JPH06212155A - 微生物保持用担体、該担体を用いた土壌修復剤及び土壌修復方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 簡易かつ経済的な方法で調製可能であり、土
壌修復用の微生物の保持に適した孔隙を多数有するとと
もに栄養物もあわせて提供できる土壌修復のための微生
物保持用担体、該担体に土壌修復用微生物を保持させた
土壌修復剤及びこれらを用いた土壌修復方法を提供する
こと。 【構成】 土壌修復用微生物を保持するための孔隙を有
する担体の該孔隙内に該微生物の栄養物を保持させて担
体を形成し、これに土壌中のフェノールたトリクロロエ
チレンなどの有害物質の分解能を有する微生物等を更に
保持させて土壌修復剤とし、土壌に投与することで、土
壌修復を行う。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は土壌修復に用いる微生物
の保持用担体、該担体の孔隙に更に土壌汚染物質の分解
能を有する微生物を保持させた土壌修復剤及び該土壌修
復剤を土壌に投与する土壌修復方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、芳香族炭化水素、パラフィン、ナ
フテン等の炭化水素、あるいはトリクロロエチレン、パ
ークロロエチレン等の有機塩素系化合物等による環境汚
染が問題となっている。これらの深刻な環境汚染の拡大
を防止するとともに、すでに汚染されてしまった環境を
浄化し、もとの状態に戻していく技術の確立が強く望ま
れている。この環境修復技術の例としては、曝気処理、
天日処理、真空釜、真空抽出等の物理化学的処理が行わ
れているが、コスト、操作性、投下エネルギー量、処理
範囲、難分解性物質の分解性などの点から総合的にみた
場合、必ずしも有利な方法とはいえない。

【０００３】そこで、物理化学的処理の問題を解決でき
る方法として微生物による生物学的な処理による環境修
復の利用が検討されてきている。

【０００４】土壌汚染を引き起こしている難分解性化合
物、例えば、芳香族炭化水素や有機塩素系化合物を分解
する微生物は数多く知られている。しかしながら、現実
の汚染土壌にこれらの菌を単にそのまま散布した場合、
散布時の菌の初期濃度に対して土壌中での菌濃度は時間
の経過とともにどんどん減少し、汚染現場の修復効率は
低下してしまう。そのため、微生物散布をたびたび繰り
返さなければならないなどの不都合が生じてくる。従っ
て、土壌中における投与した分解菌の増殖能を維持さ
せ、その菌濃度を高く保持することが実用上強く求めら
れている。

【０００５】従来より医薬品工業、食品工業、廃水処理
システム等で用いられるバイオリアクターでは、微生物
を高濃度に保持するためのさまざまな微生物の保持担体
が提案されている。例えば、多孔質ガラス、セラミク
ス、金属酸化物、活性炭、ゼオライト、アンスラサイト
等の粒子状担体、寒天、ポリビニルアルコール、アルギ
ン酸、ポリアクリルアミド、カラギーナン等のゲル状担
体等である。

【０００６】また、特表平４−５０３５２８号には、ク
ロロフェノール類分解微生物を多孔質支持体に固定して
汚染土壌に添加する方法が開示されている。この多孔質
支持体は、微生物に好ましい生育環境を形成し、微生物
を捕食生物の攻撃から保護することができる。

【０００７】しかしながら、土壌は一般に貧栄養である
ので、土壌中に投与した土壌修復用微生物の栄養物とな
るような物質を更に土壌に補給する必要が生じる場合が
多い。ところが、そのような場合、土壌中での物質移動
はきわめて緩慢であるため、土壌修復用微生物の栄養物
となるような物質を土壌表面より与えても、なかなか効
果を発揮せず、このため微生物を単にそのまま土壌に散
布した場合はもちろんのこと、前述した有機、無機、粒
子状、ゲル状、または多孔性等いずれの担体に固定化し
て散布しても、投与微生物に充分な栄養物が供給されな
いため、投与微生物のの増殖能の活性化、高菌濃度の維
持は土壌中では未だ不十分であった。

