KR102443037B1 - 에탄올을 포함하는 합성 가스로부터 2,3-부탄디올 제조용 배지 조성물 및 이를 이용한 2,3-부탄디올 생산 방법 - Google Patents
에탄올을 포함하는 합성 가스로부터 2,3-부탄디올 제조용 배지 조성물 및 이를 이용한 2,3-부탄디올 생산 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 에탄올과 합성 가스를 이용하여 2,3-부탄디올을 제조하기 위한 조성물 및 2,3-부탄디올 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물은, 유효성분으로 에탄올을 포함함으로써, 상기 조성물을 포함하는 배지에 2,3-부탄디올(butanediol)을 생산하는 균주를 접종하여 배양하고, 합성 가스를 첨가하는 경우, 에탄올을 기질로 하여 경제적으로 바이오 연료 및 화학물질인 2,3-부탄디올을 제조할 수 있고, 대사 과정에서 탄소 흐름(carbon flux)을 타겟 물질의 생산 경로에 집중되게 함으로써 2,3-부탄디올의 생산 효율성을 증가시킬 수 있는 우수한 효과가 있으며, 상기 합성 가스 또는 에탄올의 첨가량 및 배지의 교반 속도와 같은 발효 조건의 조절만으로 2,3-부탄디올의 생산성을 향상시킬 수 있는 우수한 효과가 있다.
Description
본 명세서에는 에탄올과 합성 가스를 이용하여 2,3-부탄디올을 제조하기 위한 조성물, 및 2,3-부탄디올 제조방법에 관한 것이다.
지구상에 사용되는 에너지는 대부분 석유 화학 공정으로부터 생산되며, 이러한 석유자원의 한계를 극복하기 위한 방안으로 다양한 바이오매스를 이용하여 신재생 에너지를 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되었다. 신재생 에너지 생산이 이용되고 있는 바이오매스는 1세대(예:옥수수), 2세대 (목질계 바이오매스) 및 3세대(해조류)로 분류되며, 해당 바이오매스의 경우 원료 비용, 식량자원 이용 문제, 원료 수급, 가격, 재배 면적 제한 등의 단점이 있고, 미생물이 uptake 할 수 있는 단당류로 분해하는데 필요한 전처리 공정, 효소 사용 등에 드는 비용이 추가로 든다. 이러한 바이오매스의 한계를 극복하고 동시에 경제적인 탄소원으로서 CO, CO2, H2 가 혼합된 가스를 이용할 수 있는데, 바이오매스 및 유기성 폐자원 가스화로 생산할 수 있는 합성 가스, 제철소 등 산업체에서 발생하는 부생가스 및 폐가스가 주목받고 있다.
더 자세히는, 합성 가스는 폐기물, 석탄, 나프타, 중유 등 다양한 탄소 기반 원료의 가스화 공정을 통해 얻어지는 일산화탄소, 이산화탄소, 수소로 구성된 혼합가스이다. 합성 가스는 대기 중에 방출되어 지구온난화의 원인이 된다. 또한 우리나라의 경우에도 제철소 제련과정에서 연간 약 1,300만톤의 부생 가스가 발생되며, 이 중 35 내지 40%는 일산화탄소 형태로 대기 중에 방출되고 있다. 국내뿐 아니라 세계적으로 이산화탄소 배출량 감소를 위한 정책 운영 및 기술 개발을 위한 노력이 이루어지고 있으며, 석유자원 이용 시 발생되는 합성 가스를 이용하여 고부가가치의 산물로 전환은 저렴한 원료물질 공급과 이산화탄소 저감 효과(CO2 고정화)를 동시 달성 가능한 방안이다.
2,3-부탄디올(2,3-Butanediol)은 수많은 산업 분야에서 중요한 화학 중간체이다. 메틸에틸케톤(산업용 용매) 및 1,3-부타디엔(합성고무용 빌딩 블록)은 2,3-부탄디올의 탈수 과정에 의해 생산된다. 또한, 2,3-부탄디올은 인쇄 잉크, 합성 향료, 연화제 및 보습제의 제조에 사용되며, 약물 및 의약품의 운반체 및 동결 점이 낮아 부동액으로 사용되는 물질이다. 2,3-부탄디올 및 그 유도체의 제조에 화학적 합성 방법이 이용 가능하지만, 한정적인 석유자원의 원료 수급 문제와 유가 상승 등으로 인한 가격 불안정성이 지속되고 있다. 이에 바이오매스를 기반으로 하는 2,3-부탄디올 생산에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 발명에서는 2,3-부탄디올 생산을 기존의 바이오 매스의 경제성 및 단점을 극복 가능한 합성 가스를 이용하여 효율적으로 수행하고자 한다.
발효당을 탄소원으로 이용하여 미생물 발효공정에서 2,3-부탄디올을 생산하는 연구는 최근까지도 지속되고 있으며, 대표적인 2,3-부탄디올 생산 미생물로는 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 클렙시엘라 옥시토카(K. oxytoca), 세라티아 마르세스센스(Serratia marcescens), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes), 패니바실러스 폴리마이샤(Paenibacillus polymyxa) 등이 있다. 그러나 상기 미생물들은 글루코스, 자일로스 등의 발효당을 이용하여 2,3-부탄다이올을 생산하는 미생물이다. 해당 미생물이 2,3-부탄다이올 생산에 이용하는 바이오매스는 옥수수와 같은 식량자원인 1세대, 목질계 바이오 매스인 2세대, 해조류인 3세대가 있으나, 특히 2세대는 재배지 등의 원료 수급 한계, 전처리 비용, 탄소원의 비효율적 활용 등의 단점이 있고, 3세대는 탄소원의 비효율적 활용, 식량자원, 전처리 비용 등의 한계와 같은 원료 물질에 대한 여러 문제에 직면해 있다. 이러한 문제를 극복하고 경제성 있는 2,3-부탄다이올 생산을 위해 합성 가스 또는 산업체 부생가스를 탄소원으로 이용 가능한 아세토젠 균주를 이용하여 2,3-부탄다이올을 생산하고자 연구를 수행하였다.
아세토젠(Acetogen)으로 분류되는 미생물은 탄소원 및 에너지원으로 CO, CO2, H2가 혼합된 합성가스를 기질로 이용하고 혐기 발효 과정을 통해 아세트산을 생산하는 미생물군을 말한다. 아세토젠은 우드-융달 대사경로(Wood-Ljungdahl pathway)를 통해 합성 가스를 다양한 물질(에탄올, 아세트산, 부티르산, 부탄올 등)로 전환한다. 대표적으로 클로스트리디움 륭달리(Clostridium ljungdahlii, C. ljungdahlii), 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum, C. autoethanogenum), 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum), 클로스트리디움 카르복시디보란스 P7(Clostridium carboxidivorans P7, C. carboxidivorans P7), 펩토스트렙토코커스 프로덕터스(Peptostreptococcus productus), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum) 등이 잘 알려져 있다. 아세토젠 균주의 주요 생산물은 탄소 2개인 아세트산과 에탄올이며, 현재 LanzaTech, INROS Bio 등 글로벌 기업에서는 에탄올의 상용화 단계에 이르렀다. 2,3-부탄디올의 생합성이 가능한 아세토젠은 클로스트리디움 륭달리(C. ljungdahlii), 클로스트리디움 오토에타노게눔(C. autoethanogenum), 클로스트리디움 라그스달레이(C. ragsdalei), 클로스트리디움 코스카티(C. coskatii)가 있으며, 합성 가스로부터 약 0.36 g/L 이하의 낮은 효율로 2,3-부탄디올을 생산한다고 알려져 있다. 이 중 C. autoethanogenum DSMZ 10061은 합성가스를 이용하여 주로 에탄올과 아세트산을 생산하며, 2,3-부탄디올의 생산이 가능하다 정도만 보고되었으며, 이 때 2,3-부탄디올의 생산량은 극히 적어 단순히 상기 균주를 이용하여 합성가스로부터 2,3-부탄디올을 생산하는 것은 효율이 낮음을 알 수 있었다 [Kaspar Valgepea 외 12인, H2 drives metabolic rearrangements in gas-fermenting Clostridium autoethanogenum, Biotechnology for Biofuels volume 11, Article number: 55 (2018)]. 본 발명자는 C. autoethanogenum 를 균주로 합성 가스를 이용하여 고효율로 2,3-부탄다이올 생산을 달성한다면 2,3-부탄다이올를 경제적으로 생산하는 것이 가능하다고 판단하고 이에 대한 연구를 수행하였다.
