CN106381293B - 一种多糖-聚氨酯共固定化生物吸附剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多糖‑聚氨酯共固定化生物吸附剂及其制备方法，该吸附剂是利用多糖将微生物包埋固定于聚氨酯上，其制备方法包括首先将微生物扩大培养并制备多糖溶液，再将培养液与多糖溶液的充分混匀成微生物混合液，然后浸入聚氨酯并使其与混合液充分接触吸收，最后再将聚氨酯浸入固定液中凝胶固定，既得。本发明利用微生物结合固定化技术制备的固定化生物吸附剂，在更好发挥微生物的重金属吸附性能的同时，可有效避免单独利用微生物进行脱除时存在的难于与脱除对象分离的缺陷，同时可提高微生物的稳定性、机械强度；即制得的重金属生物吸附剂具有较好的重金属脱除效果，可用于液态食品物料中重金属的脱除。
Description
技术领域
本发明涉及一种多糖-聚氨酯共固定化生物吸附剂及其制备方法，属于食品生物技术领域。
背景技术
重金属污染是当今社会普遍关注的问题。由于重金属污染物不可降解、生物富集的特性，使其成为对人类及其他生物的生存健康危害最大的污染物之一。尤其是贝类、藻类等水产品，由于其对重金属的富集能力较强，易于导致水产品重金属超标；此外，也常见从粮食、蔬菜、水果、牲畜肉中检出重金属的报道，甚至个别样品超标现象严重。重金属对人体有毒害作用，例如重金属镉，其毒性强，在人体内的半衰期10到35年，对人的危害是蓄积性的，长期暴露会造成免疫***缺陷，并对肾、肝、肺、胰脏、睾丸、胎盘以及骨骼均会产生严重毒害。镉不可降解，污染的水、土壤和空气经食物链进入生物体，成为食品安全的一大隐患。
目前重金属吸附研究所用的材料多样化，其中微生物和小型藻类不容小觑。多种微生物和藻类，例如细菌、霉菌、酵母菌、微藻等对重金属都有较好的吸附性能。利用微生物对于金属离子的吸附性能进行重金属的脱除，被称为生物吸附法。生物吸附法作为一种新兴的重金属处理技术，在处理食品物料时，相对于传统的物理化学方法，具有来源丰富、成本低；安全无毒，适应复杂有机环境；低浓度条件下，处理效率高；选择性好、可再生等优点。
但是单独利用微生物进行重金属的吸附、脱除，在食品原料的实际应用中存在着微生物难以与脱除料液进行有效分离的问题，限制其工业化应用。通过结合固定化技术，可一定程度上对现存的问题加以改善。多糖具有良好的凝胶性能及生物相容性，使其成为理想的微生物固定化包埋剂。常规的海藻酸钠包埋法，是通过将海藻酸钠液滴滴入到还有Ca2 +、Mg2+等阳离子溶液中，形成海藻酸钙凝胶小球来实现微生物的固定化。然而此方法所得到的凝胶小球，仍存在着不稳定、易破碎和溶解，尺寸较小难于分离，不利于回收利用等缺陷，限制其工业化应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种多糖-聚氨酯共固定化重金属生物吸附剂及其制备方法，以弥补现有技术的不足。
为达到上述目的，本发明的具体技术方案是：
一种多糖-聚氨酯共固定化重金属生物吸附剂是利用多糖将微生物包埋固定于聚氨酯上。
进一步的，所述的微生物为细菌,以及真菌中的酵母菌和霉菌。
进一步的，所述细菌包括乳酸菌、枯草芽孢杆菌；所述的酵母菌包括库德毕赤酵母、鲁氏酵母、酿酒酵母；所述霉菌包括曲霉、根霉。
进一步，所述的酵母菌优选为库德毕赤酵母。
进一步，所述的多糖优选海藻酸钠、壳聚糖、果胶中一种或两种混合。
进一步的，所述的多糖优选为海藻酸钠。
上述的多糖-聚氨酯共固定化生物吸附剂的制备方法，包括以下步骤：首先将微生物扩大培养获得足量的微生物细胞并制备多糖溶液，再将培养液与多糖溶液进行充分混匀获得微生物混合液，然后浸入聚氨酯并使其与混合液充分接触吸收，最后再将聚氨酯浸入固定液中凝胶固定，过滤除去多余液体既得。
进一步的，上述制备方法的具体步骤包括：
1）微生物的扩大培养与培养液浓缩
斜面活化：将低温保藏的菌株接种到固体斜面培养基，恒温培养箱中培养6~48 h；