【０００８】また、例えば、逆に、投与微生物に好適な
条件が揃い、この微生物を土壌中で増殖、高濃度で維持
させることができ、汚染物質の分解除去処理を良好に行
え得たとすると、今度はその投与微生物が除去処理後も
環境中に存在し続けることは好ましくない。これは投与
微生物自体による２次汚染等の不必要な懸念を招きかね
ないためである。

【０００９】すなわち、理想的には、外部から侵入した
微生物は汚染領域のみ働き、汚染が修復された後は自動
的に消滅することが望ましい。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、微生
物を用いた土壌修復において土壌中にある該微生物への
簡易で経済的な栄養物の供給が可能となり、該微生物の
土壌中での増殖能の活性化、高菌濃度の維持を可能と
し、更にこの投与した微生物が汚染領域でのみ働き、汚
染が修復された後は自動的に消滅して、投与微生物の残
存による生態系への影響を排除することのできる微生物
の保持用担体、該担体に微生物を保持させた土壌修復
剤、及び係る修復剤を用いた土壌修復方法を提供するこ
とにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】上記目的は以下の本発明
によって達成される。

【００１２】即ち、本発明の微生物保持用担体は、土壌
修復に用いる微生物を保持する担体であって、前記担体
が孔隙を有し、前記孔隙中に栄養物を保持していること
を特徴とする。

【００１３】また、本発明のもう一つの微生物保持用担
体は、土壌修復に用いる微生物を保持する担体であっ
て、前記担体が孔隙を有し、前記微生物の栄養物である
ことを特徴とする。

【００１４】本発明の土壌修復剤は、土壌汚染物質分解
能を有する微生物、及び、前記微生物を保持する微生物
保持用担体を含む土壌修復剤であって、前記担体が孔隙
を有し、前記孔隙中に栄養物を保持していることを特徴
とする。

【００１５】本発明のもう一つの土壌修復剤は、土壌汚
染分解能を有する微生物、及び、前記微生物を保持する
微生物保持用担体を含む土壌修復剤であって、前記担体
が孔隙を有し、前記微生物の栄養物であることを特徴と
する。

【００１６】更に、本発明の土壌修復方法は、上記の土
壌修復剤を土壌に投与することにより土壌を修復する土
壌修復方法である。

【００１７】本発明者らは、上記観点から汚染化合物分
解能を有する土壌修復用の微生物を土壌に投与するため
に有用な担体を種々検索した結果、微生物を保持する孔
隙を有する担体であって、該孔隙中に該微生物の栄養物
を保持させる、または該担体自身を該微生物の栄養物と
することにより、土壌中で投与された微生物が効率良く
維持され、かつ増殖し、しかも一定期間の後には投与し
た微生物も消失させることができることを見出し、本発
明に至った。

【００１８】以下、本発明をより具体的に詳述する。

【００１９】まず、本発明の微生物保持用担体の１つで
ある、孔隙を有し、該孔隙中に栄養物を保持させる担
体、及び該担体に微生物を保持させた土壌修復剤につい
て説明する。

【００２０】この微生物保持担体の基本構成材料として
は、例えば、セルロース、デキストラン、アガロースの
ような多糖類、ゼラチン、アルブミンなどの不活化タン
パク、イオン交換樹脂、ポリビニルクロライドのような
合成高分子化合物、セラミクス、多孔性ガラスなどの無
機物、コラーゲン、寒天、アルギン酸、カラギーナン、
セルロースアセテート、ポリアクリルアミド、ポリビニ
ルアルコール、エポキシ樹脂、光硬化性樹脂、ポリエス
テル、ポリスチレン、ポリウレタンなどの包括担体に用
いる高分子化合物などがあげられる。

【００２１】これらの基本構成材料は、有用微生物の保
持という点から考えると、微生物を微小孔隙中へ侵入さ
せることにより保持力を高めることができるような、そ
して孔隙径がある程度制御可能であるような多孔性の担
体を形成できるものが望ましい。つまり、多孔性とする
ことにより有用微生物が付着できる表面積を増すことが
可能となるとともに、孔隙の径を制御することにより原
生動物などによる捕食を回避することもあわせて可能と
なるからである。さらに、本発明によるところの栄養物
の供給手段をこれらの担体に加えることによってはじめ
て、土壌中において有用微生物の増殖、維持をはかるこ
とが可能となった。