미생물이 발효당을 탄소원으로 이용하는 경우 해당 작용(glycolysis)을 통해 피루빈산염(pyruvate)을 거쳐 아세틸-CoA(acetyl-CoA)로 전환되고, 아세틸-CoA로부터 아세트산, 에탄올 등을 합성하게 된다. 합성 가스를 이용하는 경우 우드-융달 대사경로(Wood-Ljungdahl pathway)를 통해 아세틸-CoA를 생산하고 아세트산, 에탄올 등을 합성하게 된다. 2,3-부탄디올 생산 경로는, 발효당을 이용하는 경우에는 생산된 피루빈산염을 전구체로 사용하여 아세토락트산(acetolactate), 아세토인(acetoin) 순으로 전환되고, 최종적으로 아세토인이 2,3-부탄디올 탈수소효소(2,3-butanediol dehydrogenase)에 의해 2,3-부탄디올로 전환된다. 즉, 발효당을 이용하는 경우 피루빈산염에서 아세틸-CoA로 전환되기 전에 2,3-부탄디올의 합성이 가능하다. 반면, 합성 가스를 이용하는 경우 아세틸-CoA로부터 에탄올, 아세트산 생산과 피루빈산염으로 전환이 경쟁적으로 이루어지기 때문에 피루빈산염으로 대사의 흐름이 집중될수록 2,3-부탄디올의 생산성 향상을 도모할 수 있다(생산경로는 도 1 참조).
이에, 본 발명자는 아세토젠 균주 중 2,3-부탄디올 생산이 가능하다고 알려진 균주인 C. autoethanogenum DSMZ 10061을 이용하여 2,3-부탄디올을 효율적으로 생산하고자 하였으며, 동시에 주요 생산 물질인 에탄올의 첨가로 C. autoethanogenum DSMZ 10061의 대사과정에서 아세틸-CoA를 피루빈산염으로 대사의 흐름을 집중시켜 2,3-부탄디올 생산성 향상을 도모하고자 하였다. 이는 저렴한 탄소원과 저가의 재생가능한 첨가물을 통해 고부가가치 산물인 2,3-부탄디올을 생산하고자 하는 방안이다. 또한, 2,3-부탄디올을 분리한 후 잔존하는 아세테이트와 에탄올을 다시 2,3-부탄디올 생산에 재이용하여 부산물을 줄일 수 있는 2,3-부탄디올 생산 방법이다.
종래 2,3-부탄디올을 생산하는 방법으로, 탄소원으로 당을 이용하거나 산을 이용하는 방법이 있다(KR 10-2016-0123108 A, KR 10-2012-0096756 A, US 9,771,603 B2). 그러나, 탄소원으로 당을 이용하는 경우 원료 비용, 전처리 공정, 효소 사용 등의 문제가 있어 경제적, 시간적으로 비효율적인 문제가 있다. 또한, 산을 이용하는 경우 첨가된 산으로 인해 균주의 성장이 저해되는 문제가 있다.
일 측면에서, 본 발명의 목적은, 종래의 비효율성 및 균주의 성장 저해와 같은 문제 없이, 에탄올과 합성 가스를 이용하여, 2,3-부탄디올을 제조하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 또한 에탄올을 첨가하여 합성 가스로부터 2,3-부탄다이올 생산을 향상시키기 위한 방법을 제공하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명은, 유효성분으로서 에탄올을 포함하고, 합성 가스로부터 2,3-부탄디올(butanediol) 제조하며, 2,3-부탄디올을 생산하는 균주를 배양하기 위한, 2,3-부탄디올 제조용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 상기 조성물을 포함하는 배지에 2,3-부탄디올(butanediol)을 생산하는 균주를 접종하는 단계; 및 상기 배지에 합성 가스를 첨가하는 단계;를 포함하는, 2,3-부탄디올 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물은, 유효성분으로 에탄올을 포함하고 있는 배지 조성물로서 상기 조성물을 포함하는 배지에 2,3-부탄디올(butanediol)을 생산하는 균주를 접종하여 배양하고, 합성 가스를 첨가하는 경우, 에탄올을 기질로 하여 경제적으로 바이오 연료 및 화학물질인 2,3-부탄디올을 제조할 수 있고, 대사 과정에서 탄소 흐름(carbon flux)을 타겟 물질의 생산 경로에 집중되게 함으로써 2,3-부탄디올의 생산 효율성을 증가시킬 수 있는 우수한 효과가 있다. 나아가 상기 합성 가스 또는 에탄올의 첨가량 및 배지의 교반 속도와 같은 발효 조건의 조절만으로 2,3-부탄디올의 생산성을 향상시킬 수 있다.
도 1은 합성 가스 및 당을 이용하여 본 발명의 일 측면에 따른 C. autoethanogenum DSMZ 10061가 2,3-부탄다이올 생산 대사 경로를 모식화한 그림이다.
도 2a 내지 2c는 본 발명의 일 측면에 따른 C. autoethanogenum DSMZ 10061의 합성 가스 발효 결과를 나타낸 그래프로, 도 2a는 상기 균주의 합성 가스 소모 경향을, 도 2b는 상기 균주의 성장 및 pH 변화를, 도 2c는 발효 168 시간 후 합성 가스로부터 상기 균주의 2,3-부탄디올(2,3-BDO), 에탄올(EtOH), 아세트산(Acetate) 생산량을 나타낸다.
도 3a 내지 3e는 본 발명의 일 측면에 따른 C. autoethanogenum DSMZ 10061의 교반 속도와 합성 가스 첨가량을 달리하였을 때의 발효 패턴을 나타낸 그래프로, 도 3a 내지 3d는 교반 속도 및 합성 가스 첨가량에 따른 합성 가스 소모 경향 및 상기 균주의 성장을 나타내고, 도 3e는 교반 속도 및 합성 가스 첨가량에 따른 발효 192 시간 후 합성 가스로부터 상기 균주의 2,3-부탄디올(2,3-BDO), 에탄올(EtOH), 아세트산(Acetate) 생산량을 나타낸다.
도 4a 내지 4f는 본 발명의 일 측면에 따른 C. autoethanogenum DSMZ 10061의 합성 가스 반복 첨가, 아세트산 또는 에탄올 첨가에 의한 발효 경향을 비교한 그래프로, 도 4a 내지 4c는 합성 가스 소모 경향을, 도 4d 내지 4f는 발효 시간에 따른 생산 물질을 나타낸다.
도 5a 내지 5g는 본 발명의 일 측면에 따른 C. autoethanogenum DSMZ 10061의 에탄올 첨가량, 합성 가스 첨가 시간 간격을 달리하였을 때의 발효 경향을 비교한 그래프로, 도 5a 내지 5d는 합성 가스 소모 경향을, 도 5e 및 5f는 발효 시간에 따른 2,3-부탄디올 및 에탄올 생산 경향을 나타내며, 도 5g는 발효 48 시간 후 2,3-부탄디올 생산량 및 에탄올 변화량을 비교한 그래프이다.
도 2a 내지 2c는 본 발명의 일 측면에 따른 C. autoethanogenum DSMZ 10061의 합성 가스 발효 결과를 나타낸 그래프로, 도 2a는 상기 균주의 합성 가스 소모 경향을, 도 2b는 상기 균주의 성장 및 pH 변화를, 도 2c는 발효 168 시간 후 합성 가스로부터 상기 균주의 2,3-부탄디올(2,3-BDO), 에탄올(EtOH), 아세트산(Acetate) 생산량을 나타낸다.
도 3a 내지 3e는 본 발명의 일 측면에 따른 C. autoethanogenum DSMZ 10061의 교반 속도와 합성 가스 첨가량을 달리하였을 때의 발효 패턴을 나타낸 그래프로, 도 3a 내지 3d는 교반 속도 및 합성 가스 첨가량에 따른 합성 가스 소모 경향 및 상기 균주의 성장을 나타내고, 도 3e는 교반 속도 및 합성 가스 첨가량에 따른 발효 192 시간 후 합성 가스로부터 상기 균주의 2,3-부탄디올(2,3-BDO), 에탄올(EtOH), 아세트산(Acetate) 생산량을 나타낸다.
도 4a 내지 4f는 본 발명의 일 측면에 따른 C. autoethanogenum DSMZ 10061의 합성 가스 반복 첨가, 아세트산 또는 에탄올 첨가에 의한 발효 경향을 비교한 그래프로, 도 4a 내지 4c는 합성 가스 소모 경향을, 도 4d 내지 4f는 발효 시간에 따른 생산 물질을 나타낸다.
