CN112875872B - 一种贝莱斯芽孢杆菌在改善水体磷污染中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种贝莱斯芽孢杆菌在改善水体磷污染中的应用，所述贝莱斯芽孢杆菌为Bacillus velezensis H18，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2020557。经过聚磷活性的鉴定和聚磷能力的检测，本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌在改善水体磷污染中的应用，水体样品的磷去除率高达92.6％，去除磷速度快，除磷维持时间久。

Description

一种贝莱斯芽孢杆菌在改善水体磷污染中的应用
技术领域
本发明涉及污水处理技术领域，尤其是涉及一种贝莱斯芽孢杆菌在改善水体中磷污染的应用。
背景技术
当前水产养殖尤其是高密度集约化的淡水养殖中，面临着水体富营养化问题的困扰，水体富营养化(Eutrophication)影响着所有的水生生态***，是近几十年来最普遍发生的全球性问题。水体富营养化指水体中N、P等营养盐含量过多而引起的水质污染现象。其实质上是由于营养盐的过量输入导致单一物种疯长，造成水生生态***物种分布失衡，破坏了***的物质与能量的流动，使整个水生态***逐渐走向死亡。
目前，物理化学方法是减轻水体生态环境污染的主要途径。在水体除磷方面，传统的除磷方式包括物理吸附法、化学沉淀法、电解质法、电渗析法和人工湿地法等，这些方法成本高，同时含有多种有害作用，不能达到治本的目的，同时也易引起对水体的二次污染。
生物除磷主要包括藻类除磷、微生物除磷和水生植物除磷。与传统除磷方法相比，生物除磷法利用生物在生长代谢过程中对磷的吸收、吸附作用达到除磷目的，其费用低，自动化水平高，效果突出，已成为研究的热点。基于微生物多样性的微生物除磷技术是水体恢复的重要新兴技术之一。聚磷菌是一类能过量吸磷并储存磷的微生物，包括不动杆菌属、气单孢菌属、棒杆菌属、微丝菌等，常被用于生物除磷。
红树林是一个尚未完全开发的生态***，其中蕴含着种类繁多的微生物并具有多种功能，是发现和挖掘工业、农业、药用等功能微生物的宝库。
发明内容
基于此，本发明的目的在于，提供一种贝莱斯芽孢杆菌在改善水体磷污染中的应用，该菌株能够在好氧情况下吸收水体中的铜聚集到自身机体中，并且其吸收磷的能力持久，从而能够有效降低水体中磷的含量，解决水体磷污染严重的问题。
本发明采用的技术方案如下：
一种贝莱斯芽孢杆菌在改善水体磷污染中的应用，所述贝莱斯芽孢杆菌为Bacillus velezensis H18，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2020557。
本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌在改善水体磷污染中的应用，水体样品的磷去除率高达92.6％，去除磷速度快，除磷维持时间久。
进一步地，所述贝莱斯芽孢杆菌的培养方法包括以下步骤：
S1接种：所述贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18以1.0×105～5.0×108个/mL接种浓度、1:25～1:100菌液与培养基体积比接种量接种于培养基中；
S2培养：将接种有所述贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18的培养基，于25～37℃，以180～220rpm速度振荡。恒温培养16～36小时。
进一步地，所述培养基为DTE液体培养基，所述DTE液体培养基包括以下重量份的原料：胰蛋白胨5份、酵母浸粉5份、红糖15份，氯化钠10份、无菌水1000份。
进一步地，步骤S1中的接种浓度为2.5×106个/mL。
进一步地，步骤S1中的菌液与培养基体积比接种量为1:50。
进一步地，步骤S2中的培养温度为30℃。
进一步地，步骤S2中的培养时长为24小时。
为了更好地理解和实施，下面结合实施例详细说明本发明。
具体实施方式
本发明采用的贝莱斯芽孢杆菌菌株，命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis H18，于2020年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国湖北省武汉市武汉大学校内中国典型培养物保藏中心)，保藏编号为CCTCC NO:M2020557。
