CN106460020B - 酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于从木质纤维素材料制备发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：·a)任选地，预处理所述木质纤维素材料，·b)任选地，清洗所述任选地预处理的木质纤维素材料，·c)使用包含至少两种纤维素酶的酶组合物酶促水解所述任选地经清洗的和/或任选地经预处理的木质纤维素材料，并且其中所述酶组合物至少包含LPMO，以及任选地纯化所述经水解的木质纤维素材料，·d)发酵所述经水解的木质纤维素材料以产生发酵产物，以及·e)任选地，回收发酵产物，其中通过在所述预处理之后且在所述酶促水解之前和/或期间向所述木质纤维素材料中添加适合量的氧，将通过LPMO对含有纤维素和/或纤维寡糖的木质纤维素材料的氧化而形成的经水解的氧化产物葡糖酸在酶促水解结束时的量保持在3至80g/kg存在于木质纤维素材料中的葡聚糖之间，优选地所形成的经水解的氧化产物是葡糖酸、醛糖酸和/或偕二醇，更优选地经水解的氧化产物是葡糖酸。

Description

酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法
发明领域
本发明涉及用于木质纤维素材料的酶促水解和糖的发酵的方法。
发明背景
在本文中也被称之为原料的木质纤维素植物材料为可再生能源，其为可被转化为有价值的产物如糖或生物燃料例如生物乙醇的糖的形式。在该过程中，存在于原料中的(木质或半)纤维素如麦秆、玉米秸秆、稻壳等通过(半)纤维素分解酶被转化成还原性糖，其随后可通过微生物如酵母、细菌和真菌被任选地转化成有价值的产物，如乙醇。
由于(半)纤维素为结晶的且被截留在木质素网状物中，因此至还原性糖的转化通常是慢且不完全的。通常情况下，未处理原料的酶促水解产生<20％的理论量的糖。通过应用化学和热物理预处理，(半)纤维素对于(半)纤维素分解酶更可及，且因此转化更快且产量更高。
来自从预处理的玉米秸秆得到的葡萄糖的通常的乙醇产量为每1000kg的干玉米秸秆40加仑的乙醇(Badger,P,Ethanol from cellulose:a general review,Trends innew crops and new uses,2002,J.Janick和A.Whipkey(编)ASHS Press,Alexandria,VA)或每g原料0.3g乙醇。纤维素基的乙醇的最大产量大约为90％。
纤维素分解酶-它们中的大多数是由物种如Trichoderma、Humicola和Aspergillus产生的-被商用于将预处理的原料转化成含有不可溶的(半)纤维素、由其制成的还原性糖和木质素的糊状物。从Rasamsonia得到的热稳定性纤维素分解酶已被用于降解木质纤维素原料且已知这些酶具有热稳定性，见WO 2007/091231。所产生的糊状物用于发酵中，在发酵期间，还原性糖被转化成酵母生物质(细胞)、二氧化碳和乙醇。以这种方式产生的乙醇被称为生物乙醇。
从预处理的木质纤维素原料进行的糖的一般生产，也被称之为液化、预糖化或糖化的水解，通常发生在45至50℃的升高温度和非无菌条件下持续6至168小时(Kumar,S.Chem.Eng.Technol.32(2009)517-526)的过程中。在该水解期间，所存在的纤维素被部分(通常为30至95％，这可取决于酶的活性和水解条件)转化成还原性糖。在酶被存在于预处理的原料中的化合物和释放的糖抑制以及在使热灭活尽可能少的情况下，尽可能地减少该升高温度的时间段。
在水解之后的发酵在相同或不同的容器中发生在单独的优选为厌氧的方法步骤中，其中温度被调整至30至33℃(中温方法(mesophilic process))以适应通过微生物生物质通常为酵母进行的生长和乙醇生产。在该发酵方法中，剩余的(半)纤维素材料通过已从水解步骤存在的酶被转化成还原性糖，且同时产生微生物生物质和乙醇。一旦(半)纤维素材料被转化成可发酵糖且所有可发酵糖被转化成乙醇、二氧化碳和微生物细胞，则发酵完成。这可进行长达6天。在一般情况下，水解和发酵的总处理时间可长达13天。
如此获得的经发酵糊状物由不可发酵的糖、不可水解的(半)纤维素材料、木质素、微生物细胞(最常见为酵母细胞)、水、乙醇、溶解的二氧化碳组成。在后续的步骤中，将乙醇从糊状物蒸馏出来并进一步地纯化。干燥剩余的固体悬浮液并将其用作例如，燃烧燃料、肥料或牛饲料。
WO2010/080407提出在厌氧条件下用纤维素酶组合物处理纤维素材料。去除或排除反应性氧类可提高纤维素水解酶***的性能。通过酶组合物进行的纤维素材料例如木质纤维素的水解可通过对酶组合物的成分的氧化损伤和/或通过例如分子氧进行的纤维素材料的氧化而减少。
WO2009/046538公开了一种用于处理木质纤维素原料植物材料以释放可发酵糖的方法，其使用在真空下处理材料的酶促水解方法并产生富糖处理流，其包含减少的量的挥发性糖/发酵抑制化合物，如糠醛和乙酸。除了去除挥发性的抑制性化合物外，还去除其他化合物和/或分子包括氮、氧、氩和二氧化碳。
对于每批原料，添加酶以使产量和在给定的处理时间内从预处理的木质纤维素原料释放出可发酵糖的速率最大化。在一般情况下，用于酶生产的成本、原料到乙醇的产率和投资是总生产成本中的主要成本因素(Kumar,S.Chem.Eng.Technol.32(2009)517-526)。迄今，酶使用成本的减少是通过应用源于单个或多个微生物来源(WO2008/008793)的酶产物而实现的，该微生物来源具有更广泛和/或更高(比)水解活性，其使用的目的是更低的酶需求、更快地转化速率和/或更高的转化产量，从而具有整体更低的生物乙醇生产成本。这需要对这些酶产物的研究和开发进行大量投资。在酶产物是由源于多个微生物来源的酶构成的情况下，需要大量的资本投资以生产各单酶化合物。
因此期望提高上述涉及水解和发酵的方法。
发明概述
因此，本发明的一个目的是提供这样的方法，其中水解步骤在改进的条件下进行。本发明的另一个目的是提供这样的方法，其涉及处理时间减少的水解。本发明的再一目的是提供这样的方法，其中酶剂量可以减少并且同时有用水解产物的输出保持在相同水平或甚至提高。另一个目的是提供涉及水解的方法，其中水解的处理条件被优化。本发明的又一个目的是提供涉及水解的方法，其中使用相同的酶剂量使有用水解产物的输出增加。根据本发明达到这些目的中的一个或多个。
本发明提供了用于从木质纤维素材料制备糖产物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)任选地，预处理所述木质纤维素材料，
b)任选地，清洗所述任选地预处理的木质纤维素材料，
c)使用包含至少两种纤维素酶的酶组合物酶促水解所述任选地经清洗的和/或任选地经预处理的木质纤维素材料，其中所述酶组合物至少包含LPMO，以及
d)任选地，回收含葡萄糖的组合物，
其中通过在所述预处理之后且在所述酶促水解之前和/或期间向所述木质纤维素材料中添加适合量的氧，将通过LPMO对含有纤维素和/或纤维寡糖的木质纤维素材料的氧化而形成的葡糖酸在酶促水解结束时的量保持在3至80g/kg存在于木质纤维素材料中的葡聚糖之间。
此外，本发明提供了用于从木质纤维素材料制备发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)任选地，预处理所述木质纤维素材料，
b)任选地，清洗所述任选地预处理的木质纤维素材料，
c)使用包含至少两种纤维素酶的酶组合物酶促水解所述任选地经清洗的和/或任选地经预处理的木质纤维素材料，其中所述酶组合物至少包含LPMO，以及任选地纯化所述经水解的木质纤维素材料，
d)发酵所述经水解的木质纤维素材料以产生发酵产物，以及
e)任选地，回收发酵产物，
其中通过在所述预处理之后且在所述酶促水解之前和/或期间向所述木质纤维素材料中添加适合量的氧，将通过LPMO对含有纤维素和/或纤维寡糖的木质纤维素材料的氧化而形成的葡糖酸在酶促水解结束时的量保持在3至80g/kg存在于木质纤维素材料中的葡聚糖之间。
木质纤维素材料被LPMO氧化产生经氧化的多糖，在水解期间所述多糖被水解为葡萄糖和经氧化的葡萄糖单元(如葡糖酸)或二醇等。通常，1分子氧(O2)给出1mol氧化产物。氧还可以被原料(例如木质素)占用。
优选地，所述氧在酶促水解步骤c)期间添加。
在一个优选实施方式中，所述氧以(气)泡的形式添加。
出人意料地，根据本发明，通过添加氧可达到许多工艺优势，包括最佳温度条件、减少的处理时间、减少的酶剂量、酶的重复使用、更高的产率以及其他过程优化，从而导致成本降低。
在此方法的一个实施方式中，发酵时间是5至120小时。在一个实施方式中，使用的稳定的酶组合物保持活性30小时或更久。根据再一个实施方式，优选地在45℃或更高的温度下，更优选地在50℃或更高的温度下并且仍更优选地在55℃或更高的温度下进行水解。在一个优选实施方式中，所述酶组合物源于真菌，优选Rasamsonia属的微生物，或者所述酶组合物包含真菌酶，优选Rasamsonia酶。将在下文更加详细地说明本发明的方法。
发明详述
贯穿本说明书和所附权利要求书，词语“包括”和“包含”及其变型均被解释为包括性的。即，在上下文允许的情况下，这些词语旨在传达可包括未具体指出的其他元件或整体。在本文中不使用数量词修饰时指代一个或多于一个的(即，一个或至少一个的)语法对象。举例来说，“元件”可表示一个元件或多于一个的元件。
在本发明的背景下，“提高的”、“增加的”、“减少的”被用于指示，与除了未添加额外的氧以外相同的情况、方法或处理条件相比，本发明示出了优点。在本发明的背景下，“在相同的条件下测量”或“在相同的条件下分析”等表示，本发明的方法和未添加氧的相同方法是在相同的条件下(除了添加氧外)进行的，且如果与没有氧添加的方法相比，本方法的结果是使用相同的条件测量的，优选为使用相同的测定和/或方法进行，更优选为在相同或平行实验中进行的。水解的条件是这种条件的一个示例。
在现有技术中，建议通过在酶促水解期间使用厌氧(WO2010/080407)或真空(WO2009/046538)条件而提高纤维素分解材料的水解。在两个文件的方法中，氧水平被降低。令人惊讶地，现在已发现本发明的水解示出导致改进的反应产物，其与其中不添加氧的方法相比，在水解后的发酵中给出更高量(还原的)糖产物和/或期望的发酵产物。在一般情况下，观测到葡萄糖转化的增加为5至15w/w％。
可用几种方式添加氧。例如，氧可作为氧气、富氧气体如富氧空气或空气而添加。可连续或不连续地添加氧。“添加”氧表示氧被添加至水解反应器中的液相(包含木质纤维素材料)，而不是氧存在于液相上方的反应器顶部空间中，因而，氧必须从顶部空间扩散至液相。优选地，氧在水解反应器的液相(包含木质纤维素材料)中添加或生成。因此，优选地，氧作为气泡添加，最优选为作为小的气泡添加。在一个实施方式中，气泡的直径为至少0.5mm、至少1mm、至少1.5mm、至少2mm、至少2.5mm、至少为3mm、至少3.5mm、至少4mm、至少为4.5mm、至少为5mm。在一个实施方式中，气泡的直径在0.5mm和500mm之间，优选为0.5mm和400mm之间，0.5mm和300mm之间，0.5mm和200mm之间，0.5mm和100mm之间。
发明人提出了以下假设，即在(酶促)水解(步骤)中，将无定形和结晶多糖或纤维素水解为糖(如葡萄糖)。无定形多糖例如被内切葡聚糖酶转化为寡糖，这之后所述寡糖可以被纤维二糖水解酶(CBH)和β-葡糖苷酶(BG)转化为葡萄糖。结晶多糖的转化可以并行地或顺序地进行，并且即使当大部分无定形多糖被水解时继续。根据本发明假设，尤其是与LPMO组合添加氧在结晶多糖的水解期间是有益的，例如在将多糖降解为寡糖中。因此，添加氧是非常有用的，尤其是在结晶多糖被酶转化的阶段。在此阶段之外，不添加氧或添加较少的氧可以更有效。这个假设仅仅作为发明人所注意到的效果的可能解释给出，并且本发明并不因这个理论的正确性而成立或不成立。
结晶葡聚糖结构可通过溶解性多糖单加氧酶(LPMO)打开。该类型的酶通过氧化糖苷键并使其可用于其他纤维素分解酶而进一步地将寡糖水解为葡萄糖而打开该结构。
大多数已知的LPMO形成醛糖酸，即在裂解位点的末端糖的C1位置被氧化的产物。该氧化的葡萄糖单元是在水解期间作为葡萄糖酸释放的。此外，已报道了在裂解位点非还原葡萄糖单元的C4和C6的氧化。例如，T.Isaksen等(参见上文)报道了非还原末端结构C4位置的氧化在C4位置上产生酮糖，其与水溶液中的C4偕二醇相平衡。本发明人提出水解的氧化产物如葡萄糖酸为在木质纤维素水解中施加的LPMO的性能的量度。
出人意料地，本发明人已经发现最佳木质纤维素水解(多于70％葡聚糖转化)与上文提及的氧化产物(像例如葡糖酸)的最佳形成息息相关。显而易见的是，仅当(结晶)纤维素和纤维寡糖被最佳地水解时才可以实现最佳木质纤维素水解。在LPMO作用下的这种最佳水解将导致形成氧化产物(像葡糖酸)。无氧化产物意味着(结晶)葡聚糖的水解效率较低。然而，过高水平的氧化产物(像葡糖酸)将以葡萄糖为代价，并且因此基于(起始)葡聚糖的葡萄糖产率将下降。有利地通过在所述预处理之后且在所述酶促水解之前和/或期间向所述木质纤维素材料中添加适合量的氧，将通过LPMO氧化纤维素和/或纤维寡糖形成的经水解的氧化产物的量保持在3至110g/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖之间。优选地，氧化产物是醛糖酸和/或偕二醇，更优选地经水解的氧化产物是葡糖酸。优选地，将通过氧化纤维素和/或纤维寡糖形成的经水解的氧化产物的量保持在4至80g/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖之间，更优选地5至60g/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖之间，甚至更优选地6至40g/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖之间，仍更优选地7至30g/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖之间并且最优选地8至25g/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖之间。在另一个实施方案中，将通过氧化纤维素和/或纤维寡糖形成的葡糖酸的量保持在3至110g/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖之间，优选地3至80g/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖之间，优选地3至75g/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖之间，优选地3至70g/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖之间，优选地3至65g/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖之间，优选地3至60g/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖之间，优选地3至50g/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖之间，优选地4至50g/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖，更优选地4至30g/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖，甚至更优选地4至20g/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖并且最优选地5至10g/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖。
通过根据本发明的方法，有利地获得更高的葡萄糖产率。添加更高量的氧将导致更多的产生的葡糖酸而非葡萄糖的产物，另一方面在更低量氧的情况下，LPMO不能最佳地起作用。此外，应注意的是，过高量的氧化产物(如葡糖酸)可抑制纤维素酶或半纤维素酶，或在随后发酵水解物的情况下，葡糖酸可通过抑制发酵中使用的微生物(如酵母)而对发酵具有负面影响。以上量是水解结束时的量。
