随附的任何权利要求中,词语“包含(comprise)”、“包含(comprising)”等应以与排它性意义相反的包含性意义(也就是说,以“包括但不限于”的意义)理解。
Claims (21)
1.一种提高在微生物发酵期间至少一种丙酮酸盐衍生产物的产量的方法,所述方法包含:
a)将包含CO的气态底物提供到在液体营养物培养基中包含至少一种产乙酸一氧化碳营养型微生物的培养物的生物反应器中,以生产至少一种丙酮酸盐衍生产物和至少乙酰基-CoA衍生产物;和
b)将所述液体营养物培养基中的至少一种营养物的浓度提高到高于所述至少一种产乙酸一氧化碳营养型微生物的细胞需要的浓度,使得至少一种丙酮酸盐衍生产物的产量提高,所述营养物选自由以下各者组成的群组:
1)维生素B1;
2)维生素B5;
3)维生素B7和其混合物。
2.一种提高通过微生物发酵生产的2,3-丁二醇的产量的方法,所述方法包含:
a)将包含CO的气态底物提供到在液体营养物培养基中包含至少一种产乙酸一氧化碳营养型微生物的培养物的生物反应器中,以至少生产2,3-丁二醇和乙醇;和
b)将所述液体营养物培养基中的至少一种营养物的浓度提高到高于所述至少一种产乙酸一氧化碳营养型微生物的细胞需要的浓度,使得2,3-丁二醇的产量提高,所述营养物选自由以下各者组成的群组:
1)维生素B1;
2)维生素B5;
3)维生素B7和其混合物。
3.根据权利要求1所述的方法,其中将维生素B5或维生素B1的浓度从高于所述至少一种微生物的细胞需要的浓度的2倍提高到80倍。
4.根据权利要求2所述的方法,其中将维生素B5或维生素B1的浓度从高于所述至少一种微生物的细胞需要的浓度的2倍提高到80倍。
5.根据权利要求1所述的方法,其中将维生素B7在所述液体营养物培养基中的浓度从高于所述至少一种微生物的细胞需要的浓度的2倍提高到30倍。
6.根据权利要求2所述的方法,其中将所述维生素B7在所述液体营养物培养基中的浓度从高于所述至少一种微生物的细胞需要的浓度的2倍提高到30倍。
7.根据权利要求1所述的方法,其中维生素B1在所述液体营养物培养基中的浓度从20μg/g生产的生物质到500μg/g生产的生物质变化。
8.根据权利要求2所述的方法,其中所述维生素B1在所述液体营养物培养基中的浓度从20μg/g生产的生物质到500μg/g生产的生物质变化。
9.根据权利要求1所述的方法,其中维生素B5在所述液体营养物培养基中的浓度从100μg/g生产的生物质到4000μg/g生产的生物质变化。
10.根据权利要求2所述的方法,其中所述维生素B5在所述液体营养物培养基中的浓度从100μg/g生产的生物质到4000μg/g生产的生物质变化。
11.根据权利要求1所述的方法,其中维生素B7在所述液体营养物培养基中的浓度从100μg/g生产的生物质到4000μg/g生产的生物质变化。
12.根据权利要求2所述的方法,其中所述维生素B7在所述液体营养物培养基中的浓度从100μg/g生产的生物质到4000μg/g生产的生物质变化。
13.根据权利要求1所述的方法,其中所述丙酮酸盐衍生产物选自由以下各者组成的群组:2,3-丁二醇、乳酸酯、丁二酸酯、甲基乙基酮、2-丁醇、丙二醇、2-丙醇、异丙醇、乙偶姻、异丁醇、柠苹酸、丁二烯和聚乳酸。
14.根据权利要求1所述的方法,其中所述乙酰基-CoA衍生产物为乙醇。。
15.根据权利要求2所述的方法,其中提高2,3-丁二醇的产量使得乙醇:2,3-丁二醇的比率从4:1到1:1变化。
16.根据权利要求2所述的方法,其中2,3-丁二醇的产量为至少10克/升/天。
17.根据权利要求2所述的方法,其中2,3-丁二醇的产量为至少20克/升/天。
18.根据权利要求1所述的方法,其中所述产乙酸一氧化碳营养型微生物选自由以下各者组成的群组:梭菌属(Clostridium)、穆尔氏菌属(Moorella)、产醋杆菌属(Oxobacter)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、醋酸杆菌属(Acetobacterium)、真杆菌属(Eubacterium)或丁酸杆菌属(Butyribacterium)。
19.根据权利要求2所述的方法,其中所述产乙酸一氧化碳营养型微生物选自由以下各者组成的群组:梭菌属、穆尔氏菌属、产醋杆菌属、消化链球菌属、醋酸杆菌属、真杆菌属或丁酸杆菌属。
20.根据权利要求18所述的方法,其中所述产乙酸一氧化碳营养型微生物选自由以下各者组成的群组:自产醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、扬氏梭菌(Clostridiumljungdahli)、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、德氏梭菌(Clostridiumdrakei)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、甲酸乙酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)、大梭菌(Clostridium magnum)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrphoicum)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴奇产碱菌(Alkalibaculum bacchi)、长生布劳特菌(Blautia producta)、淤泥真杆菌(Eubacterium limosum)、热醋酸穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata)、森林产乙酸鼠孢菌(Sporomusa silvacetica)、类球鼠孢菌(Sporomusa sphaeroides)、普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)和凯伍热厌氧菌(Thermoanaerobacter kiuvi)。
21.根据权利要求19所述的方法,其中所述产乙酸一氧化碳营养型微生物选自由以下各者组成的群组:自产醇梭菌、扬氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德氏梭菌、粪味梭菌、醋酸梭菌、甲酸乙酸梭菌、大梭菌、食甲基丁酸杆菌、伍氏醋酸杆菌、巴奇产碱菌、长生布劳特菌、淤泥真杆菌、热醋酸穆尔氏菌、卵形鼠孢菌、森林产乙酸鼠孢菌、类球鼠孢菌、普氏产醋杆菌和凯伍热厌氧菌。
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