液体培养基活化：接种环刮取斜面活化后的菌体少量接种到液体培养基中，恒温振荡培养箱中培养6~48 h，为种子液；
液体扩大培养：取活化后的种子液，接种到液体培养基中，震荡培养6~48 h；
菌泥浓缩：首先对微生物扩大培养液进行定量分析，按计数结果，取一定体积的微生物培养液，离心用超纯水冲洗，反复两次后，离心取沉淀加无菌超纯水复悬，即得浓缩菌泥；
2）制备多糖溶液
量取多糖溶解于水配制成浓度为1%~4%的多糖溶液；
3）聚氨酯泡沫的准备
取聚氨酯泡沫，在超纯水中反复挤压冲洗后，浸没于超纯水中超声处理10~20min，再用超纯水挤压冲洗，排出多余水分，干燥备用；
4）多糖-聚氨酯微生物固定化
将浓度为1%~4%的多糖溶液与菌泥浓缩液以体积比1：1混合，震荡混匀；
将干燥好的聚氨酯泡沫浸入到混合液中，充分挤压聚氨酯泡沫，使其完全浸入溶液中，使吸附混合液与聚氨酯泡沫充分接触；将吸附有混合液的聚氨酯泡沫取出，充分挤压，排出内部多余混合液，只留下表面附着的部分；再将其投入到1%~6%的氯化钙溶液中，震荡后静置，使其充分固定化；将固定化好的吸附剂取出，用超纯水冲洗，晾干表面多余水分，即得多糖-聚氨酯共固定化生物吸附剂。
上述多糖-聚氨酯共固定化重金属生物吸附剂在食品料液、中药提取液及其相关领域的应用。
本发明的有益效果：本发明利用具有吸附重金属能力的微生物结合固定化技术制备的固定化微生物吸附剂，在液态物料中呈悬浮状态，在更好发挥微生物的重金属吸附性能的同时，可有效避免单独利用微生物进行脱除时存在的难于与脱除对象分离的缺陷，同时可提高微生物的稳定性、机械强度；本发明制得的重金属生物吸附剂具有较好的重金属脱除效果，可用于液态食品物料、中草药提取液中重金属的脱除。
本发明利用固定化方法有助于更好地发挥微生物的脱除效果，又对常规包埋固定化方法加以改进，引入聚氨酯材料，所制得的固定化吸附剂，在保证对重金属高脱除率的同时，提高了机械强度、增大了表面积与体积并且易于分离，便于产业化应用，脱除效果可达54.35%，比一般脱除效果提升10%~20%。
本发明具有操作简单、成本低、安全性好并且有利于工业化应用的优良特性。
附图说明
图1为本发明对比例2海藻酸钠-聚氨酯空白吸附剂的扫描电镜图；
图2为本发明实施例1海藻酸钠-聚氨酯共固定化库德毕赤酵母吸附剂的扫描电镜图；
图3为CaCl2浓度对实施例1吸附剂在10ppm Cd2+溶液的脱除率及酵母菌蛋白质核酸流失的影响结果图；
图4为海藻酸钠浓度对实施例1吸附剂在固定化后10ppm Cd2+溶液的脱除率及酵母菌蛋白质核酸流失的影响结果图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步详细描述。
实施例1
一种多糖-聚氨酯共固定化重金属生物吸附剂的制备方法，具体步骤如下：
1）库德毕赤酵母的培养
斜面活化：将4℃保藏的菌株接种到YPD 斜面培养基，28 ℃恒温培养箱中培养24h；
液体培养基活化：接种环刮取斜面活化后的菌体少量接种到YPD 液体培养基中，恒温振荡培养箱中28 ℃、180 r/min 培养24 h，为种子液；
液体扩大培养：取活化好的酵母菌种子液1ml，接种到YPD液体培养基中28℃、180r/min 培养24 h；
菌泥浓缩：对扩大培养好的酵母，进行血球计数法定量，按计数结果，取一定体积的酵母培养液，离心，使得到的酵母菌定量到5×109个，离心弃去培养基。加无菌超纯水，冲洗一遍，离心取沉淀加5ml无菌超纯水复悬。
2）多糖溶液制备：配置2%的海藻酸钠溶液；
3）聚氨酯泡沫的准备
取聚氨酯泡沫，在超纯水中反复挤压冲洗后，浸没于超纯水中超声处理20min，再用超纯水挤压冲洗3次，排出多余水分，于烘箱中烘干备用。
4）海藻酸钠-聚氨酯微生物共固定化
将海藻酸钠溶液与浓缩菌液1:1混合，震荡均匀；
将干燥好的聚氨酯泡沫加入到混合液中，充分挤压聚氨酯泡沫，使其完全浸入溶液中，使吸附混合液与聚氨酯泡沫充分接触；
