UA121113C2 - Спосіб ферментативного гідролізу лігноцелюлозного матеріалу й ферментації цукрів - Google Patents

Спосіб ферментативного гідролізу лігноцелюлозного матеріалу й ферментації цукрів Download PDF

Info

Publication number
UA121113C2
UA121113C2 UAA201612108A UAA201612108A UA121113C2 UA 121113 C2 UA121113 C2 UA 121113C2 UA A201612108 A UAA201612108 A UA A201612108A UA A201612108 A UAA201612108 A UA A201612108A UA 121113 C2 UA121113 C2 UA 121113C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
hydrolysis
lignocellulosic material
oxygen
enzyme
fermentation
Prior art date
Application number
UAA201612108A
Other languages
English (en)
Inventor
Бертус Нордам
Лус Елізабет Беверс
Лус Элизабет Беверс
Руді Франсуа Марія Йозеф Партон
Руди Франсуа Мария Йозеф Партон
Міхаель Петрус Йозеф Беркхаут
Михаель Петрус Йозеф Беркхаут
Original Assignee
Дсм Айпі Асетс Б.В.
ДСМ АйПи АСЕТС Б.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=53008520&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA121113(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Дсм Айпі Асетс Б.В., ДСМ АйПи АСЕТС Б.В. filed Critical Дсм Айпі Асетс Б.В.
Publication of UA121113C2 publication Critical patent/UA121113C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/16—Butanols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C13—SUGAR INDUSTRY
    • C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
    • C13K1/00—Glucose; Glucose-containing syrups
    • C13K1/02—Glucose; Glucose-containing syrups obtained by saccharification of cellulosic materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C13—SUGAR INDUSTRY
    • C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
    • C13K13/00—Sugars not otherwise provided for in this class
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C13—SUGAR INDUSTRY
    • C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
    • C13K13/00—Sugars not otherwise provided for in this class
    • C13K13/002—Xylose
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
    • D21C3/00—Pulping cellulose-containing materials
    • D21C3/22—Other features of pulping processes
    • D21C3/26—Multistage processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P2201/00—Pretreatment of cellulosic or lignocellulosic material for subsequent enzymatic treatment or hydrolysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P2203/00—Fermentation products obtained from optionally pretreated or hydrolyzed cellulosic or lignocellulosic material as the carbon source
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Винахід належить до способу одержання цукрового продукту з лігноцелюлозного матеріалу, що включає попередню обробку лігноцелюлозного матеріалу тепловою, механічною і/або хімічною модифікацією або будь-якою комбінацією таких способів, ферментативний гідроліз, підданий попередній обробці лігноцелюлозного матеріалу із застосуванням ферментної композиції, що включає щонайменше дві целюлази; де ферментна композиція щонайменше містить літичну полісахаридну монооксигеназу, де кількість утвореної глюконової кислоти наприкінці ферментативного гідролізу шляхом окиснення лігноцелюлозного матеріалу, що містить целюлозу й/або целолігосахариди, підтримують від 3 до 10 г/кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі шляхом додавання необхідної кількості кисню після попередньої обробки й до й/або під час ферментативного гідролізу лігноцелюлозного матеріалу.

Description

Область техніки, до якої відноситься винахід
Винахід відноситься до способу ферментативного гідролізу лігноцелюлозного матеріалу й ферментації цукрів.
Попередній рівень техніки
Лігпоцелюлозний рослинний матеріал, який також називається сировинним матеріалом, є поновлюваним джерелом енергії у формі цукрів, які можна перетворити в корисні продукти, наприклад, цукри або біопаливо, таке як біоетанол. Під час цього процесу (лігно- або гемі- )целюлоза, присутня у вихідній сировині, такій як пшенична солома, кукурудзяна солома, рисова лушпайка і т.д., перетворюється на відновлюючи цукри за допомогою (гемі)целюлолітичних ферментів, які потім необов'язково перетворюються в корисні продукти, такі як етанол, за допомогою таких мікроорганізмів, як дріжджі, бактерії й гриби.
Оскільки (гемі)целюлоза є кристалічною й вбудована в мережу лігніну, перетворення на відновлюючі цукри, є в цілому повільним і неповним. Як правило, ферментативний гідроліз неопрацьованого сировинного матеріалу дає менше 20 95 від теоретичної кількості цукрів. При використанні хімічної й термофізичної попередньої обробки (гемі)целюлоза стає більш доступною для (гемі)целюлолітичних ферментів, і таким чином, перетворення проходять швидше й з більш високим виходом.
Типовий вихід етанолу із глюкози, отриманої з попередньо обробленої кукурудзяної соломи, становить 40 галонів етанолу на 1000 кг сухої кукурудзяної соломи (Ваддег, Р, "ЕШВапої! їот сеййшШо5е: а депега! геміем, Ттепав іп пем/у стор5 апа пем/ изев5", 2002, у. УапісК апа А. МпірКеу (ед5.) АН Ргез5, АІехапагіа, МА) ("Етанол із целюлози: загальний огляд; напрямку в нових сільськогосподарських культурах і нових видах застосування")) або 0,3 г етанолу на г сировинного матеріалу. Максимальний вихід етанолу на основі целюлози становить приблизно 90 Фр.
Целюлолітичні ферменти - більшість із них виробляються такими видами, як Тгісподегта,
Нитісоїа і Азрегойи5 - комерційно застосовуються для перетворення попередньо обробленого сировинного матеріалу на сусло, яке містить нерозчинну (гемі)целюлозу відновлюючі цукри, отримані з неї, і лігнін. Термостабільні целюлолітичні ферменти, отримані з Казатвзопіа, застосовуються для деградації лігноцелюлозного сировинного матеріалу, і ці ферменти відомі
Зо своєю термостабільністю, див. МО 2007/091231. Отримане сусло застосовують у ферментації, під час якої відновлюючі цукри, перетворюються в дріжджову біомасу (клітини), диоксид вуглецю й етанол. Етанол, отриманий таким способом, називається біоетанолом.
Загальне одержання цукрів з попередньо обробленого лігноцелюлозного сировинного матеріалу, гідроліз, який також називають зрідженням, попереднім оцукрюванням або оцукрюванням, як правило, відбувається під час процесу, що триває від 6 до 168 годин (Киптаг,
З. Сет. Епд. Тесппої. 32 (2009) 517-526) за підвищених температур від 45 до 50"С ів нестерильних умовах. Під час цього гідролізу присутня целюлоза частково (як правило, від 30 до 95 95, залежно від активності ферменту й умов гідролізу) перетворюється в відновлюючі цукри. У випадку інгібування ферментів сполуками, які присутні в попередньо обробленому вихідному матеріалі і які вивільняються цукрами, і для мінімізації термічної інактивації, цей період підвищеної температури якнайсильніше скорочують.
Ферментацію після гідролізу проводять на окремому, переважно анаеробному етапі способу, у тому ж самому або в іншому посуді, температуру якого доводять до 30-33 С (мезофільний процес) для пристосування до росту й продукції етанолу мікробною біомасою, зазвичай дріжджами. Під час цього процесу ферментації, решта (гемі)уцелюлозного матеріалу перетворюється у відновлюючі цукри, ферментами, уже присутніми з етапу гідролізу, у той час як продукується мікробна біомаса й етанол. Ферментацію закінчують, як тільки (гемі)зцелюлозний матеріал перетворюється у ферментовані цукри, а всі ферментовані цукри перетворюються в етанол, диоксид вуглецю й мікробні клітини. Це може займати до 6 днів. У цілому, загальний час процесу гідролізу й ферментації може становити до 13 днів.
Отримане таким способом ферментоване сусло складається з неферментованих цукрів, негідролізованого (гемі)целюлозного матеріалу, лігніну, мікробних клітин (найчастіше дріжджових клітин), води, етанолу, розчиненого диоксиду вуглецю. Під час наступних етапів етанол відокремлюють дистиляцією від сусла й піддають додатковому очищенню. Тверду суспензію, яка залишилася, сушать і застосовують, наприклад, у якості горючої суміші, фертилізатора або корму для великої рогатої худоби.
МО 2010/080407 пропонує обробку целюлозного матеріалу целюлазною композицією в анаеробних умовах. Видалення або виключення активних форм кисню може поліпшувати продуктивність системи ферментів, які гідролізують целюлозу. Гідроліз целюлозного матеріалу, бо наприклад, лігноцелюлози ферментною композицією може знижуватися через окисне ушкодження компонентів ферментної композиції й/або окиснення целюлозного матеріалу, наприклад, молекулярним киснем.
МО 2009/046538 розкриває спосіб обробки лігноцелюлозних сировинних рослинних матеріалів для вивільнення ферментованих цукрів із застосуванням способу ферментативного гідролізу для обробки матеріалів, який виконується під вакуумом, що й продукує багатий цукром технологічний потік, що включає знижені кількості летких сполук, таких як фурфураль і оцтова кислота, які інгібують ферментацію цукрів. Крім видалення летких інгібуючих сполук, видаляються інші сполуки й/або молекули, які включають азот, кисень, аргон і диоксид вуглецю.
З кожним завантаженням сировинного матеріалу додають ферменти для максимізації виходу й швидкості вивільнення ферментованих цукрів з попередньо обробленого лігноцелюлозного сировинного матеріалу в певний час процесу. У цілому витрати на продукцію ферментів, сировинний матеріал і вихід етанолу й капіталовкладення є основними факторами вартості в загальних витратах на виробництво (Китаг, 5. Спет. Епд. Тесппої. 32 (2009) 517- 526). До теперішнього часу зниження застосування ферментів досягається шляхом використання ферментних продуктів з одного або з кількох мікробних джерел (М/О 2008/008793) з більш широкою й/або високою (питомою) гідролітичною активністю, чиє застосування націлене на зниження потреби у ферментах, більш високі швидкості перетворення й/або більш високий вихід перетворення, і таким чином, на загальне зниження витрат на виробництво біоетанолу. Це вимагає більших інвестицій у дослідження й розробку цих ферментних продуктів. У випадку, коли ферментний продукт складається з ферментів з декількох мікробних джерел, потрібні більші інвестиції для одержання кожної конкретної ферментної сполуки.
Таким чином, необхідно поліпшити вищевказаний спосіб, що включає гідроліз і ферментацію.
Виклад сутності винаходу
Таким чином, завданням даного винаходу є забезпечення способу, у якому етап гідролізу проводять в удосконалених умовах. Іншим завданням винаходу є забезпечення способу, що включає гідроліз зі скороченим часом процесу. юІншим завданням винаходу є забезпечення способу, де дозування ферменту може бути зменшене, а при цьому вихід корисного продукту гідролізу підтримується на тому ж самому рівні або навіть підвищується. Іншим завданням є
Зо забезпечення способу, який включає гідроліз, де умови процесу гідролізу є оптимізованими. Ще одним завданням винаходу є забезпечення способу, який включає гідроліз, де вихід корисного продукту гідролізу підвищується при використанні того ж самого дозування ферменту. Одне або декілька із цих завдань вирішуються відповідно до винаходу.
Даний винахід забезпечує спосіб приготування цукрового продукту з лігноцелюлозного матеріалу, що включає наступні етапи: (а) необов'язково, попередньої обробки лігноцелюлозного матеріалу; (Б) необов'язково, промивання необов'язково підданого попередній обробці лігноцелюлозного матеріалу; (с) ферментативного гідролізу необов'язково промитого й/або необов'язково підданого попередній обробці лігноцелюлозного матеріалу в гідролітичному реакторі із застосуванням ферментної композиції що включає щонайменше дві целюлази; і при цьому ферментна композиція щонайменше містить ЛІПИМО, і (а) необов'язково, видалення глюкозо-вмісної композиції; де кількість утвореної глюконової кислоти наприкінці ферментативного гідролізу шляхом окиснення ЛОМО лігноцелюлозного матеріалу, що містить целюлозу й/або целолігосахариди, підтримують від З до 80 г/кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, шляхом додавання придатної кількості кисню після попередньої обробки й до й/або під час ферментативного гідролізу лігноцелюлозного матеріалу.
Крім того, цей винахід забезпечує спосіб приготування продукту ферментації з лігноцелюлозного матеріалу, що включає наступні етапи: (а) необов'язково, попередньої обробки лігноцелюлозного матеріалу; (Б) необов'язково, промивання необов'язково підданого попередній обробці лігноцелюлозного матеріалу; (с) ферментативного гідролізу необов'язково промитого й/або необов'язково підданого попередній обробці лігноцелюлозного матеріалу із застосуванням ферментної композиції, що включає щонайменше дві целюлази, і при цьому ферментна композиція щонайменше містить
ЛПМО, і необов'язково очищення гідролізованого лігноцелюлозного матеріалу, (4) ферментації гідролізованого лігноцелюлозного матеріалу для одержання продукту ферментації; і бо (є) необов'язково, видалення продукту ферментації;
де кількість утвореної глюконової кислоти наприкінці ферментативного гідролізу шляхом окиснення ЛОПМО лігноцелюлозного матеріалу, що містить целюлозу й/або целолігосахариди, підтримують від З до 80 г/кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, шляхом додавання придатної кількості кисню після попередньої обробки й до й/або під час ферментативного гідролізу лігноцелюлозного матеріалу.
Окиснення лігпоцелюлозного матеріалу за допомогою ЛІМО приводить до окиснених полісахаридів, які при гідролізі гідролізуються, серед іншого, у глюкозу й окиснені глюкозні одиниці, такі як глюконова кислота або диол. Як правило, 1 молекула кисню (Ог) дає один моль продукту окиснення. Кисень може також споживатися сировинним матеріалом (наприклад, лігніном).
Переважно, кисень додають під час етапу ферментативного гідролізу (с).
У кращому варіанті здійснення кисень додають у формі (газових) пухирців.
Несподівано, відповідно до даного винаходу, шляхом додавання кисню можна досягти багатьох переваг способу, включаючи оптимальні температурні умови, скорочення часу процесу, зниження дозування ферменту, повторне застосування ферментів, високий вихід і інші вдосконалення процесу, що приводить до зниження витрат.
В одному варіанті здійснення цього способу час ферментації становить від 5 до 120 годин. В одному варіанті здійснення стабільна ферментна композиція зберігає активність протягом 30 годин або більше. Відповідно до іншого варіанта здійснення, гідроліз переважно проводять за температури 45 "С або більше, більш переважно за температури 50 "С або більше, і ще більш переважно за температури 55 С або більше. У кращому варіанті здійснення ферментна композиція отримана із грибків, переважно з мікроорганізму з роду Казатвзхопіа, або ферментна композиція включає грибковий фермент, переважно фермент Казатзопіа. Спосіб з винаходу більш докладно ілюстрований нижче.
Докладний опис винаходу
Протягом опису й формули винаходу слова "містити" і "включати" і їх варіанти, такі як "містить", "вмісний", "включає" і "який включає" повинні інтерпретуватися, як включаючі. Тобто, ці слова призначені для вираження можливого включення інших елементів або цілих чисел, не перерахованих спеціально, де це випливає з контексту. Терміни однини призначено для
Ко) позначення одного або більш ніж одного (тобто одного або щонайменше одного) граматичного об'єкта статті. Як приклад, "елемент" може означати один елемент або більш одного елемента.
У контексті даного винаходу терміни "удосконалений", "підвищений", "знижений" застосовуються для зазначення, що даний винахід демонструє перевагу в порівнянні з тією ж самою ситуацією, процесом або умовами процесу, за винятком відсутності додавання зайвого кисню. У контексті даного винаходу "визначений за тих же самих умов" або "аналізований за тих же самих умов" і т.д. означає, що спосіб даного винаходу й той же самий спосіб без додавання кисню проводять у тих же самих умовах (за винятком додавання кисню), і що результати представленого способу, у порівнянні зі способом без додавання кисню, вимірюють за тих же самих умов, переважно із застосуванням одного й того ж аналізу й/або методології, більш переважно, у тому самому або в паралельному експерименті. Умови гідролізу є, наприклад, такими умовами.
У попередньому рівні техніки пропонується поліпшення гідролізу целюлолітичного матеріалу із застосуванням анаеробних (МО 2010/080407) або вакуумних (МО 2009/046538) умов під час ферментативного гідролізу. У способах з обох документів рівень кисню знижували. Було несподівано встановлено, що гідроліз за даним винаходом показує результати вдосконалення продукту реакції, який дає більш високі кількості (відновлюючих) цукрових продуктів і/або необхідних продуктів ферментації у ферментації після гідролізу, у порівнянні зі способом, у якому не додають кисню. У цілому, підвищення перетворення глюкози становить від 5 до 15 мас. 95.
Кисень можна додавати декількома способами. Наприклад, кисень може бути доданий у вигляді газоподібного кисню, збагаченого киснем газу, такого як збагачене киснем повітря, або повітря. Кисень можна додавати безупинно або періодично. "Додавання" кисню означає, що кисень додають у рідку фазу (яка містить лігноцелюлозний матеріал) у гідролітичний реактор, а не те, що кисень присутній у вільному просторі реактора над рідкою фазою, де кисень повинен дифундувати з вільного простору в рідку фазу. Переважно, кисень додають або генерують у рідкій фазі (яка містить лігноцелюлозний матеріал) у гідролітичному реакторі. Більш переважно, кисень додають у вигляді пухирців, найбільше переважно, маленьких пухирців. В одному варіанті здійснення пухирці мають діаметр щонайменше 0,5 мм, щонайменше 1 мм, щонайменше 1,5 мм, щонайменше 2 мм, щонайменше 2,5 мм, щонайменше З мм, щонайменше 60 3,5 мм, щонайменше 4 мм, щонайменше 4,5 мм, щонайменше 5 мм. В одному варіанті здійснення пухирці мають діаметр від 0,5 мм до 500 мм, переважно від 0,5 до 400 мм, від 0,5 до 300 мм, від 0,5 до 200 мм, від 0,5 до 100 мм. Автори винаходу висунули гіпотезу, що на етапі (ферментативного) гідролізу аморфні полісахариди гідролізуються до цукрів, таких як глюкоза.
Аморфні полісахариди, наприклад, перетворюються в олігосахариди ендоглюконазами, при цьому згодом олігосахариди можуть перетворюватися целобіогідролазою (ЦБГ) і бета- глюкозидазою (БГ) у глюкозу. Перетворення кристалічних полісахаридів може відбуватися паралельно або послідовно, і тривати навіть коли більшість аморфних полісахаридів гідролізується. Відповідно до представленої гіпотези, особливо додавання кисню в комбінації із
ЛІМО сприятливе при гідролізі кристалічних полісахаридів, наприклад, при деградації полісахаридів в олігосахариди. Таким чином, додавання кисню дуже корисне, особливо у фазі, коли кристалічні полісахариди перетворюються ферментами. Поза цією фазою відсутність додавання кисню або додавання меншої кількості кисню може бути більш ефективним. Ця гіпотеза є єдиною, що дає можливе пояснення ефекту, який спостерігається авторами винаходу, і цей винахід не спростовує й не заперечує правильність цього припущення.
Кристалічна структура глюканів може бути відкрита літичною полісахарид-монооксигеназою (ЛІПМО). Цей тип ферменту відкриває структуру шляхом окиснення глікозидних зв'язків і забезпечення їх доступності для інших целюлолітичних ферментів для наступного гідролізу олігосахаридів у глюкозу.
Більшість відомих ЛОІМО утворюють альдонові кислоти, тобто продукти, окиснені в С1 положенні термінального цукру в ділянці розщеплення. Ця окиснена глюкозна одиниця вивільняється у вигляді глюконової кислоти при гідролізі. Крім того, відзначене окиснення Са і
Сб невідновлюючої глюкозної одиниці на ділянці розщеплення. Наприклад, Т. Ізаксхеп еї. аї. (вище) повідомляли про окиснення С4 положення невідновлюючого кінцевого компонента, що призводить до утворення кето-цукру в С4 положенні, який перебуває в рівновазі із приєднаним до того ж атому С4 діолом у водному розчині. Автори даного винаходу припустили, що гідролізовані продукти окиснення, наприклад, такі як глюконова кислота, є мірою активності застосованої ЛІПІМО в гідролізі лігноцелюлози.
Автори даного винаходу несподівано встановили, що оптимальний гідроліз лігноцелюлози (перетворення більш 7095 глюканів) пов'язаний з оптимальним утворенням продуктів
Зо окиснення, згаданих вище, наприклад, таких як глюконова кислота. Очевидно, що оптимальний гідроліз лігноцелюлози може досягатися тільки тоді, коли (кристалічна) целюлоза й целолігосахариди оптимально гідролізуються. Оптимальний гідроліз під дією ЛОМО приводить до утворення продукту окиснення, такого як глюконова кислота. Відсутність продукту окиснення означає менш ефективний гідроліз (кристалічного) глюкану. Однак занадто високі рівні продуктів окиснення, таких як глюконова кислота, відбуваються при витраті глюкози, і таким чином, вихід глюкози по (вихідному) глюкану знижується. Кількість утворених продуктів окиснення при окисненні ЛЛМО целюлози й/або целолігосахаридів переважно зберігається від З до 110 г/кг глюкану присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, шляхом додавання необхідної кількості кисню після попередньої обробки й до й/або під час ферментативного гідролізу в лігноцелюлозний матеріал. Переважно, продуктом окиснення є альдонова кислота й/або гемінальний діол, більш переважно, гідролізованим продуктом окиснення є глюконова кислота.
Переважно, кількість утворених гідролізованих продуктів окиснення при окисненні целюлози й/або целолігосахаридів підтримується від 4 до 8 г/кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, більш переважно від 5 до 60 г/кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, ще більш переважно від 6 до 40 г/кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, ще більш переважно від 7 до 30 г/кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі й найбільше переважно від 8 до 25 г/кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі. В іншому варіанті здійснення кількість утвореної глюконової кислоти при окисненні целюлози й/лабо целолігосахаридів підтримується від З до 110 г/кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, переважно від З до 80 г/кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі переважно від З до 75 г/кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі переважно від З до 70 г/кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі переважно від З до 65 г/кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, переважно від З до 60 г/кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, переважно від З до 50 г/кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі переважно від 4 до 50 г/кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, більш переважно від 4 до 30 г/кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, ще більш переважно від 4 до 20 г/кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, і найбільше переважно від 5 до 10 г/кг глюкану, присутнього в бо лігноцелюлозному матеріалі.
За допомогою способу за даним винаходом переважно одержують вищі виходи глюкози.
Додавання більш високих кількостей кисню приводить до більшого утворення глюконової кислоти замість глюкози, а з іншого боку, у випадку низьких кількостей кисню ЛОМО нездатна оптимально функціонувати. Далі, відзначалося, що занадто високі кількості продуктів окиснення, таких як глюконова кислота, можуть інгібувати целюлази або геміцелюлази, або у випадку наступної ферментації гідролізата, глюконова кислота може впливати на ферментацію шляхом інгібування мікроорганізму, такого як дріжджі, використаного при ферментації.
Вищевказані кількості є кількостями наприкінці гідролізу.
Як правило, кількість кисню, що додається після попередньої обробки й до й/або під час ферментативного гідролізу в лігноцелюлозний матеріал, можна контролювати або змінювати різними способами. Обмеження подачі кисню можливо шляхом додавання кисню тільки під час частини часу гідролізу. Іншим варіантом є додавання кисню в низькій концентрації, наприклад, за допомогою суміші повітря й рециркулюючого повітря (повітря, що виходить із гідролітичного реактора) або шляхом "розведення" повітря інертним газом. Підвищення кількості кисню, що додається, може бути досягнуте шляхом додавання кисню протягом більш тривалого часу гідролізу, шляхом додавання кисню в більш високій концентрації або шляхом додавання більшої кількості повітря. Іншим варіантом зміни споживання кисню є зміна температури гідролізу, більш висока температура викликає зниження максимальної концентрації насичення киснем вмісту реактора. Іншим способом контролю концентрації кисню є додавання споживача кисню або генератора кисню. У випадку, якщо фермент може ушкоджуватися при наявності або при додаванні кисню, можна застосовувати більш помірну подачу кисню. У цьому випадку може бути знайдений баланс між поліпшеним виробленням глюкози й продуктивністю ферменту.