通常，在预处理之后且在酶促水解之前和/或期间向所述木质纤维素材料中添加的氧的量可以按若干方式控制或改变。通过仅在部分水解时间期间添加氧来限制供应的氧是可行的。另一种选择是通过例如使用空气和循环空气(离开水解反应器的空气)的混合物或通过用惰性气体“稀释”空气来添加低浓度的氧。可以通过在更长的水解时间段期间添加氧、通过添加更高浓度的氧或通过添加更多的空气来增加添加的氧的量。用于改变摄氧量的另一种选择是改变水解温度，较高的温度将在反应器内容物中导致较低的氧最大饱和浓度。用于管理氧浓度的另一种方式是添加耗氧物或产氧物。在酶可被氧的存在或添加损害的情况下，可以使用较温和的氧供应。在这种情况下，可以在改进的葡萄糖生产与酶性能之间找到平衡。可以在酶促水解之前和/或期间向纤维素分解材料中添加氧。在以气态形式添加氧的情况下，含氧气体可以被引入，例如吹入纤维素分解材料的液体水解反应器内容物中。在本发明的另一个实施方式中，含氧气体被引入将进入水解反应器的液体纤维素分解材料流中。在本发明的仍另一个实施方式中，含氧气体与进入水解反应器的纤维素分解材料或与经过反应器外环的部分液体反应器内容物一起被引入。在大多数情况下，进入水解反应器之前添加氧并不是足够的，还可以在水解期间添加氧。在本发明的另一个实施方式中，用含氧气体连续地或不连续地更新存在于反应器上部(顶部空间)中的气相。在后一种情况下，需要(剧烈)混合或搅拌以使氧作为泡和/或通过扩散进入液体反应器内容物，优选地与反应器中的超压组合。通常，对于尺寸高达100升至1m3的反应器而言，与(剧烈)混合或搅拌组合，用空气吹入顶部空间可以将足够的氧引入水解反应器中的纤维素材料中。在更大规模时，例如在50m3或更大(例如100m3)的反应器中，剧烈搅拌需要如此多的能量以至于从经济学角度来看这将无法应用于商业操作方法中。
如本文描述的，通过在所述预处理之后且在所述酶促水解之前和/或期间向所述木质纤维素材料中添加适合量的氧，将通过LPMO对含有纤维素和/或纤维寡糖的木质纤维素材料的氧化而形成的葡糖酸在酶促水解结束时的量保持在3至80g/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖之间。在一个实施方案中，“适合量的氧”是20-10,000mmol氧/kg葡聚糖，优选地30-5,000mmol氧/kg葡聚糖，更优选地40-4,000mmol氧/kg葡聚糖并且最优选地50-3,500mmol氧/kg葡聚糖。氧的量是在酶促水解期间添加的氧的完整量。
根据本发明，可以在水解步骤之前、部分水解步骤期间、整个水解步骤期间或者水解步骤之前或期间的组合中添加氧。有利地，在水解步骤的前半段期间添加氧。可以在例如出现酶的氧化损伤的情况下仅在部分水解期间添加氧。在存在于水解反应器内容物或者在水解步骤中形成的糖产物或水解物中的氧可能在后续发酵步骤中造成影响或产生干扰的情况下，可以在除了水解的最后部分之外添加氧，因此(大部分)氧在经水解的生物质进入发酵反应器之前被消耗。
在实施例中给出了在酶促水解方法期间通气的若干实例，以显示本发明的有益效果。针对若干底物或原料发现了这种有益效果，并且因此认为这种有益效果在所有种类的底物或原料的水解中都存在。
在实施例中给出了用于酶促水解方法的酶组合物的若干实例，以显示本发明的有益效果。针对若干酶组合物发现了这种有益效果，并且因此认为这种有益效果针对所有种类的水解酶组合物都存在。
对于本发明的再一个优选实施方式，在酶促水解期间存在木质纤维素材料的液相中的氧浓度(DO)是至少0.001mol/m3，优选地至少0.002mol/m3，更优选地至少0.003mol/m3并且甚至更优选地多于0.01mol/m3，例如多于0.02mol/m3或0.03mol/m3。在小于1m3的反应器中，通过缓慢搅拌将获得低于0.01mol/m3或0.02mol/m3的DO值。在这种规模下剧烈混合或搅拌将顶部空间的部分气相引入反应液中。例如，混合或搅拌可以产生将氧卷入液体中的涡流。通常，对于尺寸高达100升至1m3的反应器而言，与(剧烈)混合或搅拌组合，用空气吹入顶部空间将足够的氧引入水解反应器中的纤维素材料中。在更大规模时，例如在50m3或更大(例如100m3)的反应器中，剧烈搅拌需要如此多的能量以至于从经济学角度来看这将无法应用于商业操作方法中。通常，在大反应器中，在不引入空气或氧的情况下搅拌或混合将导致小于0.01mol/m3的DO值。
对于本发明的又一个优选实施方式，在氧生成或产生期间，在酶促水解期间存在木质纤维素材料的液相中的氧浓度(通气或添加氧)优选地是在水解反应条件下的氧饱和浓度的至多80％，更优选地至多0.12mol/m3，仍更优选地至多0.09mol/m3，甚至更优选地至多0.06mol/m3，甚至仍更优选地至多0.045mol/m3并且最优选地至多0.03mol/m3。上文考虑了当木质纤维素材料的氧转化率大于木质纤维素材料的摄氧率(OUR)的情况。当氧消耗(OUR)高于氧转化率时，氧浓度是0mol/m3。温度和压力将影响DO。上文给出的优选和示例性mol/m3值涉及正常气压和约62℃的温度。本领域技术人员将在本发明教导的基础上领会到有利的DO值。
根据本发明的再一个优选实施方案，氧以对应于20与5000mmol之间的分子氧/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖的量被消耗。优选地，氧以对应于22与4500mmol之间的分子氧/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖、24与4000mmol之间的分子氧/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖、26与3500mmol之间的分子氧/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖、28与3400mmol之间的分子氧/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖的量被消耗。氧在所述木质纤维素材料的预处理之后且在酶促水解之前和/或期间添加，优选地以对应于至少30mmol分子氧/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖的量，更优选地以对应于至少40mmol分子氧/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖的量，并且最优选地以对应于至少50mmol分子氧/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖的量。添加到体系中的所有氧将被转移到液体中并且用于水解。可以通过测量并控制带入体系中的空气的量来控制这个量。
根据本发明的再一个优选实施方案，氧以对应于0.17与41.7mmol之间的分子氧/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖/小时的量被消耗。优选地，氧以对应于0.18与37.5mmol之间的分子氧/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖/小时、0.20与33.3mmol之间的分子氧/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖/小时、0.22与29.2mmol之间的分子氧/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖/小时、0.23与28.3mmol之间的分子氧/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖/小时的量被消耗。更优选地，氧以对应于0.36与27.8mmol之间的分子氧/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖/小时的量被消耗。添加到体系中的所有氧将被转移到液体中并且用于水解。可以通过测量并控制带入体系中的空气的量来控制这个量。如本文使用的“/小时”意指水解的每小时。
根据本发明，以空气或其他含氧气体的形式添加氧还可以用于至少部分地搅拌或混合水解反应器内容物。添加氧的其他方式包括原位氧生成。例如，通过电解生成氧，酶促地产生氧(优选地通过添加过氧化物)，或通过例如氧生成体系(如KHSO5)用化学方法产生氧。例如，通过过氧化氢酶由过氧化物产生氧。过氧化物可以按溶解的过氧化物的形式添加或通过酶促或化学反应生成。在过氧化氢酶被用作产生氧的酶的情况下，可以使用存在于用于水解的酶组合物中的过氧化氢酶或可以为此目的添加过氧化氢酶。
本发明的方法尤其在试验工厂和工业规模显示出优势。根据本发明的一个实施方案，用于酶促水解的反应器具有1m3或更大的容积。优选地，反应器具有至少1m3、至少2m3、至少3m3、至少4m3、至少5m3、至少6m3、至少7m3、至少8m3、至少9m3、至少10m3、至少15m3、至少20m3、至少25m3、至少30m3、至少35m3、至少40m3、至少45m3、至少50m3、至少60m3、至少70m3、至少75m3、至少80m3、至少90m3、至少100m3、至少200m3、至少300m3、至少400m3、至少500m3、至少600m3、至少700m3、至少800m3、至少900m3、至少1000m3、至少1500m3、至少2000m3、至少2500m3的容积。通常，反应器将小于3000m3或5000m3。可以使用若干反应器。在本发明的方法中使用的反应器可以具有相同的容积，但是也可以具有不同的容积。
本发明人提出了下述理论，即尤其是在大规模时，水解可利用的氧并不充足，这可能是由于反应器中(例如纤维素分解生物质中)的氧传递受限。在实验室规模实验中，这种氧不充足可发挥不太重要的作用。与大规模实验相比，表面面积(或反应器内容物的氧接触面积)与反应器容积的比率对于小规模实验而言更有利。此外，小规模实验中的混合比大规模实验中的混合相对容易。在那些小规模实验期间，从水解反应器的顶部空间运输氧也比大规模实验中的情况更快。这个理论仅仅作为发明人所注意到的效果的可能解释给出，并且本发明并不因这个理论的正确性而成立或不成立。根据本发明的再一个实施方案，氧的添加可以用于至少部分地控制水解过程。
本发明所述方法有利地联合热稳定酶的使用被应用。
“热稳定”酶表示：酶的最适温度为60℃或更高，例如70℃或更高，例如75℃或更高，例如80℃或更高，例如85℃或更高。例如，它们可分离自嗜热微生物，或者可由本领域技术人员设计和人工合成。在一个实施方式中，多核苷酸可分离自或获自嗜热或耐热丝状真菌或者分离自非嗜热或非耐热但被发现热稳定的真菌。
“嗜热真菌”表示在50℃或以上的温度下生长的真菌。“耐热真菌”表示在45℃或以上(最大值接近50℃)的温度下生长的真菌。
嗜热真菌菌株的实例是Rasamsonia emersonii(以前被称为Talaromycesemersoni)。Talaromyces emersonii,Penicillium geosmithia emersonii和Rasamsoniaemersonii在本文中可交换使用。
合适的嗜热或耐热真菌细胞可以是Humicola、Rhizomucor、Myceliophthora、Rasamsonia、Talaromyces、Thermomyces、Thermoascus或Thielavia细胞，优选地Rasamsonia emersonii细胞。优选的嗜热或耐热真菌是Humicola griseavar.thermoidea、Humicola lanuginosa、Myceliophthora thermophila、Papulasporathermophilia、Rasamsonia byssochlamydoides、Rasamsonia emersonii、Rasamsoniaargillacea、Rasamsonia eburnean、Rasamsonia brevistipitata、Rasamsoniacylindrospora、Rhizomucor pusillus、Rhizomucor miehei、Talaromycesbacillisporus、Talaromyces leycettanus、Talaromyces thermophilus、Thermomyceslenuginosus、Thermoascus crustaceus、Thermoascus thermophilus、Thermoascusaurantiacus和Thielavia terrestris。
嗜热真菌不限于特定分类学等级并出现在真菌进化树各处。实例是Mucorales中的Rhizomucor，Sordariales中的Myceliophthora和Eurotiales中的Talaromyces、Thermomyces和Thermoascus(Mouchacca 1997)。Talaromyces物种大部分是嗜温的，但例外是Emersonii和Thermophila部分(section)的物种。Emersonii部分包括Talaromycesemersonii、Talaromyces byssochlamydoides、Talaromyces bacillisporus和Talaromyces leycettanus，它们全部在40℃下生长良好。Talaromyces bacillisporus耐热，Talaromyces leycettanus耐热至嗜热，Talaromyces emersonii和Talaromycesbyssochlamydoides尤其嗜热(Stolkand Samson 1972)。Talaromyces部分Thermophila的唯一成员T.thermophilus在50℃下生长迅速(Evans和Stolk1971；Evans 1971；Stolk和Samson 1972)。这些嗜热的Talaromyces物种的目前分类主要基于表型和生理特征，例如它们在高于40℃时生长的能力、囊孢子颜色、子囊果覆盖物(ascornatal covering)的结构和特定无性型类型的形成。Stolk和Samson(1972)陈述：Emersonii部分的成员具有Paecilomyces(T.byssochlamydoides和T.leycettanus)或Penicillium cylindrosporum系列(T.emersonii和T.bacillisporus)其中之一的无性型。稍后，基于多种特征例如从端孔而非在颈(collula，neck)上形成分生孢子(Penicillium和Paecilomyces的特征)，Pitt(1979)将属于Penicillium cylindrosporum系列的物种转移至Geosmithia属。在Geosmithia属内，仅G.argillacea是耐热的，Stolk等人(1969)和Evans(1971)提出了与Talaromyces部分Emersonii成员的联系。Talaromyces内的嗜热Talaromyces物种与Trichocomaceae的******未知(参见J.Houbraken,Antonie van Leeuwenhoek 2012年2月；101(2):403-21)。
Rasamsonia是包括耐热的和嗜热的Talaromyces和Geosmithia物种的新属(J.Houbraken等人，如上所述)。基于表型、生理和分子数据，Houbraken等人提出将T.emersonii、T.byssochlamydoides、T.eburneus、G.argillacea和G.cylindrospora物种转移至Rasamsonia新属。Talaromyces emersonii、Penicillium geosmithia emersonii和Rasamsonia emersonii在本文中可交换使用。
优选的嗜热真菌是Rasamsonia byssochlamydoides、Rasamsonia emersonii、Thermomyces lenuginosus、Talaromyces thermophilus、Thermoascus crustaceus、Thermoascus thermophilus和Thermoascus aurantiacus。
“丝状真菌”包括Eumycota和Oomycota亚门的所有丝状形式(如Hawksworth等人,在Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中定义)。丝状真菌的特征为由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复杂多糖构成的菌丝壁。营养生长通过菌丝伸长进行且碳分解代谢绝对好氧。丝状真菌菌株包括但不限于，Acremonium,Agaricus,Aspergillus,Aureobasidium,Beauvaria,Cephalosporium,Ceriporiopsis,Chaetomium paecilomyces,Chrysosporium,Claviceps,Cochiobolus,Coprinus,Cryptococcus,Cyathus,Emericella,Endothia,Endothia mucor,Filibasidium,Fusarium,Geosmithia,Gilocladium,Humicola,Magnaporthe,Mucor,Myceliophthora,Myrothecium,Neocallimastix,Neurospora,Paecilomyces,Penicillium,Piromyces,Panerochaete,Pleurotus,Podospora,Pyricularia,Rasamsonia,Rhizomucor,Rhizopus,Scylatidium,Schizophyllum,Stagonospora,Talaromyces,Thermoascus,Thermomyces,Thielavia,Tolypocladium,Trametes pleurotus,Trichoderma和Trichophyton的菌株。