将吸附有混合液的聚氨酯泡沫取出，充分挤压，排出内部多余混合液，只留下表面附着的部分，将处理好的聚氨酯泡沫，浸入到2%的氯化钙溶液中，震荡30min后于4℃静置4h，充分固定化，即得多糖-聚氨酯共固定化重金属生物吸附剂；
利用上述制得的多糖-聚氨酯共固定化重金属生物吸附剂对牡蛎匀浆液中重金属镉进行脱除实验：
牡蛎酶解液加入多糖-聚氨酯共固定化重金属生物吸附剂进行脱除，震荡脱除2h。每处理30ml牡蛎酶解液，加入固定化吸附剂的量为10个，其中海藻酸钠及微生物干重为0.064±0.015g。
取脱除前后的牡蛎匀浆液湿法消化后，利用原子吸收测定镉的含量，从而计算脱除率。
结果如下表1所示：
表1 牡蛎酶解液加入固定化微生物吸附剂脱除镉前后对比
| 项目 | 脱除前（mg/kg） | 脱除后（mg/kg） | 脱除率 |
| 镉 | 2.695±0.187 | 1.230±0.001 | 54.35% |
对比例1：
聚氨酯泡沫固定化库德毕赤酵母脱除牡蛎中重金属的实验，具体步骤如下：
1）库德毕赤酵母的培养
斜面活化：将4℃保藏的菌株接种到YPD 斜面培养基，28 ℃恒温培养箱中培养24h；
液体培养基活化：接种环刮取斜面活化后的菌体少量接种到YPD 液体培养基中，恒温振荡培养箱中28 ℃、180 r/min 培养24 h，为种子液；
2）聚氨酯泡沫的准备
取聚氨酯泡沫，在超纯水中反复挤压冲洗后，浸没于超纯水中超声处理20min，再用超纯水挤压冲洗3次，排出多余水分，干燥备用。
配制50ml的YPD培养基，加入10个聚氨酯泡沫，121℃灭菌15min，备用。
3）聚氨酯微生物固定化
取活化好的酵母菌种子液1ml，接种到含有聚氨酯泡沫的YPD液体培养基中于28℃、180 r/min 培养24 h。取出固定化好的聚氨酯泡沫，于无菌水中冲洗3次，挤出多余水分，既得-聚氨酯微生物固定化吸附剂。
利用上述制得的吸附剂对牡蛎匀浆液中重金属镉进行脱除实验：
牡蛎酶解液中加入固定化吸附剂进行脱除，震荡脱除2h。每处理30ml牡蛎酶解液，加入固定化吸附剂的量为10个，其中固定化微生物干重为0.013±0.009g。
取脱除前后的牡蛎匀浆液湿法消化后，利用原子吸收法测定镉的含量，从而计算脱除率。
结果如下表2所示：
表2 牡蛎酶解液加入固定化微生物吸附剂脱除镉前后对比
| 项目 | 脱除前（mg/kg） | 脱除后（mg/kg） | 脱除率 |
| 镉 | 2.024±0.047 | 1.698±0.026 | 16.11% |
对比例2：
海藻酸钠-聚氨酯重金属吸附剂脱除牡蛎中重金属的实验，具体步骤如下：
1）聚氨酯泡沫的准备
取聚氨酯泡沫，在超纯水中反复挤压冲洗后，浸没于超纯水中超声处理20min，再用超纯水挤压冲洗3次，排出多余水分，于烘箱中烘干备用。
2）海藻酸钠-聚氨酯固定化
配制浓度为2%海藻酸钠，将烘干好的聚氨酯泡沫加入到海藻酸钠液中，充分挤压聚氨酯泡沫，使其完全浸入溶液中，置于超声清洗机中超声处理10min，4℃静置0.5h，排出气泡，使海藻酸钠溶液与聚氨酯泡沫充分接触吸收；
将吸附有混合液的聚氨酯泡沫取出，充分挤压，排出内部多余混合液，只留下表面附着的部分。将处理好的聚氨酯泡沫，投入到2%的氯化钙溶液中，震荡30min后于4℃静置4h，充分固定化；
将固定化好的吸附剂取出，用超纯水冲洗三遍，晾干表面多余水分，即得。
利用上述制得的吸附剂对牡蛎匀浆液中重金属镉进行脱除实验：
牡蛎酶解液中加入固定化吸附剂进行脱除，震荡脱除2h。每处理30ml牡蛎酶解液，加入固定化吸附剂的量为10个，其中海藻酸钠干重为0.042±0.019g。
取脱除前后的牡蛎匀浆液湿法消化后，利用原子吸收法测定镉的含量，从而计算脱除率。
结果如下表3所示：
表3 牡蛎酶解液加入固定化吸附剂脱除镉前后对比
| 项目 | 脱除前（mg/kg） | 脱除后（mg/kg） | 脱除率 |
| 镉 | 2.024±0.047 | 1.594±0.028 | 21.23% |