Додавання кисню ов целюлолітичний матеріал можна проводити до й/або під час ферментативного гідролізу. У випадку додавання кисню в газоподібній формі, кисневмісний газ можна вводити, наприклад, вдмухувати, у рідкий уміст гідролітичного реактора (із целюлолітичного матеріалу. В іншому варіанті здійснення винаходу кисневмісний газ уводять у рідкий потік целюлолітичного матеріалу, який надходить у гідролітичний реактор. В іншому варіанті здійснення винаходу кисневмісний газ уводять разом із целюлолітичним матеріалом, який надходить у гідролітичний реактор, або із частиною рідкого вмісту реактора, який проходить зовнішню петлю реактора. У більшості випадків додавання кисню до надходження в гідролітичний реактор не є достатнім, і додавання кисню можна здійснювати також під час гідролізу. В іншому варіанті здійснення винаходу газову фазу, що присутня у верхній частині реактора (вільному просторі), безупинно або періодично оновлюють кисневмісним газом. В останньому випадку необхідне (активне) збовтування або перемішування для проходу кисню у вигляді пухирців і/або за допомогою дифузії в рідкий уміст реактора, переважно в комбінації з надлишковим тиском у реакторі. У цілому, продування вільного простору повітрям у комбінації з (активним) збовтуванням або перемішуванням може забезпечувати достатнє введення кисню в целюлолітичний матеріал у гідролітичному реакторі для реакторів розміром від 100 літрів до 1 м. При більшому масштабі, наприклад, у реакторі 50 м3 або більше, наприклад, 100 му, потрібно так багато енергії для активного перемішування, що з економічної точки зору це незастосовно в комерційних операційних процесах.
Як описано в даній заявці, кількість утвореної глюконової кислоти наприкінці ферментативного гідролізу за допомогою ЛІМО лігноцелюлозного матеріалу, що містить целюлозу й/або целолігосахариди, зберігають від З до 80 г/кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, шляхом додавання необхідної кількості кисню після попередньої обробки до й/або під час ферментативного гідролізу до лігноцелюлозного матеріалу. В одному варіанті здійснення "необхідна кількість кисню становить 20-10,000 ммоль кисню на кілограм глюкану, переважно 30-5,000 ммоль кисню на кілограм глюкану, більш переважно 40 - 4,000 ммоль кисню на кілограм глюкану й найбільше переважно 50-3,500 ммоль кисню на кілограм глюкану. Кількість кисню є повною кількістю кисню, доданого при ферментативному гідролізі.
Відповідно до даного винаходу, кисень може бути доданий перед етапом гідролізу, під час частини етапу гідролізу, під час усього етапу гідролізу, або комбінації до або під час етапу гідролізу. Переважно, кисень додають під час першої половини етапу гідролізу. Додавання кисню під час тільки частини гідролізу можна проводити, наприклад, у випадку, якщо відбувається окисне ушкодження ферменту(ів). У випадку присутності кисню в гідролітичному реакторі вміст цукрового продукту або гідролізату, утвореного на етапі гідролізу, може впливати або порушувати наступний етап ферментації, і додавання кисню можна проводити за винятком останньої частини гідролізу, і таким чином, кисень (більша частина) споживається до надходження гідролізованої біомаси в реактор для ферментації. бо Деякі приклади аерації під час процесу ферментативного гідролізу наведені в Прикладах для демонстрації сприятливого ефекту даного винаходу. Цей сприятливий ефект виявлений для деяких субстратів або сировинних матеріалів, і таким чином, як уважається, є присутнім при гідролізі всіх видів субстратів або сировинних матеріалів.
Деякі приклади ферментних композицій для процесу ферментативного гідролізу наведені в
Прикладах для демонстрації корисного ефекту даного винаходу. Цей корисний ефект був установлений для деяких ферментних композицій, і таким чином, визнаний присутнім для всіх видів гідролізуючих ферментних композицій.
В іншому кращому варіанті здійснення винаходу концентрація кисню (РК) у рідкій фазі, де є присутнім лігноцелюлозний матеріал під час ферментативного гідролізу, становить щонайменше 0,001 моль/м?, переважно щонайменше 0,002 моль/м3, більш переважно щонайменше 0,003 моль/м3 і ще більш переважно більше 0,01 моль/м3, наприклад, більше 0,02 моль/м3 або 0,03 моль/м3. У реакторах об'ємом менше 1 м3 значення РК нижче 0,01 моль/м3 або 0,02 моль/м3 досягаються шляхом повільного перемішування. Інтенсивне перемішування або збовтування в такому масштабі вводить частину газової фази з вільного простору в реакційну рідину. Наприклад, перемішування або збовтування може створити лійку, що вводить кисень у рідину. У цілому, продування вільного простору повітрям у комбінації з (інтенсивним) перемішуванням або збовтуванням забезпечує введення достатньої кількості кисню в целюлозний матеріал у гідролітичному реакторі для реакторів розміром від 100 літрів до 1 м3. У більшому об'ємі, наприклад, у реакторі об'ємом 50 му або більше, наприклад, 100 му, потрібно так багато енергії для інтенсивного перемішування, що з економічної точки зору це незастосовно в комерційному операційному процесі. У цілому, у більших реакторах перемішування або збовтування без уведення повітря або кисню приводить до значень РК менше 0,01 моль/м3.
В іншому кращому варіанті здійснення винаходу при генерації або продукції кисню концентрація кисню в рідкій фазі (аерація або додавання кисню), де є присутнім лігноцелюлозний матеріал під час ферментативного гідролізу, становить переважно якнайбільше 8095 від концентрації насичення кисню в умовах реакції гідролізу, більш переважно якнайбільше 0,12 моль/м3, ще більш переважно якнайбільше 0,09 моль/м3, ще більш переважно якнайбільше 0,06 моль/мУ, ще більш переважно якнайбільше 0,045 моль/м3 і
Зо найбільше переважно якнайбільше 0,03 моль/м3. Вищевказане враховує ситуацію, коли швидкість перенесення кисню з лігноцелюлозного матеріалу перевищує швидкість споживання кисню (ШСК) лігноцелюлозного матеріалу. Коли споживання кисню (ШСК) перевищує швидкість перенесення кисню, концентрація кисню становить 0 моль/м3. Температура й тиск впливають на
РК. Кращі й зразкові значення в моль/м", наведені вище, відносяться до нормального атмосферного тиску й температури близько 62 "С. Фахівець у даній області техніки зможе підібрати придатні значення РК на основі представлених вчень.
Відповідно до іншого кращого варіанта здійснення винаходу, кисень споживається в кількості, що відповідає від 20 до 5000 ммоль молекулярного кисню на кілограм глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі. Переважно, кисень споживається в кількості, що відповідає від 22 до 4500 ммоль молекулярного кисню на кілограм глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, від 24 до 4000 ммоль молекулярного кисню на кілограм глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, від 26 до 3500 ммоль молекулярного кисню на кілограм глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, від 28 до 3400 ммоль молекулярного кисню на кілограм глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі. Кисень додають після попередньої обробки й до й/або під час ферментативного гідролізу лігноцелюлозного матеріалу, переважно, у кількості, що відповідає щонайменше 30 ммоль молекулярного кисню на кілограм глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, більш переважно в кількості, що відповідає щонайменше 40 ммоль молекулярного кисню на кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, і найбільше переважно в кількості, що відповідає щонайменше 50 ммоль молекулярного кисню на кілограм глюкану, присутнього у лігноцелюлозному матеріалі. Увесь кисень, який додають у систему, переноситься в рідину й використовується для гідролізу. Цю кількість можна контролювати шляхом вимірювання й контролю кількості повітря, принесеного в систему.
Відповідно до іншого кращого варіанта здійснення винаходу, кисень споживається в кількості, що відповідає від 0,17 до 41,7 ммоль молекулярного кисню на кілограм глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, за годину. Переважно, кисень споживається в кількості, що відповідає від 0,18 до 37,5 ммоль молекулярного кисню на кілограм глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, за годину, від 0,20 до 33,3 ммоль молекулярного кисню на кілограм глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, за годину, від 0,22 до бо 29,2 ммоль молекулярного кисню на кілограм глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, за годину, від 0,23 до 28,3 ммоль молекулярного кисню на кілограм глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, за годину. Більш переважно, кисень споживається в кількості, що відповідає від 0,36 до 27,8 ммоль молекулярного кисню на кілограм глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, за годину. Увесь кисень, що додається в систему, переноситься в рідину й застосовується для гідролізу. Цю кількість можна контролювати шляхом вимірювання й контролю кількості повітря, внесеного в систему. "За годину", як застосовується в даній заявці, означає за годину гідролізу.
Додавання кисню у формі повітря або іншого кисневмісного газу відповідно до даного винаходу можна також застосовувати для щонайменше часткового збовтування або перемішування вмісту гідролітичного реактора. Інші способи додавання кисню включають генерацію кисню іп 5йи. Наприклад, кисень генерують шляхом електролізу, кисень продукують ферментативно, переважно шляхом додавання перекису, або кисень продукують хімічним шляхом, наприклад, за допомогою систем, що генерують кисень, таких як КНЗО»5. Наприклад, кисень продукується з перекису каталазою. Перекис можна додавати у формі розчиненого перекису, або генерувати шляхом ферментативної або хімічної реакції. У випадку, коли каталазу застосовують як фермент для продукції кисню, можна застосовувати каталазу, що присутня у ферментній композиції для гідролізу, або каталазу можна додавати з цією метою.
Представлений спосіб за даним винаходом демонструє переваги, особливо в пілотному масштабі й промисловому масштабі. Відповідно до одного варіанту здійснення винаходу, реактор для ферментативного гідролізу має об'єм 1 м3 або більше. Переважно, реактор має об'єм щонайменше 1 м3, щонайменше 2 му, щонайменше З м3, щонайменше 4 м3, щонайменше 5 мі, щонайменше 6 м3, щонайменше 7 му, щонайменше 8 му, щонайменше 9 м3, щонайменше 10 м3, щонайменше 15 м3, щонайменше 20 м3, щонайменше 25 му, щонайменше 30 му, щонайменше 35 м3, щонайменше 40 м3, щонайменше 45 му, щонайменше 50 м3, щонайменше 60 м, щонайменше 70 м3, щонайменше 75 м, щонайменше 80 м, по меншій мері 90 му, щонайменше 100 м, щонайменше 200 м3, щонайменше 300 м", щонайменше 400 му, щонайменше 500 м, щонайменше 600 м, щонайменше 700 м", щонайменше 800 му, щонайменше 900 м3, щонайменше 1000 м3, щонайменше 1500 м3, щонайменше 2000 му, щонайменше 2500 м3. У цілому, реактор повинен бути менше 3000 м" або 5000 м3. Можна
Зо використовувати кілька реакторів. Реактори, використовувані в способах за даним винаходом, можуть мати той самий об'єм, але також можуть мати різні об'єми.
Автор даного винаходу припустив, що особливо при великомасштабному виробництві недостатньо кисню, доступного для гідролізу що може бути обумовлено обмеженнями перенесення кисню в реакторі, наприклад, у целюлолітичній біомасі. В експериментах у лабораторному масштабі ця недостатність кисню може відіграти менш важливу роль.
Відношення поверхневої площі (або площі контакту з киснем умісту реактора) до об'єму реактора є більш сприятливим для експериментів у маленькому масштабі, ніж для великомасштабних експериментів. Далі, перемішування в експериментах у маленькому масштабі відносно легше перемішування у великому масштабі. Під час цих експериментів у маленькому масштабі також швидше відбувається транспорт кисню з вільного простору гідролітичного реактора, у порівнянні з великомасштабними експериментами. Ця теорія є єдиною, що дає можливе пояснення ефекту, відзначеного авторами даного винаходу, і цей винахід не спростовує й не заперечує правильність цієї теорії. Відповідно до іншого варіанту здійснення винаходу, додавання кисню можна застосовувати для щонайменше часткового контролю процесу гідролізу.
Спосіб за даним винаходом переважно застосовують у комбінації з використанням термостабільних ферментів. "Термостабільний" фермент означає фермент, що має температурний оптимум 60 "С або вище, наприклад, 70 "С або вище, такий як 75 "С або вище, наприклад, 80 "С або вище, такий як 85 "С або вище. Він може бути, наприклад, виділений з термофільних мікроорганізмів, або може бути сконструйований фахівцем у даній області техніки й штучно синтезований. В одному варіанті здійснення полінуклеотиди можуть бути виділені або отримані з термофільних або термотолерантних міцеліальних грибків, або виділені з нетермофільних або нетермотолерантних грибків, але є термостабільними. "Термофільний грибок" означає грибок, що росте за температури 50 "С або вище. "Термотолерантний" грибок означає грибок, що росте за температури 45 "С або вище, і має максимум близько 50 "С.
Прикладами термофільних грибкових штамів є Казатвбхопіа етегзопії (раніше відомий як
Таіаготусе5 етегвопі; Таіаготусе5 етегзопії, РепісйШіит деобтіїйіа етегзопії і Казатзопіа бо етегзопії застосовуються взаємозамінно в даній заявці).
Придатними термофільними або термотолерантними грибковими клітинами можуть бути клітини Нитісоїа, РПіготисої, Мусеїорпїйога, Назатвбзопіа, Таіаготусе5, Ппептотусев,
Тнептоазсив або Тпіеіама, переважно клітини Казатзхопіа етегзопії. Кращими термофільними або термотолерантними грибками є Нитісоїа дгізеа маг. (Шептоїідеа, Нитісоїа Іапидіпоза, Мусеїйорпійога Шепторніа, Раршавзрога Шепторийа, Назатбвхтопіа Був5зоспіатуадоідев,
Вазатвзопіа етегїзопії, Назатвзхопіа агодіПасеа, Назатзтопіа еритеап, Назатвзопіа Бгемівзіїрітава,
Вазатвхопіа суїїпагозрога, ВПіготисог ривіїйшв5, ННПіготисог тіейеї, Таіаготусе5 бБасійїзрогив,
Таіаготусе5 Ісусейапив5, Таіаготусе5 Шегпторпіїй5, Тпептотусе5 Іепидіпо5и5, Пегтоавсив сгизіасеи5, Тпептоазсиз (Шегторпйи5 Тпептоазсиз ашигапійасиз і Тпієїаміа їеггевігів.
Термофільні грибки не обмежуються специфічним таксономічним порядком, і всі належать до грибкової гілки еволюції. Прикладами є Кпіготисог у мукорових грибках, Мусеїйорпїпога у сордарієвих грибках, і ТаїЇаготусе5, Тпептотусе5 і ТПептоабхси5 в еуроцієвих грибках (Моиспасса 1997). Більшість видів Таіаготусев5 є мезофілами, але виключенням є види в групах
Етегвогі і Тпепторпйа. Група ЄЕютегзопі включає Таіаготусе5 етегвзопії, Таіаготусев5 руззоспіатуадоідев, Таіаготусез бБасіїйїзрогив і Таіаготусе5 ІеусеНапив5, усі з яких добре ростуть при 40 "С. Таіаготусез Брасійїзроги5 є термотолерантним, Т. Іеусенапих5 є термотолерантним або термофільним, а Т. етегзопії і Т. Ббуззоспіатуадоідез є істинно термофільними (50ІК апа зЗатз5оп 1972). Єдиний представник групи Таіаготусе5з Тпепторпйа, Т. (пегпторпйи5, швидко росте при 50 С (Емап5 апа 50ІКк 1971; Емап5 1971; 5ЮІК апа Затзоп 1972). Поточна класифікація цих термофільних видів Таіаготусе5 заснована головним чином на фенотипічних і фізіологічних характеристиках, таких як їхня здатність до росту за температури вище 40 "С, забарвлення аскоспор, структура оболонки аска, і утворення певного типу анаморфу. БІК апа Затв5оп (1972) установили, що члени групи Етегзопії мають анаморфи серій або Раесіотусез (Т. руззоспіатуаоїаез і Т. Іеусенапив5), або Репісіййшт суїїпагозрогит (Т. етегзопії і Т. расійййрогив).
Пізніше РІ (1979) переніс види, що належать до виду Репісіййшт суїїпагозрогит, У рід
Сеозтіїпіа, на підставі різних ознак, таких як утворення конідій з термінальних пор замість шийки, ознаки РепісйШіит і Раесйотусе5. З роду Сеозптіїйіа, тільки (3. агодШасеа є термотолерантним, і 500ЇК еї аіІ. (1969) і Емап5 (1971) припустили зв'язок із членами групи
Таіаготусе5 Етегзопії. Філогенетичний зв'язок термофільних видів Таіаготусе5 у межах
Таіаготусез і Тгіспосотасеає невідомий (див. У. Ноибгакеп, Апіопіе мап Геецуеппоек 2012 Рербр; 101(2): 403-21).
Казатвзопіа є новим родом, що містить термотолерантні й термофільні види Таїіаготусез і
Сеозтіїпіа «9. Ношибгакеп еї аіІ, вище). На основі фенотипічних, фізіологічних і молекулярних даних, НошбгакКеп еї а! запропонували перенести види Т. етегзопії, Т. Буззоспіатуаоіаев, Т. еригпецйз, о. агуйасеа і б. суїпагозрога у рід Казатвзопіа. Таіаготусе5 етегзопії, Репісйит деозтіїйіа етегзопії і Казатвзопіа етегзопії застосовуються взаємозамінно у даній заявці.
Кращими термофільними грибками є Казатбхопіа Буззоспіатудоіде5, Казатзопіа етегзопії,
Тпептотусев Іепидіпозив5, Таіаготусе5 ІШепторпйй5, Ппептоабсив сгпивіасеи5, Пептоавсив
ІШепторпійиз ії Тпегтоазсив аигапііасив. "Міцеліальні грибки" включають усі філаментні форми підвідділу Ештусоїа і Оотусоїа (як визначено Нам/к5могій еї аї., в "Аіпзууогй апа Візру Оісіопагу ої Те Еипді, 8" еайіоп, 1995,
САВ Іпіегпайіопаї, Опімегейу Ргез55, Сатьгідде, ОК ("Довідник грибів Бісбі")). Міцеліальні грибки характеризуються міцеліальною стінкою, що складається з хітину, целюлози, глюкану, хітозану, манану, і інших комплексних полісахаридів. Вегетативний ріст здійснюється за рахунок гірального подовження, а метаболізм вуглецю є облігатно аеробним. Штами міцеліальних грибків включають Астетопішт, Адагісив, Аврегадіїв, Айгеобавідіит, Веаймагіа, Сернаіозрогійт,
Сепрогпіорвзії, СНаєїотішт раесіотусев5, СНгузовзропййт, Сіамісерх, СоспіороЇшв5, Соргіпив,
Стуріососсив, Суаїйпив, ЕтегісеїМа, Епаоїйпіа, Епдоїніа тисог, Ріїїразідійт, Ризагпит, Сеозтіїніа,
Сіїосіадішт, Нитісоїа, Мадпаропйе, Мисог, Мусеїорпійога, Мугоїпесішт, МеосаїЇїтавіїх,
Мешгозрога, Раесіотусев, Репісійит, Ріготусез, Рапегоснавєїе, Рівигоїш5, Родозрога, Ругісшагніа,
Вазатзопіа, ВНіготисог, ВПігорив, 5суїайдійт, З5сНігорпуйшт, еіадопозрога, Таіаготусев,
Тпептоазсив, ТПептотусев, ТПівіаміа, Тоїуросіадіит, Ттатеїе5 ріеигоїш5, Тгісподегта і
Тиїспорнуйоп, але не обмежуються ними.
Деякі штами міцеліальних грибків легко доступні за номером колекцій культур, таких як
Американська колекція типових культур (АТСС), Німецька колекція мікроорганізмів і клітинних культур (О5М), Центральне бюро грибкових культур (СВ5), і Колекція патентованих культур
Служби сільськогосподарських досліджень, Північний регіональний дослідний центр (МКК).
Приклади таких штамів включають Азрегдійи5 підег СВ5 513,88, АзрегодіПи5 огулае АТСС 20423,
ІРО 4177, АТОС 1011, АТОС 9576, АТОС14488-14491, АТОС 11601, АТОС12892, Р. спгуводепит 60 СВ5 455,95, РепісйШіит сійпит АТСС 38065, Репісійит спгузодепит Ре, Таіаготусе5 етеїзопії
СВ 393,64, Асгетопішт спгузходепит АТСС 36225 або АТСС 48272, Тгісподегта геезві АТОС 26921 або АТСС 56765 або АТСС 26921, Аврегойи5 зо|дае АТСС11906, Спгузозрогішт
ІнсКпомжепзе С1, Сага 27К, МКМ Е-3500-О0, АТОС44006 і їх похідні.
Перевагою експресії й вироблення ферментів (наприклад, щонайменше двох, трьох або чотирьох різних целюлаз) у придатному мікроорганізмі може бути високий вихід ферментної композиції, яку можна застосовувати в способі за даним винаходом.
Відповідно до винаходу, шляхом додавання кисню можна досягти багатьох переваг способу, включаючи оптимальні температурні умови, скорочення часу процесу, зниження дозування ферменту, повторне застосування ферментів і інші оптимізації процесу, що приводить до зниження витрат. Переважно, винахід забезпечує спосіб, у якому етап гідролізу здійснюють за вдосконалених умов. Винахід також забезпечує спосіб, що включає гідроліз, що має скорочений час процесу. Далі, винахід забезпечує спосіб, де дозування ферменту може бути знижене, і в той же час вихід корисного продукту гідролізу залишається на тому ж самому рівні. Іншою перевагою винаходу є те, що представлений спосіб, що включає гідроліз, може приводити до оптимізованих умов процесу. Іншою перевагою винаходу є те, що вихід корисного продукту способу, що включає гідроліз, підвищується при тому ж самому дозуванні ферменту.
Стабільна ферментна композиція
Стабільна ферментна композиція означає у даній заявці, що ферментна композиція зберігає активність через 30 годин реакції гідролізу, переважно щонайменше 10 95, 20 95, ЗО 9о, 40 95,
БО бь, 60 96, 65 Зо, 70 90, 75 95, 80 965 85 96, 90 9о, 95 96, 96 95, 97 У, 98 95, 99 90 або 100 95 від вихідної активності через 30 годин реакції гідролізу. Переважно, ферментна композиція зберігає активність через 40, 50, 60, 70, 80, 90 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 годин реакції гідролізу.
В одному варіанті здійснення ферментна композиція, використовувана в способах за даним винаходом, отримана із грибків, або ферментна композиція, використовувана в способах за даним винаходом, містить фермент грибка. В одному варіанті здійснення ферментна композиція отримана з міцеліального грибка, або ферментна композиція містить фермент міцеліального грибка. Способи за винаходом переважно застосовують у комбінації з ферментними композиціями, отриманими з мікроорганізму з роду Казатвзопіа, або ферментна
Зо композиція містить фермент із Казатзопіа.
Ферментна композиція може бути приготовлена шляхом ферментації придатного субстрату з придатним мікроорганізмом, наприклад, Казатбвопіа ептегеопії або АзрегойШив5 підег, де ферментна композиція виробляється мікроорганізмом. Мікроорганізм може бути змінений для поліпшення або одержання целюлазної композиції. Наприклад, мікроорганізм може бути підданий мутації за допомогою класичних процедур поліпшення штаму або шляхом методик рекомбінантної ДНК. Таким чином, мікроорганізм, згаданий у даній заявці, можна застосовувати як такий для одержання целюлазної композиції, або він може бути змінений для підвищення продукції або для вироблення зміненої целюлазної композиції, яка може включати гетерологічні целюлази, такі ферменти, які не є первинно продуковані цим мікроорганізмом. Переважно грибок, більш переважно міцеліальний грибок застосовують для одержання целюлазної композиції. Переважно застосовують термофільний або термотолерантний мікроорганізм.