丝状真菌的若干菌株在许多培养物保藏机构易于被公众获得，例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC)),德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)),真菌生物多样性中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS))和农业研究服务专利培养物保藏北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center(NRRL))。这些菌株的实例包括Aspergillus nigerCBS 513.88、Aspergillus oryzae ATCC 20423、IFO 4177、ATCC 1011、ATCC 9576、ATCC14488-14491、ATCC 11601、ATCC12892、P.chrysogenum CBS 455.95、Penicilliumcitrinum ATCC 38065、Penicillium chrysogenum P2、Talaromyces emersonii CBS393.64、Acremonium chrysogenum ATCC 36225或ATCC 48272、Trichoderma reesei ATCC26921或ATCC 56765或ATCC 26921、Aspergillus sojae ATCC11906、Chrysosporiumlucknowense C1、Garg 27K、VKM-F 3500-D、ATCC44006和其衍生株。
在合适的微生物中表达和生产酶(例如至少2、3或4种不同纤维素酶)的一个优势可以为高的酶组合物产率，其可被用于本发明所述方法中。
根据本发明，通过加入氧，可以达到许多方法优势，包括最佳温度条件、减少处理时间、降低酶剂量、酶的再利用和其它过程优化，从而导致成本降低。有利地，本发明提供这样的方法，其中水解步骤在改进的条件下进行。本发明还提供涉及具有减少的处理时间的水解的方法。此外，本发明提供这样的方法，其中酶的剂量可被减少并且同时有用水解产物的输出被保持在相同水平。本发明的另一个优势是：涉及水解的本发明方法可导致被优化的处理条件。本发明的另一个优势是：使用相同的酶剂量，涉及水解的方法的有用水解产物的输出增加。
稳定的酶组合物
本文中的稳定酶组合物表示：酶组合物在30小时水解反应时间后保持活性，优选地，在30小时水解反应时间后保持其初始活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。优选地，酶组合物在40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500小时的水解反应时间后保持活性。
在一个实施方式中，用于本发明方法中的酶组合物衍生自真菌或用于本发明方法中的酶组合物包含真菌酶。在一个实施方式中，酶组合物衍生自丝状真菌或酶组合物包含丝状真菌酶。本发明的方法有利地是结合从Rasamsonia属的微生物衍生的酶组合物应用的或酶组合物包含Rasamsonia酶。
可通过用合适的微生物(例如Rasamsonia emersonii或Aspergillus niger)发酵合适的底物制备酶组合物，其中酶组合物通过微生物生产。可改变微生物以改进或制造纤维素酶组合物。例如，可通过传统菌株改良程序或通过重组DNA技术使微生物突变。因此，本文提及的微生物可被原样使用以产生纤维素酶组合物或可被改变以增加产量或产生改变的纤维素酶组合物(其可包含异源纤维素酶，即这种微生物原本不产生的酶)。优选地，真菌更优选地丝状真菌被用来产生纤维素酶组合物。有利地，使用嗜热或耐热微生物。任选地，在酶组合物生产期间，使用诱导酶组合物中的酶表达的底物。
酶组合物被用来从包含多糖的木质纤维素中释放糖。主要的多糖为纤维素(葡聚糖)和半纤维素(木聚糖、杂木聚糖(heteroxylans)和木葡聚糖(xyloglucans))。另外，一些半纤维素可在例如得自木材的原料中作为葡甘露聚糖存在。这些多糖向可溶糖(包括单体和多聚体，例如葡萄糖、纤维二糖、木糖、***糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸以及其它己糖和戊糖)的酶促水解发生于共同作用(acting inconcert)的不同酶的作用下。糖产物表示原料或木质纤维素材料的酶促水解产物。糖产物将包含可溶性糖(包含单体和多聚体二者)，优选地将包含葡萄糖。其它糖的实例为纤维二糖、木糖、***糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸以及其它己糖和戊糖。糖产物可被原样使用或者可被进一步加工例如被纯化。
另外，果胶和其它果胶类物质如***聚糖(arabinans)可占来自非木本植物组织典型的细胞壁干物质的可观的比例(约四分之一到一半的干物质可以是果胶)。
纤维素是由通过β-1,4键连接的葡萄糖残基构成的线性多糖。纤维素纤维的线性特性以及β-连接的葡萄糖(相对于α)的化学计量产生比淀粉的高度枝化α-连接结构更倾向于链间氢键结合的结构。因此，纤维素聚合物与淀粉中存在的纤维相比通常溶解度更小，并且形成更紧密结合的纤维。
现更详细描述可被包括在用于本发明的稳定酶组合物中的酶：
GH61，内切葡聚糖酶(EG)和外切纤维二糖水解酶(CBH)催化不溶性纤维素水解成产物例如纤维寡糖(纤维二糖作为主要产物)，而β-葡糖苷酶(BG)将寡糖(主要是纤维二糖和纤维三糖)转化成葡萄糖。
半纤维素是复杂聚合物及其组成常常在生物之间、组织类型之间大幅变化。通常，半纤维素的主要成分是β-1,4-连接的木糖(一种五碳糖)。然而，所述木糖通常在木糖的0-3和/或0-2原子枝化，并且可以被与***糖、半乳糖、甘露糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸的键或者通过乙酸酯化(和阿魏酸对***糖的酯化)被取代。半纤维素也可含有葡聚糖，所述葡聚糖是β-连接的六碳糖(例如先前提到的β-(1,3)(1,4)葡聚糖和杂葡聚糖)和另外的葡甘露聚糖(其中葡萄糖和甘露糖均存在于线性主链中，彼此通过β-键连接)的总称。
木聚糖酶与其它辅助酶例如α-L-***呋喃糖酶、阿魏酸酯酶和乙酰木聚糖酯酶、葡糖醛酸酶和β-木糖苷酶)一起催化半纤维素的水解。
果胶类物质包括果胶、***聚糖、半乳聚糖和***半乳聚糖。果胶是植物细胞壁中最复杂的多糖。它们围绕一定程度上散布着L-鼠李糖的α(1,4)-连接的D-半乳糖醛酸单元的核心链构建。在任何细胞壁中都存在符合所述描述的大量结构单元，并且通常认为在单个果胶分子中，不同结构单元的核心链彼此连续。
结构单元的主要类型是：半乳糖醛酸(同聚半乳糖醛酸)，其可被甲醇在羧基上取代，被乙酸酯在O-2和O-3上取代；鼠李半乳糖醛酸聚糖I(RGI)，其中半乳糖醛酸单元与带有(1,4)-连接的半乳聚糖和(1,5)-连接的***聚糖侧链的鼠李糖交替。***聚糖侧链可直接与鼠李糖结合，或者通过半乳聚糖链间接结合；木半乳糖醛酸聚糖(xylogalacturonan)，在半乳糖醛酸的O-3上具有单个木糖基单元(与RGI紧密关联)；和鼠李半乳糖醛酸聚糖II(RGII)，含有罕见糖例如芹菜糖的特别复杂的小型单元。RGII单元可含有两个芹菜糖残基，所述芹菜糖残基在合适的离子条件下能够与硼酸盐可逆地形成酯。
在本发明方法中使用的组合物优选地包含至少两种活性，但典型的组合物将包含多于两种活性，例如三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或更多。典型地，本发明的组合物可包含至少两种不同的纤维素酶或者两种纤维素酶和至少一种半纤维素酶。本发明的组合物可包含纤维素酶，但是不含木聚糖酶。另外，本发明的组合物可包含辅助酶活性，即直接或间接导致木质纤维素降解的额外活性。这种辅助活性的实例在本文中被提及。
因此，在本发明中使用的组合物可包含GH61，内切葡聚糖酶活性和/或纤维二糖水解酶活性和/或β-葡糖苷酶活性。在本发明中使用的组合物可包含一个或多个这些种类中的多于一种的酶活性。例如，在本发明中使用的组合物可包含两种内切葡聚糖酶活性，例如内切-1,3(1,4)-β葡聚糖酶活性和内切-β-1,4-葡聚糖酶活性。这种组合物也可包含一种或多种木聚糖酶活性。这种组合物可包含辅助酶活性。
在本发明中使用的组合物可来源于真菌，例如如Rasamsonia的丝状真菌例如Rasamsonia emersonii。在一个实施方式中，核心的一组(降解木质纤维素的)酶活性可来源于Rasamsonia emersonii。Rasamsonia emersonii能够提供本文中证明对木质纤维素材料的水解而言高度有效的活性组。如果需要，活性组可被来自其它来源的额外的酶活性补充。这种额外的活性可来源于经典来源和/或由经遗传改造的生物生产。
本发明中使用的组合物中的活性可以是热稳定的。本文中这表示：该活性的最适温度为约60℃或更高，例如约70℃或更高，例如约75℃或更高，例如约80℃或更高，例如85℃或更高。本发明中使用的组合物中的活性一般不具有相同的最适温度，但是优选地将是热稳定的。
另外，本发明中使用的组合物中的酶活性可以能够在低pH下起作用。为了本发明目的，低pH表示约5.5或更低，约5或更低，约4.9或更低，约4.8或更低，约4.7或更低，约4.6或更低，约4.5或更低，约4.4或更低，约4.3或更低，约4.2或更低，约4.1或更低，约4.0或更低，约3.9或更低，或约3.8或更低，约3.7或更低，约3.6或更低，或约3.5或更低的pH。
本发明中使用的组合物中的活性可以通过任何上述最适温度和pH值的组合来限定。
除了来源于Rasamsonia的活性以外，本发明方法中使用的组合物还可包含纤维素酶(例如来源于不同于Rasamsonia的来源的纤维素酶)和/或半纤维素酶(例如来源于不同于Rasamsonia的来源的半纤维素酶)和/或果胶酶。
在当前发明的方法中所用的酶组合物可包含不同于Rasamsonia的来源的纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶。它们可以与一种或更多种Rasamsonia酶一起使用或者它们可以在不存在额外的Rasamsonia酶的情况下使用。
例如，用于本发明的方法中的酶可包含源于Aspergillus的β-葡糖苷酶(BG)，如Aspergillus oryzae如在WO 02/095014中公开的或具有在WO 2008/057637中公开的β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或Aspergillus fumigatus，如在WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2或在WO 2014/130812中的SEQ ID NO:5所公开的或Aspergillus fumigatusβ-葡糖苷酶变体，如在WO 2012/044915中公开的，如具有下列替换的：F100D,S283G,N456E,F512Y(使用WO2014/130812中的SEQ ID NO:5进行编号)或Aspergillus aculeatus,Aspergillus niger或Aspergillus kawachi。在另一个实施方式中，β-葡糖苷酶源自Penicillium，如WO 2007/019442中的SEQ ID NO:2所公开的Penicillium brasilianum或来自Trichoderma，如Trichoderma reesei,，如在US 6,022,725、US 6,982,159、US 7,045,332、US 7,005,289、US2006/0258554、US2004/0102619中描述的那些。在一个实施方式中，甚至可使用细菌β-葡糖苷酶。在另一个实施方式中，β-葡糖苷酶是从Thielavia terrestris(WO 2011/035029)或Trichophaea saccata(WO 2007/019442)衍生的。
例如，用于本发明方法中的酶可包含内切葡聚糖酶(EG)，其源于Trichoderma,例如Trichoderma reesei；Humicola,例如Humicola insolens的菌株；Aspergillus,例如Aspergillus aculeatus或Aspergillus kawachii；Erwinia,例如Erwinia carotovara；Fusarium,例如Fusarium oxysporum；Thielavia,例如Thielavia terrestris；Humicola,例如Humicola grisea var.thermoidea或Humicola insolens；Melanocarpus,例如Melanocarpus albomyces；Neurospora,例如Neurospora crassa；Myceliophthora,例如Myceliophthora thermophila；Cladorrhinum,例如Cladorrhinum foecundissimum和/或Chrysosporium,例如Chrysosporium lucknowense的菌株。在一个实施方式中，甚至可使用细菌内切葡聚糖酶，其包括但不限于Acidothermus cellulolyticus内切葡聚糖酶(见WO91/05039；WO 93/15186；US 5,275,944；WO 96/02551；US 5,536,655,WO 00/70031,WO 05/093050)；Thermobifida fusca内切葡聚糖酶III(见WO 05/093050)；以及Thermobifidafusca内切葡聚糖酶V(见WO05/093050)。
例如，用于本发明方法的酶可包含纤维二糖水解酶I，其源于Aspergillus，如Aspergillus fumigatus，如在WO 2011/057140中SEQ ID NO:6或WO 2014/130812中SEQ IDNO:6公开的Cel7A CBH I或源于Trichoderma，如Trichoderma reesei。
例如，用于本发明方法中的酶可包含纤维二糖水解酶II，其源于Aspergillus，如Aspergillus fumigatus，如在WO 2014/130812中SEQ ID NO:7或源于Trichoderma，如Trichoderma reesei或源于Thielavia，如Thielavia terrestris，如源于Thielaviaterrestris的纤维二糖水解酶II CEL6A。
例如，用于本发明方法中的酶可包含GH61多肽(溶解性多糖单加氧酶)，其源于Thermoascus，如Thermoascus aurantiacus，如在WO 2005/074656中作为SEQ ID No:2和在WO2014/130812中SEQ ID NO:1和WO 2010/065830所述的；或源于Thielavia，如Thielaviaterrestris，如在WO 2005/074647中作为SEQ ID NO:8或在WO2014/130812中的SEQ ID NO:4，WO 2008/148131和WO 2011/035027中所述的；或源于Aspergillus，如Aspergillusfumigatus，如在WO 2010/138754作为SEQ ID NO:2或在WO2014/130812中的SEQ ID NO:3所述的；或源于Penicillium，如Penicillium emersonii，如作为WO 2011/041397中的SEQ IDNO:2或在WO2014/130812中的SEQ ID NO:2所述的。另一些合适的GH61多肽包括但不限于Trichoderma reesei(见WO 2007/089290)、Myceliophthora thermophila(见WO 2009/085935、WO 2009/085859、WO 2009/085864、WO 2009/085868)、Penicillium pinophilum(见WO 2011/005867)、Thermoascus sp.(见WO 2011/039319)和Thermoascus crustaceous(见WO 2011/041504)。在一个方面，根据WO 2008/151043在存在有可溶的活化二价金属阳离子的情况下使用GH61多肽，例如硫酸锰。在一个方面中，在存在有二氧基化合物、双环化合物、杂环化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物或从预处理的纤维素材料如预处理的玉米秸秆获得的液体的情况下使用GH61多肽。