도 5a 내지 5g는 본 발명의 일 측면에 따른 C. autoethanogenum DSMZ 10061의 에탄올 첨가량, 합성 가스 첨가 시간 간격을 달리하였을 때의 발효 경향을 비교한 그래프로, 도 5a 내지 5d는 합성 가스 소모 경향을, 도 5e 및 5f는 발효 시간에 따른 2,3-부탄디올 및 에탄올 생산 경향을 나타내며, 도 5g는 발효 48 시간 후 2,3-부탄디올 생산량 및 에탄올 변화량을 비교한 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
일 측면에서, 본 발명은 2,3-부탄디올(butanediol) 제조용 배지 조성물로서, 상기 조성물은 유효성분으로서 에탄올을 포함하고, 상기 2,3-부탄디올 제조는 합성 가스로부터의 제조이고, 상기 조성물은 2,3-부탄디올을 생산하는 균주를 배양하기 위한, 2,3-부탄디올 제조용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따른 2,3-부탄디올 제조용 배지 조성물은 유효성분으로서 에탄올을 포함할 수 있다. 에탄올은 아세트산과 함께 합성 가스를 이용해 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum) 10061이 주로 생산하는 물질이다. 상기 균주는 합성 가스의 대사 과정에서 합성된 아세틸-CoA에서 에탄올과 아세트산을 생산하게 되는데, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물을 포함하는 배지에서 2,3-부탄디올 생산 균주를 접종하고 합성 가스를 첨가 시, 대사 흐름을 아세틸-CoA에서 에탄올의 생산이 아닌 피루빈산염으로 전환을 유도하여 공급된 탄소의 흐름을 2,3-부탄디올 생산에 집중시켜 2,3-부탄다이올 생산량을 향상시킬 수 있다. 종래기술로 산 또는 당을 이용하여 2,3-부탄디올을 제조하는 방법이 있으나(KR 10-2016-0123108 A, KR 10-2012-0096756 A, US 9,771,603 B2), 전술한 바와 같이 이들은 경제적으로 비효율적이고 첨가된 산으로 인해 균주의 성장이 저해되어 2,3-부탄디올 생산량이 감소하는 문제가 있다. 그러나, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 에탄올을 이용하여 생산량 감소의 문제 없이 2,3-부탄디올을 생산할 수 있어 경제성을 확보할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 화학 촉매 또는 효소를 이용하여 에탄올에서 2,3-부탄디올을 전환하는 것(KR 10-2019-0088648 A)이 아닌, 미생물이 에탄올을 소모하여 2,3-부탄디올을 생산하는 것으로 발효가 포함된 것을 특징으로 한다. 또한, 기존에 기존에 당을 이용해서 2,3-부탄디올 생산하거나, 당과 함께, 합성가스 중 일산화탄소만을 공급하여 2,3-부탄디올 생산하는 기술이 존재하나, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 합성가스만을 이용하여 더 높은 수율로 2,3-부탄디올을 생산할 수 있다. 나아가, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 단일 가스가 아닌 합성 가스를 이용하여 2,3-부탄디올을 생산할 수 있어 단일 가스(예를 들어, 일산화탄소)만을 분리 공급하는 공정이 불필요하여 비용 및 시간적으로 보다 경제적인 우수한 효과가 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 에탄올은 상기 배지 조성물이 포함된 배지의 총 부피에 대하여 1 내지 25 g/L일 수 있고, 구체적으로 에탄올은 상기 배지 조성물이 포함된 배지의 총 부피에 대하여 1 g/L 이상, 2 g/L 이상, 3 g/L 이상, 4 g/L 이상, 5 g/L 이상, 6 g/L 이상, 7 g/L 이상, 8 g/L 이상, 9 g/L 이상, 10 g/L 이상, 11 g/L 이상, 12 g/L 이상, 13 g/L 이상, 14 g/L 이상, 15 g/L 이상, 16 g/L 이상, 17 g/L 이상, 18 g/L 이상, 19 g/L 이상, 20 g/L 이상, 21 g/L 이상, 22 g/L 이상, 23 g/L 이상 또는 24 g/L 이상일 수 있고, 25 g/L 이하, 24 g/L 이하, 23 g/L 이하, 22 g/L 이하, 21 g/L 이하, 20 g/L 이하, 19 g/L 이하, 18 g/L 이하, 17 g/L 이하, 16 g/L 이하, 15 g/L 이하, 14 g/L 이하, 13 g/L 이하, 12 g/L 이하, 11 g/L 이하, 10 g/L 이하, 9 g/L 이하, 8 g/L 이하, 7 g/L 이하, 6 g/L 이하, 5 g/L 이하, 4 g/L 이하, 3 g/L 이하 또는 2 g/L 이하일 수 있으나, 미생물 생장을 저해하지 않으면서 2,3-부탄디올을 생산할 수 있는 에탄올의 양이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 2,3-부탄디올을 생산하는 균주는 아세토젠 균주일 수 있다. 상기 아세토센 균주는 합성 가스를 탄소원과 에너지원으로 이용 가능한 균주이다. 당을 통한 발효 시 해당작용(glycolysis)을 통해 피루빈산염(pyruvate)으로부터 2,3-부탄디올을 합성하고, 또한 피루빈산염(pyruvate)은 아세틸-CoA로 전환되어 에탄올과 아세트산을 생산한다. 합성 가스 이용 시에는 우드-융달 대사경로(Wood-Ljungdahl pathway)를 통해 아세틸-CoA가 합성되고 에탄올과 아세트산을 생산하며, 아세틸-CoA가 피루빈산염으로 전환 후 2,3-부탄디올 생산이 가능하다. 피루빈산염은 2,3-부탄디올 생산에 중간체로 2,3-부탄디올 생산을 위해 필수적이다. 미생물은 합성 가스를 이용하는 경우 아세틸-CoA가 에탄올, 아세트산 등의 생산물이 아닌 피루빈산염로 전환 될 수 있는 방안이 필요하다. 따라서 아세틸-CoA 풀(pool)을 늘려 피루빈산염으로 전환하기 위해 합성 가스의 공급량을 늘려 줄 수 있으며, 이 때 일산화탄소의 경우 과량 공급 시 균주의 성장에 저해를 주게 되는 문제가 있으므로 합성가스 공급량 조절이 필요하다.
또한, 본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 2,3-부탄디올을 생산하는 균주는 클로스트리디움 륭달리(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 클로스트리디움 코스카티(Clostridium coskatii), 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum), 클로스트리디움 카르복시디보란스 P7(Clostridium carboxidivorans P7), 펩토스트렙토코커스 프로덕터스(Peptostreptococcus productus), 및 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum)일 수 있으며, 보다 구체적으로 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum) DSMZ 10061일 수 있으나, 합성 가스를 이용하여 2,3-부탄디올을 생산할 수 있는 균주라면 이에 제한되지 않는다. 상기 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum) DSMZ 10061은 합성 가스를 이용하여 2,3-부탄다이올의 생산이 가능하다는 정도만 연구되었는데, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 균주를 이용하여 합성가스를 이용한 발효를 수행시 에탄올을 첨가하여 고효율로 2,3-부탄디올을 제조할 수 있다.
본 발명에 일 측면에 따른 2,3-부탄디올을 생산하는 균주는 유전자 재조합 여부와 무관하게 어떠한 균주라도 가능하고, 야생형 균주이거나 형질전환 균주일 수 있고, 구체적으로 정상 대조군에 비하여 유전자가 과발현 또는 발현 억제되도록 생명공학적 기술이 적용되지 않은 야생형 균주이거나, 유전자 재조합된 형질전환 균주일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 합성 가스로부터 2,3-부탄디올을 제조하기 위한 것일 수 있고, 즉 2,3-부탄디올 제조는 합성 가스로부터의 제조일 수 있으며, 구체적으로 상기 합성 가스는 일산화탄소, 이산화탄소 및 수소를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 합성 가스는 연속적으로 첨가된 것일 수 있고, 구체적으로 합성 가스 내 일산화탄소 양이 모두 소모되지 않도록 연속적으로 첨가된 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 일산화탄소가 0 kPa 초과로 존재하도록 연속적으로 첨가된 것일 수 있고, 보다 더 구체적으로 1 kPa 이상 존재하도록 연속적으로 첨가된 것일 수 있으며, 보다 더욱더 구체적으로 일산화탄소가 1 kPa 이상, 1.2 kPa 이상, 1.4 kPa 이상, 1.6 kPa 이상, 1.8 kPa 이상, 2 kPa 이상, 2.2 kPa 이상, 2.4 kPa 이상, 2.6 kPa 이상, 2.8 kPa 이상, 3 kPa 이상, 3.2 kPa 이상, 3.4 kPa 이상, 3.6 kPa 이상, 3.8 kPa 이상, 4 kPa 이상, 4.2 kPa 이상, 4.4 kPa 이상, 4.6 kPa 이상, 4.8 kPa 이상 또는 5 kPa 이상 존재하도록 연속적으로 첨가된 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 합성 가스 첨가 시간 간격이 긴 경우보다 짧은 경우 2,3-부탄디올의 생산량이 증가하였는바, 일산화탄소가 5 kPa 이하로 감소되기 전 합성 가스를 추가로 첨가한 경우 2,3-부탄디올의 생산량이 증가함을 확인하였다(실험예 4-1).