Необов'язково, застосовують субстрат, який індукує експресію ферментів у ферментній композиції при одержанні ферментної композиції.
Ферментну композицію застосовують для вивільнення цукрів з лігноцелюлози, яка включає полісахариди. Головними полісахаридами є целюлоза (глюкани), геміцелюлози (ксилани, гетероксилани й ксилоглюкани). Крім того, деяка геміцелюлоза може бути присутня у вигляді глюкомананів, наприклад, у сировинному матеріалі з деревини. Ферментативний гідроліз цих полісахаридів до розчинних цукрів, включаючи мономери й мультимери, наприклад, глюкозу, целобіозу, ксилозу, арабінозу, галактозу, фруктозу, манозу, рамнозу, рибозу, галактуронову кислоту, глюкуронову кислоту й інші гексози й пентози, здійснюється під дією різних ферментів, що діють узгоджено. "Цукровий продукт" означає продукт ферментативного гідролізу сировинного матеріалу або лігноцелюлозного матеріалу. Цукровий продукт включає розчинні цукри, у тому числі мономери й мультимери, переважно включає глюкозу. Прикладами інших цукрів є целобіоза, ксилоза, арабіноза, галактоза, фруктоза, маноза, рамноза, рибоза, галактуронова кислота, глюкуронова кислота й інші гексози й пентози. Цукровий продукт може застосовуватися як такий, або може бути підданий додатковій обробці, наприклад, очищений.
Крім того, пектини й інші пектинові речовини, такі як арабінани, можуть становити значну частину сухої маси стінок типової клітини із тканин недеревної рослини (приблизно від чверті до половини сухої маси може бути пектинами). 60 Целюлоза є лінійним полісахаридом, який складається із глюкозних залишків, зв'язаних р-
1,4 зв'язками. Лінійна природа целюлозних волокон, а також стехіометрія рД-зчепленої глюкози (відносно а) створює структури, більш схильні до зв'язування водню між ланцюгами, ніж високо розгалужені а-зчеплені структури крохмалю. Таким чином, целюлозні полімери, як правило, є менш розчинними, і утворюють більш тісно зв'язані волокна, ніж волокна, з яких складається крохмаль.
Ферменти, які можуть бути включені в стабільну ферментну композицію, використовувану за даним винаходом, далі описані більш докладно.
СНб1, ендоглюканази (ЕГ) і екзоцелобіогідролази (ЦБГ) каталізують гідроліз нерозчинної целюлози в такі продукти, як целолігосахариди (целобіоза в якості основного продукту), у той час як бета-глюкозидази (БГ) перетворюють олігосахариди, головним чином целобіозу й целотриозу, у глюкозу.
Геміцелюлоза є складним полімером, і її сполука часто широко варіює від організму до організму, і від одного типу тканини до іншого. Як правило, головним компонентом геміцелюлози є ВД-1,4-зчеплена ксилоза, цукор з п'ятьома атомами вуглецю. Однак ця ксилоза часто розгалужена на 0-3 і/або 0-2 атоми ксилози, і може бути заміщена зі зв'язками на арабінозу, галактозу, манозу, глюкуронову кислоту, галактуронову кислоту, або шляхом етерифікації на оцтову кислоту (і етерифікацією ферулової кислоти на арабінозу).
Геміцелюлоза може також містити глюкан, який є загальним терміном для р-зчеплених цукрів із шістьма вуглецевими атомами (таких як В-(1,3)(1,4) глюкани й гетероглюкани, згадані раніше) і крім того, глюкоманани (у яких глюкоза й маноза присутні в лінійному каркасі, зв'язуючись із іншими р-зв'язками).
Ксиланази разом Кк! іншими допоміжними ферментами, наприклад, а-І- арабінофуранозидазами, ферулоїл- і ацетилксилан естеразами, глюкуронідазами й р- ксилозидазами каталізують гідроліз геміцелюлоз.
Пектинові речовини включають пектини, арабінани, галактани й арабіногалактани. Пектини є найбільш складними полісахаридами в клітинній стінці рослин. Вони побудовані навколо серцевинного ланцюга з одиниць а(1,4)-зчепленої Ю-галактуронової кислоти, певною мірою упереміж з І -рамнозой. У будь-якій клітинній стінці є ряд структурних одиниць, які відповідають цьому опису, і в цілому вважається, що в окремій пектиновій молекулі серцевинні ланцюги
Зо різних структурних одиниць є безперервними з будь-якими іншими.
Основними типами структурної одиниці є: галактуронан (гомогалактуронан), який може бути заміщений метанолом на карбоксильній групі й ацетатом на 0-2 і 0-3; рамногалактуронан (РГІ), у якому одиниці галактуронової кислоти чергуються з рамнозними одиницями, що несуть бічні ланцюги (1,4)-зв'язаного галактану й (1,5)-зв'язаного арабінану. Арабінанові бічні ланцюги можуть приєднуватися безпосередньо до рамнози або опосередковано через галактанові ланцюги; ксилогалактуронану, з окремими ксилозильними одиницями на 0-3 галактуроновій кислоті (тісно пов'язаній із РГІ); ії рамногалактуронану І! (РГІЇ), особливо складній мінорній одиниці, яка містить незвичайні цукри, наприклад, апіозу. РГІЇ одиниця може містити два апіозильних залишки, які при придатних іонних умовах можуть зворотньо формувати складні ефіри з боратом.
Композиція для застосування в способі за даним винаходом має щонайменше дві активності, хоча, як правило, композиція має більше двох активностей, наприклад, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять або більше. Як правило, композиція за даним винаходом може містити щонайменше дві різні целюлази, або одну целюлазу й щонайменше одну геміцелюлазу.
Композиція за даним винаходом може містити целюлази, але не ксиланази. Крім того, композиція за даним винаходом може мати допоміжну ферментативну активність, тобто додаткову активність, яка прямо або опосередковано приводить до деградації лігноцелюлози.
Приклади таких допоміжних активностей згадані у даній заявці.
Таким чином, композиція для застосування за винаходом може містити СН, ендоглюканазну активність і/або целобіогідролазну активність і/або бета-глюкозидазну активність. Композиція для застосування за винаходом може містити більше однієї ферментативної активності одного або декількох із цих класів. Наприклад, композиція для застосування за даним винаходом може містити дві ендоглюканазних активності, наприклад, ендо-1,3(1,4)-ВД-глюканазну активність і ендо-В-1,4-глюканазну активність. Така композиція може також включати одну або декілька ксиланазних активностей. Така композиція може містити допоміжну ферментативну активність.
Композиція для застосування за даним винаходом може бути отримана із грибків, таких як міцеліальні грибки, такі як Казатвопіа, такі як Казатбзхопіа етегзопії. В одному варіанті здійснення основний набір (деградуючих целюлозу) ферментативних активностей може бути бо отриманий з Казатзопіа етегзопії. Казат5опіа етегзопії може забезпечити високоефективний набір активностей, як показано у даній заявці, для гідролізу лігноцелюлозного матеріалу. Якщо необхідно, до набору активностей можуть бути додані додаткові ферментативні активності з інших джерел. Такі додаткові активності можуть бути отримані із класичних джерел і/або забезпечені генетично модифікованими організмами.
Активності в композиції для застосування за винаходом можуть бути термостабільними. У даній заявці це означає, що активність має температурний оптимум близько 60 "С або вище, наприклад, близько 70 "С або вище, такий як близько 75 "С або вище, наприклад, близько 80 С або вище, такий як 85 "С або вище. Активності в композиції для застосування за винаходом, як правило, не мають однаковий температурний оптимум, але, проте, переважно є термостабільними.
Крім того, активності ферментів у композиції для застосування за винаходом можуть працювати при низькому рН. Для цілей цього винаходу, низький рН означає рН близько 5,5 або нижче, близько 5 або нижче, близько 4,9 або нижче, близько 4,8 або нижче, близько 4,7 або нижче, близько 4,6 або нижче, близько 4,5 або нижче, близько 4,4 або нижче, близько 4,3 або нижче, близько 4,2 або нижче, близько 4,1 або нижче, близько 4,0 або нижче, близько 3,9 або нижче, близько 3,8 або нижче, близько 3,7 або нижче, близько 3,6 або нижче, або близько 3,5 або нижче.
Активності для композиції для застосування за винаходом можуть визначатися комбінацією будь-яких з вищевказаних температурних оптимумів і значень рн.
Композиція, використана в способі за даним винаходом, може включати, на додаток до активностей, отриманих з Казатзопіа, целюлазу (наприклад, отриману з іншого джерела, ніж
Казатвопіа) і/або геміцелюлазу (наприклад, отриману з іншого джерела, ніж Казатвзопіа), і/або пектиназу.
Ферментативна композиція для застосування за винаходом може включати целюлазу й/або геміцелюлазу й/або пектиназу з іншого джерела, ніж Казатвзопіа. Вони можуть застосовуватися разом з одним або декількома ферментами Казатвзопіа, або вони можуть застосовуватися без додаткових ферментів Казатвзопіа.
Наприклад, ферменти для застосування в процесах за даним винаходом можуть включати бета-глюкозидазу (БГ) з Аврегоййи5, такого як АзрегуйШиє огулає, таку як розкрито в МО
Ко) 02/095014, або гібридний білок, що має бета-глюкозидазну активність, розкритий в УМО 2008/057637, або Азрегойи5 Типтідацшве, такий як розкритий як ЗХЕО ІЮ МО:2 в УМО 2005/047499 або 5ЕО ІЮО МО:5 в МО 2014/130812, або варіант бета-глюкозидази Азрегоїйїи5 ттідасив5, такий як розкритий в МО 2012/044915, такий як з наступними замінами: Е1000, 52830, М456Е, Е512У (із застосуванням ЗЕО ІЮ МО: 5 в УМО 2014/130812 для нумерації), або Азрегоїйив5 аси!ієайив,
Азрегдйи5 підег або Азрегудйи5 Кажаспі. В іншому варіанті здійснення бета-глюкозидаза отримана з Репісійшт, такого як Репісіит бБгазпййапит, розкрита як 5ЕО ІЮ МО2 в УМО 2007/019442, або з Тгісподепта, такого як Тгісподегта геезеї, такі, як описано в 05 6,022,725,
ОБ 6,982,159, 005 7,045,332, 5 7,005,289, 05 2006/0258554 (5 2004/0102619. В одному варіанті здійснення можна застосовувати навіть бактеріальну бета-глюкозидазу. В іншому варіанті здійснення бета-глюкозидаза отримана з ТПіеЇаміа (егевігіє (ММО 2011/035029) або
Тиснпорнаєа зассаїа (МО 2007/019442).
Наприклад, ферменти для застосування за даним винаходом можуть включати ендоглюканазу (ЕГ) з Тгісподегта, такого як Тгісподегта геезеї; з Нитісоїа, такого як штам
Нитісоїа іпзоЇеп5; з АзрегоїЇїи5, такого як АзрегодіПи5 асшіеац» або Азрегоїйи5 Камаснпії; з Егміпіа, такого як Егміпіа сагоїомага; з Ризагішт, такого як Ризагшт охузрогит; з ТПпіеіаміа, такого як
Тпіеїіаміа їетевігіє; з Нитісоїа, такого як Нитісоїа дгізеа маг. (пегтоїдеа або Нитісоїа іпзоЇепв; з
МеїІапосагрив, такого як МеІапосагри5 аІротусев5; з Меигозрога, такого як Меиго5рога сгазза; з
Мусеїїорпїйпога, такого як МусеїПорпїйтога (пегторпйа; з Сіадоггпіпит, такого як Сіадогпіпит тоесипаібвітит і/або з Спгузозрогішт, такого як штам Спгузозрогішт ІшсКпоу"епхзе. В одному варіанті здійснення можна застосовувати навіть бактеріальну ендоглюканазу, включаючи ендоглюканазу Асідоїпегти»х сеїПшоїуУйси5 (див. МО 91/05039; МО 93/15186; 05 5,275,944; УМО 96/02551; 05 5,536,655, МО 00/70031, МО 05/093050); ендоглюканазу ІП з Тпегтобіїйда тизса (див. МУО 05/093050); і ендоглюканазу М з Тпепторійда їТизса (див. МО 05/093050), але не обмежуючись ними.
Наприклад, композиція для застосування в способах за даним винаходом може включати целобіогідролазу І з Азрегойи5, такого як Азрегоїйи5 Титідаєш»5, таку як СеІ7А СВН І, розкриту в
ЗЕО ІЮ МО:6 в УМО 2011/057140 або 5ЕО ІОЮ МО:6 в УМО 2014/130812, або з Тгісподепта, такого як Тгісподегта геезеїі.
Наприклад, композиція для застосування в способах за даним винаходом може містити 60 целобіогідролазу ІЇ з А5регодійи5, такого як Азрегоїййи5 Типтідацшве, таку як 5ХЕО ІЮ МО:7 в УМО
2014/130812, або з Тгісподепта, такого як Тгісподетта геезві, або з ТПпівіаміа, такого як Тпівіаміа
Іеітевігі5, таку як целобіогідролаза ІІ СЕЇ бА з Тпівіаміа іеггевігів.
Наприклад, ферменти для застосування в способах за даним винаходом можуть містити поліпептид (ЗНб1 (літичну полісахаридну монооксигеназу) з ТПептоаб5сив5, такого як
Тпептоазсив5 ашигапііаси5, таку як описано в УМО 2005/074656 як 5ЕО ІОЮО МО:2 ії 5ЕО ІЮО МО:1 в
УММО2014/130812 і в МО 2010/065830; або з Тпієїама, такого як ТПівеЇаміа (еггевігіє5, таку як описано в МО 2005/074647 як 5ЕБЕО ІЮ МО: 8 або 5ЕО ІЮ МО:4 в УМО2014/130812 і в УМО 2008/148131, і МО 2011/035027; або з Азрегуйив5, такого як Аврегоййи5 Титідацв5, таку як описано в ММО 2010/138754 як 5ЕО ІЮ МО:2 або 5ЕБЕО ІО МО: 3 в УМО2014/130812; або з
Репісійит, такого як Репісійшт етегзопії, таку як описана як БЗЕО ІЮ МО:2 в УМО 2011/041397 або 5ЕО ІО МО:2 в М/О2014/130812. Інші придатні поліпептиди ЗНб1 включають Тгісподегта геезеі (див. МО 2007/089290), Мусеїйорпйїтога (Ппептпорпйа (див. УМО 2009/085935, УМО 2009/085859, УМО 2009/085864, УМО 2009/085868), Репісіййшт ріпорпйчт (див. УМО 2011/005867),
Тпептоазсиз 5р. (див. МО 2011/039319), і Тпеппоазси5 сгибїасеоив (див. УМО 2011/041504), але не обмежуються ними. В одному аспекті поліпептид СНбЄїЇ застосовують у присутності розчинного активуючого двовалентного металевого катіона, відповідно до УМО 2008/151043, наприклад, магнію сульфат. В одному аспекті поліпептид ЗНб1 застосовують у присутності диоксидної сполуки, біцикличної сполуки, гетероциклічної сполуки, азотвмісної сполуки, хінонової сполуки, серковмісної сполуки, або рідини, отриманої з попередньо обробленого целюлозного матеріалу, такого як попередньо оброблена кукурудзяна солома.
Інші целюлолітичні ферменти, які можна використовувати в композиції для застосування за винаходом, описані, наприклад, в УМО 98/13465, УМО 98/015619, МО 98/015633, УМО 99/06574,
МО 99/10481, МО 99/025847, УМО 99/031255, МО 2002/101078, МО 2003/027306, МО 2003/052054, МО 2003/052055, МО 2003/052056, МО 2003/052057, МО 2003/052118, МО 2004/016760, МО 2004/043980, МО 2004/048592, МО 2005/001065, МО 2005/028636, МО 2005/093050, МО 2005/093073, МО 2006/074005, МО 2006/117432, МО 2007/071818, МО 2007/071820, УМО 2008/008070, УМО 2008/008793, 05 5,457,046, 05 5,648,263, і 05 5,686,593, з перерахуванням лише невеликої кількості.
Крім того, приклади ксиланаз, застосовуваних у способах за даним винаходом, включають
Зо ксиланази з АвзрегуйШи5 асшеайшв5 (див. УМО 94/21785), Авзрегодйи5 їТиптідайи5 (див. УМО 2006/078256), Репісіййшт ріпорпйшт (див. УМО 2011/041405), РепісшШіит 5р. (см. УМО 2010/126772), Тпівіаміа їеітевігіз МКК. 8126 (див. МО 2009/079210), і Тгіспорпнаєа зассага СНІО (див. УМО 2011/057083), але не обмежуються ними. Приклади бета-ксилозидаз, застосовуваних в інтегрованих процесах за даним винаходом, включають бета-ксилозидази з Меигозрога сгазза і Тгісподегта геезеї, але не обмежуються ними. Приклади ацетилксилан-естераз, придатних у даному винаході, включають ацетилксилан-естерази з Азрегойи5 асшеайше (див. УМО 2010/108918), Спаеїотішт діорозит, Спаеютішт дгасіїє, Нитісоїа іп5оЇеп5 ОМ 1800 (див. МО 2009/073709), Нуросгеа |есогіпа (див. М/О 2005/001036), Мусеїйорптега (пегторпйа (див. УМО 2010/014880), Меигозрога сгазза, Рпаеозрпаєгіа подогит і ТпієеїЇаміа (еггезігіз МКК. 8126 (див.
УМО 2009/042846), але не обмежуються ними. Приклади ферулоїл-естераз (естераз ферулової кислоти), придатних у даному винаході, включають ферулоїл-естерази з Нитісоїа іпзхоїеп5 О5М 1800 (див. УМО 2009/076122), Меозапогуа їїзспегі, Меигозрога сгазза, Репісійшт аигапіодгізент (див. УМО 2009/127729), і Тпівеіаміа Теггевігіз (див. МУЛО 2010/053838 і УМО 2010/065448), але не обмежуються ними. Приклади арабінофуранозидаз, придатних у даному винаході, включають арабінофуранозидази з Азрегойи5 підег, Нитісоїа іпвоїеп5 О5М 1800 (див. УМО 2006/114094 і
УМО 2009/073383) і М. дідапієи5 (див. УМО 2006/114094), але не обмежуються ними. Приклади альфа-глюкуронідаз, придатних у даному винаході, включають альфа-глюкуронідази з
АврегоїПи5 сіаматв5, АзрегуйПи5 Титідасв5, Азрегодіи5 підег, АзрегойПив5 їетеив5, Нитісоїа іпзоїеп5 (див. МО 2010/014706), РепісйШішт ашигапіодгізент (див. М/О 2009/068565) і Тгісподепта геезеїі, але не обмежуються ними.
Композиція для застосування за даним винаходом може включати один, два, три, чотири або більше класів целюлази, наприклад, одну, дві, три або чотири, або всі з сНнб1, ендоглюканазу (ЕГ), одну або дві екзоцелобіогідролази (ЦБГ) і бета-глюкозидазу (БГ).
Композиція для застосування за даним винаходом може містити два або більше будь-яких із цих класів целюлази.
Композиція за даним винаходом може включати активність іншого типу целюлазної активності й/або геміцелюлазної активності й/або пектиназної активності, ніж той, який забезпечується композицією для застосування в способі за даним винаходом. Наприклад, композиція за даним винаходом може включати один тип целюлазної і/або геміцелюлазної 60 активності й/або пектиназної активності, забезпеченої композицією, як описано у даній заявці, і другий тип целюлазної і/або геміцелюлазної активності й/або пектиназної активності, забезпеченої додатковою целюлазою/геміцелюлазою/пектиназою.
У даній заявці целюлаза є поліпептидом, здатним до деградації або модифікації целюлози.
Поліпептид, здатний до деградації целюлози, є поліпептидом, здатним до каталізу процесу руйнування целюлози на одиниці меншого розміру, або частково, наприклад, на целодекстрини, або повністю на глюкозні мономери. Целюлаза відповідно до даного винаходу може давати початок змішаній популяції целодекстринів і глюкозних мономерів при контакті із целюлазой.
Така деградація, як правило, відбувається шляхом реакції гідролізу.
Літичні полісахаридні монооксигенази (ЛІМО) недавно класифіковані Са7у у родина ААЗ9 (Родина допоміжної активності 9) і або родина ААТО (Родина допоміжної активності 10). Як згадувалося вище, ЛІМО здатні до відкриття кристалічної глюканової структури. ЛЛМО можуть також впливати на целоолігосахариди. Терміни ПМО й ЛІПМО застосовуються взаємозамінно.
Білки СНБЇ1 (родини глікозил-гідролаз 61 або іноді позначувані як ЕСІМ) є (літичними) кисень- залежними полісахаридними монооксигеназами (ПМО/ЛІПМО) відповідно до останніх літературних даних (Ізакзеп еї аї., Удошигпаї ої Віоїодіса! Спетівігу, мої. 289, по. 5, рр. 2632-2642).
Часто в літературі ці білки згадуються як посилюючі активність целюлаз на лігноцелюлозних субстратах. СНВ1 спочатку класифікували як ендоглюканазу, на основі визначення дуже слабкої ендо-1,4-8-д-глюканазної активності в одного члена родини. Термін "ЗНе1", як застосовується у даній заявці, необхідно розуміти як родина ферментів, що розділяє загальні частини консервативної послідовності й складки для класифікації як родина 61 з добре встановленої системи класифікації САМ ан (пир/Лиумли.сагу.ога/сНбТ.пІті).Родина глікозид-гідролаз 61 є членом родини глікозид-гідролаз ЄС 3.2.1. (Нб1 застосовується у даній заявці як частина целюлаз. СВМЗ3З3 (родина 33 вуглевод-єднального модуля) є літичною полісахаридною монооксигеназою (див. Ізаквеп еї аї, Чоштаї ої Віоіодіса! Спетівігу, мої. 289, по. 5, рр. 2632- 2642). Са7у недавно перекласифікувала СМВЗЗ в ААТО (Родина допоміжної активності 10).
У даній заявці геміцелюлаза є поліпептидом, здатним до деградації або модифікації геміцелюлози. Таким чином, геміцелюлаза здатна до деградації або модифікації одного або більше із ксилана, глюкуроноксилана, арабіноксилана, глюкоманана й ксилоглікана. Поліпептид, здатний до деградації геміцелюлози, є поліпептидом, здатним до каталізу процесу руйнування геміцелюлози на полісахариди меншого розміру, або частково, наприклад, на олігосахариди, або повністю на цукрові мономери, наприклад, гексозні або пентозні цукрові мономери.
Геміцелюлаза відповідно до винаходу може давати початок змішаної популяції олігосахаридів і цукрових мономерів при контакті з геміцелюлазою. Така деградація, як правило, здійснюється шляхом реакції гідролізу.
У даній заявці пектиназа є поліпептидом, здатним до деградації або модифікації пектину.
Поліпептид, здатний до деградації, є поліпептидом, здатним до каталізу процесу руйнування пектину на одиниці меншого розміру, або частково, наприклад, на олігосахариди, або повністю на цукрові мономери. Пектиназа відповідно до винаходу може давати початок змішаній популяції олігосахаридів і цукрових мономерів при контакті з пектиназою. Така деградація, як правило, здійснюється шляхом реакції гідролізу.
Відповідно, композиція за даним винаходом може включати будь-яку целюлазу, наприклад,
СНО, целобіогідролазу, ендо-В-1,4-глюканазу, бета-глюкозидазу або ІД-(1,3)(1,4)-глюканазу.