【００２２】更に、担体自体を生分解性の材料から形成
することは、残留担体による２次汚染や投与微生物によ
る土壌生態系への影響が問題となる場合に、かかる問題
を回避できるという点から好ましい。このような生分解
性の担体としては、土壌の投与微生物による修復処理後
に徐々に分解されて消失するものが好ましい。このよう
な担体を用いれば、担体の消失によって土壌中に放出さ
れた投与微生物は、土壌中の優勢な土着微生物との競争
や原生動物の捕食、あるいは生育にとって苛酷な環境下
に置かれることによって駆逐されてその数が徐々に減少
し、やがて消滅し、その結果土壌中の生態系をもとの状
態に戻すことができる。

【００２３】このような生分解性担体としては、セルロ
ース、リグニン、デンプン、アガロース、デキストラ
ン、アルブミン、キチン、キトサン、濾紙、木片等から
なるものが利用できる。これらの材料からなる担体は、
微生物の保持が比較的穏やかで増殖した微生物の脱離も
容易であり、安価であり、場合によっては投与微生物自
体の栄養源となるので好ましい。

【００２４】生分解性担体を用いた場合の担体自体の分
解速度は、その材質や性状等を選択することで制御可能
であり、例えば、材質を考慮して、孔隙の孔径、孔隙の
形態、担体の形状及び大きさ等を適宜選択する。なお、
これらの要件の選択に際して、分解速度に影響を及ぼす
因子として考慮すべきものとしては、担体を分解する微
生物（土壌中の土着微生物または投与微生物）の種類、
量及び分解活性、あるいは処理土壌の体積等を挙げるこ
とができ、どのくらいの期間で汚染物質が分解するか、
どのくらいの期間で担体が分解するかをあらかじめフィ
ールド実験で確認し、その上で担体を設計すると良い。

【００２５】係る担体に保持させる栄養物としては、炭
素、窒素、リンを含むものが好ましく、微生物の生育に
適した培養液などが挙げられる。培養液としては、例え
ば、肉汁、酵母エキス、麦芽エキス、バクトペプトン、
グルコース、無機塩類、ミネラルなどが適当な割合で混
合したものが良く用いられているが、担体に担持させよ
うとする微生物の種類に応じて適当な配合比のものを選
べば良い。また、本発明における栄養物としては、上記
の培養液以外にも有機、無機栄養物を適当に含むもので
あれば、どのようなものでも利用可能である。例えば、
自然界より採取した、あるいは培養を加えた任意の微生
物を乾燥、粉砕し、粉砕微粉体を栄養物として担体に含
有してもよい。

【００２６】栄養物を上述の担体に含有させる方法を示
す。まず、多孔性ガラス、セラミクスなどの、水不溶性
な無機多孔質担体に栄養物を含有させる方法としては、 １）担体を栄養物を含む溶液にひたし、 ２）超音波処理などにより担体の孔隙の奥まで該溶液を
浸透させた後、 ３）加温乾燥することにより栄養物を担体の孔隙中で乾
燥、固結させる工程を含む方法などがある。

【００２７】また、カラギーナン、アルギン酸などの、
ゲル状包括担体に栄養物を含有させる方法としては、 １）栄養物を含む溶液とゲル化材料（カラギーナン、ア
ルギン酸など）を含む溶液と混合した後、 ２）ゲル化とともに担体形状を制御して担体を得る工程
を含む方法などがある。

【００２８】上記の栄養物含有法はほんの一例にしか過
ぎず、栄養物は乾燥状態、あるいは水溶化された状態い
ずれの状態でも用いることが可能であり、その適用は担
体の存在状態、形状、性質などに最適な状態、方法を用
いて含有させれば良い。

【００２９】これら担体へ微生物を保持させることによ
り、本発明の土壌修復剤の１つとすることができる。こ
の保持させる方法は通常の方法でよく、例えば、粒状固
形担体の場合は物理的あるいはイオン的に吸着させるか
共有結合させる、包括法の場合は上述の方法そのままに
微生物を包み込めばよい。

【００３０】次に、本発明の微生物保持用担体のもう１
つの形である担体自身が微生物の栄養物である担体、及
び該担体に微生物を保持させた土壌修復剤について説明
する。