본 발명의 일 측면에 따른 합성 가스 첨가량은 0.2 내지 5 bar일 수 있고, 구체적으로 0.2 bar 이상, 0.3 bar 이상, 0.4 bar 이상, 0.5 bar 이상, 0.6 bar 이상, 0.7 bar 이상, 0.8 bar 이상, 0.9 bar 이상, 1 bar 이상, 1.1 bar 이상, 1.2 bar 이상, 1.3 bar 이상, 1.4 bar 이상, 1.5 bar 이상, 1.6 bar 이상, 1.8 bar 이상, 2 bar 이상, 3 bar 이상 또는 4 bar 이상일 수 있고, 5 bar 이하, 4 bar 이하, 3 bar 이하, 2.9 bar 이하, 2.8 bar 이하, 2.7 bar 이하, 2.6 bar 이하, 2.5 bar 이하, 2.4 bar 이하, 2.3 bar 이하, 2.2 bar 이하, 2.1 bar 이하, 2 bar 이하, 1.9 bar 이하, 1.8 bar 이하, 1.7 bar 이하, 1.6 bar 이하, 1.5 bar 이하, 1.3 bar 이하, 1.2 bar 이하, 1 bar 이하 또는 0.5 bar 이하일 수 있으나, 미생물 생장에 필요한 탄소원을 공급할 수 있는 첨가량이라면 제한되지 않으며, 미생물 생장을 저해하지 않고 고압으로 인한 발효 공정 안전성에 문제를 일으키지 않으면서, 합성 가스를 첨가하여 2,3-부탄디올을 생산할 수 있는 합성 가스의 첨가량이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 측면에 따른 2,3-부탄디올 제조는 상기 합성 가스가 첨가된 배지의 교반에 의한 제조일 수 있고, 상기 교반 속도는 50 내지 1000 rpm일 수 있으며, 구체적으로 상기 교반 속도는 50 rpm 이상, 60 rpm 이상, 70 rpm 이상, 80 rpm 이상, 90 rpm 이상, 100 rpm 이상, 110 rpm 이상, 120 rpm 이상, 130 rpm 이상, 140 rpm 이상, 150 rpm 이상, 160 rpm 이상, 180 rpm 이상, 200 rpm 이상, 300 rpm 이상, 400 rpm 이상, 600 rpm 이상 또는 800 rpm 이상일 수 있고, 1000 rpm 이하, 800 rpm 이하, 600 rpm 이하, 400 rpm 이하, 200 rpm 이하, 190 rpm 이하, 180 rpm 이하, 170 rpm 이하, 160 rpm 이하, 150 rpm 이하, 140 rpm 이하, 130 rpm 이하, 120 rpm 이하, 110 rpm 이하, 100 rpm 이하, 90 rpm 이하, 80 rpm 이하 또는 60 rpm 이하일 수 있으나, 미생물 생장을 저해하지 않는 교반 속도로서, 합성 가스를 첨가하여 에탄올을 이용하여 2,3-부탄디올을 생산할 수 있는 교반 속도라면 이에 제한되지 않는다.
다른 측면에서, 본 발명은 유효성분으로서 에탄올을 포함하고, 합성 가스로부터 2,3-부탄디올(butanediol)을 제조하며, 2,3-부탄디올을 생산하는 균주를 배양하기 위한, 2,3-부탄디올 제조용 배지 조성물을 포함하는 배지에 2,3-부탄디올(butanediol)을 생산하는 균주를 접종하는 단계; 및 상기 배지에 합성 가스를 첨가하는 단계를 포함하는, 2,3-부탄디올 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 에탄올을 포함하는 조성물은 상기 배지의총 부피에 대하여 1 내지 25 g/L의 에탄올을 포함할 수 있고, 구체적으로 에탄올은 상기 배지의 총 부피에 대하여 1 g/L 이상, 2 g/L 이상, 3 g/L 이상, 4 g/L 이상, 5 g/L 이상, 6 g/L 이상, 7 g/L 이상, 8 g/L 이상, 9 g/L 이상, 10 g/L 이상, 11 g/L 이상, 12 g/L 이상, 13 g/L 이상, 14 g/L 이상, 15 g/L 이상, 16 g/L 이상, 17 g/L 이상, 18 g/L 이상, 19 g/L 이상, 20 g/L 이상, 21 g/L 이상, 22 g/L 이상, 23 g/L 이상 또는 24 g/L 이상일 수 있고, 25 g/L 이하, 24 g/L 이하, 23 g/L 이하, 22 g/L 이하, 21 g/L 이하, 20 g/L 이하, 19 g/L 이하, 18 g/L 이하, 17 g/L 이하, 16 g/L 이하, 15 g/L 이하, 14 g/L 이하, 13 g/L 이하, 12 g/L 이하, 11 g/L 이하, 10 g/L 이하, 9 g/L 이하, 8 g/L 이하, 7 g/L 이하, 6 g/L 이하, 5 g/L 이하, 4 g/L 이하, 3 g/L 이하 또는 2 g/L 이하일 수 있으나, 미생물 생장을 저해하지 않으면서 에탄올 첨가로 2,3-부탄디올을 생산할 수 있는 양이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 2,3-부탄디올을 생산하는 균주는 아세토젠 균주일 수 있다. 상기 아세토센 균주는 합성 가스를 탄소원과 에너지원으로 이용 가능한 균주이다. 당을 통한 발효 시 해당작용(glycolysis)을 통해 피루빈산염(pyruvate)으로부터 2,3-부탄디올을 합성하고, 또한 피루빈산염(pyruvate)은 아세틸-CoA로 전환되어 에탄올과 아세트산을 생산한다. 합성 가스 이용 시에는 우드-융달 대사경로(Wood-Ljungdahl pathway)를 통해 아세틸-CoA가 합성되고 에탄올과 아세트산을 생산하고, 아세틸-CoA가 피루빈산염으로 전환 후 2,3-부탄디올 생산이 가능하다. 피루빈산염은 2,3-부탄디올 생산에 중간체로 2,3-부탄디올 생산을 위해 필수적이다. 미생물은 합성 가스를 이용하는 경우 아세틸-CoA가 에탄올, 아세트산 등의 생산물이 아닌 피루빈산염로 전환 될 수 있는 방안이 필요하다. 따라서 아세틸-CoA 풀(pool)을 늘려 피루빈산염으로 전환하기 위해 합성 가스의 공급량을 늘려 줄 수 있으며, 이 때 일산화탄소의 경우 과량 공급 시 균주의 성장에 저해를 주게 되는 문제가 있으므로 합성가스 공급량 조절이 필요하다.
또한, 본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 2,3-부탄디올을 생산하는 균주는 클로스트리디움 륭달리(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 클로스트리디움 코스카티(Clostridium coskatii), 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum), 클로스트리디움 카르복시디보란스 P7(Clostridium carboxidivorans P7), 펩토스트렙토코커스 프로덕터스(Peptostreptococcus productus), 및 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum)일 수 있으며, 보다 구체적으로 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum) DSMZ 10061일 수 있으나, 합성 가스를 이용하여 2,3-부탄디올을 생산할 수 있는 균주라면 이에 제한되지 않는다. 상기 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum) DSMZ 10061은 합성 가스를 이용하여 2,3-부탄다이올의 생산이 가능하다는 정도만 연구되었는데, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 균주를 이용하여 합성가스를 이용한 발효를 수행시 에탄올을 첨가하여 고효율로 2,3-부탄디올을 제조할 수 있다.