Відповідно, целобіогідролаза (ЄС 3.2.1.91) є будь-яким поліпептидом, здатним до каталізу гідролізу 1,4-8-Ю-глюкозидних зв'язків у целюлозі або целотетраозі, з вивільненням целобіози з кінців ланцюга. Цей фермент може також позначатися як целюлозо 1,4-В-целобіозидаза, 1,4-р- целобіогідролаза, 1,4-В-Ю-глюкан целобіогідролаза, авіцелаза, екзо-1,4-8-ЮО-глюканаза, екзоцелобіогідролаза або екзоглюканаза.
При цьому ендо-В-1,4-глюканаза (ЄС 3.2.1.4) є поліпептидом, здатним до каталізу ендогідролізу 1,4-8-О-глюкозидних зв'язків у целюлозних, ліхенінових або злакових рВ-0О- глюканах. Такий поліпептид може також бути здатний до гідролізу 1,4-зв'язків в В-Ю-глюканах, що також містять 1,3-зв'язки. Цей фермент може також позначатися як целюлаза, авіцелаза, Др- 1,4-ендоглюкан-гідролаза, В-1,4-глюканаза, карбоксиметилцелюлаза, целюдекстриназа, ендо- 1,4-8-О-глюканаза, ендо-1,4-8-ЮО-глюканогідролаза, ендо-1,4-ВД-глюканаза або ендоглюканаза.
При цьому бета-глюкозидаза (ЄС 3.2.1.21) є будь-яким поліпептидом, здатним до каталізу гідролізу термінальних, невідновлюючих В-ЮО-глюкозних залишків з вивільненням. В-ЮО-глюкози
Такий поліпептид може мати широку специфічність стосовно В-Ю-глюкозидів, і може також гідролізувати одне або більше із наступного: В-Ю-галактозид, а-І -арабінозид, В-ЮО-ксилозид або
В-О-фукозид. Цей фермент може також позначатися як амігдалаза, В-Ю-глюкозид- глюкогідролаза, целобіаза або гентобіаза. 60 При цьому В-(1,31,4)-глюканаза (ЄС 3.2.1.73) є будь-яким поліпептидом, здатним до каталізу гідролізу 1,4-8-ЮО-глюкозидних зв'язків в В-ЮО-глюканах, які містять 1,3- їі 1,4-зв'язки.
Такий поліпептид може діяти на ліхенінові й злакові В-Ю-глюкани, але не на В-О-глюкани, що містять тільки 1,3- або 1,4-зв'язки. Цей фермент може також позначатися як ліхеніназа, 1,3-1,4-
В-глюкан-4-глюканогідролаза, ВД-глюканаза, ендо-рВ-1,3-1,4-глюканаза, ліхеназа або Д-глюканаза змішаних зв'язків. Альтернативою для цього типу ферменту є ЄС 3.2.1.6, яка описана як ендо- 1,3(4)-бета-глюканаза. Цей тип ферменту гідролізує 1,3- або 1,4-зв'язки в бета-О-глюканазі, коли глюкозний залишок, чия відновлюючи група, утягується у зв'язок, що зазнає гідролізу, сама заміщається на С-3. Альтернативні найменування включають ендо-1,3-бета-глюканазу, ламінариназу, 1,3-(1,321,4)-бета-О-глюкан 3(4)-глюканогідролазу; субстрати включають ламінаринові, ліхенінові й злакові бета-О-глюкани.
Композиція за даним винаходом може включати геміцелюлазу, наприклад, ендоксиланазу,
В-ксилозидазу, а-І -арабінофуранозидазу, В-ЮО-глюкуронідазу, ацетилксилан-естеразу, ферулоїл-естеразу, кумароїл-естеразу, а-галактозидазу, Д-галактозидазу, В-мананазу, або рД- манозидазу.
При цьому ендоксиланаза (ЄС 3.2.1.8) є будь-яким поліпептидом, здатним до каталізу ендогідролізу 1,4-8-ЮО-ксилозидних зв'язків у ксиланах. Цей фермент може також позначатися як ендо-1,4-В8-О-ксиланаза або 1,4-8-О-ксилан-ксиланогідролаза. Альтернативною є ЄС 3.2.1.136, глюкуроноарабіноксилан-ендоксиланаза, фермент, здатний до гідролізу 1,4-ксилозидних зв'язків у глюкуроноарабіноксиланах.
При цьому В-ксилозидаза (ЄС 3.2.1.37) є будь-яким поліпептидом, здатним до каталізу гідролізу 1,4-8-Ю-ксиланів, для видалення послідовних залишків ЮО-ксилози з невідновлюючих конців. Такі ферменти можуть також гідролізувати ксилобіозу. Цей фермент може також позначатися як 0 ксилан-1,4-ВД-ксилозидаза, 1,4-8-О-ксилан-ксилогідролаза, екзо-1,4-р- ксилозидаза або ксилобіаза.
При цьому с-І-арабінофуранозидаза (ЄС 3.2.1.553 є будь-яким поліпептидом, здатним впливати на с-І-арабінофуранозиди, са-І-арабінани, які містять (1,2) і/або (1,3)- і/або (1,5)- зв'язки, арабіноксилани й арабіногалактани. Цей фермент може також позначатися як а-М- арабінофуранозидаза, арабінофуранозидаза або арабінозидаза.
При цьому а-О-глюкуронідаза (ЄС 3.2.1.139) є будь-яким поліпептидом, здатним до каталізу
Зо реакції наступного виду: альфа-О-глюкуронідаза ї Н(2)О « спирт ї- О-глюкуронат. Цей фермент може також позначатися як альфа-глюкуронідаза або альфа-глюкозидуроназа. Ці ферменти можуть також гідролізувати 4-О-метильовану глюкуронову кислоту, яка може також бути присутня у якості замісника в ксиланах. Альтернативою є ЄС 3.2.1.131, ксилан-альфа-1,2- глюкуронозидаза, яка каталізує гідроліз альфа-1,2-(4-О-метил)глюкуронозильних зв'язків.
При цьому ацетил-ксилан-естераза (ЄС 3.1.1.72) є будь-яким поліпептидом, здатним до каталізу деацилювання ксиланів і ксилоолігосахаридів. Такий поліпептид може каталізувати гідроліз ацетильних груп з полімерного ксилана, ацетильованої ксилози, ацетильованої глюкози, альфа-нафтил-ацетату або п-нітрофеніл-ацетату, але як правило, не із триацетилгліцерину. Такий поліпептид, як правило, не діє на ацетильований манан або пектин.
При цьому ферулоїл-естераза (ЄС 3.1.1.73) є поліпептидом, здатним до каталізу реакції у вигляді: ферулоїл-сахарид ї- Н(2О - ферулат жї- сахарид. Сахарид може бути, наприклад, олігосахаридом або полісахаридом. Він може, як правило, каталізувати гідроліз 4-гідрокси-3- метоксицинамоїльної (ферулоїльной) групи їх етерифікованого цукру, який зазвичай є арабінозою в "натуральних" субстратах. Як правило, п-нітрофеніл ацетат і метил-ферулат є гіршими субстратами. Цей фермент може також позначатися як цинамоїл-ефір-гідролаза, ферулової кислоти естераза або гідроксицинамоїл-естераза. Він може також позначатися як геміцелюлазний допоміжний фермент, оскільки він може допомагати ксиланазам і пектиназам руйнувати геміцелюлозу й пектин клітинної стінки рослин.
При цьому кумароїл-естераза (ЄС 3.1.1.73) є будь-яким поліпептидом, здатним до каталізу реакції виду: кумароїл-сахарид ї Н(2)О - кумарат ж сахарид. Сахарид може бути, наприклад, олігосахаридом або полісахаридом. Цей фермент може також позначатися як транс-4-кумароїл- естераза, транс-п-кумароїл-естераза, п-кумароїл-естераза або естераза п-кумарової кислоти.
Цей фермент також відноситься до ЄС 3.1.1.73, так що може також позначатися як ферулоїл- естераза.
При цьому а-галактозидаза (ЄС 3.2.1.22) є будь-яким поліпептидом, здатним до каталізу гідролізу термінальних, невідновлюючих В-Ю-галактозних залишків в «-ЮО-галактозидах, включаючи галактозні олігосахариди, галактоманани, галактани і арабіногалактани. Такий поліпептид може також бути здатним до гідролізу «-Ю-фукозидів. Цей фермент може також позначатися як мелібіаза. бо При цьому Д-галактозидаза (ЄС 3.2.1.23) є будь-яким поліпептидом, здатним до каталізу гідролізу термінальних, невідновлюючих В-ЮО-галактозних залишків в В-О-галактозидах. Такий поліпептид може також бути здатним до гідролізу а-І -арабінозидів. Цей фермент може також бути позначений як екзо-(1--4)-8-ЮО-галактаназа або лактаза.
При цьому В-мананаза (ЄС 3.2.1.786) є поліпептидом, здатним до каталізу довільного гідролізу 1,4-8-О-манозидних зв'язків у мананах, галактомананах і глюкомананах. Цей фермент може також бути позначений як манан-ендо-1,4-В-манозидаза або ендо-1,4-мананаза.
При цьому В-манозидаза (ЄС 3.2.1.253 є будь-яким поліпептидом, здатним до каталізу гідролізу термінальних, невідновлюючих В-ЮО-манозних залишків в В-Ю-манозидах Цей фермент може також позначатися як мананаза або маназа.
Композиція за даним винаходом може містити будь-яку ппектиназу, наприклад, ендополігалактуроназу, пектин-метилестеразу, ендогалактаназу, бета-галактозидазу, пектин- ацетилестеразу, ендопектин-ліазу, пектат-ліазу, альфа-рамнозидазу, екзогалактуроназу, екзополігалактуронат-ліазу, рамногалактуронан-гідролазу, рамногалактуронан-ліазу, рамногалактуронан-ацетил-естеразу, рамногалактуронан-галактуроногідролазу, ксилогалактуроназу.
При цьому ендополігалактуроназа (ЄС 3.2.1.153 є будь-яким поліпептидом, здатним до каталізу довільного гідролізу 1,4-0-ЮО-галактозидуронових зв'язків у пектаті й інших галактуронанах. Цей фермент може також бути позначений як полігалактуроназа пектин- деполімераза, пектиназа, ендополігалактуроназа, пектолаза, пектин-гідролаза, пектин- полігалактуроназа, полі-0-1,4-галактуронід-глюканогідролаза, ендогалактуроназа, ендо-О- галактуроназа або полі(1,4-4-О-галактуронід)гліканогідролаза.
При цьому пектин-метил-естераза (ЄС 3.1.1.11) є будь-яким ферментом, здатним до каталізу реакції: пектин - п Н2О - п метанол ж пектат. Фермент може також бути відомий як пектин-естераза, пектин-деметоксилаза, пектин-метоксилаза, пектин-метилестераза, пектаза, пектиноестераза або пектин-пектилгідролаза.
При цьому ендогалактаназа (ЄС 3.2.1.89у є будь-яким ферментом, здатним до каталізу ендогідролізу 1,4-8-ЮО-галактозидних зв'язків в арабіногалактанах. Фермент може також бути відомий як арабіногалактан-ендо-1,4-ВД-галактозидаза, ендо-1,4-Д-галактаназа, галактаназа, арабіногалактаназа або арабіногалактан-4-В-О-галактаногідролаза.
Зо При цьому пектин-ацетилестераза визначається у даній заявці як фермент, який має ацетил-естеразну активність, який каталізує деацетилювання ацетильних груп на гідроксильних групах сашША залишків пектину.
При цьому ендопектин-ліаза (ЄС 4.2.2.10) є ферментом, здатним до каталізу елімінаційного розщеплення (1--4)-4-ЮО-галактуронан-метилового ефіру до одержання олігосахаридів з 4- дезокси-6-О-метил-а-О-галакт-4-енуронозильних груп на їхніх невідновлюючих кінцях. Фермент може також бути відомий як пектин-ліаза, пектин-транс-еліміназа, ендопектин-ліаза, поліметилгалактуронова транселіміназа, пектин-метилтранселіміназа, пектоліаза, ПЛ, ПНЛ або
ПМГЛ або (1--4)-6-О-метил-а-О-галактуронан-ліаза.
При цьому пектат-ліаза (ЄС 4.2.2.2) є ферментом, здатним до каталізу елімінуючого розщеплення (1--4)-4-ЮО-галактуронана з отриманням олігосахаридів з 4-дезокси-а-ЮО-галакт-4- енуронозильних груп на їхніх невідновлюючих кінцях. Цей фермент може також бути відомий як полігалактуронова транселіміназа, пектинової кислоти транселіміназа, полігалактуронат-ліаза, ендопектин-метилтранселіміназа, пектат-транселіміназа, ендогалактуронат-транселіміназа, пектинової кислоти ліаза, пектинова ліаза, а-1,4-ЮО-ендополігалактуронової кислоти ліаза, ПГА ліаза, ППаза-М, ендо-а-1,4-полігалактуронової кислоти ліаза, полігалактуронової кислоти ліаза, пектин-транселіміназа, полігалактуронової кислоти транселіміназа або (1--4)-4-О-галактуронан- ліаза.
При цьому альфа-рамнозидаза (ЄС 3.2.1.40) є будь-яким поліпептидом, здатним до каталізу гідролізу термінальних, невідновлюючих а-І-рамнозних залишків в а-І-рамнозидах або альтернативно в рамногалактуронані. Цей фермент може також бути відомий як а-1- рамнозидаза Т, с-І -рамнозидаза М або с-І -рамнозида рамногідролаза.
При цьому екзогалактуроназа (ЄС 3.2.1.82) є будь-яким поліпептидом, здатним до гідролізу пектинової кислоти на невідновлюючому кінці, з вивільненням дигалактуроната. Цей фермент може також бути відомий як екзополі-с-галактуронозидаза, екзополігалактуронозидаза або екзополігалактуранозидаза.
При цьому екзогалактуроназа (ЄС 3.2.1.67) є поліпептидом, здатним до каталізу: (1,4-а4-0- галактуронід)л-НгО - (1,4-а-О-галактуронід)п1-О-галактуронат. Фермент може також бути відомий як галактуран-1,4-с-галактуронідаза, екзополігалактуроназа, полі(галактуронат)- гідролаза, екзо-О-галактуроназа, екзо-О-галактуронаназа, екзополі-О-галактуроназа або бо полі(1,4-4-О-галактуронід)-галактуроногідролаза.
При цьому екзополігалактуронат-ліаза (ЄС 4.2.2.9у є поліпептидом, здатним до каталізу елімінуючого розщеплення 4-(4-дезокси-4-О-галакт-4-енуронозил)-О-галактуроната З відновлюючого кінця пектата, тобто де-етерифікованого пектину. Цей фермент може бути відомий як пектат-дисахарид-ліаза, пектат-екзоліаза, екзопектинової кислоти транселіміназа, екзопектат-ліаза, екзополігалактуронової кислоти транселіміназа, ПКТЕ, екзо-ПКТЕ, екзо-ПГЛ або (1-4)-а-О-галактуронана відновлюючого кінця дисахарид-ліаза.
При цьому рамногалактуронан-гідролаза є поліпептидом, здатним до ендогідролізу зв'язку між галактозилуроновою кислотою й рамнопіранозилом в рамногалактуронанових структурах, які строго чергуються і складаються із дисахариду (|(1,2-альфа-ї -рамноїл-(1,4)-альфа- галактозилуронової кислоти))|.
При цьому рамногалактуронан-ліаза є будь-яким поліпептидом, здатним до розщеплення зв'язків а-І -Рамнр-(1--4)-4-0-ГалрА ендообразом у рамногалактуронані шляхом бета-елімінації.
При цьому рамногалактуронан-ацетилестераза є будь-яким поліпептидом, який каталізує деацетилювання основного каркасу із залишків рамнози й галактуронової кислоти, які чергуються в рамногалактуронані.
При цьому рамногалактуронан-галактуроногідролаза є поліпептидом, здатним до екзогідролізу галактуронової кислоти з невідновлюючого кінця рамногалактуронанових структур, які строго чередуються.
При цьому ксилогалактуроназа є будь-яким поліпептидом, який діє на ксилогалактуронан шляхом розщеплення каркасу з В-ксилозо-заміщеної галактуронової кислоти ендо- чином. Цей фермент може також бути відомий як ксилогалактуронан-гідролаза.
При цьому а-І-арабінофуранозидаза (ЄС 3.2.1.553 є будь-яким поліпептидом, здатним до впливу на а-арабінофуранозиди, а-арабінани, які містять (1,2) і/або (1,3)- і/або (1,5)-зв'язки, арабіноксилани й арабіногалактани. Цей фермент може також позначатися як а- М- арабінофуранозидаза, арабінофуранозидаза або арабінозидаза.
При цьому ендоарабінаназа (ЄС 3.2.1.99) є будь-яким поліпептидом, здатним до каталізу ендогідролізу 1,5-4-арабінофуранозидних зв'язків в 1,5-арабінанах. Фермент може також бути відомий як ендоарабіназа, арабінан-ендо-1,5-а-І -арабінозидаза, ендо-1,5-а-І -арабінаназа, ендо-а-1,5-арабаназа, ендоарабаназа або 1,5а-І -арабінан 1,5-с-І -арабінаногідролаза.
Композиція за даним винаходом, як правило, містить щонайменше дві целюлази й необов'язково щонайменше одну геміцелюлазу й необов'язково щонайменше одну пектиназу (одна з яких є поліпептидом відповідно до даного винаходу). Композиція за даним винаходом може містити СНО, целобіогідролазу, ендоглюканазу й/або бета-глюкозидазу. Така композиція може також містити одну або декілька геміцелюлаз і/або одну або декілька пектиназ.
Крім того, одне або більше (наприклад, два, три, чотири або всі) з амілази, протеази, ліпази, лігнінази, гексозилтрансферази, глюкуронідази або експанзину або індукованого целюлозою білка або інтегруючого целюлозу білка або подібного білка можуть бути присутнім у композиції за даним винаходом (вони позначаються як допоміжні активності вище). "Протеаза" включає ферменти, які гідролізують пептидні зв'язки (пептидази), а також ферменти, які гідролізують зв'язки між пептидами й іншими компонентами, такими як цукри (глікопептидази). Багато з протеаз характеризуються за ЄС 3.4, і придатні для застосування в цьому винаході, і включені за допомогою посилання. Деякі специфічні типи протеаз включають цистеїнові протеази, включаючи пепсин, папаїн і серинові протеази, включаючи хімотрипсін, карбоксипептидази й металоендопептидази. "Ліпаза" включає ферменти, які гідролізують ліпіди, жирні кислоти й ацилгліцериди, включаючи фосфогліцериди, ліпопротеїни, диацилгліцерини, і таке інше. У рослинах ліпіди застосовуються як структурні компоненти для обмеження втрати води й інфекції патогенами. Ці ліпіди включають воски, отримані з жирних кислот, а також кутин і суберин. "Лігніназа" включає ферменти, які можуть гідролізувати або руйнувати структури лігнінових полімерів. Ферменти, які можуть руйнувати лігнін, включають лігнін-пероксидази, марганцеві пероксидази, лаккази й ферулоїл-естерази, а інші ферменти, описані в даній області техніки, відомі як деполімеризуючі або іншим способом руйнуючі лігнінові полімери. Також включені ферменти, здатні гідролізувати зв'язки між геміцелюлозними цукрами (особливо арабінозою) і лігніном. Лігнінази включають наступні групи ферментів: лігнін-пероксидази (ЄС 1.11.1.14), марганцеві пероксидази (ЄС 1.11.1.13), лаккази (ЄС 1.10.3.2) і ферулоїл-естерази (ЄС 3.1.1.73), але не обмежуються ними. "Гексозилтрансфераза" (2,4,1-) включає ферменти, які здатні до каталізу трансферазної реакції, але які також каталізують реакцію гідролізу, наприклад, целюлози й/або продуктів деградації целюлози. Прикладом гексозилтрансферази, яку можна застосовувати за даним бо винаходом, є В-глюканозилтрансфераза. Такий фермент може бути здатний до каталізу деградації (1,3)(1,4)глюкану й/або целюлози й/або продукту деградації целюлози. "Глюкуронідаза" включає ферменти, які каталізують гідроліз глюкуронозида, наприклад, В- глюкуронозида, з одержанням спирту. Багато з глюкуронідаз охарактеризовані й можуть бути придатними для застосування за даним винаходом, наприклад, В-глюкуронідаза (ЄС 3.2.1.31), гіалуроно-глюкуронідаза (ЄС 3.2.1.36), глюкуронозил-дисульфоглюкозамін-глюкуродидаза (3.2.1.56), гліциррізинат-В-глюкуронідаза (3.2.1.128) або а-О-глюкуронідаза (ЄС 3.2.1.139).
Композиція для застосування за даним винаходом може включати експанзин або експанзин- подібний білок, такий як своленін (див. ЗаЇІпеїто еї аї., Єшиг. У. Віопет. 269, 4202-4211, 2002) або своленін-подібний білок.
Експанзини залучені в ослаблення структури клітинної стінки під час росту клітин рослин.
Експанзини були запропоновані для руйнування водневих зв'язків між целюлозою й іншими полісахаридами клітинної стінки без наявності гідролітичної активності. Таким чином, передбачається, що вони забезпечують ковзання целюлозних волокон і збільшення клітинної стінки. Своленін, експанзин-подібний білок, містить М-кінцевий вуглевод-єднального модуля родини 1 домен (СВО) і С-кінцевий експанзин-подібний домен. Для цілей даного винаходу експанзин-подібний білок або своленін- подібний білок може містити один або обидва таких домени й/(або може руйнувати структуру клітинних стінок (наприклад, руйнуючи целюлозну структуру), необов'язково без продукції відновлюючих цукрів у кількостях, що виявляються.
Композиція для застосування за даним винаходом може бути індукованим целюлозою білком, наприклад, поліпептидним продуктом сірі! або сір2 гена або подібних генів (див.
Еогетап еї аї., У. Віої. Спет. 278(34), 31988-31997, 2003), целюлозу/целулосому інтегруючим білком, наприклад, поліпептидним продуктом гена сірА або сірС, або скафолдином або скафолдин-подібним білком. Скафолдини Й целюлозу інтегруючі білки Є мультифункціональними інтегруючими субодиницями, які можуть організувати целюлолітичні субодиниці в мульти-ферментний комплекс. Це здійснюється шляхом взаємодії двох комплементарних класів доменів, тобто домена когезії на скафолдині й домена докерин на кожній ферментативній одиниці. Субодиниця скафолдину також несе домен, що зв'язує целюлозу (СВМ), який опосередковує прикріплення целюлосоми до її субстрату. Скафолдин або білок, що інтегрує целюлозу, для цілей даного винаходу може включати обидва таких домени.
Композиція для застосування за даним винаходом може також включати каталазу. Термін "каталаза" означає перекис водню: перекис водню-оксидоредуктазу (ЄС 1.11.1.6 або ЄС 1.11.1.21), яка каталізує перетворення двох перекисів водню в кисень і дві води. Активність каталази можна визначити шляхом моніторингу деградації перекису водню при 240 нм на основі наступної реакції: 2Н2О» - 2Н2О-0». Реакцію проводять в 50 мМ фосфатному буфері при рН 7,0 за 25"С з 10,3 мМ субстратом (НгОг2) і приблизно 100 одиницями ферменту на мл.
Поглинання контролюють спектрофотометрично в межах 16-24 секунд, що повинно відповідати зниженню поглинання від 0,45 до 0,4. Одна одиниця каталазної активності може бути виражена у вигляді деградації одного мікромоля НгО»5 за хвилину при рН 7,0 і 25 70.
Композиція для застосування в способі за даним винаходом може складатися з члена кожного класу ферментів, згаданих вище, декількох членів кожного класу ферментів, або будь- якої комбінації цих класів ферментів і хелперних білків (тобто білків, згаданих у даній заявці, які не мають ферментативної активності як такої, проте сприяють деградації лігноцелюлози).