【００３１】この担体の具体例としては、自然界もしく
は培養により得られた微生物を乾燥、固結することによ
り細胞間隙中の水分を排除し、微生物同士を固着、結合
せしめた乾燥固結微生物担体、天然高分子（例えば、間
伐材、廃材等のチップ、バガス、麦わら等のリグノセル
ロース系農林産廃棄物、エビ、カニ等甲殻類の殻やイカ
背骨等のキチン系水産廃棄物など）からなる担体、これ
ら天然高分子の爆砕処理物からなる担体などが挙げら
れ、栄養物のみからなるものがより好ましい。

【００３２】まず、微生物乾燥固結担体について述べ
る。本発明において担体として利用可能な微生物は担体
に保持させる土壌修復用微生物の種類に応じて選択さ
れ、培養もしくは自然界より採取されたものが利用でき
る。なお、該微生物は、特定化された微生物や、純粋に
分解された微生物である必要はない。

【００３３】乾燥固結化処理は、通常オーブンあるいは
乾燥器等で菌体を脱水し、固形形状のまま乾燥処理に供
することにより行うことができる。ここで、加温処理は
乾燥を促進させるためのものであり、必ずしも必要とさ
れるものではない。また、凍結乾燥による固結も可能で
ある。担体の強度を高める上で、処理菌体の水分含量は
細胞間隙の水分が存在しなくなるまで乾燥することが望
ましいが、５０％程度の水分含量でも十分実用に供する
ことが可能である。

【００３４】このようにして微生物を乾固した後、所望
する粒子サイズに適宜粉砕、切断を行い、担体粒子を調
製する。例えば、培養微生物を遠心沈殿もしくはフィル
ター上で集菌し、固形形状のまま所定の温度で乾燥、固
結し、カッター、ミル、ブレンダー等で粉砕、切断し、
粒子状の固形化物を得ることができる。ここで、粒子サ
イズは、条件設定により任意に選択可能である。さら
に、半乾燥状態で試料を取り出し、その状態で粒子化を
行い、その後さらに強度を増加させるために乾燥を加え
ることも可能である。

【００３５】また、このようにして調製した担体は、担
体の調製に利用した微生物の大きさ、形状等に依存して
数μｍから数１００μｍ程度の孔径を有し、土壌修復用
微生物の保持担体として優れた形状を有する。さらに、
集菌条件の選択、あるいは集菌固形物の爆砕処理等の空
疎化処理等により、数μｍから数１００μｍ程度の任意
の孔径を得ることも可能である。

【００３６】次に、天然高分子を材料とした担体につい
て詳述する。リグノセルロース系やキチン系の天然高分
子は、細胞由来の孔隙をさまざまな形で有し、かつ微生
物の生存に必要な炭素源および窒素源を豊富に含む。こ
れらの点より、上記天然高分子をそのまま土壌修復微生
物の保持担体として用いても十分な効果を得ることがで
きるが、さらに、本発明者らは爆砕処理を加えた該天然
高分子が、微生物の保持担体としてよりいっそう優れた
ものであることを見いだした。

【００３７】ここで爆砕とは、粗粉砕試料を密閉した圧
力窯中で水蒸気によって蒸煮し、その後速やかに空気中
に放出するという２段階の処理行程であり、一般的な効
果としては （１）高温、高圧蒸気による組織、細胞の軟化、分解。 （２）それに続く急激な圧力の低下による細胞構造の物
理的破壊。 という細胞、組織の物理的、化学的な形態変化が挙げら
れる。この処理方法は、通常木材チップの飼料化やアル
コール発酵等の前処理として用いられており、ＩＯＴＥ
ＣＨ社やＳＴＡＫＥ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社では連続
式の爆砕装置を開発し、それぞれ実用化している。な
お、これらの爆砕については『セルロース資源』（越島
哲夫編：学会出版センター）ｐ．１００−１１５に詳し
い。

【００３８】このような爆砕処理により、リグノセルロ
ース系あるいはキチン系天然高分子中のリグニン、セル
ロース、キチン等の化学結合が分断され低分子化される
とともに、その膨潤度が増し分解酵素等のアクセスビリ
ティーが高まるため、微生物が栄養物として非常に利用
しやすい性質を担体に付与することが可能である。さら
に、有用微生物の保持に好適な孔隙もあわせて提供する
ことが可能である。