본 발명에 일 측면에 따른 2,3-부탄디올을 생산하는 균주는 유전자 재조합 여부와 무관하게 어떠한 균주라도 가능하고, 야생형 균주이거나 형질전환 균주일 수 있고, 구체적으로 정상 대조군에 비하여 유전자가 과발현 또는 발현 억제되도록 생명공학적 기술이 적용되지 않은 야생형 균주이거나, 유전자 재조합된 형질전환 균주일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 합성 가스는 일산화탄소, 이산화탄소 및 수소를 포함할 수 있다. 종래 당을 탄소원으로 이용하여 2,3-부탄디올을 생산하는 기술이 존재하나, 이 경우 전처리 공정의 필요, 원료 비용, 식량자원 이용 문제, 가격 등의 문제가 존재한다. 또한, 단일 가스로부터 2,3-부탄디올을 제조하는 경우 단일 가스를 분리하는 별도의 공정이 필요하여 시간 및 비용적으로 비경제적이다. 이에 반해, 본 발명의 일 측면에 따른 제조방법은 에탄올과 합성 가스로부터 2,3-부탄디올을 제조할 수 있어 상기 당을 탄소원으로 이용하였을 때의 문제를 해결할 수 있고 단일 가스 분리 공정이 불필요하여 시간 및 비용 효율적으로 2,3-부탄디올을 높은 수율로 제조 가능한 우수한 효과가 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 합성 가스 첨가 단계는 연속적으로 합성 가스를 첨가하는 것일 수 있고, 구체적으로 2,3-부탄디올 제조 기간 또는 상기 균주 배양 기간 동안 합성 가스 내 일산화탄소가 존재하도록 연속적으로 첨가하는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 일산화탄소가 0 kPa 초과로 존재하도록 연속적으로 첨가된 것일 수 있고, 보다 더 구체적으로 1 kPa 이상 존재하도록 연속적으로 첨가한 것일 수 있으며, 보다 더욱더 구체적으로 일산화탄소가 1 kPa 이상, 1.2 kPa 이상, 1.4 kPa 이상, 1.6 kPa 이상, 1.8 kPa 이상, 2 kPa 이상, 2.2 kPa 이상, 2.4 kPa 이상, 2.6 kPa 이상, 2.8 kPa 이상, 3 kPa 이상, 3.2 kPa 이상, 3.4 kPa 이상, 3.6 kPa 이상, 3.8 kPa 이상, 4 kPa 이상, 4.2 kPa 이상, 4.4 kPa 이상, 4.6 kPa 이상, 4.8 kPa 이상 또는 5 kPa 이상 존재하도록 연속적으로 첨가한 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 합성 가스 첨가 시간 간격이 긴 경우보다 짧은 경우 2,3-부탄디올의 생산량이 증가하였는바, 일산화탄소가 5 kPa 이하로 감소되기 전 합성 가스를 추가로 첨가한 경우 2,3-부탄디올의 생산량이 증가함을 확인하였다(실험예 4-1).
본 발명의 일 측면에 따른 합성 가스 첨가량은 0.2 내지 5 bar일 수 있고, 구체적으로 0.2 bar 이상, 0.3 bar 이상, 0.4 bar 이상, 0.5 bar 이상, 0.6 bar 이상, 0.7 bar 이상, 0.8 bar 이상, 0.9 bar 이상, 1 bar 이상, 1.1 bar 이상, 1.2 bar 이상, 1.3 bar 이상, 1.4 bar 이상, 1.5 bar 이상, 1.6 bar 이상, 1.8 bar 이상, 2 bar 이상, 3 bar 이상 또는 4 bar 이상일 수 있고, 5 bar 이하, 4 bar 이하, 3 bar 이하, 2.9 bar 이하, 2.8 bar 이하, 2.7 bar 이하, 2.6 bar 이하, 2.5 bar 이하, 2.4 bar 이하, 2.3 bar 이하, 2.2 bar 이하, 2.1 bar 이하, 2 bar 이하, 1.9 bar 이하, 1.8 bar 이하, 1.7 bar 이하, 1.6 bar 이하, 1.5 bar 이하, 1.3 bar 이하, 1.2 bar 이하, 1 bar 이하 또는 0.5 bar 이하일 수 있으나, 미생물 생장에 필요한 탄소원을 공급할 수 있는 첨가량이라면 제한되지 않으며, 미생물 생장을 저해하지 않고 고압으로 인한 발효 공정 안전성에 문제를 일으키지 않으면서, 합성 가스를 반복 첨가하여 2,3-부탄디올을 생산할 수 있는 합성 가스의 첨가량이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 측면에 따른 제조방법은 상기 합성 가스가 첨가된 배지를 교반하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 상기 교반 속도는 50 내지 1000 rpm일 수 있으며, 구체적으로 상기 교반 속도는 50 rpm 이상, 60 rpm 이상, 70 rpm 이상, 80 rpm 이상, 90 rpm 이상, 100 rpm 이상, 110 rpm 이상, 120 rpm 이상, 130 rpm 이상, 140 rpm 이상, 150 rpm 이상, 160 rpm 이상, 180 rpm 이상, 200 rpm 이상, 300 rpm 이상, 400 rpm 이상, 600 rpm 이상 또는 800 rpm 이상일 수 있고, 1000 rpm 이하, 800 rpm 이하, 600 rpm 이하, 400 rpm 이하, 200 rpm 이하, 190 rpm 이하, 180 rpm 이하, 170 rpm 이하, 160 rpm 이하, 150 rpm 이하, 140 rpm 이하, 130 rpm 이하, 120 rpm 이하, 110 rpm 이하, 100 rpm 이하, 90 rpm 이하, 80 rpm 이하 또는 60 rpm 이하일 수 있으나, 합성 가스를 반복 첨가하여 2,3-부탄디올을 생산할 수 있는 교반 속도라면 이에 제한되지 않는다. 또한 미생물 생장을 저해하지 않는 교반 속도라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 측면에 따른 제조방법은 상기 배지에 에탄올을 추가로 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 에탄올 추가 첨가 단계는 상기 배지의 총 부피에 대하여 0.2 내지 5 g/L의 에탄올을 1회 이상 반복 첨가하는 것일 수 있고, 상기 에탄올의 반복 첨가는 2,3-부탄디올 제조 기간 또는 상기 균주 배양 기간 동안 합성 가스 내 일산화탄소가 존재하도록 합성 가스를 연속적으로 첨가하면서 에탄올을 반복 첨가하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 배지에 대하여 0.2 g/L 내지5 g/L의 에탄올을 1회 이상 반복 첨가하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 상기 배지에 대하여 0.2 g/L 이상, 0.4 g/L 이상, 0.6 g/L 이상, 0.8 g/L 이상, 1 g/L 이상, 1.2 g/L 이상, 1.4 g/L 이상, 1.6 g/L 이상, 1.8 g/L 이상, 2 g/L 이상, 2.2 g/L 이상, 2.4 g/L 이상, 2.6 g/L 이상, 2.8 g/L 이상, 3 g/L 이상, 3.2 g/L 이상, 3.4 g/L 이상, 3.6 g/L 이상, 3.8 g/L 이상, 4 g/L 이상, 4.2 g/L 이상, 4.4 g/L 이상, 4.6 g/L 이상 또는 4.8 g/L 이상의 에탄올을 1회 이상 반복 첨가하는 것일 수 있고, 5 g/L 이하, 4.8 g/L 이하, 4.6 g/L 이하, 4.4 g/L 이하, 4.2 g/L 이하, 4 g/L 이하, 3.8 g/L 이하, 3.6 g/L 이하, 3.4 g/L 이하, 3.2 g/L 이하, 3 g/L 이하, 2.8 g/L 이하, 2.6 g/L 이하, 2.4 g/L 이하, 2.2 g/L 이하, 2 g/L 이하, 1.8 g/L 이하, 1.6 g/L 이하, 1.4 g/L 이하, 1.2 g/L 이하, 1 g/L 이하, 0.8 g/L 이하, 0.6 g/L 이하 또는 0.4 g/L 이하의 에탄올을 1회 이상 반복 첨가하는 것일 수 있다. 또한, 상기 에탄올을 1회 이상 반복하여 첨가하는 경우, 상기 2,3-부탄디올 제조 기간 또는 상기 균주 배양 기간 동안 합성 가스 내 일산화탄소가 존재하도록 합성 가스를 연속적으로 첨가하면서 에탄올을 반복하여 첨가하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 일산화탄소가 0 kPa 초과로 존재하도록 합성 가스를 연속적으로 첨가하면서 에탄올을 반복하여 첨가하는 것일 수 있고, 보다 더 구체적으로 1 kPa 이상 존재하도록 존재하도록 합성 가스를 연속적으로 첨가하면서 에탄올을 반복하여 첨가하는 것일 수 있고, 보다 더욱더 구체적으로 일산화탄소가 1 kPa 이상, 1.2 kPa 이상, 1.4 kPa 이상, 1.6 kPa 이상, 1.8 kPa 이상, 2 kPa 이상, 2.2 kPa 이상, 2.4 kPa 이상, 2.6 kPa 이상, 2.8 kPa 이상, 3 kPa 이상, 3.2 kPa 이상, 3.4 kPa 이상, 3.6 kPa 이상, 3.8 kPa 이상, 4 kPa 이상, 4.2 kPa 이상, 4.4 kPa 이상, 4.6 kPa 이상, 4.8 kPa 이상 또는 5 kPa 이상 존재하도록 합성 가스를 연속적으로 첨가하면서 에탄올을 반복하여 첨가하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 제조방법은 발효 조건의 조절로 2,3-부탄디올을 제조하는 것일 수 있다. 상기 발효 조건의 조절은 에탄올 첨가, 합성 가스 첨가, 상기 에탄올 또는 합성 가스의 첨가량, 첨가 시간 간격, 교반 속도 등의 발효 조건을 포함할 수 있고, 구체적으로, 사용되는 균주가 유전자 재조합 여부와 무관하게 어떠한 균주, 예컨대 야생형 균주나 형질전환 균주라도 상기와 같은 발효 조건의 조절을 통해 2,3-부탄디올을 제조할 수 있는 것을 포함할 수 있고, 또는 촉매 첨가 없이도 2,3-부탄디올을 제조하는 것을 포함할 수 있다.