Композиція для застосування в способі за даним винаходом може складатися з ферментів від (1) комерційних постачальників; (2) клонованих генів, які експресують ферменти; (3) комплексного бульйону (такого, як отриманий при рості мікробного штаму в середовищі, де штами секретують білки й ферменти в середовище); (4) клітинних лізатів при вирощуванні штамів, як у пункті (3); і/або (5) рослинного матеріалу, який експресує ферменти. Різні ферменти в композиції за даним винаходом можуть бути отримані з різних джерел.
Ферменти можуть бути отримані екзогенним способом у мікроорганізмах, дріжджах, грибках, бактеріях або рослинах, потім виділені й додані, наприклад, у лігноцелюлозний сировинний матеріал. Альтернативно, ферменти одержують, але не виділяють, і неочищений бульйон від ферментації клітинної маси, або рослинний матеріал (такий, як кукурудзяна солома або пшенична солома) і таке інше можна додати, наприклад, до сировинного матеріалу.
Альтернативно, неочищену клітинну масу або середовище від виробництва ферментів, або рослинний матеріал можна обробити для запобігання подальшого росту мікроорганізмів (наприклад, шляхом нагрівання або додавання антимікробних агентів), потім додати, наприклад, до сировинного матеріалу. Ці неочищені суміші ферментів можуть включати організм, який продукує фермент. Альтернативно, фермент може бути отриманий при бо ферментації, при якій застосовується (попередньо оброблений) сировинний матеріал (такий, як кукурудзяна солома або пшенична солома) для забезпечення живлення організму, який продукує фермент(и). Таким чином, рослини, які продукують ферменти, можуть самі служити в якості лігноцелюлозного сировинного матеріалу, і можуть бути додані в лігноцелюлозний сировинний матеріал.
У застосуваннях і способах, описаних у даній заявці, компоненти з композицій, описаних вище, можуть бути забезпечені спільно (тобто в єдиній композиції як такій) або окремо або послідовно.
Таким чином, винахід відноситься до способів, у яких застосовують композицію, описану вище, і до застосування композиції в промислових процесах.
В одному варіанті здійснення способів відповідно до даного винаходу ферментна композиція перебуває у формі цільного ферментаційного бульйону від грибків. В одному варіанті здійснення ферментна композиція може бути цільним ферментаційним бульйоном, як описано нижче. Цільний ферментаційний бульйон може бути приготовлений при ферментації нерекомбінантних і/або рекомбінантних міцеліальних грибків. В одному варіанті здійснення міцеліальний грибок є рекомбінантним міцеліальним грибком, який містить один або кілька генів, які можуть бути гомологічними або гетерологічними для міцеліальних грибків. В одному варіанті здійснення міцеліальний грибок є рекомбінантним міцеліальним грибком, який містить один або кілька генів, які можуть бути гомологічними або гетерологічними для міцеліального грибка, у якому один або кілька генів кодують ферменти, які можуть руйнувати целюлозний субстрат. Цільний ферментаційний бульйон може містити будь-які поліпептиди або будь-яку їхню комбінацію.
Переважно, ферментна композиція є цільним ферментаційним бульйоном, де цільні клітини є вбитими. Цільний ферментаційний бульйон може містити органічну кислоту (кислоти) (використовувану для лізису клітин), убиті клітини й/або клітинний детрит, і культуральне середовище.
Як правило, міцеліальні грибки культивують у середовищі для культивування клітин, придатному для одержання ферменту, здатного до гідролізу целюлозного субстрату.
Культивування здійснюють у придатному поживному середовищі, яке містить джерела вуглеводню й азоту й неорганічні солі, із застосуванням процедур, відомих у даній області
Зо техніки. Придатні середовища для культивування, температурні діапазони й інші умови, придатні для росту й вироблення целюлази й/або геміцелюлази й/або пектинази, відомі в даній області техніки. Цільний ферментаційний бульйон можна приготувати шляхом вирощування міцеліальних грибків до стаціонарної фази й витримування міцеліальних грибків в умовах обмеження вуглецю протягом періоду часу, достатнього для експресії однієї або декількох целюлаз і/або геміцелюлаз і/або пектиназ. Як тільки ферменти, такі як целюлази й/або геміцелюлази й/або пектинази, секретуються міцеліальними грибками у ферментаційне середовище, цільний ферментаційний бульйон можна використовувати. Цільний ферментаційний бульйон за даним винаходом може містити міцеліальні грибки. У деяких варіантах здійснення цільний ферментаційний бульйон містить не фракціонований уміст ферментаційних матеріалів, отриманих до кінця ферментації. Як правило, цільний ферментаційний бульйон містить виснажене культуральне середовище й клітинний детрит, присутній після вирощування міцеліальних грибків до насичення, інкубації в умовах обмеження вуглецю для забезпечення синтезу білків (зокрема, експресії целюлаз і/або геміцелюлаз і/або пектиназ). У деяких варіантах здійснення цільний ферментаційний бульйон містить виснажене середовище для культивування клітин, екстраклітинні ферменти й міцеліальні грибки. У деяких варіантах здійснення міцеліальні грибки, що присутні в цільному ферментаційному бульйоні, можуть бути лізовані, пермеабілізовані або вбиті із застосуванням способів, відомих у даній області техніки для одержання цільного ферментаційного бульйону з лізованими клітинами. В одному варіанті здійснення цільний ферментаційний бульйон є цільним ферментаційним бульйоном з убитими клітинами, де цільний ферментаційний бульйон містить клітини міцеліальних грибків, що є лізованими або вбитими. У деяких варіантах здійснення клітини вбивають за допомогою лізису міцеліальних грибків за допомогою хімічної й/або рН обробки для одержання цільного бульйону з лізованими клітинами міцеліальних грибків. У деяких варіантах здійснення клітини вбивають шляхом лізису міцеліальних грибків за допомогою хімічної й/або рН обробки й підведення рН ферментаційної суміші з убитими клітинами до придатного значення рН. В одному варіанті здійснення цільний ферментаційний бульйон містить перший компонент із органічної кислоти, який містить органічну кислоту щонайменше з 1-5 атомами вуглецю й/або її сіль, і другий компонент із органічної кислоти, який містить органічну кислоту щонайменше з б або більше атомами вуглецю й/або її сіль. В одному варіанті здійснення бо перший компонент із органічної кислоти є оцтовою кислотою, мурашиною кислотою,
пропіоновою кислотою, її сіллю, або будь-якою їхньою комбінацією, а другий компонент із органічної кислоти є бензойною кислотою, циклогексанкарбоновою кислотою, /4- метилвалеріановою кислотою, фенілоцтовою кислотою, її сіллю, або будь-якою їхньою комбінацією.
Термін "цільний ферментаційний бульйон", як застосовується у даній заявці, означає препарат, отриманий шляхом ферментації клітин, який не зазнає, або зазнає мінімального виділення й/(або очищення. Наприклад, одержують цільний ферментаційний бульйон, де мікробні культури вирощують до насичення, інкубують в умовах обмеження вуглецю для забезпечення синтезу білків (наприклад, експресії ферментів клітинами-носіями) і секреції в середовище культивування клітин. Як правило, цільний ферментаційний бульйон є не фракціонованим, і містить виснажене середовище для культивування клітин, екстраклітинні ферменти, і мікробні, переважно нежиттєздатні клітини.
При необхідності цільний ферментаційний бульйон можна фракціонувати, і можна застосовувати одне або більше із фракціонованого вмісту. Наприклад, лізовані клітини й/або клітинний детрит можна вилучити із цільного ферментаційного бульйону для одержання композиції, що не містить цих компонентів.
Цільний ферментаційний бульйон може додатково містити консервант і/або антимікробний агент. Такі консерванти й/або агенти відомі в даній області техніки.
Цільний ферментаційний бульйон, як описано у даній заявці, як правило, є рідиною, але може містити нерозчинні компоненти, такі як лізовані клітини, клітинний детрит, компоненти культурального середовища, і/або нерозчинний фермент(и). У деяких варіантах здійснення нерозчинні компоненти можуть бути вилучені для освітлення цільного ферментаційного бульйону.
В одному варіанті здійснення цільний ферментаційний бульйон може бути доповнено однією або декількома ферментативними активностями, які не експресуються ендогенно, або експресуються на відносно низькому рівні міцеліальними грибками, для поліпшення деградації целюлозного субстрату, наприклад, до ферментованих цукрів, таких як глюкоза або ксилоза.
Додатковий фермент(и) може бути доданий у вигляді добавки до цільного ферментаційного бульйону, а ферменти можуть бути компонентом окремого цільного ферментаційного бульйону,
Зо або можуть бути очищені, або мінімально витягнуті й/або очищені.
В одному варіанті здійснення цільний ферментаційний бульйон містить цільний ферментаційний бульйон від ферментації рекомбінантних міцеліальних грибків, які надлишково експресують один або кілька ферментів для поліпшення деградації целюлозного субстрату.
Альтернативно, цільний ферментаційний бульйон може містити суміш цільного ферментаційного бульйону від ферментації нерекомбінантного міцеліального грибка й рекомбінантного міцеліального грибка, які надлишково експресують один або кілька ферментів для поліпшення деградації целюлозного субстрату. В одному варіанті здійснення цільний ферментаційний бульйон включає цільний ферментаційний бульйон від ферментації міцеліальних грибків, які надлишково експресують бета-глюкозидазу. Альтернативно, цільний ферментаційний бульйон для застосування в даних способах і реактивних композиціях може містити суміш цільного ферментаційного бульйону від ферментації нерекомбінантного міцеліального грибка й цільного ферментаційного бульйону від ферментації рекомбінантного міцеліального грибка, який надлишково експресує бета-глюкозидазу.
В одному варіанті спосіб приготування цукрового продукту з лігноцелюлозного матеріалу включає наступні етапи: (а) необов'язково, попередньої обробки лігноцелюлозного матеріалу, (Б) необов'язково, промивання необов'язково підданого попередній обробці лігноцелюлозного матеріалу, (с) одержання ферментної композиції, яка містить щонайменше дві целюлази, і де ферментна композиція щонайменше містить ЛЛМО, шляхом культивування грибка в умовах, що забезпечують експресію ферментної композиції, (4) ферментативного гідролізу необов'язково промитого й/або необов'язково підданого попередній обробці лігноцелюлозного матеріалу із застосуванням ферментної композиції, і (е) необов'язково, видалення глюкозо-вмісної композиції, де кількість утворених гідролізованих продуктів окиснення наприкінці ферментативного гідролізу шляхом окиснення ЛІМО лігноцелюлозного матеріалу, що містить целюлозу й/або целолігосахариди, підтримується від З до 110 г/кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, шляхом додавання необхідної кількості кисню після попередньої обробки й до й/або під час ферментативного гідролізу в лігноцелюлозний матеріал, переважно, утворений гідролізований продукт окиснення є глюконовою кислотою, альдоновою кислотою й/"або гемінальним діолом, більш переважно, гідролізований продукт окиснення є глюконовою кислотою. бо В одному варіанті здійснення спосіб одержання продукту ферментації з лігноцелюлозного матеріалу включає наступні етапи: (а) необов'язково, попередньої обробки лігноцелюлозного матеріалу, (Б) необов'язково, промивання необов'язково підданого попередній обробці лігноцелюлозного матеріалу, (с) одержання ферментної композиції, що містить щонайменше дві целюлази, і де ферментна композиція щонайменше містить ЛІМО, шляхом культивування грибка в умовах, що забезпечують експресію ферментної композиції, (4) ферментативного гідролізу необов'язково промитого і/або необов'язково підданого попередній обробці лігноцелюлозного матеріалу із застосуванням ферментної композиції, і (е) ферментації гідролізованого лігноцелюлозного матеріалу до одержання продукту ферментації, і (0) необов'язково, видалення продукту ферментації, де кількість утворених гідролізованих продуктів окиснення наприкінці ферментативного гідролізу шляхом окиснення ЛІПИМО лігноцелюлозного матеріалу, який містить целюлозу й/або целолігосахариди, підтримується від
З до 110 г/кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі, шляхом додавання необхідної кількості кисню після попередньої обробки й до й/або під час ферментативного гідролізу в лігноцелюлозний матеріал, переважно, утворений гідролізований продукт окиснення є глюконовою кислотою, альдоновою кислотою й/або гемінальним діолом, більш переважно, гідролізований продукт окиснення є глюконовою кислотою.
Як зазначено вище, у кращому варіанті здійснення грибок є міцеліальним грибком, переважно грибком, що належить до роду Казатвзопіа або АзрегудйШи5. В одному варіанті здійснення культивування грибка здійснюють в аеробних умовах. Фахівцеві в даній області техніки добре відомі конструкції біореакторів для аеробного культивування, наприклад, таких як резервуари з перемішуванням і барботажні колони. Як правило, грибки культивують у середовищі для культивування клітин, придатному для одержання ферментної композиції, що цікавить. Культивування проводять у придатному поживному середовищі, яке включає джерела вуглецю й азоту й неорганічні солі, із застосуванням процедур, відомих у даній області техніки.
Придатні культуральні середовища, діапазони температур і інші умови, що підходять для вирощування й продукції ферментів, відомі в даній області техніки. Їхні приклади описані у даній заявці. Ферментну композицію можна приготувати шляхом вирощування грибків до стаціонарної фази й витримування грибків в умовах обмеження вуглецю протягом періоду часу, достатнього для експресії ферментів. Як тільки ферменти, що цікавлять, секретуються грибками у
Зо ферментаційне середовище, ферментну композицію можна використовувати. Етапу способу одержання ферментної композиції, яка включає щонайменше дві целюлази, і де ферментна композиція щонайменше містить ЛОМО, за допомогою культивування грибка в умовах, які забезпечують експресію ферментної композиції, як описано у даній заявці, може передувати процес розмноження грибка. Розмноження може включати кілька етапів у флаконах, що струшуються, невеликих контейнерах і більших контейнерах.
Лігпоцелюлозний матеріал
Лігноцелюлозний матеріал у даній заявці включає будь-який лігноцелюлозний (і/або геміцелюлозний матеріал. Лігноцелюлозний матеріал, придатний для застосування як сировинний матеріал за даним винаходом, включає біомасу, наприклад, первинну біомасу й/або непервинну біомасу, комерційну органіку, будівельне й міське сміття, тверді комунальні відходи, макулатуру й садові відходи. Загальні форми біомаси включають дерева, чагарники й траву, пшеницю, пшеничну солому, цукровий очерет, очеретяну солому, очеретяно-цукрову багассу, відходи цукрового очерету, просо, міскантус, енергетичний очерет, кукурудзу, кукурудзяну солому, кукурудзяну лушпайку, стрижні кукурудзяних качанів, стебла каноли, стебла сої, цукрове сорго, зерна кукурудзи, включаючи волокна із зерен, продукти й субпродукти розмелених зерен, таких як кукурудза, пшениця і ячмінь (включаючи мокре мливо й сухе мливо), які часто називають "висівками або волокном", а також комунальні тверді відходи, макулатуру й садові відходи. Біомаса також може бути трав'янистим матеріалом, сільськогосподарськими відходами, відходами лісового господарства, комунальними твердими відходами, макулатурою, і паперовою масою й відходами від виробництва паперу, але не обмежується ними. "Сільськогосподарська біомаса" включає гілки, кущі, очерет, кукурудзу й кукурудзяну лушпайку, енергетичні культури, лісоматеріал, плоди, квіти, зерна, траву, трав'янисті культури, листя, кору, хвою, колоди, коріння, пагони, деревні культури з короткою ротацією, чагарники, просо, дерева, овочі, шкірку плодів, ліани, жом цукрового буряка, пшеничні висівки, лушпайку вівса, і тверду й м'яку деревину (не включаючи деревину зі шкідливими матеріалами). Крім того, сільськогосподарська біомаса включає органічні відходи, утворені в сільськогосподарських процесах, включаючи землеробство й лісове господарство, особливо включаючи деревні відходи лісового господарства. Сільськогосподарська біомаса може бути будь-якою з вищезгаданого, окремо або в комбінації, або їх сумішшю. бо Целюлоза є органічною сполукою з формулою (СеНіоОб)п, полісахаридом, який складається із лінійного ланцюга від декількох сотень до більш десяти тисяч В(1--4) зв'язаних О-глюкозних одиниць. Глюканова молекула є полісахаридом з ОЮ-глюкозних мономерів, зв'язаних глікозидними зв'язками. У даній заявці глюкан і целюлоза застосовуються взаємозамінно для полісахарида з Ю-глюкозних мономерів, зв'язаних глікозидними зв'язками. Способи кількісного аналізу глюканових або полісахаридних композицій добре відомі й описані в даній області техніки, і узагальнені, наприклад, в СагмаІйо де 50и17а еї аї., Сагропуагате Роїутегв 95 (2013) 657-663. Як правило, від 50 до 70 95 глюкану є кристалічною целюлозою, а решта є аморфною целюлозою.
Попередня обробка
Лігпоцелюлозний матеріал, використовуваний у даному винаході, може бути промитий і/або підданий попередній обробці. Сировинний матеріал може бути необов'язково підданий попередній обробці з нагріванням, механічною й/або хімічною модифікацією, або будь-якою комбінацією таких способів, для підвищення доступності субстрату для ферментативного гідролізу й/або гідролізу геміцелюлози й/або солюбілізації геміцелюлози й/або целюлози й/або лігніну, будь-яким способом, відомим у даній області техніки. В одному варіанті здійснення попередню обробку проводять, обробляючи лігноцелюлозу парою, гарячою водою або розведеною кислотою або розведеною основою.
В одному варіанті здійснення лігноцелюлозний матеріал піддають попередній обробці до й/або під час ферментативного гідролізу. Способи попередньої обробки відомі в даній області техніки й включають нагрівання, механічну, хімічну модифікацію, біологічну модифікацію, і будь- яку їхню комбінацію, але не обмежуються ними. Попередню обробку, як правило, проводять для підвищення доступності лігноцелюлозного матеріалу для ферментативного гідролізу й/або гідролізу геміцелюлози й/або солюбілізації геміцелюлози й/або целюлози й/або лігніну, у лігноцелюлозному матеріалі. В одному варіанті здійснення попередня обробка включає обробку лігноцелюлозного матеріалу парою, обробку гарячою водою або обробку розведеною кислотою або розведеною основою. Приклади способів попередньої обробки включають обробку парою (наприклад, обробку за 100-260 "С, під тиском 7-45 бар, при нейтральному рН, протягом 1-10 хвилин), обробку розведеною кислотою (наприклад, обробку з 0,1 - 5 95 Н25Ох і/або 50» і/або
НМО: і/або НСІ, у присутності або при відсутності пари, за 120-200 "С, під тиском 2-15 бар, при
Зо кислому рН, протягом 2-30 хвилин), обробку органічним розчинником (наприклад, обробку 1- 1,5 96 Н25О» у присутності органічного розчинника й пари, за 160-200 "С, під тиском 7-30 бар, при кислому рН, протягом 30-60 хвилин), обробку вапном (наприклад, обробку 0,1-2 95
Ммаон/Са(ОнН)»: у присутності води/пари за 60-160 "С, під тиском 1-10 бар, при лужному рН, протягом 60-4800 хвилин), АКР обробку (наприклад, обробку 5-15 95 МНз, за 150-180 "С, під тиском 9-17 бар, при лужному рН, протягом 10-90 хвилин), АРЕХ обробку (наприклад, обробку з 215 95 МНз, за 60-140 "С, під тиском 8-20 бар, при лужному рН, протягом 5-30 хвилин), але не обмежуються ними.
Етап промивання
Необов'язково, спосіб відповідно до даного винаходу включає етап промивання.
Факультативний етап промивання може застосовуватися для видалення водорозчинних сполук, які можуть діяти в якості інгібіторів для етапу ферментації. Етап промивання можна проводити звичайним способом.
Лігноцелюлозний матеріал може бути промитий. В одному варіанті здійснення лігноцелюлозний матеріал може бути промитий після попередньої обробки. Етап промивання можна застосовувати для видалення водорозчинних сполук, які можуть діяти в якості інгібіторів для етапу ферментації й/або гідролізу. Етап промивання можна проводити способом, відомим фахівцям у даній області техніки. Слідом за промиванням, існують інші способи детоксикації.
Підданий попередній обробці лігноцелюлозний матеріал може також бути підданий детоксикації будь-яким (або комбінацією) із цих способів, які включають відділення твердої речовини/рідини, вакуумне розпарювання, екстракцію, адсорбцію, нейтралізацію, надлишкове вапнування, додавання агентів, що відновлюють, додавання детоксикуючих ферментів, таких як лаккази або пероксидази, додавання мікроорганізмів, здатних до детоксикації гідролізатів, але не обмежуються ними.
Ферментативний гідроліз
Ферментна композиція, використовувана в способі за даним винаходом, може вкрай ефективно гідролізувати лігноцелюлозний матеріал, наприклад, кукурудзяну солому, пшеничну солому, очеретяну солому, і/або очеретяно-цукрову багассу, яку можна потім перетворити в корисний продукт, такий як етанол, біогаз, бутанол, молочна кислота, пластик, органічна кислота, розчинник, добавка до корму тварин, фармацевтичний засіб, вітамін, амінокислота, бо фермент або хімічний сировинний матеріал. Крім того, проміжні продукти від процесу після гідролізу, наприклад, молочну кислоту як проміжний продукт при виробництві біогазу, можна застосовувати в якості стандартного блоку для інших матеріалів. Даний винахід супроводжується прикладами виробництва етанолу, але вони приводяться з метою ілюстрації, а не обмеження, також можна виробляти інші згадані корисні продукти.
Спосіб відповідно до даного винаходу включає етап ферментативного гідролізу.
Ферментативний гідроліз включає гідроліз із метою зрідження сировинного матеріалу, і гідроліз із метою вивільнення цукру із сировинного матеріалу, або те й інше, але не обмежується ними.
На цьому етапі необов'язково підданий ферментативній обробці й необов'язково промитий лігноцелюлозний матеріал приводять у контакт із ферментативною композицією відповідно до даного винаходу. Залежно від лігноцелюлозного матеріалу й попередньої обробки, різні умови реакції, наприклад, температура, дозування ферменту, час реакції гідролізу й концентрація сухої речовини можуть бути пристосовані фахівцем у даній області техніки для досягнення необхідного перетворення лігноцелюлози в цукор. Далі наведені деякі вказівки.
В одному варіанті здійснення ферментативний гідроліз включає щонайменше етап зрідження, де лігноцелюлозний матеріал гідролізують щонайменше в першому контейнері, і етап сахарифікації де зріджений лігноцелюлозний матеріал гідролізують щонайменше в першому контейнері й/або щонайменше в другому контейнері. Сахарифікацію можна проводити в тому ж самому контейнері, що й зрідження (тобто щонайменше в першому контейнері), її можна також проводити в окремому контейнері (тобто щонайменше в другому контейнері).
Таким чином, ферментативний гідроліз зі способів відповідно до даного винаходу можна комбінувати зрідження й сахарифікацію. Альтернативно, зрідження й сахарифікація можуть бути окремими етапами. Зрідження й сахарифікацію можна проводити за різних температур, але також можна проводити за однієї і тої ж температури. В одному варіанті здійснення температура зрідження вище температури сахарификації. Зрідження краще проводять за температури 60- 75 "С, а сахарифікацію переважно проводять за температури 50-65 "С.
Ферменти, використовувані у ферментативному гідролізі, можна додавати до й/або під час ферментативного гідролізу. У випадку, якщо ферментативний гідроліз включає етап зрідження й етап сахарификації, додаткові ферменти можуть бути додані під час і/або після етапу зрідження. Додаткові ферменти можуть бути додані до й/або під час етапу сахарификації.
Зо Додаткові ферменти можуть також бути додані після етапу сахарификації.