【００３９】それ自身が栄養物である担体の構成材料
は、該担体に保持させる土壌修復用の微生物の種類に応
じて選択されるが、上述の乾燥固着微生物からなるもの
や天然高分子爆砕法などにより調製された担体は、広範
な微生物の栄養物となり得るものであり、特に有用であ
り、更に土壌修復用の微生物の保持に適した孔隙を持つ
ことから、土壌中でのその増殖、維持に充分な機能を持
つ。なお、栄養物から構成されるということは、言を換
えれば生分解性であるということにほかならない。ま
た、これらの担体は、水分と接触し膨潤しても十分な強
度を有し、汚染土壌中に散布しても微細化することなく
実用に供することができる。

【００４０】これらの担体へ微生物を保持させることに
より、本発明の土壌修復剤の１つとすることができる。

【００４１】この土壌修復用微生物を保持させる方法は
通常の方法でよく、例えば、担体と培地を混合して菌を
培養する、減圧下で孔隙内に菌を封入する、等の方法で
保持させれば良い。

【００４２】本発明の担体に保持させる微生物は、特に
限定されないが、芳香族炭化水素系化合物、トルエン等
の有機溶剤、有機塩素化合物等を分解するPseudomonas
属に属する細菌の他に、各種有害物質の分解能を有する
ことが知られているMethylosinus、Methylomonas、Meth
ylobacterium、Alcaligenes、Mycobacterium、Nitrosom
onas、Xanthomonas、Spirillum、Vibrio、Bacterium、A
chromobacter、Acinetobacter、Flavobacterium、Chrom
obacterium、Desulfovibrio、Desulfotomaculum、Micro
coccus、Sarcina、Bacillus、Streptomyces、Nocardi
a、Corynebacterium、Pseudobacterium、Arthrobacte
r、Brevibacterium、Saccharomyces、Lactobacillusの
各属に属する微生物等を用いることがきる。

【００４３】なお、投与微生物としては、既に単離され
ているもの、土壌等から目的に応じて新たにスクリーニ
ングしたものが利用でき、複数の株の混合系でもよい。
なお、スクリーニングにより分離したものの場合それが
未同定のものでも良い。

【００４４】上述したような微生物を保持した本発明の
担体、すなわち土壌修復剤を土壌に投与することによっ
て土壌の浄化処理を行うことができる。土壌への投与
は、散布処理、土壌との混合処理等常法によって行うこ
とができる。また、土壌の比較的深部の投与には、掘削
孔を設けてそこから土壌修復剤を投与・分散させる方法
が利用できる。そのような方法の一例を以下に図面を用
いて説明する。

【００４５】図１７は、通気孔を利用する投与方法にお
ける工法を示す図である。通気孔を利用する方法では、
まず、土壌に掘削等の方法によって通気孔１を設け、そ
こに通気用パイプ１ａを挿入し、コンプレッサー等の送
風手段４によって通気用パイプ内に気圧をかけて陽圧と
しつつ投入孔３から土壌修復剤を投入し、通気用パイプ
１ａの土壌修復剤放出用の孔（ピット）が多数設けられ
たピット部２から土壌修復剤を土壌中に放出させる。な
お、必要に応じて、適当な位置に吸気孔５を設けて吸気
ポンプ等の吸気手段６によって吸気孔内を負圧にするこ
とで、通気孔１での通気による土壌修復剤の分散効果を
促進することができる。なお、土壌深部の酸素分圧は低
く、好気性菌による処理には不適当な場合が多いが、こ
の通気孔を用いる方法によれば、土壌の深部に酸素を送
り込むことができ、好気性菌による活発な分解作用を得
ることもできる。なお、通気孔や吸気孔の大きさ（内
径）、深さ、形状、通気孔への通風量、吸気孔からの吸
気量は、処理する土壌層の深さ、土質、微生物や担体の
種類等に応じて適宜選択すれば良い。