또한, 종래 합성 가스에서 수소를 제거한 후 2,3-부탄디올을 생산하는 방법이 있으나, 이러한 수소 제거 공정으로 인해 비용이 증가하는 문제가 있다(US 8,673,603 B2). 본 발명의 일 측면에 따른 제조방법은 수소 제거 공정과 같은 합성 가스의 전처리 공정을 포함하지 않아 그로 인한 비용이 발생하지 않아 경제적으로 유리한 장점이 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실험예 1] 합성 가스를 이용 시 발효 경향 확인
합성 가스를 기질로 하여 미생물 발효를 통해 2,3-부탄디올을 제조하기 위해서, 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum, C. autoethanogenum) DSMZ 10061의 합성 가스 이용 경향 및 및 2,3-부탄디올 생산여부를 확인하기 위하여 다음과 같은 방법으로 합성 가스를 공급해 주고 발효를 진행하였다.
먼저, 총 부피 1 리터당 2 g 효모추출물, 2 g 염화암모늄(NH4Cl), 0.08 g 염화칼슘(CaCl2·2H2O), 0.4 g 황산마그네슘(MgSO4·7H2O), 0.2 g 염화칼륨(KCl), 0.2 g 인산칼륨(KH2PO4), 0.01 g 황산망간(MnSO4·H2O), 0.002 g 몰리브덴산나트륨(NaMoO4·2H2O), 0.2 g 시스테인(Cysteine)를 포함하는 배지에 ATCC medium: 1754 PETC medium의 미량 원소를 첨가하였다. 발효가 진행되는 동안 pH 완충을 위하여 50 mM의 2-[N-모르폴리노]에탄설폰산(MES:(2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid))첨가하였으며, 배지 초기의 pH는 2 M 수산화칼륨(KOH)를 이용하여 pH 6으로 조정하였다.
회분식 배양(batch culture)으로 157 ml 시료병(serum bottle)에 20 ml의 상기 배지를 넣고 상기 균주 C. autoethanogenum DSMZ 10061을 접종한 후 합성 가스를 1.5 bar로 첨가하였다. 합성 가스는 일산화탄소(CO), 이산화탄소(CO2) 및 수소(H2)를 각각 3:3:4 비율로 조정하였다. 진탕 배양기에서 섭씨 37
의 온도 및 150 rpm의 회전 속도로 배양하였으며, 시간에 따라 가스의 소모, 균주의 성장, pH변화 및 생산 물질을 분석하였다.
합성 가스는 열전도성 검출기(thermal conductivity detector (TCD)) (Agilent technology 6890N, USA)를 이용하여 일산화탄소(CO), 이산화탄소(CO2) 및 수소(H2)의 시간에 따른 농도를 변화를 측정하였고, 미생물의 성장은 분광광도계(Cary 60, Agilent Tech nologies; CA, USA)로 600 nm에서 흡광도로 측정하였다. 생산 물질 분석은 가스크로마토그래프(Agilent model 6890N gas chromatograph)를 이용하여 측정하였으며, 그 결과는 도 2a 내지 2c와 같다.
도 2a에 나타난 바와 같이, 총 1.5 bar의 합성 가스(CO:CO2:H2 = 3:3:4) 첨가 시 첨가된 일산화탄소 및 수소를 발효 120시간만에 모두 소모하였으나 이산화탄소의 양은 크게 달라지지 않았다. 이는 일산화탄소가 우드-융달 대사경로(Wood-Ljungdahl pathway)를 통해 이산화탄소로 전환되고, 이산화탄소는 수소와 함께 소모되기 때문에 이산화탄소는 소모와 생산이 동시에 이루어지기 때문이다.
또한, 도 2b에 나타난 바와 같이, 발효를 진행하는 동안 균주는 빠르게 성장하였으나, 당을 통한 발효에서보다 낮은 성장을 보였다. 이는 당을 이용하는 경우 균주의 성장에 필요한 에너지(ATP)의 공급이 해당과정과 아세트산 생산과정에서 공급되는 반면, 합성 가스 이용 시에는 아세트산 생산과정에서만 에너지(ATP)를 공급받게 되기 때문이다. 균주 성장이 높을수록 pH 감소도 증가하였으며, 이는 균주가 성장에 필요한 에너지를 공급받기 위해 아세트산을 생산하고, 생산된 아세트산으로 인하여 pH가 저하된 것이다.
한편, 도 2c에 나타난 바와 같이, 발효과정을 거쳐 생산된 생산 물질은 에탄올과 아세트산으로 확인되었으며, 2,3-부탄디올은 확인되지 않았다. 이것은 아세틸-CoA에서 대사흐름(metabolic flux)이 피루빈산염이 아닌 아세트산 또는 에탄올로 전환되기 때문이며, 이를 극복하기 위해서는 합성 가스의 첨가량이 조절되야함을 확인하였다.
[실험예 2] 교반 속도 및 합성 가스 첨가량에 따른 2,3-부탄디올 생산 여부 확인
발효 시 교반 속도와 합성 가스의 첨가량에 따라 발효 시 배지 내에 합성 가스의 용해 속도가 달라지게 되고, 이로 인하여 균주의 성장 및 생산 물질 달라지게 된다. 도 2c의 합성 가스를 이용한 발효 결과에 따르면, 단순히 합성 가스만을 첨가하는 경우 2,3-부탄디올은 생산하지 않고 에탄올과 아세트산만을 생산함을 확인하였다. 이에, 2,3-부탄디올의 제조를 위하여 발효 조건(교반 속도 및 합성 가스 첨가량)을 달리하여 C. autoethanogenum DSMZ 10061의 2,3-부탄디올 생산을 확인하고자 하였다.
먼저, 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 C. autoethanogenum DSMZ 10061 발효를 수행하되, 상기 합성 가스 첨가량은 1.5 bar과 1.2 bar로 달리 첨가하고, 교반 속도도 150 rpm과 100 rpm로 달리하였으며, 그 결과를 도 3a 내지 3e에 나타내었다.
도 3a 내지 3d에 나타난 바와 같이, 합성 가스 첨가량이 1.5 bar과 1.2 bar인 경우 첨가된 일산화탄소와 수소를 동시에 소모하였으며, 일산화탄소는 첨가량을 모두 소모하였다. 또한, 교반 속도가 150 rpm일 때 일산화탄소의 배지 내로 용해되는 속도는 증가되고 이에 따라 일산화탄소의 소모 속도가 100 rpm인 경우보다 빠르게 소모하였다. 교반 속도를 150 rpm에서 100 rpm으로 느리게 해주는 경우, 합성 가스가 배지 내로 용해되는 속도가 감소하게 되고 이로 인하여 균주는 일산화탄소에 의한 저해를 덜 받게 된다. 일산화탄소에 의한 저해를 덜 받게 되는 100 rpm의 경우 일산화탄소의 소모 속도는 감소하였으나 수소 소모량은 증가되어 발효 종료 시 첨가된 수소를 거의 소모하였다.
또한, 도 3e에 나타난 바와 같이, 발효 종료 시 생산 물질은 에탄올과 아세트산이 주 생산물로 확인되었으며, 첨가된 합성 가스의 첨가량이 증가할수록 에탄올과 아세트산의 생산량이 증가함을 확인하였다. 한편, 합성 가스 첨가량이 1.2 bar인 경우 교반 속도는 에탄올과 아세트산의 생산에 큰 영향을 주지는 않았다. 그러나 합성 가스 첨가량이 1.5 bar인 경우 교반 속도가 150 rpm에서 100 rpm으로 낮춰주었을 때 에탄올 생산량은 0.59 g/L에서 0.76 g/L로, 아세트산 생산량은 3.41 g/L 에서 3.68 g/L로 증가하였다. 이는 교반 속도에 의해 일산화탄소의 용해 속도가 달라져 일산화탄소의 저해를 덜 받게 됨에 따라 수소 소모가 증가되었기 때문이다. 그러나 교반 속도와 합성 가스 첨가량의 변화만으로는 2,3-부탄디올을 제조할 수 없음을 알 수 있었다.
[실험예 3] 합성 가스 연속 첨가, 및 아세트산 또는 에탄올 첨가 시 2,3-부탄디올 생산 여부 확인
상기 실험예 1과 2의 결과를 바탕으로, 합성 가스를 연속적으로 첨가하고 아세트산 또는 에탄올을 발효 초기에 첨가할 때 2,3-부탄디올이 생산되는지 여부를 확인하였다.