В одному аспекті винаходу гідроліз проводять за температури 45 "С або вище, 50 "С або вище, 55"С або вище, 60 "С або вище, 65"С або вище, або 70"С або вище. Висока температура при гідролізі має багато переваг, які включають роботу за оптимальної температури ферментної композиції, зниження ризику (бактеріальної) контамінації, зниження в'язкості, менша кількість необхідної для охолодження води, застосування охолодної води з більш високою температурою, повторне застосування ферментів, і т.д.
В'язкість лігноцелюлозного матеріалу в одному або декількох контейнерах, використовуваних для ферментативного гідролізу, зберігають від 10 до 4000 сП, від 10 до 2000
СП, переважно від 10 до 1000 сП.
У випадку, якщо спосіб включає ферментативний гідроліз, що включає етап зрідження й етап сахарификації, в'язкість лігноцелюлозного матеріалу на етапі зрідження зберігають від 10 до 4000 сП, від 10 до 2000 сП, переважно від 10 до 1000 сП, і/або в'язкість лігноцелюлозного матеріалу на етапі сахарификації зберігають від 10 до 1000 сП, від 10 до 900 сП, переважно від 10 до 800 сП.
В'язкість можна визначити з реометром Вгооклеїй ОМ І за температури, використовуваної для гідролізу.
В іншому аспекті винаходу кількість доданої ферментної композиції (також називають дозуванням ферменту або навантаженням ферменту) є низькою. В одному варіанті здійснення кількість ферменту становить 6 мг білка/г маси сухої речовини або нижче, 5 мг білка/г маси сухої речовини або нижче, 4 мг білка/г маси сухої речовини або нижче, З мг білка/г маси сухої речовини або нижче, 2 мг білка/г маси сухої речовини або нижче, або 1 мг білка/г маси сухої речовини або нижче (виражена у вигляді білка, в мг білка на г сухої речовини). В одному варіанті здійснення кількість ферменту становить 0,5 мг ферменту/г маси сухої речовини або нижче, 0,4 мг ферментної композиції/г маси сухої речовини або нижче, 0,3 мг ферменту/г маси сухої речовини або нижче, 0,25 мг ферменту/г маси сухої речовини або нижче, 0,20 мг ферменту/г маси сухої речовини або нижче, 0,18 мг ферменту/г маси сухої речовини або нижче, 0,15 мг ферменту/г маси сухої речовини або нижче, або 0,10 мг ферменту/г маси сухої речовини або нижче (виражена у вигляді всіх целюлазних ферментів у мг ферменту на г сухої речовини).
Низьке дозування ферменту можливе, оскільки завдяки активності й стабільності ферментів бо можна підвищити час реакції гідролізу.
В іншому аспекті винаходу час реакції гідролізу становить 5 годин або більше, 10 годин або більше, 20 годин або більше, 40 годин або більше, 50 годин або більше, 60 годин або більше, 70 годин або більше, 80 годин або більше, 90 годин або більше, 100 годин або більше, 120 годин або більше, 130 годин або більше. В іншому аспекті час реакції гідролізу становить від 5 до 150 годин, від 40 до 130 годин, від 50 до 120 годин, від 60 до 120 годин, від 60 до 110 годин, від 60 до 100 годин, від 70 до 100 годин, від 70 до 90 годин, або від 70 до 80 годин. Завдяки стабільності ферментної композиції можливий більш тривалий час реакції гідролізу з відповідними більш високими виходами цукрів.
Значення рН під час гідролізу може бути обране фахівцем у даній області техніки. В іншому аспекті винаходу рН під час гідролізу може становити від 3,0 до 6,4. Стабільні ферменти за даним винаходом можуть мати широкий діапазон рН до 2 одиниць рН, до З одиниць рН, до 5 одиниць рН. Оптимальне значення рН може перебувати в межах рнН від 2,0 до 8,0, від 3,0 до 8,0, від 3,5 до 7,0, від 3,5 до 6,0, від 3,5 до 5,0, від 3,5 до 4,5, від 4,0 до 4,5, або становить близько 4,2.
В іншому аспекті винаходу етап гідролізу проводять, поки не вивільниться до 70 95 або більше, 80 95 або більше, 85 95 або більше, 90 95 або більше, 92 95 або більше, 95 95 або більше доступного цукру в лігноцелюлозному матеріалі.
Важливо, що спосіб за даним винаходом можна проводити із застосуванням високих рівнів сухої речовини (або лігпоцелюлозного матеріалу) у реакції гідролізу. Таким чином, винахід можна здійснювати зі вмістом сухої речовини приблизно 5 мас. 95 або більше, приблизно 8 мас. У або більше, приблизно 10 мас.95 або більше, приблизно 11 мас. 95 або більше, приблизно 12 мас. 95 або більше, приблизно 13 мас. 95 або більше, приблизно 14 мас. 95 або більше, приблизно 15 мас. 95 або більше, приблизно 20 мас. 95 або більше, приблизно 25 мас. У або більше, приблизно 30 мас.95 або більше, приблизно 35 мас. 95 або більше, приблизно 40 мас. 95 або більше. В іншому варіанті здійснення вміст сухої речовини на етапі гідролізу становить 14 мас. 95, 15 мас. 95, 16 мас. 95, 17 мас. 90, 18 мас. 95, 19 мас. 95, 20 мас. 95, 21 маб. 95, 22 мас. 95, 23 мас. 95, 24 мас. 95, 25 мас. 95, 26 маб. 95, 27 мас. 90, 28 мас. 9о, 29 мас. У», 30 мас. 95, 31 мас. 95, 32 мас. 96, 33 мас. У» або більше, або від 14 до 33 мас. 95. В іншому варіанті здійснення вміст сухої речовини наприкінці гідролізу становить 5 мас. 95 або
Ко) більше, 6 мас. 95 або більше, 7 мас. 95 або більше, 8 мас. 95 або більше, 9 мас. 95 або більше, 10 мас. 95 або більше, 11 мас. 95 або більше, 12 мас. 95 або більше, 13 мас. 95 або більше, 14 мас. У» або більше, 15 мас. 95 або більше, 16 мас. 95 або більше, 17 мас. 95 або більше, 18 мас. У» або більше, 19 мас. 956 або більше, 20 мас. 95 або більше, 21 мас. 95 або більше, 22 мас. У» або більше, 23 мас. 956 або більше, 24 мас. 95 або більше, 25 мас. 95 або більше, 26 мас. 96 або більше, 27 мас. 95 або більше, 28 мас. 95 або більше, 29 мас. 95 або більше, 30 мас. У» або більше, 31 мас. 95 або більше, 32 мас. 95 або більше, 33 мас. 95 або більше, 34 мас. У» або більше, 35 мас. 95 або більше, 36 мас. 95 або більше, 37 мас. 95 або більше, 38 мас. о або більше, або 39 мас. 95 або більше. В іншому варіанті здійснення вміст сухої речовини наприкінці ферментативного гідролізу становить 5 мас. 95 - 40 мас. 9о, 6 мас. 95 - 40 мас. 95, 7 мас. Фь - 40 мас. 95, 8 мас. 9 - 40 мас. 95, 9 маб. Фь - 40 мас. 95, 10 мас. Фо - 40 мас. 9, 11 мас. бо - 40 мас. 95, 12 маб. 95 - 40 маб. 95, 13 мас. 95 - 40 мас. 95, 14 мас. бо - 40 мас. 95, 15 мас. о - 40 мас. 90, 16 мас. 95 - 40 мас. 95, 17 мас. У5 - 40 мас. 95, 18 мас. бо - 40 мас. бо, 19 мас. о - 40 мас. 95, 20 мас. 95 - 40 мас. 95, 21 мас. 5 - 40 мас. 95, 22 мас. Фо - 40 маб. бо, 23 мас. Зо - 40 мас. 90, 24 мас. 95 - 40 маб. 95, 25 мас. 965 - 40 мас. 95, 26 мас. Фо - 40 маб. бо, 27 мас. о - 40 мас. 95, 28 мас. 965 - 40 мас. 95, 29 мас. 965 - 40 мас. 9Уо, 30 мас. 905 - 40 маб. Фо, З1 мас. о - 40 мас. 90, 32 мас. 95 - 40 мас. 95, 33 мас. 95 - 40 мас. 95, 34 мас. бо - 40 маб. бо, 35 мас. о - 40 мас. 9Уо, 36 мас. 95 - 40 мас. 95, 37 мас. 5 - 40 мас. 95, 38 мас. бо - 40 мас. бо, 39 мас. 95 - 40 мас. 9.
Ферментація
Спосіб відповідно до даного винаходу включає етап ферментації. Ферментацію можна проводити одночасно з гідролізом в одному реакторі (З55Е). Переважно, ферментацію проводять після гідролізу, і можна вибрати оптимальні умови для гідролізу й для ферментації, які можуть різнитися для гідролізу й для ферментації. Таким чином, в іншому аспекті винахід включає на етапі ферментації процес, при якому використовують мікроорганізми для ферментації джерела вуглецю, що включає цукор(и), наприклад, глюкозу, І -арабінозу й/або ксилозу. Джерело вуглецю може включати будь-який вуглеводний оліго- або полімер, що містить І -арабінозні, ксилозні або глюкозні одиниці, наприклад, такі як лігноцелюлоза, ксилани, целюлоза, крохмаль, арабінан і таке інше. Для вивільнення ксилозних або глюкозних одиниць із таких вуглеводів, придатні карбогідрази (такі, як ксиланази, глюканази, амілази й тому подібні) бо можуть бути додані до ферментаційного середовища, або можуть продукуватися модифікованою клітиною-носієм. В останньому випадку модифікована клітина-носій може бути створена генно-інженерними методами для продукції й екскреції таких карбогідраз. Додатковою перевагою застосування оліго- і полімерних джерел глюкози є те, що вони забезпечують збереження низької (більш низької) концентрації вільної глюкози при ферментації, наприклад, шляхом застосування кількостей, що лімітують швидкість, карбогідраз. Це, у свою чергу, запобігає репресії систем, необхідних для метаболізму й транспорту неглюкозних цукрів, таких як ксилоза. У кращому способі модифіковані клітини-носії ферментують як І1-арабінозу (необов'язково, ксилозу), так і глюкозу, переважно одночасно; у цьому випадку переважно застосовують модифіковані клітини-носії, які є нечутливими до пригнічення глюкози для запобігання диауксичного росту. На додаток до джерела І -арабінози, необов'язково, ксилози (їі глюкози) у якості джерела вуглецю, ферментаційне середовище додатково містить придатний інгредієнт, необхідний для росту модифікованої клітини-носія. Склад ферментаційних середовищ для вирощування мікроорганізмів, таких як дріжджі й міцеліальні грибки, добре відомий в даній області техніки.
Час ферментації може бути коротшим, ніж при звичайній ферментації в тих же умовах, де частина ферментативного гідролізу усе ще повинна відбуватися під час ферментації. В одному варіанті здійснення час ферментації становить 100 годин або менше, 90 годин або менше, 80 годин або менше, 70 годин або менше, або 60 годин або менше, для цукрової композиції з 50 г/л глюкози й відповідних інших цукрів з лігноцелюлозного сировинного матеріалу (наприклад, 50 г/л ксилози, 35 г/л І -арабінози й 10 г/л галактози). Для більш розведених цукрових композицій час ферментації може відповідно бути скороченим.
Процес ферментації може бути аеєеробним або анаеробним процесом ферментації.
Анаеробний процес ферментації визначається у даній заявці як процес ферментації, що проходить за відсутності кисню, або в якому по суті не споживається кисень, переважно споживається менше 5, 2,5 або 1 ммоль/л/год., більш переважно 0 ммоль/л/год. (тобто споживання кисню не виявляється), і де органічні молекули служать як донори електронів і акцепторів електронів. За відсутності кисню НАДН, який продукується при гліколізі й утворенні біомаси, не може бути окиснений за допомогою окисного фосфорилювання. Для розв'язку цієї проблеми багато мікроорганізмів застосовують піруват або одне з його похідних як акцептора
Зо електрону й водню, таким чином, регенеруючи НАД". Таким чином, у кращому анаеробному процесі ферментації піруват застосовують у якості акцептора електрона (і водню), і відновлюють до таких продуктів ферментації, як етанол, молочна кислота, З-гідроксипропіонова кислота, акрилова кислота, оцтова кислота, бурштинова кислота, лимонна кислота, яблучна кислота, фумарова кислота, амінокислота, 1,3-пропандіол, етилен, гліцерин, бутанол, ВД- лактамні антибіотики й цефалоспорин. У кращому варіанті здійснення процес ферментації є анаеробним. Анаеробний процес є кращим, оскільки він дешевше аеробного процесу: потрібно менше спеціального устаткування. Далі, передбачається, що анаеробні процеси дають більш високий вихід, ніж аеробні процеси. В аеробних умовах звичайно вихід біомаси вище, ніж в анаеробних умовах. У результаті звичайно в аеробних умовах очікуваний вихід продукту нижче, ніж в анаеробних умовах.
В іншому варіанті здійснення процес ферментації проводять в умовах обмеження кисню.
Більш переважно, процес ферментації є аеробним і здійснюється в умовах обмеження кисню.
Процес ферментації з обмеженням кисню є процесом, у якому споживання кисню обмежене перенесенням кисню з газу в рідину. Ступінь обмеження кисню визначається кількістю й складом потоку газу, який надходить, а також дійсним перемішуванням/властивостями масового перенесення використовуваного встаткування для ферментації. Переважно, у процесі в умовах обмеження кисню швидкість споживання кисню становить щонайменше 5,5, більш переважно щонайменше 6, і ще більш переважно щонайменше 7 ммоль/л/год.
Процес ферментації переважно проходить за температури, оптимальної для модифікованої клітини. Таким чином, для більшості дріжджових або грибкових клітин процес ферментації проводять за температури менше 42 "С, переважно менше 38 "С. Для дріжджових і грибкових клітин-носіїв процес ферментації переважно проводять за температури нижче 35, 33, 30 або 28 "С, і температури вище 20, 22 або 25 76.
В одному варіанті здійснення винаходу етап ферментації проводять із мікроорганізмом, здатним до ферментації щонайменше одного С5 цукру. В одному варіанті здійснення процес є процесом для одержання етанолу, де процес включає етап, який включає ферментацію середовища, що містить цукор(и), з мікроорганізмом, здатним до ферментації щонайменше одного С5 цукру, де клітина-носій здатна до ферментації глюкози, І-арабінози й ксилози в етанол. Мікроорганізм може бути прокаріотичним або еукаріотичним організмом. Мікроорганізм, бо використовуваний у процесі, може бути мікроорганізмом, отриманим за допомогою генної інженерії. Прикладами придатних організмів є дріжджі, наприклад, засспаготусев, наприклад,
Засспаготусев сегемізіае, Засспаготусев5 равіопіапи5 або Засспаготусе5 имагит, Напзепшіа,
ІєзаїспепКіа, наприклад, і5заїспепкКіа огіепіай5, Ріспіа, наприклад, Ріспіа віїрйе5 або Ріспіа разіогізх, Кісумеготусе5, наприклад, Кінумеготусев5 Тадії5, Сапаїда, наприклад, Сапаїда рзецйдоїгорісаїї5 або Сападіда асідоштегторпійїшт, Распузоїеп, наприклад, Распузоїеп їаппорпйЙи5, або бактерії, наприклад, І асіобасіїйш5, наприклад, І асіобасіййн5 Іасії5, сеобасійи5, 7утотопав, наприклад, 7утотопах тобіїї5, Сіовігідічт, наприклад, Сіовігідішт рпуфотегтепіапв, Езспегіспіа, наприклад, Е. соїї, Кіерзіе(а, наприклад, Кіерзієйа охуїоса. В одному варіанті здійснення мікроорганізмом, здатним до ферментації щонайменше одного С5 цукру, є дріжджі. В одному варіанті здійснення дріжджі належать до роду Засспаготусе5, переважно до виду засспаготусеб5 сегемізїіає, у якому виконані генетичні модифікації. Приклад такого мікроорганізму і його приготування описане більш докладно в М/О 2008/041840 і в Європейській патентній заявці ЕР10160622.6, поданій 21 квітня 2010. В одному варіанті здійснення процес ферментації для одержання етанолу є анаеробним. Термін "анаеробний" уже визначений у даній заявці В іншому кращому варіанті здійснення процес ферментації для одержання етанолу є аеробним. В іншому кращому варіанті здійснення процес ферментації для одержання етанолу проводиться в умовах обмеження кисню, більш переважно в аеробних умовах і з обмеженням кисню. Умови з обмеженням кисню вже описані вище.
У такому процесі об'ємна продуктивність етанолу переважно становить щонайменше 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 5,0 або 10,0 г етанолу на літр на годину. Вихід етанолу за І -арабінозою й необов'язково ксилозою й/або глюкозою в процесі переважно становить щонайменше 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50,60, 70, 80, 90, 95 або 98 95. Вихід етанолу у даній заявці визначається як відсоток від теоретичного максимального виходу, який для глюкози й І-арабінози й необов'язково для ксилози становить 0,51 грам етанолу на грам глюкози або ксилози.
В одному аспекті процес ферментації, який приводить до одержання етанолу, має кілька переваг, у порівнянні з відомими процесами ферментації для одержання етанолу: - можливі анаеробні процеси; - можливі також умови з обмеженням кисню; - можна досягти більш високих виходів етанолу й швидкостей продукції етанолу;
Зо - використовуваний штам може бути здатний до застосування І -арабінози й необов'язково ксилозЗи.
У якості альтернативи для процесів ферментації, описаних вище, можна застосовувати щонайменше дві різні клітини, це означає, що процес є процесом спільної ферментації. Усі кращі варіанти процесів ферментації, як описано вище, також є кращими варіантами здійснення цих процесів спільної ферментації: ідентичність продукту ферментації, ідентичність джерела І - арабінози й джерела ксилози, умови ферментації (аеробні або анаеробні умови, умови обмеження кисню, температура, за якої здійснюють процес, продуктивність етанолу, вихід етанолу).
Процес ферментації можна проводити без якої-небудь вимоги до підведення рН під час процесу. Тобто, процес є процесом, який можна проводити без додавання якої-небудь кислоти (кислот) або основи (основ). Однак це виключає етап попередньої обробки, де можна додавати кислоту. Справа в тому, що композиція за даним винаходом здатна діяти при низькому рн, і таким чином, немає необхідності підводити рН попередньо обробленого кислотою сировинного матеріалу, щоб забезпечити оцукрювання або гідроліз. Відповідно, спосіб за даним винаходом може бути безвідхідним способом із застосуванням тільки органічних продуктів без необхідності введення неорганічних хімікатів.
Загальний час реакції
Відповідно до винаходу, загальний час реакції (або спільний час реакції етапу гідролізу й етапу ферментації) може бути скорочений. В одному варіанті здійснення загальний час реакції
БО становить 300 годин або менше, 200 годин або менше, 150 годин або менше, 140 годин або менше, 130 годин або менше, 120 годин або менше, 110 годин або менше, 100 годин або менше, 90 годин або менше, 80 годин або менше, 75 годин або менше, або приблизно 72 години при 90 95 виході глюкози. Відповідно, можна досягти зниження загального часу при більш низькому виході глюкози.
Продукти ферментації
Продукти ферментації, які можна одержати відповідно до винаходу, включають амінокислоти, вітаміни, фармацевтичні засоби, добавки в корм тварин, хімікати спеціального призначення, хімічні сировинні матеріали, пластики, розчинники, паливо, або інші органічні полімери, молочну кислоту й етанол, включаючи паливний етанол (під терміном "етанол" мають бо на увазі включення етилового спирту або сумішей етилового спирту й води).
Специфічні корисні продукти, які можуть бути зроблені за допомогою способів за даним винаходом, включають біопаливо (включаючи біогаз, етанол і бутанол); молочну кислоту; 3- гідроксипропіонову кислоту; акрилову кислоту; оцтову кислоту; 1,3-пропан-діол; етилен; гліцерин; пластик; хімікат спеціального призначення; органічну кислоту, включаючи лимонну кислоту, бурштинову кислоту й малеїнову кислоту; розчинник; добавку в корм тварин; фармацевтичний засіб, такий як Д-лактамний антибіотик або цефалоспорин; вітамін; амінокислоту, таку як лізин, метіонін, триптофан, треонін і аспарагінову кислоту; фермент, такий як протеаза, целюлаза, амілаза, глюканаза, лактаза, ліпаза, ліаза, оксидоредуктаза, трансфераза або ксиланаза; хімічний сировинний матеріал; або добавку в корм тварин, але не обмежуються ними.
Продукти ферментації, які можна одержати за допомогою способу за даним винаходом, можуть бути будь-якою речовиною, отриманою ферментацією. Вони включають спирти (такі, як арабінітол, бутанол, етанол, гліцерин, метанол, 1,3-пропандіол, сорбітол і ксилітол); органічну кислоту (таку, як оцтова кислота, ацетонова кислота, адипінова кислота, аскорбінова кислота, акрилова кислота, лимонна кислота, 2,5-дикето-Ю-глюкюонова кислота, мурашина кислота, фумарова кислота, глукарова кислота, глюконова кислота, глюкуронова кислота, глутарова кислота, З-гідроксипропіонова кислота, ітаконова кислота, молочна кислота, малеїновая кислота, яблучна кислота, малонова кислота, щавелева кислота, щавелевооцтова кислота, пропіонова кислота, бурштинова кислота й ксилонова кислота); кетони (такі, як ацетон); амінокислоти (такі, як аспарагінова кислота, глутамінова кислота, гліцин, лізин, серин, триптофан і треонін); алкани (такі, як пентан, гексан, гептан, октан, нонан, декан, ундекан і додекан), циклоалкани (такі, як циклопентан, циклогексан, циклогептан і циклооктан), алкени (такі, як пентен, гексен, гептен і октен); і гази (такі, як метан, водень (Нг), диоксид вуглецю (СО?) і монооксид вуглецю (СО)), але не обмежуються ними. Продукт ферментації може також бути білком, вітаміном, фармацевтичним засобом, добавкою в корм тварин, хімікатом спеціального призначення, хімічним сировинним матеріалом, пластиком, розчинником, етиленом, ферментом, таким як протеаза, целюлаза, амілаза, глюканаза, лактаза, ліпаза, ліаза, оксидоредуктаза, трансфераза або ксиланаза.
Відділення продукту ферментації
Спосіб відповідно до даного винаходу необов'язково включає виділення продукту ферментації. Продукт ферментації може бути відділений від ферментаційного бульйону будь- яким відомим способом. Таким чином, для кожного продукту фахівець у даній області техніки може вибрати придатну методику відділення. Наприклад, етанол може бути відділений від дріжджового ферментаційного бульйону шляхом дистиляції, наприклад, дистиляції парою/вакуумної дистиляції звичайним способом.
Деякі варіанти здійснення винаходу далі описані більш докладно, але без обмеження яким- небудь чином об'єму даного винаходу.
Застосування термостабільних ферментів в оптимальних температурних умовах
В одному варіанті здійснення винахід відноситься до застосування термостабільних ферментів, таких як целюлолітичні ферменти з Казатзопіа, для одержання відновлюючи цукрів, з попередньо обробленого лігноцелюлозного сировинного матеріалу при продукції етанолу, але не обмежуючись ним. Целюлолітичні ферменти з Казатвзопіа, застосовувані на попередньо обробленому лігноцелюлозному сировинному матеріалі, показали максимальні швидкості перетворення за температури в діапазоні від 50 до 70 "С. Фермент залишається активним у цих умовах протягом 14 діб і більше без повної втрати активності.
Із застосуванням оптимальних температурних умов можна вивільнити максимальну кількість відновлюючи цукрів із сировинного матеріалу (повний гідроліз) з найкоротшим можливим часом гідролізу. Таким способом досягається 100 95 перетворення целюлози в глюкози менш ніж за 5 днів.