由实施例1和对比例1-2的脱除结果可以看出，本发明利用多糖将微生物固定于聚氨酯上的金属脱除效果要显著优于多糖-聚氨酯、微生物-聚氨酯分别固定得到的重金属吸附剂。说明了本发明对于重金属良好的脱除效果。
由图1可以看出，聚氨酯泡沫内部呈现多孔网状结构，多糖凝胶可在聚氨酯泡沫的网状结构表面形成一层薄膜，说明多糖凝胶可以在聚氨酯泡沫的网状结构形成均匀膜，增大了反应面积。
由图2可以看出，通过多糖的固定化，能够将库德毕赤酵母均匀的固定于聚氨酯泡沫的表面，并能较好的维持库德毕赤酵母的形态，最大程度的保证了微生物的活化数并显著提高了反应面积及效率。
蛋白质、核酸流失表征的是固定化的效果，流失越少表明固定化的效果越好，即通过固定化可将微生物较好的保护防止微生物的流失、破碎以及内部物质的流失。由图3可以看出，Ca2+的浓度的增加，脱除率的变化不大，但蛋白质、核酸流失增加，可能的原因是，由于Ca2+浓度的增加，导致渗透压增加，引起细胞脱水，不利于微生物保持形态。所以，氯化钙浓度选择对于本发明的脱除效果有重要影响，本发明优选的氯化钙浓度能显著提高微生物活性，提高脱除重金属效率。
由图4可以看出，海藻酸钠的浓度，对脱除率和蛋白质、核酸流失均有显著影响。由于海藻酸钠本身具有重金属的吸附性能，随着海藻酸钠浓度的增加，脱除率也随之增加，与此同时，蛋白质、核酸的流失也随之增加，可能的原因是，随着海藻酸钠浓度的增加，其与Ca2+形成的凝胶网络结构更为致密，使得酵母细胞的生长受限，因而蛋白质、核酸流失增加。考虑到，随着海藻酸钠浓度的增加，粘度增加，溶解难度随之增加，本发明优选的海藻酸钠浓度能较好的保持脱除率和细胞活性，并且不会增加操作难度。
Claims (3)
1.一种多糖-聚氨酯共固定化重金属生物吸附剂，其特征在于，该吸附剂是利用多糖将微生物包埋固定于聚氨酯上：首先将微生物扩大培养并制备多糖溶液，再将培养液与多糖溶液的充分混匀成微生物混合液，然后浸入聚氨酯并使其与混合液充分接触吸收，最后再将聚氨酯浸入固定液中凝胶固定，即得；所述的微生物为库德毕赤酵母；所述的多糖为海藻酸钠；所述吸附剂的具体制备方法包括：
1）微生物的扩大培养与培养液浓缩
斜面活化：将低温保藏的菌株接种到固体斜面培养基，恒温培养箱中培养；
液体培养基活化：接种环刮取斜面活化后的菌体少量接种到液体培养基中，恒温振荡培养箱中培养，为种子液；
液体扩大培养：取活化好的种子液，接种到液体培养基中，震荡培养；
菌泥浓缩：首先对微生物扩大培养液进行定量分析，按计数结果，取一定体积的微生物培养液，离心用超纯水冲洗，离心取沉淀加无菌超纯水复悬，即得浓缩菌泥；
2）制备浓度为1%~4%多糖溶液；
3）聚氨酯泡沫的准备
取聚氨酯泡沫，在超纯水中反复挤压冲洗后，浸没于超纯水中超声处理，再用超纯水挤压冲洗，排出多余水分，干燥备用；
4）多糖-聚氨酯微生物固定化
将多糖溶液与菌泥浓缩液混合，震荡混匀；将烘干后的聚氨酯泡沫浸入到混合液中，充分挤压聚氨酯泡沫，使其完全浸入溶液中，使吸附混合液与聚氨酯泡沫充分接触；将吸附有混合液的聚氨酯泡沫取出，充分挤压，排出内部多余混合液；再将其投入到1%~6%的氯化钙溶液中，震荡后静置，充分固定化；将固定化好的吸附剂取出，超纯水冲洗，晾干表面多余水分，即得多糖-聚氨酯共固定化生物吸附剂。
2.如权利要求1所述的多糖-聚氨酯共固定化生物吸附剂，其特征在于，所述氯化钙的浓度为2%。
3.如权利要求1所述的多糖-聚氨酯共固定化生物吸附剂，其特征在于，所述海藻酸钠的溶液浓度为2%。
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| 壳聚糖改性聚氨酯载体处理高氨氮废水的研究;耿 佳等;《材料导报B：研究篇》;20130131;第27卷(第1期);摘要部分，第118页右栏第二段，第1.2节第2段 * |
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