[실험예 3-1] 합성 가스 연속 첨가에 따른 2,3-부탄디올 생산 여부 확인
합성 가스 연속 첨가에 의해 균주가 충분한 에너지(ATP)를 이용 가능한 상태가 되도록 하여 아세틸-CoA가 피루빈산염으로 전환되어 2,3-부탄디올을 생산할 수 있는지를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
먼저, 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 C. autoethanogenum DSMZ 10061 발효를 수행하되, 일산화탄소 소모를 기준으로 하여 일산화탄소가 모두 소모되기 전 동일한 조성의 합성 가스를 재 첨가하였으며(이하, 실시예 1-1)(도 4a 내지 4f에서 Control), 그 결과는 도 4a 및 4d 내지 4f와 같다.
도 4a에 나타난 바와 같이, 발효 진행 시 연속적으로 합성 가스를 추가 공급해준 결과 일산화탄소와 수소를 동시에 소모하면서 발효가 진행되었다. 또한, 도 4d에 나타난 바와 같이, 합성 가스 연속 공급 결과 발효 종료 시 (발효 336시간) 0.32 g/L의 2,3-부탄디올이 생산되었다. 즉, 합성 가스를 연속적으로 첨가해줌으로써 균주가 충분한 에너지를 확보하고 아세틸-CoA를 피루빈산염으로 전환시켜 2,3-부탄디올을 생산할 수 있었던 것으로 추정되며, 이를 통해 2,3-부탄디올 제조를 위해서는 충분한 양의 합성 가스가 첨가되어야 함을 알 수 있었다.
[실험예 3-2] 아세트산 또는 에탄올 첨가에 따른 2,3-부탄디올 생산 여부 확인
우드-융달 대사경로(Wood-Ljungdahl pathway)의 주 생산 물질인 아세트산 또는 에탄올의 첨가에 의해 대사과정에서 생성된 아세틸-CoA가 아세트산과 에탄올이 아닌 피루빈산염으로 대사의 흐름이 집중되어 2,3-부탄디올 생산이 증가할 수 있는지를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
먼저, 상기 실험예 3-1과 동일한 방법으로 C. autoethanogenum DSMZ 10061 발효를 수행하되, 아세트산을 아세트산나트륨(C2H3NaO2)을 이용하여 배지에 대하여 아세트산이 2 g/L가 되도록 발효 초기에 첨가하고(이하, 실시예 1-2)(도 4b에서 adding acetate 2 g/L, 도 4d 내지 4f에서 AA 2 g/L), 에탄올은 배지에 대하여 1 g/L가 되도록 발효 초기에 첨가하였으며(이하, 실시예 1-3)(도 4c에서 adding EtOH 1 g/L, 도 4d 내지 4f에서 EtOH 1 g/L), 그 결과는 도 4b 내지 4f와 같다.
도 4b 및 4c에 나타난 바와 같이, 아세트산 또는 에탄올의 첨가에 의해 일산화탄소의 소모는 저하되지 않았다.
또한, 발효 초기 아세트산의 첨가(실시예 1-2)는 아세트산을 첨가하지 않은 경우(실시예 1-1)보다 아세트산 생산량이 감소하고, 이에 아세트산 생산이 줄어든 만큼 탄소 흐름이 에탄올 또는 2,3-부탄디올의 생산 증가에 이용될 것을 기대하였으나, 도 4b 및 4d 내지 4f에 나타난 바와 같이, 합성 가스의 소모 및 생산 물질에 큰 차이를 보이지 않았다. 당을 이용하여 2,3-부탄다이올을 생산하는 호기성 미생물의 경우 아세트산을 첨가하면 CoA transferase에 의해 첨가된 아세테이트가 2,3-부탄디올로 전환이 되어 C2 이상의 생산 물질의 생산을 증가 시킨다는 보고가 있다(KR 10-2016-0123108 A). 그러나 아세토젠 균주의 경우 발효 초기에 아세트산을 첨가해도 탄소 흐름이 아세틸-CoA에서 피루빈산염으로 전환되는 것이 증가되지 않고, 따라서 2,3-부탄디올 생산도 증가하지 않은 것이다. 이는 합성 가스를 이용한 대사과정에서 미생물이 성장에 필요한 에너지(ATP)를 아세트산 생산을 통해 얻을 수 있기 때문에 아세트산 생산 경로로 탄소흐름이 집중되기 때문인 것으로 추정된다. 미생물은 생장을 위해 아세트산의 첨가 유무와 관계없이 아세트산을 생산하여, ATP를 얻고 이를 이용해 생장한다. 따라서 아세트산을 첨가하지 않은 실시예 1-1(도 4a 내지 4f의 Control; 2,3-부탄디올 생산량 0.38 g/L, 에탄올 생산량 0.88 g/L, 아세트산 생산량 9.34 g/L)과, 아세트산을 첨가한 실시예 1-2의 각 생산 물질의 생산량은 유사하였다(도 4b 및 도 4d 내지 4f의 AA 2 g/L; 2,3-부탄디올 생산량 0.38 g/L, 에탄올 생산량 0.98 g/L, 아세트산 생산량(발효 336시간 아세트산 - 발효 0시간 아세트산) 8.83 g/L).
한편, 도 4d 및 4e에 나타난 바와 같이, 에탄올 첨가 시 발효 48 시간 만에 첨가해준 에탄올이 0.38 g/L(에탄올 첨가량의 35.19%)만큼 감소하면서 2,3-부탄디올이 발효 초기부터 빠르게 생산됨을 확인하였다. 더불어 에탄올을 첨가한 실시에 1-3(도 4d의 EtOH 1 g/L)은 발효 종료 시 0.80 g/L의 2,3-부탄디올을 생산하여 에탄올을 첨가하지 않은 실시예 1-1(도 4d의 Control)과 비교할 때 2,3-부탄디올 생산량이 2.5배 향상하였다. 즉, 에탄올의 첨가는 합성 가스의 소모에는 영향을 주지 않으면서, 첨가된 에탄올이 미생물 내에서 전환을 통해 아세틸-CoA 로 전환되면서 환원력 (NADH)가 증가하고, 증가된 환원력(NADH)이 2,3-부탄디올 생산에 집중적으로 사용되었으며, 이로부터 2,3-부탄디올의 생산성을 향상시켰다. 반면, 에탄올을 첨가하지 않은 실시예 1-1의 경우는 환원력이 필요한 2,3-부탄다이올과 에탄올 생산에 환원력이 경쟁적으로 사용되고, 따라서 2,3-부탄다이올 생산으로 환원력이 집중되지 않는 것으로 추정된다. 합성가스 없이 에탄올만 첨가한 경우 미생물 생장은 없었으며 2,3-부탄디올도 생산되지 않았다. 즉, 합성가스 배양 시 에탄올을 첨가하면 2,3-부탄디올 생산 경로로 탄소흐름을 이동(shift)시키는 효과가 있음을 확인하였다.
[실험예 4] 에탄올 첨가량 및 합성 가스 연속 첨가에 따른 2,3-부탄디올 생산량 변화 확인
상기 실험예 3을 통해, 발효 초기 에탄올을 첨가하는 것은 에탄올의 소모 및 2,3-부탄디올의 생산을 증가시키는 것을 확인하였다. 이에, 에탄올 첨가량과 합성 가스 연속 공급에 따른 2,3-부탄디올 생산량에 영향을 미치는 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
[실험예 4-1] 합성 가스 연속 첨가에 따른 2,3-부탄디올 생산량 변화 확인
합성 가스를 이용하여 발효를 진행하는 동안 합성 가스 내의 일산화탄소 유지량을 늘려 2,3-부탄디올 생산량의 변화를 확인하기 위하여, 상기 실험예 3-1와 동일한 방법으로 C. autoethanogenum DSMZ 10061 발효를 수행하되, 합성 가스 내 일산화탄소 기준 5 kPa 이하로 감소 되기 전 합성가스를 추가 공급하였다.
그 결과, 합성 가스 첨가 시간 간격(48시간)이 긴 경우 발효 336 시간에 0.32 g/L의 2,3-부탄디올을 생산하였지만(도 4a 및 4d), 합성 가스 첨가 시간 간격 (24시간)이 짧은 경우 192 시간만에 2,3-부탄디올을 1.62 g/L(도 5a 및 5e)로 생산하였는바, 합성 가스의 연속 첨가를 통해 일산화탄소의 첨가 및 유지량이 증가될수록 2,3-부탄디올의 생산량이 증가함을 확인하였다.