Теоретичний максимальний вихід (Ур5 тах у грамах продукту на грам глюкози) для ферментаційного продукту може бути отриманий з підручника по біохімії. Для етанолу 1 моль глюкози (180 г) дає відповідно до нормального шляху ферментації у вигляді гліколізу щонайменше 2 моль етанолу (52 х 46-92 г етанолу). Теоретичний максимальний вихід етанолу за глюкозою, таким чином, становить 92/180-0,511 г етанолу/г глюкози.
Для бутанолу (М.м. 74 г/моль) або ізобутанолу теоретичний максимальний вихід становить 1 моль бутанолу на моль глюкози. Таким чином, Хр тах для (ізо)бутанолу становить - 74/180-0,411 г (ізо)бутанолу/г глюкози.
Для молочної кислоти вихід ферментації для гомомолочнокислої ферментації становить 2 моль молочної кислоти (М.м. - 90 г/моль) на моль глюкози. Відповідно до цієї стехіометрії, уро бо тах-1 г молочної кислоти/г глюкози.
Для інших продуктів ферментації можна провести подібні розрахунки.
Зниження витрат, що досягається із застосуванням целюлолітичних ферментів з
Казатвзопіа, забезпечує зменшення загального часу процесу.
Компенсація низького дозування ферменту зі збільшенням часу гідролізу із застосуванням ферментів Казатвзопіа
Завдяки високій стабільності стабільних ферментів, активність не зникає згодом, хоча вивільняється менше цукрів у ході гідролізу. Можна знизити дозування ферменту й продовжити застосування ферменту шляхом збільшення часу гідролізу для одержання подібних рівнів відновлюючих цукрів, що вивільняються. Наприклад, 0,175 мл ферменту/г сухої речовини сировинного матеріалу приводить до вивільнення приблизно 90 95 від теоретичного максимуму відновлюючих цукрів з попередньо обробленого сировинного матеріалу за 72 години. При використанні 0,075 мл ферменту/г сухої речовини сировинного матеріалу приблизно 90 95 перетворення від теоретичного максимуму досягається в межах 120 годин. Результати показують, що завдяки стабільності ферментативної активності, зниження дозування ферменту можна компенсувати шляхом збільшення часу гідролізу для одержання тієї ж кількості відновлюючих цукрів. Те ж саме справедливо для гідролізу попередньо обробленого сировинного матеріалу при вмісті сухої речовини вище 10 95, що показує компенсаторний ефект подовження часу гідролізу при 15 95 сухої речовини сировинного матеріалу.
Зниження витрат на виробництво, що досягається шляхом застосування целюлолітичних ферментів, таких як Казатвзопіа, приводить до необхідного зниженого дозування ферменту, забезпечуючи подібний вихід при гідролітичному перетворенні.
Зниження ризику контамінації зі стабільними ферментами
У загальному способі перетворення лігноцелюлозного матеріалу в етанол етапи способу переважно здійснюють у септичних умовах для зниження витрат на виробництво. Таким чином, можлива контамінація й ріст контамінуючих мікроорганізмів, що може привести до небажаних побічних ефектів, таких як вироблення молочної кислоти, мурашиної кислоти й оцтової кислоти, втрати виходу етанолу на субстраті, вироблення токсинів і екстрацелюлярних полісахаридів, що може значно впливати на витрати на виробництво. Висока температура процесу й/або короткий час процесу обмежує ризик контамінації при гідролізі й ферментації. Термостабільні ферменти,
Зо такі як з Казатвзопіа, здатні до гідролізу лігноцелюлозного сировинного матеріалу при температурах вище 60 "С. При цих температурах ризик контамінації мікроорганізмами, що викликають небажані побічні ефекти, є слабким або майже нульовим.
Під час етапу ферментації, при якому утворюється етанол, температура, як правило, становить від 30 до 37 "С і переважно не підвищується через втрати продукції. При використанні як найкоротшого часу ферментації ризики й ефекти контамінації й/або росту контамінантів максимально знижуються. Зі стабільними ферментами, такими як з Казатвзопіа, можна застосовувати якнайкоротший час ферментації (див. опис вище), і таким чином, ризики контамінації й/або росту контамінантів якнайбільше знижуються. Таким чином, зниження витрат на виробництво, що досягається із застосуванням термостабільних целюлолітичних ферментів з Казатзопіа, приводить до зниження ризику порушень процесу через контамінацію.
Стабільні ферменти дозволяють знизити витрати на охолодження й підвищують продуктивність виробництва етанолу
На першому етапі після термічної обробки необхідно остудити попередньо оброблений сировинний матеріал до температур, де ферменти мають оптимальну активність. У великому масштабі це, як правило, виконують шляхом додавання (охолодженої) води, яка, крім зниження температури, знижує вміст сухої речовини. Із застосуванням термостабільних ферментів, таких як з Вазатзопіа, можна досягти зниження витрат на виробництво завдяки тому, що (ї) потрібно менше охолодження попередньо обробленого сировинного матеріалу, оскільки більш високі температури допускаються при гідролізі, і (ії) додають менше води, що підвищує вміст сухої речовини при гідролізі й ферментації, і таким чином, підвищує виробничий потенціал для етанолу (кількість, вироблена за одиницю часу за обсягом) для заводу з виробництва етанолу.
Крім того, із застосуванням термостабільних ферментів відповідно до даного винаходу, таких як з Казатвзхопіа, можна досягти зниження витрат на виробництво шляхом застосування охолодної води, що має більш високу температуру, ніж вода, використовувана в способі з нетермостабільним ферментом.
Повторне використання ферментів після гідролізу зі стабільними ферментами
Наприкінці гідролізу активність ферментів стає низькою, оскільки вивільняється мало відновлюючих цукрів через перетворення майже всієї целюлози. Однак кількість присутньої ферментативної активності мало знижується, приблизно, головним чином через абсорбцію бо ферментів на субстраті. За допомогою застосування відділення твердої речовини від рідини,
такого як центрифугування, фільтрація, осадження з декантацією, і т.д., можна виділити 60 Фо або більше, наприклад, 70 95 ферментативної активності в розчині, і повторно застосувати для гідролізу нового попередньо обробленого лігпоцелюлозного сировинного матеріалу при наступному гідролізі.
Далі, після поділу твердої речовини й рідини фермент у розчині можна відокремити від розчину, який містить відновлюючі цукри й інші продукти гідролізу від ферментативної активності. Це відділення можна виконати шляхом (ультра- і мікро)фільтрації, центрифугування, осадження з декантацією, седиментації, з першою абсорбцією ферменту на носії будь-якого виду, або без неї, але не обмежуючись ними.
Наприклад, після гідролізу попередньо обробленого сировинного матеріалу з ферментативним навантаженням 0,175 мл/г сухої речовини сировинного матеріалу протягом 20 годин, вивільняється 50 95 від теоретичної максимальної кількості відновлюючих цукрів, а після того ж гідролізу протягом 72 годин вивільняється 90 95 від теоретичної максимальної кількості відновлюючих цукрів. Шляхом центрифугування й ультрафільтрації витягали 60-70 9о ферментативної активності в концентраті, у той час як фільтрат містив більш 80 95 вивільнених відновлюючих цукрів. Шляхом повторного застосування концентрату, як такого або після додаткового очищення й/або концентрування, дозування ферменту під час наступного етапу гідролізу можна знизити від 60 до 70 95. Зниження витрат, що досягається із цими стабільними целюлолітичними ферментами, такими як з Казатвзопіа, забезпечується таким способом за рахунок зниження необхідного дозування ферменту.
Повторне використання ферментів після гідролізу в комбінації із продукцією ферментів і повторним використанням дріжджових клітин зі стабільними ферментами
Спосіб, що включає повторне застосування ферментів після гідролізу, як описано вище, можна об'єднати з повторним застосуванням мікроорганізмів, що виробляють етанол, після ферментації, і із застосуванням фільтрату, який містить відновлюючі цукри, у якості субстрату (очищеного й/або концентрованого або розведеного) у ферментації з виробленням ферменту й у якості субстрату для культивування мікроорганізму, що виробляє етанол.
Повторне застосування ферментів після вакуумної дистиляції зі стабільними ферментами
Термостабільність ферментів, таких як з Казатзопіа, забезпечує целюлолітичну активність,
Зо що залишилася після гідролізу, ферментації й вакуумної дистиляції у відфільтрованій барді.
Загальна активність ферменту знижується під час трьох наступних етапів процесу. Таким чином, відфільтровану барду, отриману після вакуумної дистиляції, можна повторно використовувати в якості джерела ферментів для нового циклу процесу гідролізу-ферментації- дистиляції для перетворення попередньо обробленої пшеничної соломи в етанол.
Відфільтровану барду можна застосовувати в концентрованій або (не)розведеній формі й/або очищеною з додаванням додаткових ферментів, або без них.
Повторне застосування ферментів у комбінації з додаванням ферментів після вакуумної дистиляції з термостабільними ферментами
В оптимальному способі кількість ферменту, що додається у відфільтровану барду перед її повторним застосуванням у новому циклі процесу, дорівнює кількості активності, втрачених на трьох послідовних етапах процесу з попереднього циклу процесу. Таким способом запобігають надлишковому дозуванню ферменту, і таким чином, досягають найбільш ефективного застосування ферменту.
Далі, шляхом забезпечення високого дозування ферменту в першому виробничому циклі й додавання ферменту, рівного кількості активності, втраченій під час трьох послідовних етапів процесу в наступних циклах процесу, можна досягти найбільш високих можливих швидкостей гідролізу в кожному циклі процесу, що приводить до короткого часу гідролізу менше 48 годин у комбінації з найбільш ефективним застосуванням ферментів.
Застосування стабільних ферментів у змішаних системах
За рахунок застосування перемішування під час гідролізу, ферменти частіше приходять у контакт із субстратами, що приводить до більш ефективного застосування каталітичної активності. Це забезпечує застосування менших дозувань ферментів і таким чином, до зниження витрат, якщо тільки змішування не виявляє негативного впливу на ферменти.
Стабільні ферменти, такі як термостабільні ферменти з Вавзатбвопіа, стійкі й можуть витримувати умови (місцеві) високого зрушення й температур, які відзначаються у випадку інтенсивного перемішування суспензій. Застосування систем з перемішуванням, таким чином, є сприятливим, і приводить до зменшення дозування, і таким чином, до зниження витрат.
Винахід далі описаний за допомогою наступних прикладів, які не слід уважати обмежуючими об'єм винаходу. 60 Приклади
Інформація про експеримент
Штами
Придатними штамами Казатвзопіа, які можна використовувати в представлених прикладах для демонстрації ефекту й переваг винаходу, є, наприклад, ТЕС-101, ТЕС-147, ТЕС-192, ТЕС- 201 або ТЕС-210. Штами описані в УМО 2011/000949.
Приготування попередньо обробленого кислотою субстрату з кукурудзяної соломи
Попередньо оброблену розведеною кислотою кукурудзяну солому (ККС) одержували, як описано в 5осопеїЇ, 0.9У., Арріїєй Віоспетізігу апа Віоїесппоіоду (2003), мої. 105-108, рр 69-85.
Використовували реактор для попередньої обробки в пілотному масштабі, що працює в умовах рівноважного стану 190 "С, із тривалістю перебування 1 хв. і ефективною концентрацією Н25О4 1,45 мас. 95 у рідкій фазі.
Аналізи для визначення білка 1. Загальний білок
ТХО Біурет
Спосіб є комбінацією осадження білка із застосуванням трихлороцтової кислоти (ТХО) для видалення речовин, що заважають, і забезпечення визначення концентрації білка з колориметричною біуретовою реакцією. У біуретовій реакції іон міді (ІЇ) відновлюється до іона міді (І), який утворює комплекс із азотами й вуглецями пептидних зв'язків у лужному розчині.
Фіолетове забарвлення вказує на присутність білків. Інтенсивність забарвлення, і отже, поглинання при 546 нм, прямо пропорційні концентрації білка, відповідно до закону Ламберта-
Бера. Калібрування проводили із застосуванням БСА (бичачого сироваткового альбуміну), і вміст білка виражали в грам білка у вигляді еквівалента БСА/л або в мг білка у вигляді еквівалента БСА/мл. Вміст білка розраховували із застосуванням стандартних протоколів, відомих у даній області технікиь, шляхом побудови кривої значень ОП5авє проти концентрації зразків з відомою концентрацією, з наступними розрахунками концентрації невідомих зразків, із застосуванням рівняння, отриманого з каліброваної кривої. 2. Індивідуальні білки із застосуванням ПАГЕ
Попередня обробка зразків для ДСН-ПАГЕ
На основі встановленої концентрації білка в зразках, проводили наступну підготовку зразків.
Зо ДО 10 мкл зразка додавали 40 мкл води Мід і 50 мкл ТХО (20 9о) для п'ятикратного розведення зразка (х 1 мг/мл) і осадження білків. Через 1 годину інкубації на льоді зразки центрифугували (10 хвилин, 14000 об./хв.). Осад промивали 500 мкл ацетону й центрифугували (10 хвилин, 14000 об./хв.). Осад обробляли, як описано нижче.
ДСН-ПАГЕ
Осад розчиняли в 65 мкл води Мійд, 25 мкл Мирадент ГО5 буфера для зразків (4х)
Іпмігодеп і 10 мкл Мирадеїт агента, що відновлює, для зразків (10х) Іпмігодеп. Перед етапом денатурації зразок розбавляли в 5 разів із застосуванням суміші Міїйд; Мирадент ГО5 буфера для зразків і 10 мкл Мирадеїт агента, що відновлює, для зразків у відношенні 65:25:10. Після змішування зразки інкубували в термоміксері протягом 10 хвилин за 70 "С. Розчини зразків вносили на 4-12 95 Віб-Тгіз гель (Мирадеїт Візігі5, Іпмігодеп). На гель також наносили зразок маркера (10 мкл) М12 (Іпмігодеп). Електрофорез у гелях проводили при 200 В протягом 50 хвилин, із застосуванням ХСЕЇЇ БЗигеїоскК, з 600 мл розведеного в 20 разів ДСН буфера в зовнішній буферній камері й 200 мл розведеного в 20 разів ДСН буфера, що містить 0,5 мл антиоксиданту (Мирадейт Іпмігодеп), у внутрішній буферній камері. Після електрофорезу гель двічі промивали демінералізованою водою, фіксували гелі розчином 50 95 метанолу/7 90 оцтової кислоти протягом 1 години, і фарбували Зурго Кибу (50 мл на гель) протягом ночі. Зображення одержували із застосуванням Турпооп 9200 (610 ВР 30, Зелений (532 нм), РМТ бОО0М, 100 мікрон) після відмивання гелю водою МіїЇд.
Кількісний аналіз білка
Із застосуванням сканера Турпооп визначали відношення між білковими смугами доріжки із застосуванням стандартних способів, відомих у даній області техніки. Зразок наносили в трьох повторностях, і рівень яскравості визначали із застосуванням програми Ітаде Оцапі. Значення виражали у вигляді процентної кількості білка стосовно загального білка, при розрахунках із застосуванням рівня яскравості вибраної білкової смуги щодо загального рівня яскравості всіх білкових смуг.
Розрахунки перетворення глюканів:
Перетворення глюканів (95) - (глюкоза (г/л) х 100 95) / (глюкан (фракція за сухою речовиною) х СР (г/кг) х 1,1); де:
Глюкоза (г/л) - концентрація глюкози в надосадовій рідині після гідролізу. 60 Глюкан (фракція за СР) - вміст глюкану в субстраті перед попередньою обробкою.
СР (г/кг) - вміст сухої речовини при гідролізі (наприклад, 20 95 СР - 200 г/кг). 1,1 - збільшення маси через вбудовування води при гідролізі.
Зразковий розрахунок:
Глюкоза - 60 г/л
Глюкановая фракція - 0,40 (40 95 за сухою речовиною)
СР - 200 г/кг
Приклад перетворення глюкану - (607100) / (0,4 х 200 х 1,1) - 68 95 перетворення
Робили поправку на випаровування, якщо необхідно. Концентрацію в надосадовій рідині потім перетворювали в концентрацію на кілограм гідролізату.
Вимірювання глюкуронової кислоти в гідролізатах біомаси за допомогою СВЕРХ-МС/МС
Аналіз заснований на поділі глюконової кислоти зі СВЕРХ стовпчиком і детекції за допомогою МС/МС (на основі негативної електророзпилюючої іонізації). Для виключення помилок, викликаних ефектами супресії іонів, випаровування й уведення, використовували мічений внутрішній стандарт, а саме "ЗСв-глюконову кислоту.
Хімікати й еталонні сполуки
Воду, використовувану для підготовки зразків і СВЕРХ-МС/МС, фільтрували за допомогою фільтра МіШіроге, 0,22 мкм. Ацетонітрил ВЕРХ якості одержували від МегсК (Амстердам,
Нідерланди). 0,1 об. 95 розчин мурашиної кислоти у воді й 0,1 об. 95 розчин мурашиної кислоти в ацетонітрилі одержували від Віозоїме В.М. (Валкенсвард, Нідерланди). Еталонна сполука глюконової кислоти одержували від Зідта (Звейндрехт, Нідерланди). Мічена ізотопом глюконова кислота (ЗСв, використана в якості внутрішнього стандарту) була виготовлена на замовлення Виспет В.М. (Апелдорн, Нідерланди).
Внутрішній стандартний розчин
Матковий розчин готували з використанням навішення 10 мг "ЗС6-глюконової кислоти, внесеної в 10 мл мірну колбу, з розчиненням в 10 мл води (близько 1 мг/мл). Із цього маткового розчину готували робочий розчин шляхом відбору піпеткою 100 мкл маткового внутрішнього стандартного розчину й додавання 9,99 мл води (концентрація близько 10 мкг/мл).
Стандартні розчини
Матковий розчин глюконової кислоти готували шляхом приготування навішення 5 мг глюконової кислоти й додавання 10 мл води. Матковий розчин потім розбавляли шляхом відбору піпеткою 20 мкл маткового розчину й додавання 980 мкл води (розведень 1, концентрація близько 10 мг/мл). Інше розведення готували, відбираючи піпеткою 100 мкл із розведення 1 і додаючи 900 мкл води (розведення 2, концентрація близько 1 мг/мл).
Калібровану криву будували для ВЕРХ флаконів відповідно до Таблиці 1 нижче.
Підготовка зразків
Разморожували гідролізати біомаси, якщо необхідно, і розбавляли в 10 разів водою, шляхом розведення 150 мкл зразка в пробірці Еппендорф із 1350 мл води, з наступним центрифугуванням при 13000 об./хв. протягом 15 хвилин. Отриману надосадову рідину розбавляли в 50 разів водою шляхом відбору піпеткою 20 мкл надосадової рідини у ВЕРХ флакон і додавання 100 мкл робочого розчину внутрішнього стандарту й 880 мкл води.
СВЕРХ-МС/МС
Глюконову кислоту аналізували в системі УМаїег5 ОРІ С іСіабє5, що складається з модуля
Умаїег5 іСіаз5 Віпагу Зоїмепі Мападег і модуля Умаїег іСіає5 Ззатріє Мападег ЕТМ, з'єднаних з мас-спектрометром Умаїеі5 Хемо ТО (УМаїег5, Мілфорд, Массачусетс, США). Хроматографічний поділ проводили зі стовпчиком УмМаїег Асдийу ОРІ С ВЕН С18 (150 х 2,1 мм, 1,8 мкм) із застосуванням градиєнтної елюції (А) 0,1 об. 96 мурашиної кислоти у воді й (В) 0,1 95 мурашиної кислоти в ацетонітрилі в якості мобільних фаз. 7 хв. градієнт починали з 1 хвилини при 99 95 (А) з наступним лінійним зниженням до 90 95 (А) за 2 хвилини, потім промивали 20 95 (А) протягом 2 хвилин і повторно врівноважували 99 95 (А) протягом 2 хвилин. Швидкість потоку зберігали 0,35 мл/хв., із застосуванням об'єму, що вводиться, 5 мкл, а температуру стовпчика встановлювали на"40 С.
Мас-спектрометр працював у режимі негативної іонізації. Обробку даних і інтеграцію піків проводили із застосуванням програмного забезпечення Маб5іупх 4.1 (Умаїег5). Детекцію глюконової кислоти й "ЗСе-глюконової кислоти проводили в режимі моніторингу множинних реакцій (МРМ). Загальні установки були наступними: капілярна напруга ЕРІ 2,0 кВ, напруга на екстракторі 3,0 В, напруга на конусі 30 В. Потік десольватаційного газу (азоту) склав 800 л/година з температурою, установленою на 350 "С, потік конусного газу (азоту) 50 л/година, а температура джерела 150 С. Використовували наступні установки ММР: т/7 глюконової кислоти 195,0 -» 129,0, тривалість витримки 0,1 сек, напруга зіткнення 2 В; т/72 "ЗСв-глюконової 60 кислоти 201,0 -» 134,0, тривалість витримки 0,08 сек, напруга зіткнення 2 В.
Зо
Кількісний аналіз
Концентрацію глюконової кислоти в г/л розраховували із застосуванням лінійної регресії:
Концентрація (г/л) - ((ППлоща сполукиЛ/лоща внутрішнього стандарту) - зрушення по осі)х(1000 (фактор розведення) / (тангенс кута нахилу калібровочної кривої х 1000)
Розрахункову кількість глюконової кислоти в г/л можна перетворити у вміст глюконової кислоти в грамах/кілограмах глюкану в лігноцелюлозному матеріалі за допомогою наступних розрахунків.
При використанні попередньо обробленої кислотою кукурудзяної соломи в концентрації 20 мас. 96 СР, наприкінці гідролізу протягом 120 годин, при рн 4,5 і 62 "С відзначається об'єм осаду б 95 (нерозчинного) і об'єм надосадової рідини 94 95. Надосадова рідина має щільність 1,07 кг/л, і вміст глюкану 36 95. Таким чином, попередньо оброблена кислотою кукурудзяна солома при концентрації 20 мас. 95 СР містила 72 г глюкану на кілограм гідролізату.
Починаючи, наприклад, з 0,5 г/л глюконової кислоти, це дає 0,5/1,07-0,47 г глюконової кислоти/кг надосадової рідини (1,07 є щільністю рідини). Це відповідає 0,47(0,94-0,44 г глюконової кислоти/кг гідролізату (фактор осаду 6 96 через нерозчинність). При використанні попередньо обробленої кислотою кукурудзяної соломи в концентрації 20 мас.95 СР це відповідає 0,44/0,072-6,1 г глюконової кислоти/кг глюкану.
Приклад 1
Застосування кисню під час гідролізу для контролю кількості глюконової кислоти, що утворюється
Оптимальний ферментативний гідроліз попередньо обробленої кукурудзяної соломи, що містить 20 95 сухої речовини (містить 36 956 глюкану за сухою речовиною) за температури реактора 60 "С ї рН 4,5 проводили при збереженні концентрації глюконової кислоти від 0,7 до 1,5 г/л у надосадовій рідині гідролізату шляхом додавання кисню. Це відповідає 9,7-20,8 г глюконової кислоти, яка продукується на кілограм глюкану під час гідролізу глюкану. Гідроліз проводили в 2,5 мг/г СР сировинного матеріалу ТЕС-20 целюлазної ферментної композиції (або коктейлю). ТЕС-210 проводили відповідно до процедур інокуляції й ферментації, описаних в УМО 2011/000949.
Приклад 2
Зо Застосування кисню під час гідролізу для контролю кількості глюконової кислоти, що утворюється
Ферментативний гідроліз проводили із застосуванням сировинного матеріалу у вигляді попередньо обробленої кислотою кукурудзяної соломи (кККС) при концентрації 20 мас. 95 сухої речовини (СР). Розчин сировинного матеріалу готували шляхом розведення концентрованої суспензії сировинного матеріалу водою. Доводили рН до 4,5 з 25 мас. 95 розчином МНАОН.