以下实施例便于理解本发明，但并不限定本发明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例一：贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备
本发明所述贝莱斯芽孢杆菌使用DTE液体培养基，过程如下所示：
培养前活化：取-20℃保存的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis H18，CCTCCNO:M2020557，由华南农业大学提供)甘油种子液以1：100体积比接种量接种到DTE液体培养基中，置于恒温摇床中37℃恒温振荡培养28h，获得已活化的菌液。
S1接种：取已活化的菌液按照1：100菌液与培养基体积比接种于500mL的DTE液体培养基中；
S2培养：将接种有所述贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18的培养瓶，置于恒温摇床中37℃、以200rpm速度恒温振荡培养20h，即可获得该菌株的发酵液。
所述DTE液体培养基包括以下重量份的原料：胰蛋白胨5份、酵母浸粉5份、红糖15份，氯化钠10份、无菌水1000份。制作方法为：准确添加各组分，最后定容，分装至锥形瓶，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，保存备用。
实施例二：贝莱斯芽孢杆菌菌体聚磷活性鉴定
S1：取实施例一制备的本发明的贝莱斯芽孢杆菌的发酵液菌密度调至OD600＝1.0；
S2：取OD600＝1.0的菌液100μL(空白对照CK组为加入100μL ddH20)接种至内含900μL PAM-TBO培养基的96孔板点样孔内，混匀，每株菌株作三个平行组；
本发明所述PAM-TBO培养基包括以下重量份的原料：柠檬酸钠4份，NaCl0.5份，(NH4)2SO4 2.5份，CaCl2 0.25份，MgSO4 0.05份，Na2HPO4 12.8份，KH2PO43份，麦芽糖0.01份，甲苯胺蓝-O 0.025份，蒸馏水1000份。制作方法为：准确添加各组分，最后定容，分装至锥形瓶，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，其中的CaCl2，MgSO4，麦芽糖需单独添加，配制成母液，通过0.22μm无菌滤器过滤后按比例添加，备好后保存备用。
S3：置于生化培养箱中28℃恒温静置培养48h；
S4：将96孔板离心，同时通过酶标仪测定OD625，计算聚磷率，确定菌株聚磷能力大小。聚磷率计算公式如下：聚磷率＝(空白对照组OD625－实验组OD625)÷空白对照组OD625×100％。若菌株具有聚磷能力，菌株内会形成聚磷酸盐颗粒，培养液中的甲苯胺蓝会进入菌体与之反应着色，从而导致培养液中的甲苯胺蓝含量下降，培养液颜色随之变浅，且褪色效果越好，表明菌株聚磷能力越强。结果如表1所示。在28℃恒温静置的情况下，在微孔板中48小时测定的聚磷率达到83.2％。
表1贝莱斯芽孢杆菌菌体聚磷活性鉴定结果
Figure BDA0002887474350000041
实施例三：贝莱斯芽孢杆菌菌体聚磷能力检测
S1：取实施例一制备的本发明贝莱斯芽孢杆菌的发酵液，12000r/min离心10min获得菌体；
S2：用无菌水清洗步骤S1获得的菌体，12000r/min离心5min，此步骤重复操作三次，即获得用于污水除磷除磷的菌体；
S3：取步骤S2获得的菌体以0.1％(m/v)比例投加至城市湖泊污水中，进行厌氧—好氧流程处理。
S4厌氧—好氧流程具体操作：将菌以0.1％(m/v)比例加入到内含40L污水样品密闭玻璃容器中，搅拌混匀，向容器中充入氮气6min然后保藏容器密闭状态，打开容器的搅拌功能，使转速保持在30r/min状态处理12h，此为厌氧处理。再将容器打开，改为用400目纱布封口，搅拌速度提高为60r/min处理36h，此为好氧处理。好氧处理后，使污水样品静止放置至150h。在不同的处理时间点取水样，再将水样离心(12000r/min，10min)取上清液，测定此时水样中的TP(总磷)的浓度，并计算其去除率。
S5污水样品来源及预处理：步骤S4中的污水样品采集于广州市华南农业大学校内鄱阳湖，其水质指标为pH＝6.4、TP＝4.68mg/L，远超过水体磷含量标准0.3mg/ml，同时采集水体底部污泥；将采集到的水样置于玻璃容器，并在玻璃缸底部填充10cm高度的污泥营造水体环境。
S6：TP测定方法，采用钼锑抗分光光度计法测定水体中磷含量TP。