【００４６】また、給水を利用することによって土壌修
復剤の土壌中への散布を行うことも可能である。

【００４７】例えば、図１８に示すように、給水孔７を
設け、給水用パイプ７ａを挿入して、給水ポンプ等の給
水手段１０から給水用パイプ７ａに給水して水圧をか
け、投入部９から土壌修復剤を投入して給水の流れに載
せてこれをピット部８から土壌深部に供給し、土壌中に
分散させる。なお、ピット部８を地下水脈１３中に設け
ることにより、地下水流を利用して土壌修復剤を分散さ
せることができる。給水手段１０からの給水として溶存
酸素量の多い水を用いることで、土壌中への酸素の供給
も可能となり、好気性菌による活発な分解作用を得るこ
ともできる。また、必要に応じて吸水孔１１を設け、吸
水ポンプ等の吸水手段１２で水を吸い上げてやること
で、上記の給水による効果を促進させることができる。
この地下水を利用する方法における給水孔や吸水孔の大
きさ（内径）、深さ、形状、給水孔への給水量、吸水孔
からの吸水量は、処理する土壌層の深さ、土質、微生物
や担体の種類等に応じて適宜選択すれば良い。

【００４８】以下、実施例により本発明をより具体的に
説明するが、これらは本発明の範囲をなんら限定するも
のではない。

【００４９】

【実施例】

実施例１（多孔質ガラスを用いた微生物保持用担体の調
製） 担体として旭硝子（株）の多孔質ガラスＭＰＧ（孔径２
０μｍ、粒径２〜３ｍｍ、０．３５ｃｃ／ｇ）を用い
た。このＭＰＧ２０ｇに酵母の培養液であるＹＰＤ培地
（１リットル中、酵母エキス１０ｇ、ペプトン２０ｇ、
グルコース２０ｇ及び水を含む）３０ｍｌを加え、超音
波洗浄器で１分間処理した。過剰の培地を取り除き、乾
燥器を用いて７０℃、２時間乾燥することにより栄養物
を保持した微生物保持用担体を調製した。

【００５０】実施例２（ポリビニルアルコールを用いた
土壌修復剤の調製） ポリビニルアルコール（平均重合度２０００）５ｇを、
オートクレーブ直後のＹＰＤ培地５０ｍｌに溶解し、冷
却後、炭酸水素ナトリウム５ｇと酵母（Saccharomyces
cerevisiaeＡＢ１３８０株、東洋紡績（株））湿菌体５
ｇを混合し、ポリビニルアルコール、酵母及び酵母の栄
養物の混合物を得た。これを６０％硫酸アンモニウム
（ｐＨ４）中に滴下し、約３０分間接触の後水洗し、栄
養物及び微生物（酵母）を保持した土壌修復剤を調製し
た。

【００５１】実施例３（Saccharomyces cerevisiaeの土
壌中での生残性（１）） S. cerevisiae ＹＰＨ４９９株をＹＰＤ培地１０ｍｌに
接種し、３０℃で対数増殖にいたるまで培養を行った。
この培養液中に、実施例１で調製した微生物保持用担体
１ｇを加え、耐圧ビン中で減圧し菌を担体に導入し、土
壌修復剤を調製した。

【００５２】担体に導入された菌数は、吸光度−菌数直
線により求めた。つまり、担体を加える前の菌数と、担
体に菌を導入した後の菌数を吸光度よりもとめ、その差
分を担体に導入された菌数とした。吸光度−菌数直線
は、ある吸光度の菌懸濁液を血球計算板で菌数を計数す
ることにより求めた。

【００５３】上記のように調製した土壌修復剤を、滅菌
した褐色森林土１００ｇに添加し、３０℃で培養を行
い、経日的にこの土壌より１０ｇずつサンプリングし
た。サンプルはホモジナイザーを用いてリン酸緩衝液５
０ｍｌに分散の後、ＹＰＤ培地の希釈平板法で菌数を求
めた。実験は同一構成の実験系を５基用意してこれらを
平行して行う５連で行い、土壌１ｇあたりの菌数で平均
をとった。その結果を図１に示す。

【００５４】比較例１ 実施例３と同様の実験系で、担体を栄養物添加処理をし
ていないＭＰＧに変更した。また、土壌に導入する酵母
の菌数は、実施例３とほぼ同数となるようにした。実施
例３と同様に経日的にサンプリングをして菌数を求め
た。実験は５連で行い、土壌１ｇあたりの菌数で平均を
とった。その結果を図１に示す。