이를 통해, 합성 가스의 조성과 첨가량이 동일하다고 하여도 합성 가스 내에 일산화탄소 유지량에 따라 2,3-부탄디올의 생산량이 향상될 수 있음을 알 수 있었다. 이에 에탄올 첨가량에 따른 2,3-부탄디올 생산량 확인 시 합성가스 재공급 시간을 짧게 하여 실험을 진행하였다.
[실험예 4-2] 에탄올 첨가량에 따른 2,3-부탄디올 생산량 변화 확인
먼저, 발효 초기의 에탄올 첨가량을 증가시키는 경우 2,3-부탄디올의 생산성이 향상되는지를 확인하고자 다음의 실험을 수행하였다. 더불어 발효 초반 과량의 에탄올 첨가는 미생물 생장에 저해를 줄 수 있으므로 미생물의 생장 및 합성 가스 소모에 저해를 주지 않는 저농도의 에탄올을 발효가 진행되는 동안 추가할 때 에탄올에 의한 저해를 줄이면서 2,3-부탄디올의 생산성을 향상시킬 수 있는지 확인하였다.
상기 실험예 4-1과 동일한 방법으로 C. autoethanogenum DSMZ 10061 발효를 수행하되, 발효 초기에 에탄올을 배지에 대하여 1 g/L (이하, 실시예 2-2)(도 5b, 및 도 5e 및 도 5f의 EtOH 1 g/L refeeding), 2 g/L (이하, 실시예 2-3)(도 5c, 및 도 5e 및 도 5f 의 EtOH 2 g/L) 및 5 g/L (이하, 실시예 2-4)(도 5d 내지 도 5f의 EtOH 5 g/L)이 되도록 첨가하였으며, 상기 실시예 2-2의 경우, 발효가 진행됨에 따라 일산화탄소가 모두 소모되기 전, 구체적으로 0 kPa 초과일 때, 보다 구체적으로 5 kPa 이상일 때 합성가스를 연속적으로 공급하면서 에탄올을 배지에 대하여 1 g/L씩 첨가하여 발효 진행 동안 총 4 g/L의 에탄올을 첨가하였다. 이 때, 에탄올을 첨가하지 않은 경우를 실시예 2-1(도 5a의 Control, 도 5e 및 도 5f의 Control(w/o EtOH)으로 하였으며, 그 결과는 도 5a 내지 5f와 같다.
도 5a 내지 5d에 나타난 바와 같이, 에탄올의 첨가량과 관계없이 발효 초반에는 빠르게 일산화탄소와 수소를 소모하였다. 발효 기간 동안 소모된 일산화탄소의 양은 실시예 2-1은 153.11 kPa, 실시예 2-2는(에탄올 1 g/L씩 반복 첨가) 145.44 kPa, 실시예 2-3은(에탄올 2 g/L 첨가) 148.56 kPa, 및 실시예 2-4는(에탄올 5 g/L 첨가) 128.81 kPa이었다. 특히, 에탄올 첨가량이 늘어남에 따라 일산화탄소의 소모량이 감소하였으며, 실시예 2-4(5 g/L의 에탄올 첨가)의 발효 기간 동안 소모된 일산화탄소 소모량은 일산화탄소 소모량은 실시예 2-1에 비해 15.87%인 24.3 kPa 감소하였다. 이로써, 5 g/L 이상의 에탄올 첨가 시에는 균주의 성장을 고려할 필요가 있음을 확인하였다. 또한, 아세트산 또는 에탄올의 첨가에 의해 일산화탄소의 소모는 저하되지 않았다.
또한, 도 5e 내지 도 5f에 나타난 바와 같이, 발효 48 시간 경과 시, 실시예 2-1(에탄올 미첨가)은 0.13 g/L의 2,3-부탄디올을 생산하였으며, 실시예 2-2(에탄올 1 g/L 첨가)는 0.29 g/L의 2,3-부탄디올을 생산하였다. 반면, 발효 48 시간 경과 시, 실시예 2-3(2 g/L 에탄올 첨가)는 0.60 g/L의 2,3-부탄디올을, 실시예 2-4(5 g/L 에탄올 첨가)는 1.67 g/L의 2,3-부탄디올을 생산하였는바, 실시예 2-4(에탄올 5 g/L 첨가)는 실시예 2-1(에탄올 미첨가)에 비교하여 2,3-부탄디올 생산량이 12.85배 향상되었다(도 5g).
이를 통해, 첨가되는 에탄올의 양이 증가할수록 2,3-부탄디올 생산량이 증가함을 확인하였다.
한편, 도 5f 및 도 5g를 살펴보면, 실시예 2-1(에탄올 미첨가, Control(w/o EthOH))의 경우 발효가 진행됨에 따라 에탄올을 생산하여 발효 종료 시 3.14 g/L(에탄올 생산량 = 192시간 에탄올 농도 - 1시간 에탄올 농도)의 에탄올을 생산하였으며, 에탄올을 첨가한 실시예 2-2 내지 2-4는 발효 48 시간까지의 에탄올의 양이 첨가한 에탄올의 32.31 내지 40.66%만큼 감소되었다(도 5g). 발효 48 시간 이후 발효가 진행됨에 따라 에탄올이 생산되어 실시예 2-2(1 g/L씩 에탄올 반복 첨가)와 실시예 2-3(2 g/L의 에탄올 첨가)의 경우 각각 1.40 g/L, 1.25 g/L의 에탄올을 생산하였다. 이는 탄소원인 합성 가스와 합성 가스의 대사과정에서 생산되는 환원력이, 2,3-부탄디올과 에탄올 생산에 동시에 소모되고 있는 것으로, 2,3-부탄디올 생산 측면에서 보면 효율이 낮아지는 것이다. 반면, 실시예 2-4(5 g/L 에탄올 첨가)는 발효 초기의 에탄올 농도가 4.58 g/L, 발효 종료 시 에탄올 농도가 4.16 g/L로 감소되었는데, 이를 통해 발효 초기 고농도의 에탄올 첨가는 일산화탄소의 소모에 저해를 주지만 발효 초기의 에탄올 감소로 2,3-부탄디올의 생산 속도 및 생산량이 향상되어 2,3-부탄디올의 생산성이 향상됨을 알 수 있었다.
종합적으로, 2,3-부탄디올(butanediol)을 생산하는 균주가 접종된 배지에 합성 가스를 연속적으로 첨가하는 경우, 미생물의 유전자 조작이나 촉매 등의 기술 없이도 2,3-부탄디올을 제조할 수 있고, 특히 상기 합성 가스 내 일산화탄소 잔량, 합성 가스의 공급량 및 배지의 교반 속도를 조정함으로써 2,3-부탄디올의 생산성을 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다. 또한, 합성 가스의 연속적인 첨가 외에도, 상기 배지에 에탄올을 첨가하는 경우 에탄올을 이용하여 2,3-부탄디올을 제조할 수 있고, 에탄올의 첨가량을 조정하여 2,3-부탄디올의 생산성을 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.
Claims (10)
- 2,3-부탄디올(butanediol) 제조용 배지 조성물로서,
상기 조성물은 유효성분으로서 에탄올을 포함하고,
상기 2,3-부탄디올 제조는 합성 가스로부터의 제조이고,
상기 조성물은 2,3-부탄디올을 생산하는 균주를 배양하기 위한, 2,3-부탄디올 제조용 배지 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 2,3-부탄디올을 생산하는 균주는 클로스트리디움 륭달리(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 클로스트리디움 코스카티(Clostridium coskatii) 및 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 2,3-부탄디올 제조용 배지 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 에탄올은 상기 배지 조성물이 포함되는 배지의 총 부피에 대하여 1 내지 25 g/L인, 2,3-부탄디올 제조용 배지 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 합성 가스는 일산화탄소, 이산화탄소 및 수소를 포함하는, 2,3-부탄디올 제조용 배지 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 합성 가스는 연속적으로 첨가되는 합성 가스인, 2,3-부탄디올 제조용 배지 조성물. - 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 배지에 2,3-부탄디올(butanediol)을 생산하는 균주를 접종하는 단계; 및
상기 배지에 합성 가스를 첨가하는 단계를 포함하는, 2,3-부탄디올 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 합성 가스 첨가량은 0.2 내지 5 bar인, 2,3-부탄디올 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 합성 가스 첨가 단계는 일산화탄소가 1 kPa 이상 존재하도록 합성 가스를 첨가하는 것인, 2,3-부탄디올 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 제조방법은 상기 합성 가스가 첨가된 배지를 교반하는 단계를 추가로 포함하고,
상기 교반 속도는 50 내지 400 rpm인, 2,3-부탄디올 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 제조방법은 상기 배지의 총 부피에 대하여 0.2 내지 5 g/L 의 에탄올을 1회 이상 추가로 첨가하는 단계를 더 포함하는, 2,3-부탄디올 제조방법.
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