a.样品预处理：取25ml水样置于50ml离心管中，加入1ml过硫酸钾，混匀后密闭，置于高压蒸汽灭菌锅中加热(101KPa，30min)进行消解，待加热完毕，灭菌锅温度降至60℃时取出，室温冷却。
b.显色：取5ml经消解的水样加入50ml比色管中，加去离子水至50ml，此时向比色管总加入1ml10％抗坏血酸溶液，混匀20s后加入2ml钼酸盐溶液充分混匀，室温放置15min。
c.测量：取3ml已显色的溶液加入至比色管中，测其吸光度(OD700)，然后根据钼酸铵标准曲线计算出其磷含量。
d.钼酸铵标准曲线：取数枝50ml比色管，分别加入磷酸盐标准使用溶液0、0.5ml、1ml、3ml、5ml、10ml、15ml，加水至50ml；向比色管总加入1ml10％抗坏血酸溶液，混匀20s后加入2ml钼酸盐溶液充分混匀，室温放置15min；取3ml已显色的溶液加入至比色管中，测其吸光度(OD700)。
e.磷酸盐标准使用液：将磷酸二氢钾于110℃干燥2h然后冷却，称取0.2197g溶于水中，加入5ml盐酸溶液(1+1)，定容至1L，即获得磷酸盐标准溶液；然后取10ml磷酸盐标准溶液用水稀释定容至250ml，即为磷酸盐标准使用液。
f.磷酸盐计算公式：
磷酸盐(P，mg/L)＝m/v
式中：m—由标准曲线查得的含磷量，ug；v—水样体积，ml
由表2的结果可知，当进行12h厌氧处理时，污水样品中总磷(TP)浓度继续上升，并于12h时达到5.56mg/L的高浓度，表明此阶段本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌处于释磷过程；当从厌氧处理改为好氧处理后，污水样品中磷浓度呈直线下降，当处理48h时，污水中总磷浓度仅为0.27mg/L，磷去除率高达94.23％，表明本处理阶段本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌处于聚磷状态，具有良好的除磷效果且除磷速度快；当好氧处理结束后，磷浓度依旧维持在很低的水平，表明本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌除磷效果具有一定的长期性，具有很大的污水治理潜力；
表2贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18的除磷效果
Figure BDA0002887474350000061
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌在改善水体磷污染中的应用，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌为Bacillus velezensis H18，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2020557；所述贝莱斯芽孢杆菌的培养方法包括以下步骤：
S1接种：所述贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18以1.0×105～5.0×108个/mL接种浓度、1∶25～1∶100菌液与培养基体积比接种量接种于培养基中；
S2培养：将接种有所述贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18的培养基，于25～37℃，以180～220rpm速度振荡，恒温培养16～36小时；
所述培养基为DTE液体培养基，所述DTE液体培养基包括以下重量份的原料：胰蛋白胨5份、酵母浸粉5份、红糖15份，氯化钠10份、无菌水1000份。
2.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌在改善水体磷污染中的应用，其特征在于：步骤S1中的接种浓度为2.5×106个/mL。
3.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌在改善水体磷污染中的应用，其特征在于：步骤S1中的菌液与培养基体积比接种量为1∶50。
4.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌在改善水体磷污染中的应用，其特征在于：步骤S2中的培养温度为30℃。
5.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌在改善水体磷污染中的应用，其特征在于：步骤S2中的培养时长为24小时。
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