【００５５】実施例４（Saccharomyces cerevisiaeの土
壌中での生残性（２）） 実施例３と同様の実験系で、土壌修復剤のみを実施例２
の方法で調製した土壌修復剤に変更した。土壌に導入す
るS. cerevisiaeの菌数は、実施例３とほぼ同数となる
ようにした。実施例３と同様に経日的にサンプリングし
菌数を求めた。実験は５連で行い、土壌１ｇあたりの菌
数で平均をとった。その結果を図２に示す。

【００５６】比較例２ 実施例４と同様の実験系で、土壌修復剤の調製をＹＰＤ
培地を用いずに行った。すなわち、培養液を含まない土
壌修復剤に変更した。土壌に導入するS. cerevisiaeの
菌数は、実施例３とほぼ同数となるようにした。実施例
３と同様に経日的にサンプリングし菌数を求めた。実験
は５連で行い、土壌１ｇあたりの菌数で平均をとった。
その結果を図２に示す。

【００５７】実施例５（Pseudomonas cepaciaによるト
リクロロエチレン（ＴＣＥ）の分解及びPseudomonas ce
paciaの生残性（１）） （セルロースを用いた微生物保持用担体の調製）セルロ
ース微粉末担体（旭化成社製マイクロキャリア）を多孔
質担体として用い、この２０ｇ（乾燥重量）に０．５％
酵母エキスを加えたＭ９培地（１リットル中、Ｎａ₂Ｈ
ＰＯ₄ ６．２ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ３．０ｇ、ＮａＣｌ
０．５ｇ、ＮＨ₄Ｃｌ １．０ｇ及び蒸留水を含む（ｐＨ
７．０））５００ｍｌを加え、担体内の空気を減圧して
脱気した後、超音波洗浄器で１分間処理した。過剰の培
地を取り除き、乾熱器を用いて７０℃、２時間乾燥する
ことにより栄養物を保持した微生物保持用担体を調製し
た。

【００５８】（トリクロロエチレンの分解）トリクロロ
エチレン及びフェノールを分解する菌であるPseudomona
s cepaciaＫＫ０１株（国際寄託番号： ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４２３５）を０．０５％の酵母エキスを含むＭ９培
地１０００ｍｌに接種し、３０℃で培養を行った。培養
液のＯ．Ｄ．（５３０ｎｍ）が約０．７に達した後、こ
の溶液に上述の微生物保持用担体２０ｇ（乾燥重量）を
加え、耐圧瓶中で減圧して微小孔隙中に菌を導入した。
この担体をろ紙（ワットマンＮｏ．４４）上に広げ、
吸引して余分の培養液を担体から除き、さらに１００ｍ
ｌの蒸留水を吸引しながらろ紙上の担体に３回注ぎ、担
体に吸着されていないわずかの菌を洗脱した。

【００５９】担体に吸着している菌数は以下のようにし
て求めた。まず、菌を吸着した担体１０ｇをブレンダー
カップに入れ、滅菌水４０ｍｌを加えて１分間、１００
００ｒｐｍでブレンダー処理した。ここで得られた菌懸
濁液中の菌数を希釈平板法で測定することにより求め
た。培地はフェノール単一炭素源寒天培地を用い、さら
にコロニー性状を識別してプレートカウントを行った。

【００６０】次に、トリクロロエチレン１ｍｇ及びＴＣ
Ｅ分解のためのインデュサー物質であるフェノール２０
ｍｇを添加した含水比８０％の未滅菌褐色森林土５０ｇ
に１００ｍｌ容バイアル瓶中で上述のように作製した土
壌修復剤５ｇ（湿重量）を添加・混合し、ブチルゴム栓
を用いて密封した。同様のものを３個準備し、２０℃の
恒温培養器中に静置した。また、５０ｐｐｍのフェノー
ルを、７日ごとの測定直後にゴム栓からシリンジを用い
て添加した。培養開始後、０日、７日、１４日、２１
日、２８日目に各バイアル瓶気相中のトリクロロエチレ
ン濃度をガスクロ＝ヘッドスペース法によって測定し
た。実験は各日３連ずつ行い、トリクロロエチレン濃度
の平均をとり、初期濃度を１００として残存量の相対値
を求めた。