仅举几例，可用于本发明方法中的其它纤维素分解酶在WO 98/13465、WO 98/015619、WO 98/015633、WO 99/06574、WO 99/10481、WO 99/025847、WO 99/031255、WO2002/101078、WO 2003/027306、WO 2003/052054、WO 2003/052055、WO 2003/052056、WO2003/052057、WO 2003/052118、WO 2004/016760、WO 2004/043980、WO 2004/048592、WO2005/001065、WO 2005/028636、WO 2005/093050、WO 2005/093073、WO 2006/074005、WO2006/117432、WO 2007/071818、WO 2007/071820、WO 2008/008070、WO 2008/008793、US 5,457,046、US 5,648,263和US 5,686,593中描述。
此外，在本发明方法中有用的木聚糖酶的示例包括但不限于源于Aspergillusaculeatus(见WO 94/21785)、Aspergillus fumigatus(见WO 2006/078256)、Penicilliumpinophilum(见WO 2011/041405)、Penicillium sp.(见WO 2010/126772)、Thielaviaterrestris NRRL 8126(见WO 2009/079210)和Trichophaea saccata GH10(见WO 2011/057083)的木聚糖酶。在本发明的方法中有用的β-木糖苷酶的示例包括但不限于源于Neurospora crassa和Trichoderma reesei的β-木糖苷酶。在本发明方法中有用的乙酰木聚糖酯酶的示例包括但不限于源于Aspergillus aculeatus(见WO 2010/108918)、Chaetomium globosum,Chaetomium gracile,Humicola insolens DSM 1800(见WO 2009/073709)、Hypocrea jecorina(见WO 2005/001036)、Myceliophtera thermophila(见WO2010/014880)、Neurospora crassa,Phaeosphaeria nodorum和Thielavia terrestrisNRRL 8126(见WO 2009/042846)的乙酰木聚糖酯酶。在本发明方法中有用的阿魏酸酯酶(feruloyl esterases(ferulic acid esterases))的示例包括但不限于源于Humicolainsolens DSM 1800(见WO 2009/076122)、Neosartorya fischeri,Neurospora crassa,Penicillium aurantiogriseum(见WO 2009/127729)和Thielavia terrestris(见WO2010/053838和WO 2010/065448)的阿魏酸酯酶。在本发明方法中有用的***呋喃糖苷酶的示例包括但不限于源于Aspergillus niger,Humicola insolens DSM1800(见WO 2006/114094和WO 2009/073383)和M.giganteus(见WO 2006/114094)的***呋喃糖苷酶。在本发明方法中有用的α-葡萄糖醛酸苷酶的示例包括但不限于源于Aspergillus clavatus,Aspergillus fumigatus,Aspergillus niger,Aspergillus terreus,Humicola insolens(见WO 2010/014706)、Penicillium aurantiogriseum(见WO 2009/068565)和Trichodermareesei的α-葡萄糖醛酸苷酶。
本发明中使用的组合物可包含一种、两种、三种、四种或更多种纤维素酶，例如GH61、内切葡聚糖酶(EG)、一种或两种外切纤维二糖水解酶(CBH)和β-葡糖苷酶(BG)中的一种、两种、三种或四种或全部。本发明中使用的组合物可包含两种或更多种任何这些种类的纤维素酶。
本发明的组合物可包含下述活性，所述活性与本发明方法中使用的组合物所提供的活性具有不同种类的纤维素酶活性和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性。例如，本发明的组合物可包含一种由本文所述的组合物提供的纤维素酶和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性，和由额外的纤维素酶/半纤维素酶/果胶酶提供的第二类纤维素酶和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性。
在本文中，纤维素酶是能够降解或改性纤维素的任何多肽。能够降解纤维素的多肽是能够催化下述过程的多肽：将纤维素降解成更小的单元，部分地例如降解成纤维糊精，或者完全降解成葡萄糖单体。与纤维素酶接触时，根据本发明的纤维素酶可产生纤维素糊精与葡萄糖单体的混合类群。这种降解将典型地通过水解反应而发生。
LPMO’s(溶解性多糖单加氧酶)最近通过AA9家族(辅助活性家族9)或AA10家族(辅助活性家族10)中的CAZy被分类。如上面所提及的，LPMO能够打开结晶葡聚糖结构。LPMO也可影响纤维寡糖。PMO和LPMO在本文可互换使用。根据最新文献(Isaksen等,Journal ofBiological Chemistry,vol.289,no.5,pp.2632-2642)，GH61(糖苷水解酶家族61或有时被称为EGIV)蛋白是(溶解性)氧依赖性多糖单加氧酶(PMO’s/LPMO’s)。文献中通常提及这些蛋白增强纤维素酶对木质纤维素底物的作用。基于一个家族成员中极低的内切-1,4-β-d-葡聚糖酶活性测量值，GH61最初被归类为内切葡聚糖酶。本文所使用的术语“GH61”将被理解为这样的酶家族，其共有将被归类到得到确认的CAZy GH分类***(http://www.cazy.org/GH61.html)的家族61中的常见保守序列部分和折叠。糖苷水解酶家族61是糖苷水解酶EC 3.2.1家族的成员。GH61最近被CAZy重新归类在家族AA9(辅助活性家族9)。GH61在本文中被用作纤维素酶的一部分。CBM33(家族33碳水化合物结合模块)为LPMO(Isaksen等，Journal of Biological Chemistry,vol.289,no.5,pp.2632-2642)，CAZy最近已被重新分类为AA10(辅助活性家族10)中的CBM33。
本文中，半纤维素是能够降解或改性半纤维素的任何多肽。也就是说，半纤维素酶可以能够降解或改性木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、***木聚糖、葡甘露聚糖和木葡聚糖的一种或多种。能够降解半纤维素的多肽是能够催化下述过程的多肽：将半纤维素降解成更小的多糖，部分地例如降解成寡糖，或者完全降解成糖单体，例如己糖或戊糖单体。与半纤维素酶接触时，根据本发明的半纤维素酶可产生寡糖与糖单体的混合类群。这种降解将典型地通过水解反应而发生。
本文中，果胶酶是能够降解或改性果胶的任何多肽。能够降解果胶的多肽是能够催化下述过程的多肽：将果胶降解成更小的单元，部分地例如降解成寡糖，或者完全降解成糖单体。与果胶酶接触时，根据本发明的果胶酶可产生寡糖与糖单体的混合类群。这种降解将典型地通过水解反应而发生。
因此，本发明的组合物可包含任何纤维素酶，例如GH61，纤维二糖水解酶，内切-β-1,4-葡聚糖酶，β-葡糖苷酶或β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶。
本文中，纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)是能够催化纤维素或纤维四糖中1,4-β-D-葡糖苷键水解、从链末端释放纤维二糖的任何多肽。这种酶也可以被称作纤维素酶1,4-β-纤维二糖苷酶(1,4-β-cellobiosidase)，1,4-β-纤维二糖水解酶，1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶，微晶纤维素酶(avicelase)，外切-1,4-β-D-葡聚糖酶，外切纤维二糖水解酶或外切葡聚糖酶。
本文中，内切-β-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)是能够催化纤维素、地衣淀粉或谷类β-D-葡聚糖中1,4-β-D-葡糖苷键内切水解的任何多肽。这种多肽也可以能够水解也含有1,3-键的β-D-葡聚糖中的1,4-键。这种酶也可以被称作纤维素酶、微晶纤维素酶、β-1,4-内切葡聚糖水解酶、β-1,4-葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶、纤维糊精酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖水解酶、内切-1,4-β-葡聚糖酶或内切葡聚糖酶。
本文中，β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)是能够催化末端、非还原性β-D-葡萄糖残基水解并释放β-D-葡萄糖的任何多肽。这种多肽可具有针对β-D-葡糖苷的广泛特异性，并且也可以水解以下一种或多种：β-D-半乳糖苷、α-L-***糖苷、β-D-木糖苷或β-D-岩藻糖苷。这种酶也可以被称作苦杏仁苷酶、β-D-葡糖苷葡糖水解酶、纤维二糖酶或龙胆二糖酶。
本文中，β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)是能够催化含有1,3-和1,4-键的β-D-葡聚糖中1,4-β-D-葡糖苷键水解的任何多肽。这种多肽可作用于地衣淀粉和谷类β-D-葡聚糖，但不作用于仅含1,3-或1,4-键的β-D-葡聚糖。这种酶也可以被称作地衣淀粉酶(licheninase)，1,3-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，β-葡聚糖酶，内切-β-1,3-1,4葡聚糖酶，地衣多糖酶(lichenase)或混合键β-葡聚糖酶。这种酶的替代物是被描述为内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶的EC 3.2.1.6。当其还原基团参与待水解的键的葡萄糖残基自身在C-3处被取代时，这种酶水解β-D-葡聚糖中的1,3-键或1,4-键。替代性名称包括内切-1,3-β-葡聚糖酶，昆布多糖酶，1,3-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖3(4)葡聚糖水解酶，底物包括昆布多糖，地衣淀粉和谷类β-D-葡聚糖。
本发明的组合物可以包含任何半纤维素酶，例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-***呋喃糖苷酶、α-D-葡糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶或β-甘露糖苷酶。
本文中，内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是能够催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键内切水解的任何多肽。这种酶也可以被称作内切-1,4-β-木聚糖酶或1,4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶。供替代的选择是EC 3.2.1.136葡糖醛酸***木聚糖内切木聚糖酶(glucuronoarabinoxylan endoxylanase)，其能够水解葡糖醛酸***木聚糖中1,4木糖苷键。
本文中，β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)是能够催化1,4-β-D-木聚糖的水解，从非还原性末端去除相继的D-木糖残基的任何多肽。这种酶也可以水解木二糖。这种酶也可以被称作木聚糖1,4-β-木糖苷酶、1,4-β-D-木聚糖木糖水解酶、外切-1,4-β-木糖苷酶或木二糖酶。
本文中，α-L-***呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于α-L-***呋喃糖苷、含(1,2)和/或(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-***聚糖、***木聚糖和***半乳聚糖的任何多肽。这种酶也可以被称作α-N-***呋喃糖苷酶、***呋喃糖苷酶或***糖苷酶。
本文中，α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.139)是能够催化以下形式反应的任何多肽：α-D-葡糖醛酸苷+H(2)O＝醇+D-葡糖醛酸(D-glucuronate)。这种酶也被称作α-葡糖醛酸糖苷酶或α-葡糖苷酸酶(alpha-glucosiduronase)。这些酶也可水解可作为木聚糖中取代基存在的4-O-甲基化的葡糖醛酸。供替代的选择是EC 3.2.1.131：木聚糖α-1,2-葡糖醛酸糖苷酶，其催化α-1,2-(4-O-甲基)葡糖醛酸基连接的水解。
本文中，乙酰基木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)是能够催化木聚糖和木寡糖脱乙酰化的任何多肽。这种多肽可催化来自多聚木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、α-萘基乙酸酯或对硝基苯基乙酸酯的乙酰基水解，但是一般不催化来自于三乙酰基丙三醇的乙酰基水解。这种多肽一般不作用于乙酰化的甘露聚糖或果胶。
本文中，阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式反应的任何多肽：阿魏酸基-糖+H2O＝阿魏酸(ferulate)+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。其典型地可以催化来自酯化的糖的4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基的水解，所述糖通常是“天然”底物中的***糖。对硝基苯酚乙酸酯和阿魏酸甲基酯是典型地更弱的底物。这种酶也可以被称作肉桂酰基酯水解酶，阿魏酸酯酶或羟基肉桂酰基酯酶。也可以被称作半纤维素酶辅助酶，因为其可帮助木聚糖酶和果胶酶分解植物细胞壁半纤维素和果胶。
本文中，香豆酰基酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式反应的任何多肽：香豆酰基-糖+H(2)O＝香豆酸(coumarate)+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。这种酶也可以被称作反式-4-香豆酰基酯酶、反式-对香豆酰基酯酶、对香豆酰基酯酶或对香豆酸酯酶。这种酶也落入EC 3.1.1.73中，从而也可以被称作阿魏酸酯酶。
本文中，α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)是能够催化α-D-半乳糖苷(包括半乳糖寡糖、半乳甘露聚糖、半乳聚糖和***半乳聚糖)中末端、非还原性α-D-半乳糖残基水解的任何多肽。这种多肽也可以能够水解α-D-岩藻糖苷。所述酶也可以被称作蜜二糖酶。
本文中，β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)是能够催化β-D-半乳糖苷中末端非还原性β-D-半乳糖残基水解的任何多肽。这种多肽也可以能够水解α-L-***糖苷。这种酶也可以被称作外切-(1->4)-β-D-半乳聚糖酶或乳糖酶。
本文中，β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是能够催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖中1,4-β-D-甘露糖苷键随机水解的任何多肽。这种酶也可以被称作甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶或内切-1,4-甘露聚糖酶。
本文中，β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)是能够催化β-D-甘露糖苷中末端非还原性β-D-甘露糖残基水解的任何多肽。这种酶也可以被称作甘露聚糖酶或甘露糖酶。
本发明的组合物可包含任何果胶酶，例如内切多聚半乳糖醛酸酶，果胶甲基酯酶，内切-半乳聚糖酶，β-半乳糖苷酶，果胶乙酰基酯酶，内切-果胶裂解酶，果胶酸裂解酶，α-鼠李糖苷酶，外切-半乳糖醛酸酶，外切多聚半乳糖醛酸裂解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶，木半乳糖醛酸酶。