Ферментативний гідроліз проводили в масштабі 1 кг із застосуванням 1,5 літрового реактора.
Контролювали збереження рН 4,5 і температуру 62 "С. Розчинений кисень під час процесу контролювали за допомогою рециркуляції газу у вільному просторі й додаткового свіжого повітря (яке містить 20-21 95 кисню).
Перед додаванням ферментів проводили рециркуляцію газу вільного простору при потоці газу З л/година із застосуванням перистальтичного насоса й розподільника. Завдяки тому, що сировинний матеріал споживає кисень при хімічній реакції, рівень РК досягає 0 95 РК у межах однієї години, що приводить до анаеробного сировинного матеріалу й повного виснаження кисню у вільному просторі. Отриманий інертний газ вільного простору (вільний від кисню) використовували під час усього гідролізу як газу-носія для свіжого повітря, що вводиться.
Потім целюлазний ферментний коктейль ТЕС-210 додавали до сировинного матеріалу в дозі 3,75 мг (ТХУ білкауугї СР. ТЕС-210 одержували відповідно до процедур інокуляції й ферментації, описаних в УМО 2011/000949. Загальний час гідролізу склав 120 годин.
Свіже повітря вводили рециркуляційну лінію інертного газу вільного простору під час усього процесу гідролізу при потоці свіжого повітря 0 - 3 -6 -12 - 24 або 48 мл на кілограм реакційної суміші на годину, відповідно, починаючи прямо після додавання ферменту. РК вимірювали постійно у всіх експериментах. Зразки витягали на початку й наприкінці експерименту для аналізу глюкози за допомогою ВЕРХ.
Паралельний експеримент проводили у флаконі, що струшується, для визначення максимального рівня гідролізу глюкану. Максимальний гідроліз визначали шляхом інкубації сировинного матеріалу при дуже високому дозуванні ферменту (50 мг (ТХУ білка)/г СР) за схожих умов (рН, температура й СР) у надлишку повітря вільного простору, що містить кисень.
Визначення РК у кожному експерименті постійно показувало 095 РК. Це можна пояснити прямим споживанням кисню опісля його перенесення з потоку утримуючого кисень бо рециркулюючого газу в рідку фазу в реакторі.
Результати представлено в Таблиці 2. Підвищення продукції глюкози розраховували шляхом вирахування концентрації глюкози (у г/л) на початку гідролізу з концентрації глюкози (у г/л) наприкінці гідролізу для кожного стану (тобто потік свіжого повітря (мл/кг/год.) 0 - 3-6 - 12 - 24 - 48 - 96) і поділу відповідних величин на величину, установлену, коли потік свіжого повітря (мл/кг/год.) склав 0 (ця величина визнана 100 95).
Ці дані ясно демонструють, що більш високі кількості глюкози утворюються, коли кількість глюконової кислоти, що формується, зберігають наприкінці гідролізу вище З г/кг глюкану в лігноцелюлозному матеріалі.
Приклад З
Вплив глюконової кислоти на ферментативний гідроліз лігноцелюлозного сировинного матеріалу 20 грам попередньо обробленої кукурудзяної соломи інкубували в 50 мл аналітичній пробірці Сгеіпег протягом 50 годин при рівні сухої речовини б мас. 95, рН 4,5 за 62"С у присутності 5 мг целюлазного ферментного коктейлю ТЕС-210 на грам сухої речовини й у присутності 0, 2, 4, 6 або 8 г/л глюконової кислоти для визначення ингібуючого ефекту глюконової кислоти відносно гідролізу глюкану в лігноцелюлозному сировинному матеріалі.
Експеримент проводили при максимальному насиченні кисню.
Зразки відбирали через 50 годин інкубації, і зразки центрифугували для додаткового аналізу в центрифужних пробірках Еппендорф 5810 протягом 8 хвилин при 4000 об./хв... Концентрацію глюкози визначали в надосадовій рідині кожного зразка за допомогою ВЕРХ із застосуванням стовпчика Віо-Каа НРХВ87Н. Результати показано в таблиці 3. Вивільнення глюкози, як презентовано в таблиці 3, є прямю мірою ферментативного гідролізу (гідролізу глюкану). Рівень глюконової кислоти 2 г/л у надосадовій рідині відповідає 89 г/кг глюкану в лігноцелюлозному матеріалі. Його можна розрахувати, як описано вище, із щільністю 1,02 кг/л, фактором осаду 2 Чо і вмістом глюкану 2,16 г глюкану/кг гідролізату.
Результати ясно показують, що більш високі концентрації глюконової кислоти впливають на гідроліз глюкану.
Таблиця 1
Калібровочна крива еннни | СТЕ РА мн СТ розчин, розведення|розчин, розведення| стандарт, робочий | Вода,
Стандарт концентрація 4 2 ; ; розчин, мкл (мкг/мл) мкл мкл мкл
Стандарт! |-01 .-ЮюЮИ/Ю/Ю00/7Ї771717171717171717111111111001111771111110011717171су1 во
Стандарт2 |-02 2 (ЇЇ 7777777077777770/717717р7р1рср200111117|17111111001117171с1 700
Стандарт3 |-05 Ж | 50 | | 7100 850
Стандарт4 |-1 | 7 --/р/1лОб ЇЇ 77777771 17111111001117171с1 во
Стандарт5 |-2 2 | (2007. Ю.ЮЙБМь.Е 77777777 | 71007771 700
І(Стандартб |-5 | (0500 | -:(кРЙЙЮЙЮКЮКЮЇЇ1Ї07..ДИи1007171сСсту1г 00
Коо)
Таблиця 2
Вплив додавання кисню на ферментативний гідроліз лігноцелюлозного сировинного матеріалу.
Потік свіжого |Кількість кисню (що вводиться зі Глюконова кислота (у г/кг Підвищення повітря (у свіжим повітрям, у ммоль/кг | глюкану в лігноцелюлозному |Іпродукції глюкози мл/кг/год.) глюкану/година)" матеріалі) (в Фо 011111110111111111171Ї1111111111112861 111 - 2617 1777711111111110727777111Ї711117171717111382 |7111134 0 7796 | Юра Ї771717171717171711889... | 5 х Кисень - 24,5 л/моль за 25 "С, а вміст глюкану становить 72 г/кг гідролізату
Таблиця З
Вплив глюконової кислоти на ферментативний гідроліз. кислота (у г/л) лігноцелюлозному матеріалі) (в 90 нини нини шини ниж и нини ши ши
ОО 061111Г111111111111112671111111111111111|11111179

Claims (20)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Спосіб одержання цукрового продукту з лігноцелюлозного матеріалу, що включає наступні етапи: (а) попередню обробку лігпоцелюлозного матеріалу тепловою, механічною і/або хімічною модифікацією, або будь-якою комбінацією таких способів; і (с) ферментативний гідроліз, підданий попередній обробці лігноцелюлозного матеріалу із застосуванням ферментної композиції, що включає щонайменше дві целюлази; де ферментна композиція щонайменше містить літичну полісахаридну монооксигеназу, і де кількість утвореної глюконової кислоти наприкінці ферментативного гідролізу шляхом окиснення лігноцелюлозного матеріалу, що містить целюлозу й/або целолігосахариди, підтримують від З до 10 г/кг глюкану, присутнього в лігноцелюлозному матеріалі шляхом додавання необхідної кількості кисню після попередньої обробки й до й/або під час ферментативного гідролізу лігноцелюлозного матеріалу.
2. Спосіб за п. 1, що включає промивання, підданого попередній обробці лігноцелюлозного матеріалу.
3. Спосіб за п. 1 або 2, що включає виділення глюкозовмісної композиції.
4. Спосіб за будь-яким з пп. 1-3, що включає ферментацію гідролізованого лігноцелюлозного матеріалу до одержання продукту ферментації.
5. Спосіб за п. 4, що включає видалення продукту ферментації.
6. Спосіб за п. 4 або 5, де ферментацію проводять за допомогою мікроорганізму, здатного до ферментації щонайменше одного С5 цукру.
7. Спосіб за п. 6, де мікроорганізм належить до виду Засспаготусез сегемівзіає, у якому виконані генетичні модифікації.
8. Спосіб за будь-яким із пп. 1-7, де під час етапу (с) ферментативного гідролізу кисень додають у лігноцелюлозний матеріал. Ко)
9. Спосіб за будь-яким із пп. 1-8, де кисень додають у формі бульбашок.
10. Спосіб за будь-яким із пп. 1-9, де реактор для ферментативного гідролізу має об'єм 1 м3 або більше.
11. Спосіб за п. 10, де реактор для ферментативного гідролізу має об'єм, щонайменше 50 м3.
12. Спосіб за будь-яким із пп. 1-11, де час ферментативного гідролізу становить від 5 до 150 годин.
13. Спосіб за будь-яким із пп. 1-12, де використовувана ферментативна композиція зберігає активність протягом 30 годин або більше.
14. Спосіб за будь-яким із пп. 1-13, де гідроліз проводять за температури 45 "С або більше.
15. Спосіб за будь-яким із пп. 1-14, де ферментна композиція отримана із грибка або ферментна композиція містить грибковий фермент.
16. Спосіб за будь-яким із пп. 1-15, де вміст сухої речовини на етапі гідролізу становить 10 мас. о або більше.
17. Спосіб за п. 16, де вміст сухої речовини на етапі гідролізу становить 14-33 мас. 95.
18. Спосіб за будь-яким з пп. 1-17, де ферментативний гідроліз відбувається в реакторі для періодичного, періодичного з підживленням і/або безперервного культивування.
19. Спосіб за будь-яким із пп. 1-18, де ферментна композиція знаходиться у формі цільного ферментаційного бульйону грибка.
20. Спосіб за будь-яким із пп. 1-19, де кисень уводять у вигляді кисневмісного газу, такого як повітря.
UAA201612108A 2014-04-30 2015-04-29 Спосіб ферментативного гідролізу лігноцелюлозного матеріалу й ферментації цукрів UA121113C2 (uk)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14166545 2014-04-30
EP14166539 2014-04-30
EP14166538 2014-04-30
EP14167284 2014-05-07
EP14167483 2014-05-08
PCT/EP2015/059316 WO2015165951A1 (en) 2014-04-30 2015-04-29 Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA121113C2 true UA121113C2 (uk) 2020-04-10

Family

ID=53008520

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201612108A UA121113C2 (uk) 2014-04-30 2015-04-29 Спосіб ферментативного гідролізу лігноцелюлозного матеріалу й ферментації цукрів

Country Status (21)

Country Link
US (7) US10337040B2 (uk)
EP (2) EP3137619B1 (uk)
JP (2) JP2017514460A (uk)
KR (4) KR20160147941A (uk)
CN (3) CN106460020B (uk)
AU (2) AU2015254648B2 (uk)
BR (2) BR112016024939B1 (uk)
CA (2) CA2944955C (uk)
DK (1) DK3137619T3 (uk)
EA (3) EA035176B1 (uk)
ES (1) ES2972390T3 (uk)
FI (1) FI3137619T3 (uk)
HR (1) HRP20240318T1 (uk)
LT (1) LT3137619T (uk)
MX (2) MX2016013940A (uk)
MY (2) MY181537A (uk)
PL (1) PL3137619T3 (uk)
RS (1) RS65254B1 (uk)
SI (1) SI3137619T1 (uk)
UA (1) UA121113C2 (uk)
WO (4) WO2015165951A1 (uk)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112831534A (zh) 2012-11-09 2021-05-25 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法
EP2917354B1 (en) 2012-11-09 2020-01-15 DSM IP Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material using gh61, oxygen addition, and high dry matter content
MX2016001315A (es) 2013-07-29 2016-04-07 Danisco Us Inc Variantes de enzimas.
EP3137619B1 (en) * 2014-04-30 2023-12-27 Versalis S.p.A. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
US10435718B2 (en) * 2014-10-21 2019-10-08 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
EP3234168A1 (en) 2014-12-19 2017-10-25 DSM IP Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
CN106834386B (zh) * 2015-12-04 2021-03-02 中国科学院大连化学物理研究所 一种几丁二糖的生产方法
WO2017201233A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Poet Research, Inc. Methods of removing one or more compounds from a lignocellulosic hydrolysate via gas stripping, and related systems
US20190218583A1 (en) 2016-09-13 2019-07-18 Institut National De La Recherche Agronomique (Inra) Polysaccharide-oxidizing composition and uses thereof
TWI631215B (zh) * 2017-04-25 2018-08-01 財團法人食品工業發展研究所 果寡糖組成物及其製備方法
WO2019072732A1 (en) * 2017-10-09 2019-04-18 Dsm Ip Assets B.V. PROCESS FOR ENZYMATIC HYDROLYSIS OF LIGNOCELLULOSIC MATERIAL AND FERMENTATION OF SUGARS
WO2019086370A1 (en) * 2017-10-30 2019-05-09 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
CN111278986A (zh) * 2017-10-30 2020-06-12 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法
CA3078833A1 (en) 2017-11-09 2019-05-16 Iogen Corporation Low temperature pretreatment with sulfur dioxide
CA3078822A1 (en) 2017-11-09 2019-05-16 Iogen Corporation Low temperature sulfur dioxide pretreatment
US11371012B2 (en) 2017-11-16 2022-06-28 Poet Research, Inc. Methods for propagating microorganisms for fermentation and related methods and systems
EP3710603A4 (en) 2017-12-11 2021-10-06 University Of Louisville Research Foundation, Inc. PROCESS FOR THE ISOLATION AND RECOVERY OF C5 SUGARS
WO2019145693A1 (en) 2018-01-23 2019-08-01 The University Of York Inhibitory agent
CN108341715A (zh) * 2018-03-28 2018-07-31 安徽帝元生物科技有限公司 组合物及其制备方法和应用
WO2019191828A1 (en) 2018-04-06 2019-10-10 Iogen Corporation Pretreatment with lignosulfonic acid
CN112204151B (zh) * 2018-05-30 2024-06-11 维尔萨利斯股份公司 从碳水化合物材料产生糖的方法
US20210207321A1 (en) * 2018-05-31 2021-07-08 Novozymes A/S Method for treating dissolving pulp
WO2020058249A1 (en) * 2018-09-18 2020-03-26 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars
WO2020058253A1 (en) * 2018-09-18 2020-03-26 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars
CN109371077A (zh) * 2018-11-22 2019-02-22 浙江华康药业股份有限公司 一种利用生物质制备生物糖浆的方法
BR112023014100A2 (pt) * 2021-04-08 2023-10-17 Versalis Spa Processo para a preparação de um produto de açúcar e um produto de fermentação
CN113801900A (zh) * 2021-09-27 2021-12-17 中国科学院过程工程研究所 一种利用林木制备丙酮酸的方法及其应用
CN115960276B (zh) * 2023-03-10 2023-06-06 中国农业科学院农产品加工研究所 一种新型果胶寡糖及其制备方法和应用

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3105581C2 (de) 1981-02-16 1985-05-15 Otto Dr. 2300 Kiel Moebus Verfahren zur Fermentation von Kohlenhydraten unter Erzeugung von Äthanol und Biomasse
KR930701654A (ko) 1991-04-18 1993-06-12 리차드 지. 바커 고 경점도 산소 탈리그닌화를 제공하기 위해 펄프에 알칼리를 첨가하는 방법
FR2694768B1 (fr) 1992-07-30 1994-12-23 Pasteur Institut Séquences d'oligonucléotides pour la détection spécifique de mollicutes par amplication de gènes conservés.
CN1190373C (zh) 2000-02-17 2005-02-23 里索国家实验室 处理木质纤维素材料的方法
KR100643817B1 (ko) 2000-06-26 2006-11-10 유니버시티 오브 플로리다 리서치 파운데이션, 아이엔씨. 당화와 발효의 동시 수행을 위한 방법 및 조성물
US7034062B2 (en) 2001-05-25 2006-04-25 BP Exploration Operatiing Company Limited Fischer-tropsch process
US8580541B2 (en) 2003-03-19 2013-11-12 The Trustees Of Dartmouth College Lignin blockers and uses thereof
WO2005100582A2 (en) 2004-03-25 2005-10-27 Novozymes Inc. Methods for degrading or converting plant cell wall polysaccharides
ATE440032T1 (de) 2004-04-30 2009-09-15 Bosch Gmbh Robert Verfahren zur herstellung von schlauchbeuteln
EP1828373B1 (en) 2004-11-29 2011-08-17 Inbicon A/S Enzymatic hydrolysis of biomasses having a high dry matter (dm) content
CN101321857A (zh) 2005-09-30 2008-12-10 诺维信股份有限公司 用于增强纤维素材料降解或转化的方法
IES20060090A2 (en) 2006-02-10 2007-06-13 Nat Univ Ireland Talaromyces emersonii enzyme systems
US8968515B2 (en) * 2006-05-01 2015-03-03 Board Of Trustees Of Michigan State University Methods for pretreating biomass
WO2008008793A2 (en) 2006-07-10 2008-01-17 Dyadic International Inc. Methods and compositions for degradation of lignocellulosic material
CN101809150B (zh) 2007-05-31 2013-09-04 诺维信股份有限公司 提高多肽的纤维素分解增强活性的方法
EP2162545A4 (en) 2007-06-27 2012-05-16 Novozymes As PROCESS FOR PRODUCING FERMENTATION PRODUCTS
US8980599B2 (en) 2007-08-02 2015-03-17 Iogen Energy Corporation Method for the production of alcohol from a pretreated lignocellulosic feedstock
EP2207887A4 (en) 2007-10-09 2014-01-22 Sunopta Bioprocess Inc TWO-STAGE ENZYMATIC HYDROLYSIS PROCESS FOR THE TREATMENT OF LIGNOCELLULOSE MATERIALS
RU2010116358A (ru) 2007-10-10 2011-12-10 Маскома Канада Инк.,Са (Ca) Ферментативная обработка в вакууме лигноцеллюлозных материалов
CA2703715C (en) 2007-10-25 2016-08-23 Landmark Structures I, Lp System and method for anaerobic digestion of biomasses
KR20100105849A (ko) 2007-12-19 2010-09-30 노보자임스 에이/에스 셀룰로오스 가수분해 향상 활성을 가지는 폴리펩티드 및 그것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드
US20110201084A1 (en) 2008-07-25 2011-08-18 The Regents Of The University Of California Enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass through enhanced removal of oligomers
US10557153B2 (en) 2008-08-11 2020-02-11 Dsm Ip Assets B.V. Degradation of lignocellulosic material
CN102325889A (zh) 2008-12-19 2012-01-18 诺维信股份有限公司 增加纤维素材料水解的方法
DK2435561T3 (en) 2009-05-29 2018-11-05 Novozymes Inc PROCEDURES FOR IMPROVING THE DEGRADATION OR CONVERSION OF CELLULOSE SUBSTANCES
BR112012000078A2 (pt) * 2009-07-03 2017-03-01 Dsm Ip Assets Bv cepas de talaromyces e composições de enzima.
ES2823455T3 (es) * 2009-10-08 2021-05-07 Dsm Ip Assets Bv Proceso para la preparación de un producto de fermentación de material que contiene lignocelulosa
CN102191299A (zh) 2010-03-10 2011-09-21 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 多步酶解提高木质纤维素糖化得率的方法
US9758802B2 (en) * 2010-08-06 2017-09-12 Novozymes A/S Methods of degrading or hydrolyzing a polysaccharide
EP2635689B1 (en) 2010-11-02 2015-04-15 Novozymes, Inc. Methods of pretreating cellulosic material with a gh61 polypeptide
EP2689011B1 (en) 2011-03-25 2017-10-25 Novozymes A/S Method for degrading or converting cellulosic material
WO2012149275A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 Danisco Us Inc. Use of cellulase and glucoamylase to improve ethanol yields from fermentation
DK2748317T3 (en) 2011-08-22 2017-07-17 Codexis Inc GH61 glycoside hydrolase protein variants and cofactors that enhance GH61 activity
WO2014072392A1 (en) 2012-11-09 2014-05-15 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
CN112831534A (zh) 2012-11-09 2021-05-25 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法
EP2917354B1 (en) 2012-11-09 2020-01-15 DSM IP Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material using gh61, oxygen addition, and high dry matter content
US10407704B2 (en) 2013-02-21 2019-09-10 Novozymes A/S Methods of saccharifying and fermenting a cellulosic material
US10087475B2 (en) 2014-04-03 2018-10-02 Dsm Ip Assets B.V. Process and apparatus for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
EP3137619B1 (en) * 2014-04-30 2023-12-27 Versalis S.p.A. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
EP3234168A1 (en) 2014-12-19 2017-10-25 DSM IP Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars

Also Published As

Publication number Publication date
US11773420B2 (en) 2023-10-03
CA2944955C (en) 2021-11-02
AU2015254648B2 (en) 2018-11-08
US20190062794A1 (en) 2019-02-28
LT3137619T (lt) 2024-02-26
EA201891512A1 (ru) 2019-02-28
US20210180098A1 (en) 2021-06-17
CN112553266B (zh) 2024-05-17
HRP20240318T1 (hr) 2024-05-24
PL3137619T3 (pl) 2024-04-22
US11512334B2 (en) 2022-11-29
US10144939B2 (en) 2018-12-04
WO2015165953A1 (en) 2015-11-05
CN106255760A (zh) 2016-12-21
MX2016013939A (es) 2017-01-09
MY181516A (en) 2020-12-24
BR112016024938A2 (pt) 2018-06-19
RS65254B1 (sr) 2024-03-29
EP3137619B1 (en) 2023-12-27
DK3137619T3 (da) 2024-02-12
WO2015165951A1 (en) 2015-11-05
MY181537A (en) 2020-12-26
AU2015254649A1 (en) 2016-10-06
BR112016024939B1 (pt) 2022-03-29
EA031037B1 (ru) 2018-11-30
AU2015254648A1 (en) 2016-10-06
WO2015165952A1 (en) 2015-11-05
BR112016024939A2 (pt) 2017-10-24
EP3137619A1 (en) 2017-03-08
SI3137619T1 (sl) 2024-05-31
CN106460020A (zh) 2017-02-22
US10597689B2 (en) 2020-03-24
AU2015254649B2 (en) 2018-11-01
US20210115482A1 (en) 2021-04-22
US20170145455A1 (en) 2017-05-25
JP2017514460A (ja) 2017-06-08
CN106255760B (zh) 2020-09-29
KR20160147941A (ko) 2016-12-23
EA201692187A1 (ru) 2017-02-28
US10907183B2 (en) 2021-02-02
US20200048669A1 (en) 2020-02-13
KR20230155592A (ko) 2023-11-10
US20200270659A1 (en) 2020-08-27
EA035176B1 (ru) 2020-05-12
KR20230155591A (ko) 2023-11-10
FI3137619T3 (fi) 2024-02-01
EP3137620A1 (en) 2017-03-08
BR112016024938B1 (pt) 2022-04-12
CA2944957A1 (en) 2015-11-05
CN106460020B (zh) 2020-12-29
JP2017516460A (ja) 2017-06-22
CN112553266A (zh) 2021-03-26
KR20160145817A (ko) 2016-12-20
CA2944957C (en) 2022-03-29
EA035212B1 (ru) 2020-05-18
MX2016013940A (es) 2017-02-23
US10337040B2 (en) 2019-07-02
US20170044584A1 (en) 2017-02-16
WO2015165954A1 (en) 2015-11-05
CA2944955A1 (en) 2015-11-05
EA201692197A1 (ru) 2017-02-28
US10947573B2 (en) 2021-03-16
ES2972390T3 (es) 2024-06-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11773420B2 (en) Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
ES2761448T3 (es) Procedimiento para hidrólisis enzimática de material lignocelulósico con adición de oxígeno
AU2015202952B2 (en) Process and apparatus for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
MX2015005630A (es) Proceso para hidrolisis enzimatica de material lignocelulosico y fermentacion de azucares.
EA041359B1 (ru) Способ ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного материала и ферментации сахаров