本文中，内切-多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)是能够催化果胶酸酯和其它半乳糖醛酸聚糖中1,4-α-D-半乳糖醛酸键的随机水解的任何多肽。这种酶也可以被称作多聚半乳糖醛酸酶果胶解聚酶，果胶酶(pectinase)，内切多聚半乳糖醛酸酶，果胶酶(pectolase)，果胶水解酶，果胶多聚半乳糖醛酸酶，多聚-α-1,4-半乳糖醛酸苷聚糖水解酶，内切半乳糖醛酸酶；内切-D-半乳糖醛酸酶或多聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)聚糖水解酶。
在本文中，果胶甲基酯酶(EC 3.1.1.11)是能够催化下述反应的任何酶：果胶+nH2O＝n甲醇+果胶酸(pectate)。这种酶也被称为果胶酯酶(pectinesterase)，果胶脱甲氧基酶，果胶甲氧基酶，果胶甲基酯酶，果胶酶，果胶酯酶(pectinoesterase)或果胶果基水解酶(pectin pectylhydrolase)。
在本文中，内切-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)是能够催化***半乳聚糖中1,4-β-D-半乳糖苷键的内切水解的任何酶。这种酶也被称为***半乳聚糖内切-1,4-β-半乳糖苷酶，内切-1,4-β-半乳聚糖酶，半乳聚糖酶，***半乳聚糖酶或***半乳聚糖4-β-D-半乳聚糖水解酶。
本文中，果胶乙酰基酯酶在本文中被定义为下述任何酶，所述酶具有催化果胶GaIUA残基羟基处的乙酰基的脱乙酰的乙酰基酯酶活性。
本文中，内切-果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)是能够催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖甲基酯的清除性切割，得到在其非还原末端具有4-脱氧-6-O-甲基-α-D-半乳-4-糖醛酰基的寡糖的任何酶。所述酶也可被称为果胶裂解酶，果胶反式消除酶(trans-eliminase)，内切果胶裂解酶，多聚甲基半乳糖醛酸反式消除酶，果胶甲基反式消除酶，果胶溶解酶，PL，PNL或PMGL或(1→4)-6-O-甲基-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。
本文中，果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)是能够催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖的消除性切割，得到在其非还原性末端具有4-脱氧-α-D-半乳-4-糖醛酸基的寡糖的任何酶。这种酶也可被称为多聚半乳糖醛酸反式消除酶，果胶酸反式消除酶，多聚半乳糖醛酸酯裂解酶，内切果胶甲基反式消除酶，果胶酸反式消除酶，内切半乳糖醛酸反式消除酶，果胶酸裂解酶，果胶裂解酶，α-1,4-D-内切多聚半乳糖醛酸裂解酶，PGA裂解酶，PPase-N，内切-α-1,4-多聚半乳糖醛酸裂解酶，多聚半乳糖醛酸裂解酶，果胶反式消除酶，多聚半乳糖醛酸反式消除酶或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。
本文中，α-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)是能够催化α-L-鼠李糖苷或替代地鼠李半乳糖醛酸聚糖中末端非还原性α-L-鼠李糖残基水解的任何多肽。这种酶也可被称为α-L-鼠李糖苷酶T，α-L-鼠李糖苷酶N或α-L-鼠李糖苷鼠李糖水解酶。
本文中，外切-半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.82)是能够从非还原性末端水解果胶酸，释放二半乳糖醛酸的任何多肽。所述酶也可被称为外切-多聚-α-半乳糖醛酸苷酶(exo-poly-α-galacturonosidase)、外切多聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturonosidase)或外切多聚聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturanosidase)。
本文中，外切-半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)是能够催化以下的任何多肽：(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)n+H2O＝(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)n-1+D-半乳糖醛酸(D-galacturonate)。这种酶也可被称为半乳糖醛1,4-α-半乳糖醛酸苷酶(galacturan 1,4-α-galacturonidase)，外切多聚半乳糖醛酸酶，多聚(半乳糖醛酸)水解酶，外切-D-半乳糖醛酸酶，外切-D-半乳糖醛酸聚糖酶，外切多聚-D-半乳糖醛酸酶或多聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)半乳糖醛酸水解酶。
本文中，外切多聚半乳糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.9)是能够催化从果胶酸(即脱酯化的果胶)的还原末端消除性切割4-(4-脱氧-α-D-半乳-4-糖醛酸基)-D-半乳糖醛酸的任何多肽。这种酶也可被称为果胶酸二糖裂解酶，果胶酸外切裂解酶，外切果胶酸反式消除酶，外切果胶酸裂解酶，外切多聚半乳糖醛酸-反式-消除酶，PATE，外切-PATE，外切-PGL或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖还原末端二糖裂解酶。
本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶是能够在由二糖[(1,2-α-L-鼠李糖基-(1,4)-α-半乳糖醛酸]组成的严格交替的鼠李半乳糖醛酸聚糖结构中以内切方式水解半乳基糖醛酸和吡喃鼠李糖基之间键的任何多肽。
本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶是能够以内切方式在鼠李半乳糖醛酸聚糖中通过β-消除切割α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA键的任何多肽。
本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶是能够催化鼠李半乳糖醛酸聚糖中交替的鼠李糖和半乳糖醛酸残基主链的脱乙酰化的任何多肽。
本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶是能够以外切方式，从严格交替的鼠李半乳糖醛酸聚糖结构的非还原性末端水解半乳糖醛酸的任何多肽。
本文中，木半乳糖醛酸酶是通过以内切方式切割β-木糖取代的半乳糖醛酸主链而作用于木半乳糖醛酸聚糖的任何多肽。这种酶也可被称为木半乳糖醛酸聚糖水解酶。
本文中，α-L-***糖呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于α-L-***呋喃糖苷、含有(1,2)和/或(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-***聚糖、***木聚糖和***半乳聚糖的任何多肽。这种酶也可以被称为α-N-***糖呋喃糖苷酶，***糖呋喃糖苷酶或***糖苷酶。
本文中，内切***聚糖酶(EC 3.2.1.99)是能够催化1,5-***聚糖中1,5-α-***呋喃糖苷键内切水解的任何多肽。这种酶也可被称为内切***糖酶，***聚糖内切-1,5-α-L-***糖苷酶，内切-1,5-α-L-***聚糖酶，内切-α-1,5-***聚糖酶；内切-***聚糖酶或1,5-α-L-***聚糖1,5-α-L-***聚糖水解酶。
本发明的组合物将一般包含至少两种纤维素酶和任选地至少一种半纤维素酶和任选地至少一种果胶酶(其中之一是根据本发明的多肽)。本发明的组合物可包含GH61，纤维二糖水解酶，内切葡聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。这种组合物也可以包含一种或多种半纤维素酶和/或一种或多种果胶酶。
另外，本发明的组合物中可以存在淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、木质酶、己糖基转移酶、葡糖醛酸糖苷酶或扩展蛋白(expansin)或纤维素诱导蛋白或纤维素整合蛋白或类似蛋白质中的一种或多种(例如两种、三种、四种或所有)(这些也被称作上文的辅助活性)。
“蛋白酶”包括水解肽键的酶(肽酶)，以及水解肽和其它部分(如糖)之间键的酶(糖肽酶)。许多蛋白酶归类为EC 3.4，它们适合在本发明中使用并且通过引用并入本文。一些特定类型的蛋白酶包括半胱氨酸蛋白酶(包括胃蛋白酶，木瓜蛋白酶)和丝氨酸蛋白酶(包括糜蛋白酶，羧肽酶和金属内切蛋白酶)。
“脂肪酶”包括水解脂质、脂肪酸和酰基甘油酯(包括磷酸甘油酯)、脂蛋白、二酰基甘油等等的酶。在植物中，脂质被用作结构组分，来限制水损失和病原体感染。这些脂质包括来自脂肪酸的蜡质，以及角质和木栓素(suberin)。
“木质酶”包括能够水解或分解木质素聚合物结构的酶。能够分解木质素的酶包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶和阿魏酸酯酶，和在本领域中已知解聚或以其它方式分解木质素聚合物的描述的其它酶。还包括在内的是能够水解在半纤维素糖(主要是***糖)和木质素之间形成的键的酶。木质酶包括但不限于以下组的酶：木质素过氧化物酶(EC1.11.1.14)、锰过氧化物酶(EC 1.11.1.13)、漆酶(EC 1.10.3.2)和阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)。
“己糖基转移酶”(2.4.1-)包括能够催化转移酶反应，但是也能够催化例如纤维素和/或纤维素降解产物的水解反应的酶。可以在本发明中使用的己糖基转移酶的例子是β-葡聚糖基转移酶。这种酶可以能够催化(1,3)(1,4)葡聚糖和/或纤维素和/或纤维素降解产物的降解。
“葡糖醛酸糖苷酶”包括催化葡糖醛酸苷(例如β-葡糖醛酸苷)水解得到醇的酶。许多葡糖醛酸糖苷酶已被表征，并可适合在本发明中使用，例如β-葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.31)，透明质酸酶葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.36)，葡糖醛酰基-二硫葡糖胺葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.56)，甘草酸β-葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.128)或α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.139)。
本发明中使用的组合物可包含扩展蛋白或扩展蛋白样蛋白质，如膨胀因子(swollenin)(见Salheimo et al.,Eur.J.Biohem.269,4202-4211,2002)或膨胀因子样蛋白质。
扩展蛋白参与植物细胞生长期间细胞壁结构的松弛。已经提出扩展蛋白破坏纤维素和其它细胞壁多糖之间的氢键，但不具有水解活性。认为它们通过这种方式允许纤维素纤维的滑动和细胞壁的扩大。一种扩展蛋白样蛋白质膨胀因子含有N端碳水化合物结合模块家族1结构域(CBD)和C端扩展蛋白样结构域。为了本发明的目的，扩展蛋白样蛋白质或膨胀因子样蛋白质可包含这种结构域中的一种或两种和/或可破坏细胞壁的结构(如破坏纤维素结构)，任选地不生产可检测量的还原糖。
本发明中使用的组合物可以包含纤维素诱导的蛋白质，例如cip1或cip2基因或类似基因的多肽产物(见Foreman等人,J.Biol.Chem.278(34),31988-31997,2003)，纤维素/纤维体(cellulosome)整合蛋白质，例如cipA或cipC基因的多肽产物，或支架蛋白或支架蛋白样蛋白质。支架蛋白和纤维素整合蛋白是多功能整合亚基，其可将纤维素分解亚基组织成多酶复合体。这通过两类互补结构域(即支架蛋白上的内聚结构域(cohesion domain)和每个酶单元上的锚定结构域(dockerin domain))的相互作用完成。支架蛋白亚基还带有介导纤维体与其底物结合的纤维素结合模块(CBM)。为了本发明的目的，支架蛋白或纤维素整合蛋白可包含这种结构域中的一种或两种。
用于本发明中的组合物还可包含过氧化氢酶。术语“过氧化氢酶”表示过氧化氢：过氧化氢氧化还原酶(EC 1.11.1.6或EC 1.11.1.21)，其催化两个过氧化氢至氧和两个水的转化。过氧化氢酶活性可通过基于下列反应监控在240nm的过氧化氢的降解而确定：2H2O2→2H2O+O2。该反应是在25℃下pH为7.0的50mM磷酸盐中以10.3mM底物(H2O2)和每ml大约为100单位的酶而进行的。在16-24秒内用分光光度法监控吸光度，这应对应于0.45至0.4的吸光度减少。一个过氧化氢酶活性单位可被表达为在pH为7.0且25℃下每分钟降解的一微摩尔的H2O2。
本发明方法中使用的组合物可由上文提到的每种酶种类的成员、一个酶种类的若干成员、或这些酶种类或辅助蛋白(即本文提到的本身不具有酶活性，但是帮助木质纤维素降解的那些蛋白质)的任何组合构成。
在本发明的方法中使用的组合物可以由来自以下来源的酶构成：(1)供应商；(2)经克隆的表达酶的基因；(3)复合培养液(例如由培养基中微生物菌株的生长得到的，其中所述菌株向培养基中分泌蛋白质和酶)；(4)如(3)中培养的菌株的细胞裂解物；和/或(5)表达酶的植物材料。本发明组合物中不同的酶可获自不同的来源。
酶可以在微生物、酵母、真菌、细菌或植物中外源产生，然后分离并加入例如木质纤维素原料中。或者，酶可以被生产但不分离，并可将粗制细胞群发酵液或植物材料(如玉米秆或麦秸)等等加入例如原料中。或者，可以处理粗制细胞群或酶生产培养基或植物材料，以预防进一步的微生物生长(例如通过加热或添加抗微生物剂)，然后添加至例如原料。这些粗制酶混合物可包含生产酶的生物。或者，酶可以在下述发酵中生产，所述发酵使用(预处理的)原料(例如玉米秆或麦秸)对生产酶的生物提供营养。通过这种方式，生产酶的植物自身可以作为木质纤维素原料，并且被添加进木质纤维素原料中。
在本文所述的用途和方法中，上述组合物的组分可以同时(即本身作为单一组合物)或分别或顺次提供。
因此，本发明涉及其中使用上述组合物的方法，和所述组合物在工业方法中的用途。
在根据本发明的方法的一个实施方式中，所述酶组合物为真菌的完整发酵液的形式。在一个实施方式中，酶组合物可以是如下所述的完整发酵液。完整发酵液可通过非重组和/或重组丝状真菌的发酵而制备的。在一个实施方式中，丝状真菌是包含可以与丝状真菌同源或异源的一个或多个基因的重组丝状真菌。在一个实施方式中，丝状真菌是包含可以与丝状真菌同源或异源的一个或多个基因的重组丝状真菌，其中一个或多个基因对可降解纤维素底物的酶进行编码。完整发酵液可包含任意多肽或其任何组合。
优选地，酶组合物为完整发酵液，其中细胞被杀死。完整发酵液可包含有机酸(用于杀死细胞)、被杀死的细胞和/或细胞碎片和培养基。
一般地，在适于产生能够水解纤维素底物的酶的细胞培养基中培养丝状真菌。培养是使用在本领域中已知的程序在包括碳和氮源以及无机盐的合适的营养培养基中进行。合适的培养基、温度范围和适于生长和纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶生产的其他条件在本领域中是已知的。完整发酵液可通过使丝状真菌生长至稳定期并在碳限制条件下将丝状真菌保持足以表达一种或多种纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶的时间段而制备的。一旦丝状真菌将酶如纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶分泌至发酵培养基中，则可使用完整发酵液。本发明的完整发酵液可包含丝状真菌。在一些实施方式中，完整发酵液包含源自发酵结束时的发酵材料的未分级物质。通常，完整发酵液包含已经利用过的培养基和在丝状真菌生长至饱和后存在的细胞碎片，其在碳限制性条件下进行培养以允许蛋白质合成(特别地，表达纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶)。在一些实施方式中，完整发酵液包含已经利用过的细胞培养基、细胞外酶和丝状真菌。在一些实施方式中，存在于完整发酵液中的丝状真菌可使用本领域中已知的方法进行裂解、透化或杀灭以产生细胞经杀灭的完整发酵液。在一个实施方式中，完整发酵液是细胞经杀灭的完整发酵液，其中含有丝状真菌的完整发酵液进行了裂解或杀灭。在一些实施方式中，通过化学和/或pH处理裂解丝状真菌而杀死细胞，从而生成丝状真菌发酵的细胞经杀灭的完整发酵液。在一些实施方式中，通过化学和/或pH处理并将细胞经杀灭的发酵混合物的pH调整为合适的pH而杀死细胞。在一个实施方式中，完整发酵液包含第一有机酸成分，其包括至少一个1-5碳有机酸和/或其盐，以及第二有机酸成分，其包括至少6个或更多碳的有机酸和/或其盐。在一个实施方式中，第一有机酸成分为醋酸、甲酸、丙酸、其盐或其任意组合，第二有机酸成分为苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐或其任意组合。
如本文使用的术语“完整发酵液”指通过未进行或进行了最少回收和/或纯化的细胞发酵而产生的制备物。例如，完整发酵液是当微生物培养物生长至饱和时并在碳限制性条件下培养以允许蛋白质合成(例如，通过宿主细胞表达酶)以及分泌至细胞培养基中而产生的。通常，完整发酵液是未分级的且包括已经使用过的细胞培养基、细胞外酶和微生物，优选为非存活的细胞。
如果需要的话，完整发酵液可以是分级的且可使用经分级物质中的一个或多个。例如，可从完整发酵液去除杀死的细胞和/或细胞碎片以提供不含这些成分的组合物。
完整发酵液可进一步地包括防腐剂和/或抗微生物剂。这种防腐剂和/或试剂是本领域中是已知的。
通常，如本文所述的完整发酵液为液体，但也可含有不溶性成分，如杀死的细胞、细胞碎片、培养基成分和/或不溶性酶。在一些实施方式中，可去除不溶性成分以提供澄清的完整发酵液。
在一个实施方式中，完整发酵液可补充有一个或多个未内源性表达的或通过丝状真菌在相对低水平进行表达的酶活性以提高纤维素底物降解例如为可发酵的糖，如葡萄糖或木糖。补充酶可作为完整发酵液的添加剂而进行添加且酶可以是单独的完整发酵液的成分或可进行纯化或最低程度地进行回收和/或纯化。
在一个实施方式中，完整发酵液包括过表达一种或多种酶以提高纤维素底物的降解的重组丝状真菌的发酵的完整发酵液。替代地，完整发酵液可包括非重组丝状真菌和过表达一种或多种酶以提高纤维素底物的降解的重组丝状真菌的发酵的完整发酵液的混合物。在一个实施方式中，完整发酵液包括过表达β-葡糖苷酶的丝状真菌的发酵的完整发酵液。替代地，用于本方法和反应性组合物中的完整发酵液可包括非重组丝状真菌的发酵的完整发酵液和过表达β-葡糖苷酶的重组丝状真菌的发酵的完整发酵液的混合物。
在一个实施方案中，用于从木质纤维素材料制备糖产物的方法包括以下步骤：(a)任选地，预处理所述木质纤维素材料；(b)任选地，清洗所述任选地经预处理的木质纤维素材料；(c)通过在允许表达酶组合物的条件下培养真菌产生酶组合物，所述酶组合物包含至少两种纤维素酶，并且其中所述酶组合物至少包含LPMO；(d)使用所述酶组合物酶促水解所述任选地经清洗的和/或任选地经预处理的木质纤维素材料；以及(e)任选地，回收含葡萄糖的组合物，其中通过在所述预处理之后且在所述酶促水解之前和/或期间向所述木质纤维素材料中添加适合量的氧，将通过LPMO对含有纤维素和/或纤维寡糖的木质纤维素材料的氧化而形成的经水解的氧化产物在酶促水解结束时的量保持在3至110g/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖之间，优选地所形成的经水解的氧化产物是葡糖酸、醛糖酸和/或偕二醇，更优选地经水解的氧化产物是葡糖酸。
在一个实施方案中，用于从木质纤维素材料制备发酵产物的方法包括以下步骤：(a)任选地，预处理所述木质纤维素材料；(b)任选地，清洗所述任选地经预处理的木质纤维素材料；(c)通过在允许表达酶组合物的条件下培养真菌产生酶组合物，所述酶组合物包含至少两种纤维素酶，并且其中所述酶组合物至少包含LPMO；(d)使用所述酶组合物酶促水解所述任选地经清洗的和/或任选地经预处理的木质纤维素材料；(e)发酵所述经水解的木质纤维素材料，以产生发酵产物；以及(f)任选地，回收发酵产物，其中通过在所述预处理之后且在所述酶促水解之前和/或期间向所述木质纤维素材料中添加适合量的氧，将通过LPMO对含有纤维素和/或纤维寡糖的木质纤维素材料的氧化而在酶促水解结束时形成的经水解的氧化产物葡糖酸的量保持在3至110g/kg存在于所述木质纤维素材料中的葡聚糖之间，优选地所形成的经水解的氧化产物是葡糖酸、醛糖酸和/或偕二醇，更优选地经水解的氧化产物是葡糖酸。
如上文所指出的，在一个优选实施方式中，真菌是丝状真菌，优选地所述真菌属于Rasamsonia或Aspergillus属。在一个实施方式中，真菌的培养是在需氧条件下进行的。本领域技术人员公知用于需氧培养的发酵罐设计，例如像搅拌罐和泡罩塔。通常，在适合于产生感兴趣的酶组合物的细胞培养基中培养真菌。培养使用本领域中已知的过程在适合的营养培养基中发生，所述培养基包含碳源和氮源及无机盐。适合的培养基、温度范围以及适合于生长和酶产生的其他条件在本领域是已知的。在本文描述了其实例。可以通过使真菌生长到静止期并且将真菌在限碳条件下维持足以表达所述酶的时间段来制备酶组合物。一旦真菌将感兴趣的酶分泌到发酵培养基中，便可以使用所述酶组合物。可以在通过如本文描述的在允许表达所述酶组合物的条件下培养真菌来产生酶组合物的方法步骤前进行繁殖真菌的过程，所述酶组合物包含至少两种纤维素酶并且其中所述酶组合物至少包含LPMO。繁殖可以包括摇瓶、小容器和大容器中的若干步骤。
木质纤维素材料
本文中的木质纤维素材料包括任何木质纤维素材料和/或半纤维素材料。适于用作本发明原料的木质纤维素材料包括生物质，例如原始生物质(virgin biomass)和/或非原始生物质如农业生物质，商业有机物，建筑和拆除碎片，市政固体废弃物，废纸和庭院废弃物。常见的生物质形式包括树木，灌木丛(shrubs)和草，小麦，麦秸，甘蔗、甘蔗杆(canestraw)、甘蔗渣，甘蔗废料，柳枝稷，芒草(miscanthus)，能源甘蔗(energy cane)，玉米，玉米秆(corn stover)，玉米壳，玉米芯(corn cobs)，芸苔茎，大豆茎，高粱，玉米粒(包括来自玉米粒的纤维)，来自谷物如玉米、小麦和大麦研磨(包括湿磨和干磨)的通常称作“麸或纤维”的产物和副产物，以及市政固体废弃物，废纸和庭院废弃物。生物质也可以是但不限于草本材料，农业残余物，林业残余物，市政固体废弃物，废纸，和浆和造纸厂残余物。“农业生物质”包括树枝，灌木(bushes)，藤蔓(canes)，玉米和玉米壳，能量作物，森林，水果，花，谷物，草，草本作物，树叶，树皮，针叶，原木，根，树苗，短期轮种木本作物(short-rotationwoody crops)，灌木丛，柳枝稷，树木，蔬菜，水果皮，蔓藤(vines)，甜菜浆，小麦麸皮(wheatmidlings)，燕麦壳，和硬木材和软木材(不包括带有有害材料的木材)。另外，农业生物质包括由农业加工产生的有机废弃物材料，所述农业加工包括农业和林业活动，尤其包括林业木材废弃物。农业生物质可以是前述任一或其任何组合或混合物。
纤维素是具有式(C6H10O5)n的有机化合物，一种由几百到一万多个β(1→4)连接的D-葡萄糖单元的直链组成的多糖。葡聚糖分子是通过糖苷键连接的D-葡萄糖单体的多糖。在本文，对于通过糖苷键连接的D-葡萄糖单体的多糖而言，葡聚糖和纤维素可互换地使用。用于定量分析葡聚糖或多糖组成的方法在本领域是公知的且进行了描述的，并且例如概述于Carvalho de Souza等人，Carbohydrate Polymers 95(2013)657-663中。通常，葡聚糖的50％到70％是结晶纤维素，剩余部分是无定形纤维素。
预处理
用于本发明中的木质纤维素材料可进行洗涤和/或预处理。任选地，原料可通过本领域中已知的任何方式用热、机械和/或化学改性或这些方法的任何组合预处理，以便增强底物对酶促水解的可接近性和/或水解半纤维素和/或使半纤维素和/或纤维素和/或木质素溶解。在一种实施方式中，通过用蒸汽喷发、热水处理或用稀酸或稀碱处理木质纤维素进行预处理。
在一个实施方式中，在酶促水解之前和/或期间对木质纤维素材料进行预处理。预处理方法是本领域中已知的，其包括但不限于热、机械、化学修饰、生物修饰及其任意组合。通常，进行预处理以提高木质纤维素材料中木质纤维素材料对酶促水解的可接近性和/或水解半纤维素和/或使半纤维素和/或纤维素和/或木质素溶解。在一个实施方式中，预处理包括用蒸汽***、热水处理或稀酸或稀碱处理来处理木质纤维素。预处理方法的示例包括但不限于，蒸汽处理(例如，在100-260℃、7-45巴的压力和中性pH下处理1-10分钟)、稀酸处理(例如，在存在或不存在蒸汽的情况下在120-200℃、2-15巴的压力和酸性pH下用0.1-5％的H2SO4和/或SO2和/或HNO3和/或HCl处理2-30分钟)、有机溶剂处理(例如，在存在有机溶剂和蒸汽的情况下在160-200℃、7-30巴的压力和酸性pH下用1-1.5％的H2SO4处理30-60分钟)、石灰处理(例如，在存在水/蒸汽的情况下在60-160℃、1-10巴的压力和碱性pH下用0.1-2％的NaOH/Ca(OH)2处理60-4800分钟)、ARP处理(例如，在150-180℃、9-17巴的压力和碱性pH下用5-15％的NH3处理10-90分钟)、AFEX处理(例如，在60-140℃、8-20巴的压力和碱性pH下用>15％的NH3处理5-30分钟)。
洗涤步骤
任选地，根据本发明的方法包括洗涤步骤。任选的洗涤步骤可被用于去除可充当发酵步骤的抑制剂的水溶性化合物。可按已知的方式进行洗涤步骤。
木质纤维素材料可进行洗涤。在一个实施方式中，可在预处理后洗涤木质纤维素材料。洗涤步骤可被用于去除可充当发酵和/或水解步骤的抑制剂的水溶性化合物。可按技术人员已知的方式进行洗涤步骤。除洗涤之外，存在有其他解毒方法。预处理的木质纤维素材料也可通过包括但不限于固/液分离、真空蒸发、提取、吸附、中和、加灰过量、添加还原剂、添加解毒酶如漆酶或过氧化物酶、添加能够对水解物进行解毒的微生物的这些方法中的任一个(或任何组合)而进行解毒。
酶促水解
本发明所述方法中使用的酶组合物可极其有效水解木质纤维素材料，例如玉米秆、麦秸、甘蔗杆和/或甘蔗渣，然后其可被进一步转化为有用产物，例如乙醇、生物气、丁醇、乳酸、塑料、有机酸、溶剂、动物饲料补充剂、药物、维生素、氨基酸、酶或化学原料。此外，来自水解之后过程的中间产物(例如作为生物气生产中的中间体的乳酸)可被用作其它材料的结构单元。本发明利用乙醇生产进行示例，但这仅作为例证而非限制，其它被提及的有用产物可被同样地良好生产。
根据本发明的方法包括酶促水解步骤。酶促水解包括但不限于液化原料的目的的水解和从原料释放糖的目的的水解或两者。在该步骤中，使任选地预处理的和任选地清洗的木质纤维素材料与根据本发明的酶组合物接触。根据木质纤维素材料和预处理，技术人员可调节不同的反应条件例如温度、酶剂量、水解反应时间和干物质浓度，以实现木质纤维素向糖的期望转化。一些指标在下文给出。
在一个实施方式中，酶促水解至少包括液化步骤和糖化步骤，所述液化步骤中木质纤维素材料在至少第一容器中被水解；所述糖化步骤中经液化的木质纤维素材料在所述至少第一容器和/或在至少第二容器中被水解。糖化可以在与液化相同的容器(即所述至少第一容器)中进行，它还可以在单独的容器(即所述至少第二容器)中进行。因此，在根据本发明的方法的酶促水解中，可以将液化和糖化合并。可替代地，液化和糖化可以是单独的步骤。液化和糖化可以在不同的温度下进行，但是也可以在单一温度下进行。在一个实施方式中，液化的温度高于糖化的温度。液化优选地在60℃-75℃的温度下进行，并且糖化优选地在50℃-65℃的温度下进行。
酶促水解中使用的酶可以在酶促水解之前和/或期间添加。在酶促水解包括液化步骤和糖化步骤的情况下，另外的酶可以在液化步骤期间和/或之后添加。所述另外的酶可以在糖化步骤之前和/或期间添加。另外的酶也可以在糖化步骤之后添加。
在本发明的一个方面中，水解在45℃或更高，50℃或更高，55℃或更高，60℃或更高，65℃或更高，或70℃或更高的温度下进行。水解期间的高温具有许多优势，所述优势包括在酶组合物的最适温度下起作用、(细菌)污染风险降低、降低的粘性、需要更少量的冷却水、使用具有更高温度的冷却水、酶的再利用和更多的优势。
将用于酶促水解的一个或多个容器中的木质纤维素材料的粘度保持在10与4000cP之间、10与2000cP之间，优选10与1000cP之间。
在所述方法包括包含液化步骤和糖化步骤的酶促水解的情况下，将液化步骤中的木质纤维素材料粘度保持在10与4000cP之间、10与2000cP之间，优选10与1000cP之间，和/或将糖化步骤中的木质纤维素材料的粘度保持在10与1000cP之间、10与900cP之间，优选10与800cP之间。
可以用Brookfield DV III流变仪在用于水解的温度下确定粘度。
在本发明的另一个方面中，添加的酶组合物的量(本文中也称为酶剂量或酶负载量)低。在一种实施方式中，酶的量是6mg蛋白/g干物质重量或更低，5mg蛋白/g干物质或更低，4mg蛋白/g干物质或更低，3mg蛋白/g干物质或更低，2mg蛋白/g干物质或更低或1mg蛋白/g干物质或更低(表示为mg蛋白/g干物质形式的蛋白)。在一种实施方式中，酶的量是0.5mg酶/g干物质重量或更低，0.4mg酶组合物/g干物质重量或更低，0.3mg酶/g干物质重量或更低，0.25mg酶/g干物质重量或更低，0.20mg酶/g干物质重量或更低，0.18mg酶/g干物质重量或更低，0.15mg酶/g干物质重量或更低或0.10mg酶/g干物质重量或更低(表示为mg酶/g干物质形式的总纤维素酶)。低酶剂量是可行的，由于酶的活性和稳定性，可以增加水解反应时间。
在本发明的另一个方面中，水解反应时间是5小时或更长，10小时或更长，20小时或更长，40小时或更长，50小时或更长，60小时或更长，70小时或更长，80小时或更长，90小时或更长，100小时或更长，120小时或更长，130小时或更长。在另一方面中，水解反应时间是5-150小时，40-130小时，50-120小时，60-120小时，60-110小时，60-100小时，70-100小时，70-90小时或70-80小时。由于酶组合物的稳定性，更长水解反应时间是可以的，这对应更高的糖产率。
水解期间的pH可由技术人员选择。在本发明的另一个方面中，水解期间的pH可以是3.0-6.4。本发明的稳定酶可具有高至2个pH单位，高至3个pH单位，高至5个pH单位的宽pH范围。最适pH可位于pH 2.0至8.0，3.0-8.0，3.5-7.0，3.5-6.0，3.5-5.0，3.5-4.5，4.0-4.5的界限内或约4.2。
在本发明的另一个方面中，进行水解步骤直到木质纤维素材料中的70％或更多，80％或更多，85％或更多，90％或更多，92％或更多，95％或更多的可利用糖被释放出。
显著地，本发明的方法可在水解反应中使用高水平的(木质纤维素材料的)干物质进行。因而，本发明可用约5重量％或更高，约8重量％或更高，约10重量％或更高，约11重量％或更高，约12重量％或更高，约13重量％或更高，约14重量％或更高，约15重量％或更高，约20重量％或更高，约25重量％或更高，约30重量％或更高，约35重量％或更高或约40重量％或更高的干物质含量进行。在另一实施方式中，水解步骤中的干物质含量是14重量％，15重量％，16重量％，17重量％，18重量％，19重量％，20重量％，21重量％，22重量％，23重量％，24重量％，25重量％，26重量％，27重量％，28重量％，29重量％，30重量％，31重量％，32重量％，33重量％或更多或14-33重量％。
在另一个实施方式中，在水解结束时的干物质含量为5wt％或更高、6wt％或更高、7wt％或更高、8wt％或更高、9wt％或更高、10wt％或更高、11wt％或更高、12wt％或更高、13wt％或更高、14wt％或更高、15wt％或更高、16wt％或更高、17wt％或更高、18wt％或更高、19wt％或更高、20wt％或更高、21wt％或更高、22wt％或更高、23wt％或更高、24wt％或更高、25wt％或更高、26wt％或更高、27wt％或更高、28wt％或更高、29wt％或更高、30wt％或更高、31wt％或更高、32wt％或更高、33wt％或更高、34wt％或更高、35wt％或更高、36wt％或更高、37wt％或更高、38wt％或更高或39wt％或更高。在另一个实施方式中，在酶促水解结束时的干物质含量为5wt％至40wt％、6wt％至40wt％、7wt％至40wt％、8wt％至40wt％、9wt％至40wt％、10wt％至40wt％、11wt％至40wt％、12wt％至40wt％、13wt％至40wt％、14wt％至40wt％、15wt％至40wt％、16wt％至40wt％、17wt％至40wt％、18wt％至40wt％、19wt％至40wt％、20wt％至40wt％、21wt％至40wt％、22wt％至40wt％、23wt％至40wt％、24wt％至40wt％、25wt％至40wt％、26wt％至40wt％、27wt％至40wt％、28wt％至40wt％、29wt％至40wt％、30wt％至40wt％、31wt％至40wt％、32wt％至40wt％、33wt％至40wt％、34wt％至40wt％、35wt％至40wt％、36wt％至40wt％、37wt％至40wt％、38wt％至40wt％和39wt％至40wt％。
发酵
根据本发明的方法可以包括发酵步骤。可以在一个反应器中与水解同时进行发酵(SSF)。优选地，在水解之后进行发酵，可以选择对于水解和发酵二者的最佳条件，所述最佳条件对于水解和发酵可能是不同的。在另一个方面中，本发明因而包括分步骤发酵方法，其中微生物被用于发酵包含糖(例如葡萄糖、L-***糖和/或木糖)的碳源。碳源可包括包含L-***糖、木糖或葡萄糖单元的任何碳水化合物寡聚体或多聚体，例如木质纤维素、木聚糖、纤维素、淀粉、***聚糖等等。为了从这种碳水化合物释放木糖或葡萄糖单元，可将适宜的碳水化合物酶(例如木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶等等)添加至发酵培养基或其可通过经修饰的宿主细胞对其进行生产。在后者的情况下，经修饰宿主细胞可被遗传工程改造，以生产并分泌这种碳水化合物酶。使用葡萄糖的寡聚体或多聚体来源的另外优势是，其能在发酵期间保持低的(较低的)游离葡萄糖浓度，例如通过使用限制速率的碳水化合物酶的量。这继而会防止对非葡萄糖的糖(例如木糖)代谢和运送所需体系的抑制。在一个优选的方法中，经修饰宿主细胞发酵L-***糖(任选地木糖)和葡萄糖二者，优选地同时发酵，这种情况下优选地使用经改造的宿主细胞，所述宿主细胞对葡萄糖抑制不敏感，以防止二次生长(diauxic growth)。除了L-***糖来源，任选地木糖(和葡萄糖)作为碳源之外，发酵培养基将进一步包含经修饰宿主细胞生长所需的适宜成分。用于微生物(例如酵母或丝状真菌)生长的发酵培养基的组成在本领域众所周知。
在相同条件下的发酵时间可比在常规发酵中更短，其中部分酶促水解在发酵期间仍必须参与。在一个实施方式中，就50g/l葡萄糖和来自木质纤维素原料的相应其它糖(例如50g/l木糖，35g/l的L-***糖和10g/l的半乳糖)的糖组合而言，发酵时间是100小时或更短，90小时或更短，80小或更短，70小时或更短，或60小时或更短。对于更稀的糖组合物，可相应减少发酵时间。
发酵方法可以是需氧或厌氧发酵方法。厌氧发酵方法在本文中被定义为下述发酵方法，所述发酵方法在没有氧或基本上没有氧被消耗的情况下进行，优选地少于5、2.5或1mmol/L/h、更优选地0mmol/L/h(即氧消耗未被检测出)的氧被消耗的情况下进行，并且其中有机分子既作为电子供体又作为电子受体。没有氧时，在糖酵解和生物质形成中产生的NADH不可被氧化磷酸化所氧化。为解决该问题，许多微生物使用丙酮酸盐或其衍生物之一作为电子和氢受体，因此再产生NAD+。因而，在一个优选的厌氧发酵方法中，丙酮酸盐被用作电子(和氢受体)并被还原为发酵产物，例如乙醇、乳酸、3-羟基丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、延胡索酸、氨基酸、1,3-丙烷-二醇、乙烯、甘油、丁醇、β-内酰胺抗生素和头孢菌素。在一个优选的实施方式中，发酵方法是厌氧的。厌氧方法是有利的，因为其比需氧方法更便宜：需要较少专门的设备。而且，预计厌氧方法给出比需氧方法更高的产品产出。在需氧条件下，通常生物质产率比在厌氧条件下更高。结果，通常在需氧条件下，期望的产物产率比在厌氧条件下低。
在另一实施方式中，发酵方法在限氧条件下。更优选地，发酵方法是需氧的并在限氧条件下。限氧发酵方法是这样的方法，其中氧消耗被氧从气体至液体的转化所限制。氧限制的程度由进入气流的量和组成以及使用的发酵设备的实际的混合/质量转移特性确定。优选地，在限氧条件下的方法中，氧消耗速率为至少5.5，更优选地至少6和甚至更优选地至少7mmol/L/h。
发酵方法优选地在对经修饰细胞而言最佳的温度下运行。因而，对于大多数酵母或真菌细胞而言，发酵方法在低于42℃，优选地低于38℃下的温度下进行。对于酵母或丝状真菌宿主细胞而言，发酵方法优选地在低于35、33、30或28℃的温度下并在高于20、22或25℃的温度下进行。
在本发明的一个实施方式中，在步骤中，用能够发酵至少一种C5糖的微生物进行发酵。在一个实施方式中，所述方法是用于乙醇生产的方法，其中，所述方法包括下述步骤，所述步骤包括用能发酵至少一种C5糖的微生物发酵含糖培养基，其中宿主细胞能将葡萄糖、L-***糖和木糖发酵为乙醇。微生物可以是原核或真核生物。用于所述方法中的微生物可以是经遗传修饰的微生物。合适生物的实例为酵母，例如Saccharomyces例如Saccharomyces cerevisiae,Saccharomyces pastorianus或Saccharomyces uvarum,Hansenula,Issatchenkia,例如Issatchenkia orientalis,Pichia,例如Pichia stipites或Pichia pastoris,Kluyveromyces,例如Kluyveromyces fagilis,Candida,例如Candidapseudotropicalis或Candida acidothermophilum,Pachysolen,例如Pachysolentannophilus或细菌,例如Lactobacillus,例如Lactobacillus lactis,Geobacillus,Zymomonas,例如Zymomonas mobilis,Clostridium,例如Clostridium phytofermentans,Escherichia,例如E.coli,Klebsiella,例如Klebsiella oxytoca。在一个其实施方式中，能发酵至少一种C5糖的微生物是酵母。在一个实施方式中，酵母属于Saccharomyces属，优选地是Saccharomyces cerevisiae种，其中已进行遗传修饰。这种微生物及其制备的一个例子被更详细地描述在WO 2008/041840和于2010年4月21日提交的欧洲专利申请EP10160622.6中。在一个实施方式中，用于生产乙醇的发酵方法是厌氧的。厌氧已在本文上文定义过。在另一优选的实施方式中，用于生产乙醇的发酵方法是需氧的。在另一优选的实施方式中，用于生产乙醇的发酵方法在限氧条件下，更优选地所述方法是需氧的并在限氧条件下。限氧条件已在本文上文定义过。
在这种方法中，乙醇体积生产率优选地为至少0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、5.0或10.0g乙醇/升/小时。方法中基于L-***糖和任选的木糖和/或葡萄糖的乙醇产率优选地为至少20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、95或98％。乙醇产率在本文中被定义为理论最大产率的百分比，对于葡萄糖、L-***糖和任选的木糖，理论最大产率为0.51g乙醇/g葡萄糖或木糖。
在一个方面中，与已知乙醇发酵方法相比，导致乙醇生产的发酵方法具有若干优势：
-厌氧方法是可行的；
-限氧条件也是可行的；
-可获得较高的乙醇产率和乙醇生产速率；
-使用的菌株可以能够使用L-***糖和任选地木糖。
替代上述发酵方法，可使用至少两种有区别的细胞，这表示该方法是共发酵方法。如上所述的发酵方法的所有优选实施方式也是该共发酵方法的优选实施方式：发酵产物类别、L-***糖来源和木糖来源类别、发酵条件(需氧或厌氧条件、限氧条件、方法进行的温度、乙醇生产力、乙醇产率)。
可进行发酵方法而完全无需在发酵期间调节pH。也就是说，所述方法是不用添加任何酸或碱即可进行的方法。然而，这排除了可添加酸的预处理步骤。要点是本发明的组合物能在低pH下起作用，因而不需要为了糖化或水解可发生而调整酸预处理原料的酸的pH。因此，本发明的方法可以是仅使用有机产物不需要无机化学输入的零废物方法。
总反应时间
根据本发明，可减少总反应时间(或水解步骤和发酵步骤合起来的反应时间)。在一个实施方式中，90％葡萄糖产率下的总反应时间为300小时或更少，200小时或更少，150小时或更少，140小时或更少，130小时或更少，120小时或更少，110小时或更少，100小时或更少，90小时或更少，80小时或更少，75小时或更少，或约72小时。相应地，在较低的葡萄糖产率下可达到较少总时间。
发酵产物
可根据本发明生产的发酵产物包括氨基酸、维生素、药物、动物饲料补充物、特种化学品、化学原料、塑料、溶剂、燃料或其它有机聚合物、乳酸和乙醇包括燃料乙醇(术语“乙醇”被理解为包括乙基醇(ethyl alcohol)或乙基醇和水的混合物)。
可通过本发明的方法生产的具体的价值增加产物包括但不限于，生物燃料(包括生物气、乙醇和丁醇)；乳酸；3-羟基-丙酸；丙烯酸；乙酸；1,3-丙烷-二醇；乙烯；甘油；塑料；特种化学品；有机酸，包括柠檬酸、琥珀酸和马来酸；溶剂；动物饲料补充物；药物例如β-内酰胺抗生素或头孢菌素；维生素；氨基酸，例如赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸和天冬氨酸；酶例如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂解酶、氧化还原酶、转移酶或木聚糖酶；化学原料；或动物饲料补充物。
可通过本发明的方法产生的发酵产物可以是源自发酵的任何物质。其包括但不限于醇(如***糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1,3-丙二醇、山梨糖醇和木糖醇)；有机酸(如乙酸、丙酮酸、己二酸、抗坏血酸、丙烯酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(如丙酮)；氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、色氨酸和苏氨酸)；烷烃(如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)、环烷烃(如环戊烷、环己烷、环庚烷和环辛烷)、烯烃(如戊烯、己烯、庚烯和辛烯)；和气体(如甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。发酵产物还可以是蛋白质、维生素、药物、动物饲料补充剂、特殊化学品、化学原料、塑料、溶剂、乙烯、酶如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂解酶、氧化还原酶、转移酶或木聚糖酶。
发酵产物的分离
根据本发明的方法任选地包括回收发酵产物。可以以任何已知的方式从发酵液中分离发酵产物。对于每种发酵产物，技术人员能选择合适的分离技术。例如，可以以常规方式通过蒸馏(例如蒸汽蒸馏/真空蒸馏)将乙醇从酵母发酵液中分离出。
以下将更详细地描述本发明的某些实施方式，但绝非限制本发明的范围。
在最佳温度条件下使用热稳定酶
在一个实施方式中，本发明涉及使用热稳定酶(例如Rasamsonia的纤维素分解酶)用于在(但不限于)乙醇生产中从预处理的木质纤维素原料生产还原糖。应用于预处理的木质纤维素原料的Rasamsonia的纤维素分解酶显示出在50-70℃范围内的温度下的最大转化速率。酶在这些环境下保持活性达14天及更久，而没有完全停止活性。
通过使用最佳温度条件，最大量的还原糖能在尽可能短的水解时间内从原料(完全水解)释放出。以这种方式，在不到5天实现了葡萄糖形式的纤维素的100％转化。
发酵产物的理论最大产率(以g产物/克葡萄糖计的Yps最大)可来源于生物化学教科书。对乙醇而言，根据酵母中正常的糖酵解发酵通路，1摩尔葡萄糖(180g)产生2摩尔乙醇(＝2×46＝92g乙醇)。因此，基于葡萄糖的乙醇的理论最大产率为92/180＝0.511g乙醇/g葡萄糖。
对丁醇(MW 74g/摩尔)或异丁醇而言，理论最大产率是每摩尔葡萄糖1摩尔丁醇。因此，(异)丁醇的Yps最大＝74/180＝0.411g(异)丁醇/g葡萄糖。
对乳酸而言，同型乳酸发酵(homolactic fermentation)的发酵产率是每摩尔葡萄糖2摩尔乳酸(MW＝90g/摩尔)。根据该化学计量，Yps最大＝1g乳酸/g葡萄糖。
对其它发酵产物而言，可以进行类似的计算。
应用Rasamsonia的纤维素分解酶实现的成本降低是总方法时间减少的结果。
使用Rasamsonia酶，用延长水解时间补偿较少的酶剂量
由于稳定酶的高稳定性，活性不会随时间停止，尽管较少的还原糖在水解期间被释出。通过延长水解时间来延长酶的使用和减少酶剂量，从而获得释放的还原糖的类似水平是可行的。例如，0.175mL酶/g原料干物质导致在72小时内从预处理的原料中释放还原糖的理论最大值的约90％。当使用0.075mL酶/g原料干物质时，在120小时内实现理论最大值的约90％转化。结果显示，由于酶活性的稳定性，减少的酶剂量可通过延长水解时间补偿，以获得相同量的还原糖。对在高于10％干物质含量下的预处理原料水解同样如此，显示了在15％干物质原料下延长水解时间的补偿作用。
通过使用稳定的(例如Rasamsonia的)纤维素分解酶实现成本降低，这是由于需要较少的酶剂量，从而导致相似的水解转化产率。
用稳定酶降低污染风险
在将木质纤维素材料转化为乙醇的常见方法中，处理步骤优选地在腐败性条件(septic condition)下进行以减少操作成本。污染微生物的污染和生长可因而发生并导致不期望的副作用，这种乳酸、甲酸和乙酸生产，基于底物的乙醇的产率损失，毒素和细胞外多糖的产生可显著影响生产成本。高处理温度和/或短处理时间会限制水解和发酵期间的污染风险。热稳定酶(比如Rasamsonia的那些)能在高于60℃的温度下水解木质纤维素原料。在这些温度下，污染微生物引起不期望副作用的风险会减小至几乎为零。
在其中乙醇被生产的发酵步骤期间，温度典型地在30-37℃之间并且由于产量损失而优选地不会被升高。通过应用尽可能短的发酵处理时间，污染的风险和作用和/或污染物的生长会尽可能多地被减小。使用稳定酶(比如Rasamsonia的那些)，可应用尽可能短的发酵时间(见说明书上文)，因而污染风险和/或污染物生长将被尽可能大地降低。以这种方式应用Rasamsonia的热稳定纤维素分解酶实现的成本降低起因于降低了由于污染导致的处理失败的风险。
稳定酶减少冷却成本并增加乙醇工厂的生产力
热预处理后的第一个步骤是将预处理的原料冷却至酶为最佳活性的温度。大规模时，这典型地通过添加(冷却)水完成，这除了降低温度外，会减少干物质含量。通过使用热稳定酶(比如Rasamsonia的那些)，可通过下述事实实现成本降低：i)更少需要对预处理原料冷却，因为在水解期间允许更高温度，和ii)添加更少的水，这会增加水解和发酵期间的干物质含量并因而增加乙醇工厂的乙醇生产能力(每体积每时间单位产生的量)。而且，通过根据本发明使用热稳定酶(比如Rasamsonia的那些)，成本降低也可通过使用比用在有非热稳定酶的方法中的水具有更高温度的冷却水实现。
利用稳定酶水解后再循环酶
水解结束时，酶活性表现为低的，因为一旦几乎所有纤维素被转化，几乎没有还原糖被释放出。但是，存在的酶促活性的量仅减少少许，假设这主要是由于酶对底物的吸收。通过在水解后应用固液分离，例如离心、过滤、沉降等等，溶液中的酶活性的60％或更多，例如70％可被回收并被再利用用于在下一水解期间水解新的预处理的木质纤维素原料。
而且，固液分离后，溶液中的酶可从含有还原糖和来自酶促作用的其它水解产物的溶液中分离出。可借助或不借助首先将酶吸附到任何类型的载体上，通过但不限于(超或微)过滤、离心、沉淀、沉降进行该分离。
例如，用0.175mL/g原料干物质的酶载量对预处理的原料水解20小时后，还原糖的理论最大量的50％被释出，相同水解72小时后，还原糖的理论最大量的90％被释出。通过离心和超滤，在渗余物中回收60-70％的酶活性，而滤液含有超过80％的释出的还原糖。通过再利用渗余物自身或被进一步纯化和/或浓缩后的渗余物，在下一水解步骤期间的酶剂量可被减少60-70％。通过这种方式通过使用稳定纤维素分解酶(例如Rasamsonia的那些)实现成本降低起因于需要更少的酶剂量。
利用稳定酶的水解后酶再循环与酶生产和酵母细胞再循环的组合
包括如上文所述的水解后再循环酶的方法可与发酵后再循环生产乙醇的微生物的方法组合，其中在酶生产发酵中使用含还原糖的滤液作为底物(纯化的和/或浓缩的或稀释的)和作为底物用于培养生产乙醇的微生物。
利用稳定酶的真空蒸馏后再循环酶
酶(比如来自Rasamsonia的那些)的热稳定性导致在糟水中的水解、发酵和真空蒸馏后剩余的纤维素分解活性。酶的总活性在三个连续的方法步骤期间降低。真空蒸馏后获得的糟水可因而被再利用作为酶来源，用于将预处理麦秸转化为乙醇的新开始的水解-发酵-蒸馏处理循环。糟水可被以浓缩形式或(未)稀释形式和/或被纯化并有或没有额外的酶补充的形式被使用。
利用热稳定酶的真空蒸馏后酶再循环与酶补充的组合
在一个最佳方法中，酶在新处理循环中再利用之前，补充到糟水中的酶量等于在先前处理循环的三个连续处理步骤期间损失的活性量。以这种方式，避免超剂量的酶，并因此获得酶的最有效使用。
而且，通过在第一处理循环中提供高酶剂量并补充等于在随后处理循环中的三个连续处理步骤期间损失的活性量的酶，可在每个处理循环中获得尽可能高的水解速率，导致少于48小时的短的水解时间和酶的最有效使用的组合。
在混合***中使用稳定酶
通过在水解期间应用混合，酶变得更经常地与底物接触，这导致催化活性被更有效使用。这将导致酶剂量更低并因而导致成本更低，除非混合对酶具有负面作用。稳定酶(比如来自Rasamsonia的热稳定酶)是稳健的并可抵抗(局部)高剪切和高温环境，这是浆体剧烈混合期间的情况。在混合***中使用稳定酶因而是有益的并会导致剂量减少并因此导致成本降低。
通过下述实施例进一步描述本发明，其不应被解释为限制本发明的范围。
实施例
实验信息
菌株
可被用于本发明的实施例中以展示本发明的效果和优势的合适的Rasamsonia菌株例如TEC-101,TEC-147,TEC-192,TEC-201或TEC-210。所述菌株在WO2011/000949中描述。
制备酸预处理的玉米秆底物
如Schell,D.J.,Applied Biochemistry and Biotechnology(2003),105-108卷,69-85页中所述获得稀酸预处理的玉米秆(aCS)。使用中试规模预处理反应器，并在190℃、1分钟滞留时间和液相中1.45％(重量/重量)的有效H2SO4酸浓度的稳态条件下操作。
蛋白质测量试验
1.总蛋白
TCA双缩脲
该方法是使用三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白质以除去干扰物质并允许用比色双缩脲反应测定蛋白质浓度的组合。在双缩脲反应中，铜(II)离子被还原为铜(I)，铜(I)在碱性溶液中与肽键的氮和碳形成复合物。紫色表示蛋白质的存在。根据Beer-Lambert定律，颜色强度以及因此的在546nm的吸光度与蛋白质浓度直接成正比。使用BSA(牛血清白蛋白)进行标准化，蛋白质含量被表示为根据BSA等价物的g蛋白质/L或者mg根据BSA等价物的蛋白质/ml。使用本领域已知的标准计算方案来计算蛋白质含量，其中通过标绘相对于浓度已知样品的浓度的OD546，随后使用由校准线生成的方程计算未知样品的浓度。
2.使用PAGE的个体蛋白质
样品预处理SDS-PAGE
基于估算的样品蛋白浓度，进行下述样品制备。向10μl样品中加入40μl MilliQ水和50μl TCA(20％)以将样品稀释5倍(～1mg/ml)和沉淀蛋白。在冰上1小时后，离心样品(10分钟，14000rpm)。用500μl丙酮清洗沉淀并离心(10分钟，14000rpm)。如下所述处理沉淀。
SDS-PAGE
将沉淀溶解于65μl MilliQ水、25μl NuPAGETM LDS样品缓冲液(4×)Invitrogen和10μl NuPAGETM样品还原剂(10×)Invitrogen中。在变性步骤之前，使用比率为65:25:10的MilliQ、NuPAGETM LDS样品缓冲液和10μl NuPAGETM样品还原剂的混合物将样品稀释5倍。混合之后，在70℃下在热混合器中孵育样品10分钟。将样品溶液应用于4-12％Bis-Tris凝胶(NuPAGETM BisTris,Invitrogen)上。将标记M12(Invitrogen)的样品(10μl)也应用于凝胶上。使用外部缓冲室中具有600ml 20×稀释的SDS缓冲液和内部缓冲室中具有含0.5ml抗氧化剂(NuPAGETM Invitrogen)的200ml 20×稀释的SDS缓冲液的XCELL Surelock，使凝胶在200V下电泳50分钟。电泳后，用去离子水漂洗凝胶2次，然后用50％甲醇/7％乙酸溶液固定1小时并用Sypro Ruby(每凝胶50ml)染色过夜。用MilliQ水清洗凝胶之后，使用Typhoon9200(610BP 30,绿色(532nm),PMT 600V,100μm)成像。
定量分析蛋白质
使用Typhoon扫描仪并使用本领域已知的标准方法测定泳道内的蛋白条带之间的比率。一式三份地应用样品并使用图像定量(Image quant)程序测定灰度值。使用所选蛋白条带的灰度值相对于所有蛋白条带的总灰度值计算值，其被表示为相对于总蛋白的相对％蛋白。
葡聚糖转化计算：
％葡聚糖转化(％)＝(葡萄糖(g/l)×100％)/(葡聚糖(基于DM级分)×dm(g/kg)×1.1)
其中：
葡萄糖(g/l) ＝水解后的上清液中的葡萄糖浓度
葡聚糖(基于dm级分) ＝预处理前的底物的葡聚糖含量
dm(g/kg) ＝水解的干物质(例如20％dm＝200g/kg).1.1 ＝水解期间掺入水导致的重量增加
实例计算：
葡萄糖 ＝60g/l
葡聚糖级分 ＝0.40(基于干物质为40％)
dm ＝200g/kg
葡聚糖转化实例 ＝(60*100)/(0.4×200×1.1)＝68％转化率
必要的话进行蒸发校正。随后将上清液中的浓度转化成浓度/kg水解物。
通过UPLC-MS/MS测量生物质水解物中的葡糖酸
所述试验是基于用UPLC柱分离葡糖酸并借助MS/MS(基于负电喷雾电离)进行检测。为了排除由离子抑制、蒸发和注入效应造成的误差，使用标记的内标(即13C6-葡糖酸)。
化学品和参比化合物
将用于样品制备和UPLC-MS/MS分析的水通过Millipore 0.22μm过滤器进行过滤。HPLC级乙腈获得自Merck(阿姆斯特丹，荷兰)。水中的0.1％(v/v)甲酸和乙腈中的0.1％甲酸获得自Biosolve B.V.(范肯斯沃德，荷兰)。葡糖酸参比化合物获得自Sigma(兹韦恩德雷赫特，荷兰)。同位素标记的葡糖酸(13C6，用作内标)是通过Buchem B.V.(阿珀尔多伦，荷兰)定制的。
内标溶液
通过在10mL容量瓶中称量10mg 13C6-葡糖酸并溶解于10mL水中来制备原液(约1mg/mL)。通过吸移100μL的内标原液并添加9.99mL水由此原液制备工作溶液(浓度约10μg/mL)。
标准溶液
通过称量5mg葡糖酸并添加10mL水制备葡糖酸原液。通过吸移20μL的原液并添加980μL水进一步稀释所述原液(稀释1，浓度约10μg/mL)。通过吸移100μL的稀释1并添加900μL水进一步稀释(稀释2，浓度约1μg/mL)。根据下表1在HPLC小瓶中制作校准曲线。
样品制备
将生物质水解物除霜(必要的话)，并且通过在Eppendorf小瓶中用1350μL水稀释150μL的样品用水将生物质水解物稀释十倍，随后在13000rcf下离心15分钟。通过在HPLC小瓶中吸移20μL的上清液并添加100μL内标工作溶液和880μL水将所得上清液用水稀释五十倍。
UPLC-MS/MS
在Waters UPLC iClass体系上分析葡糖酸，所述体系由连接到Waters Xevo TQD质谱仪上的Waters iClass Binary Solvent Manager和Water iClass Sample ManagerFTN组成(Waters，米尔福德，马萨诸塞州，美国)。用A)水中的0.1％(v/v)甲酸和B)乙腈中的0.1％甲酸作为流动相，使用梯度洗脱通过Waters Acquity UPLC BEH C18柱(150x 2.1mm，1.8μm)实现层析分离。7min梯度以99％A持续1分钟开始，随后在2分钟内直线下降到90％A，然后用20％A清洗2分钟并且用99％A再平衡2分钟。使用5μl的注射容积，将流速保持在0.35mL/min，并且将柱温设为40℃。
以负离子化模式操作质谱仪。用Masslynx 4.1软件(Waters)进行数据采集和峰值积分。以多反应监测模式(MRM)进行葡糖酸和13C6-葡糖酸检测。一般设置如下：ESI毛细管电压是2.0kV，提取器电压是3.0V，锥孔电压是30V。去溶剂化气体(氮)流量是800L/h(温度设在350℃)，锥孔气体(氮)流量是50L/h，并且源温度是150℃。使用以下MRM设置：葡糖酸m/z195.0→129.0，停留时间0.1s，碰撞电压2V；13C6-葡糖酸m/z201.0→134.0，停留时间0.08s，碰撞电压2V。
定量
使用线性回归计算葡糖酸浓度(以g/L计)：
Figure BDA0001144973760000521
借助以下计算可以将所计算的葡糖酸量(以g/l计)转化为以g/kg木质纤维素材料中的葡聚糖计的葡糖酸。
当使用浓度为20％(w/w)dm的经酸预处理的玉米秸秆时，在pH 4.5和62℃下的历时120小时的水解结束时，沉淀的体积为6％(由于不可溶)，并且上清液的体积为94％。上清液的密度为1.07kg/l并且葡聚糖百分比为36％。因此，浓度为20％(w/w)dm的经酸预处理的玉米秸秆具有72g葡聚糖/kg水解物。
以例如0.5g/l葡糖酸开始，这给出0.5/1.07＝0.47g葡糖酸/kg上清液(1.07是液体的密度)。这对应于0.47*0.94＝0.44g葡糖酸/kg水解物(由于不可溶，沉淀系数是6％)。当使用浓度为20％(w/w)dm的经酸预处理的玉米秸秆时，这对应于0.44/0.072＝6.1g葡糖酸/kg葡聚糖。
实施例1
在水解期间使用氧控制所形成的葡糖酸的量
通过添加氧将水解物上清液中的葡糖酸浓度保持在0.7与1.5g/l之间，在60℃的反应器温度和4.5的pH下获得了具有20％干物质的预处理的玉米秸秆(基于干物质含有36％葡聚糖)的最佳酶促水解。这对应于在葡聚糖的水解期间每kg葡聚糖产生9.7-20.8g的葡糖酸。用2.5mg/g干物质原料的TEC-210纤维素酶酶组合物(或混合物)进行水解。根据WO2011/000949中描述的接种和发酵过程产生TEC-210。
实施例2
在水解期间使用氧控制所形成的葡糖酸的量
使用浓度为20％(w/w)干物质(dm)的经酸预处理的玉米秸秆(aCS)原料进行酶促水解。原料溶液是通过用水稀释浓缩原料浆而进行制备的。用25％(w/w)NH4OH-溶液将pH调整至pH4.5。使用1.5升的反应器在1kg规模上进行酶促水解。将pH控制在4.5并将温度控制在62℃。在该方法中溶解氧是通过顶部空间的气体再循环和额外的新鲜空气(含有20-21％的氧)进行控制的。
在添加酶之前，顶部空间的气体是使用蠕动泵和喷射器按3l/小时的气体流进行再循环的。由于原料通过化学反应消耗氧的事实，DO水平在一小时内达到0％的DO水平，这产生了厌氧原料以及完全耗尽氧的顶部空间。所产生的惰性顶部空间气体(无氧的)在整个水解中被用作所导入的新鲜空气的载气。
接下来，将纤维素酶的酶混合物TEC210按3.75mg(TCA蛋白质)/g dm的剂量添加至原料。根据在WO2011/000949中所述的接种和发酵程序制造TEC-210。总水解时间为120小时。
在整个水解过程期间分别按每小时每kg反应混合物为0-3-6-12-24或48ml的新鲜空气流将新鲜空气导入惰性顶部空间气体的再循环回路中，这是在添加酶后直接开始的。在所有实验中不断地测量DO。在实验的开始和结束时取样以通过HPLC进行葡萄糖分析。
在摇瓶中进行并行实验以确定葡聚糖水解的最大水平。该最大水解是通过在过剩的含有氧的顶部空间空气中以类似条件(pH、温度和dm)下以非常高的酶剂量(50mg(TCA蛋白质)/g dm)孵育原料而确定的。在每次实验中的DO测量不断示出0％的DO。这可通过在将氧从含氧的再循环气体流转移至反应器中的液相后氧的直接消耗进行解释。
结果被列在表2中。通过对每种条件(即新鲜空气流量(ml/kg/h)0–3–6–12–24–48–96)从水解结束时的葡萄糖浓度(以g/l计)中减去水解开始时的葡萄糖浓度(以g/l计)并且将对应的值除以当新鲜空气流量(ml/kg/h)为0时发现的值(这个值被设为100％)来计算葡萄糖产量增加。
数据清楚地证明，当将水解结束时形成的葡糖酸的量保持在高于3g/kg木质纤维素材料中的葡聚糖时，形成更高量的葡萄糖。
实施例3
葡糖酸对木质纤维素原料酶促水解的影响
在5mg的纤维素酶混合物TEC210/克干物质的存在下并且在0、2、4、6、或8g/l葡糖酸的存在下，在62℃下，在6％w/w的干物质水平、pH 4.5下，将二十克的预处理的玉米秸秆在50ml Greiner试管中孵育50小时，以确定葡糖酸对木质纤维素原料中的葡聚糖水解的抑制效应。在最大氧饱和度下进行所述实验。
孵育50小时之后取样，并且将样品在Eppendorf离心机型号5810中以4000rpm离心8分钟，用于进一步分析。使用Bio-Rad HPX87H柱借助HPLC测量每个样品的上清液中的葡萄糖浓度。结果示于表3中。呈现在表3中的葡萄糖释放是酶促水解(葡聚糖水解)的直接量度。上清液中的2g/l的葡糖酸水平对应于木质纤维素材料中的89g/kg葡聚糖。这可以如上所述的用1.02kg/l的密度、2％的沉淀系数和21.6g葡聚糖/kg水解物的葡聚糖含量来计算。
结果清楚地指示，较高浓度的葡糖酸对葡聚糖水解具有负面作用。
表1：校准曲线
Figure BDA0001144973760000541
表2.在木质纤维素原料的酶促水解中添加氧的作用。
Figure BDA0001144973760000542
Figure BDA0001144973760000551
*氧＝24.5l/mol(在25℃下)并且葡聚糖含量是72g/kg水解物
表3.葡糖酸对酶促水解的影响。
Figure BDA0001144973760000552

Claims (19)

1.用于从木质纤维素材料制备糖产物的方法，所述方法包括以下步骤：
a）预处理所述木质纤维素材料，
b）任选地，清洗所述预处理的木质纤维素材料，
c）使用包含至少两种纤维素酶的酶组合物酶促水解所述经预处理和任选地清洗的木质纤维素材料，并且其中所述酶组合物至少包含LPMO，以及
d）任选地，回收含葡萄糖的组合物，
其中通过在酶促水解步骤(c)期间向所述木质纤维素材料中添加20-10,000 mmol氧/kg葡聚糖的氧，将通过LPMO对含有纤维素和/或纤维寡糖的木质纤维素材料的氧化而形成的葡糖酸在酶促水解结束时的量保持在3至10 g/kg存在于木质纤维素材料中的葡聚糖之间。
2.用于从木质纤维素材料制备发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：
a）预处理所述木质纤维素材料，
b）任选地，清洗所述预处理的木质纤维素材料，
c）使用包含至少两种纤维素酶的酶组合物酶促水解所述经预处理和任选地清洗的木质纤维素材料，并且其中所述酶组合物至少包含LPMO，以及任选地纯化经水解的木质纤维素材料，
d）发酵所述经水解的木质纤维素材料以产生发酵产物，以及
e）回收发酵产物，
其中通过在酶促水解步骤(c)期间向所述木质纤维素材料中添加20-10,000 mmol氧/kg葡聚糖的氧，将通过LPMO对含有纤维素和/或纤维寡糖的木质纤维素材料的氧化而形成的葡糖酸在酶促水解结束时的量保持在3至10 g/kg存在于木质纤维素材料中的葡聚糖之间。
3.根据权利要求2所述的方法，其中用能够发酵至少一种C5糖的微生物进行所述发酵。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述微生物为已经进行了遗传修饰的Saccharomyces cerevisiae物种。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述氧以泡的形式添加。
6. 根据权利要求1或2所述的方法，其中用于所述酶促水解的反应器具有1 m3或更大的容积。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中酶促水解时间是5到150小时。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中所使用的酶组合物保持活性30小时或更久。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中在45℃或更高的温度下进行所述水解。
10.根据权利要求9所述的方法，其中在50℃或更高的温度下进行所述水解。
11.根据权利要求9所述的方法，其中在55℃或更高的温度下进行所述水解。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述酶组合物源于真菌，或者所述酶组合物包含真菌酶。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述酶组合物源于Rasamsonia属的微生物或者所述酶组合物包含Rasamsonia酶。
14. 根据权利要求1或2所述的方法，其中水解步骤(c)中的干物质含量是10 wt%或更多。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中水解步骤(c)中的干物质含量是14 wt%或更多。
16. 根据权利要求14所述的方法，其中水解步骤(c)中的干物质含量是14到33 wt%。
17.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述酶促水解在分批、补料分批和/或连续培养反应器中发生。
18.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述酶组合物为真菌的完整发酵液的形式。
19.根据权利要求1或2所述的方法，其中氧作为含氧气体被引入。
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