【００６１】また、同様に汚染物質及び菌を含む土壌修
復剤を調製した土壌の培養０日、７日、１４日、２１
日、２８日、５６日、８４日、１１２日目の生残菌数を
測定した。方法は、ブレンダーで土壌を懸濁し、その懸
濁液中の菌数を前述の希釈平板法で測定することにより
求めた。なお、セルロース担体は５６日目頃から生分解
作用を受け始めた。これらの結果を図３、４に示す。

【００６２】比較例３ 実施例５の担体に吸着している菌数とほぼ同じ菌数と
なるように吸光度を用いて調整した菌懸濁液５ｍｌを実
施例５と同様に土壌に添加・混合した系、 栄養物を保持した微生物保持用担体を蒸留水で湿潤後
実施例５と同様にろ紙上で吸引し、余剰蒸留水を除い
た、菌の吸着していない担体５ｇを土壌に添加・混合し
た系、 実施例５の担体に吸着している菌数とほぼ同じ菌数と
なるように吸光度を用いて調整した菌懸濁液５ｍｌと菌
の吸着していない担体５ｇを別々に同一の土壌に添加・
混合した系、 蒸留水５ｍｌを土壌に添加・混合した系 を準備し、各々実施例５と同様に密封後培養して経日的
に各バイアル瓶の気相中のトリクロロエチレン濃度をガ
スクロ＝ヘッドスペース法によって測定した。実験は各
日３連ずつ行い、トリクロロエチレン濃度の平均をと
り、初期濃度を１００として残存量の相対値を求めた。

【００６３】また、土壌中の生残菌数も各々実施例５と
同様に培養０日、７日、１４日、２１日、２８日、５６
日、８４日、１１２日目に測定した。なお、セルロース
担体は５６日目頃から生分解作用を受け始めた。

【００６４】これらの結果を図３、４に示す。

【００６５】実施例６（Pseudomonas putidaによるトリ
クロロエチレンの分解） （ゼオライトを用いた微生物保持用担体の調製）無機多
孔質担体としてゼオライト（粒径２００〜５００μｍ）
を用いた。ゼオライト３０ｇに０．５％酵母エキスを加
えたＭ９培地５０ｍｌを加え、超音波洗浄器で１分間処
理した。過剰の培地を取り除き、乾熱器を用いて７０
℃、２時間乾燥することにより栄養物を保持した微生物
保持用担体を調製した。

【００６６】（トリクロロエチレンの分解）トリクロロ
エチレン及びフェノールを分解する菌であるPseudomona
s putidaＢＨ（大阪大学工学部、環境工学科）を０．０
５％の酵母エキスを加えたＭ９培地１００ｍｌに接種
し、３０℃で培養を行った。培養液のＯ．Ｄ．（５３０
ｎｍ）が約０．７に達した後、この溶液に上述の微生物
保持用担体２０ｇを加え、耐圧瓶中で減圧して微小孔隙
中に菌を導入した。

【００６７】この担体をろ紙（ワットマンＮｏ．４４）
上に広げ、吸引して余分の培養液を担体から除き、さら
に１００ｍｌの蒸留水を吸引しながらろ紙上の担体に３
回注ぎ、担体に吸着されていないわずかの菌を洗脱し
た。

【００６８】担体に吸着している菌数は以下のようにし
て求めた。まず、菌を吸着した担体１０ｇをブレンダー
カップに入れ、滅菌水４０ｍｌを加えて１分間、１００
００ｒｐｍでブレンダー処理した。ここで得られた菌懸
濁液中の菌数を希釈平板法で測定することにより求め
た。培地はフェノール単一炭素源寒天培地を用い、さら
にコロニー性状を識別してプレートカウントを行った。

【００６９】次に、トリクロロエチレン１ｍｇ及びＴＣ
Ｅ分解のためのインデュサー物質であるフェノール２０
ｍｇを添加した含水比８０％の未滅菌褐色森林土５０ｇ
に１００ｍｌ容バイアル瓶中で上述のように作製した土
壌修復剤５ｇ（湿重量）を添加・混合し、ブチルゴム栓
を用いて密封した。同様のものを３個準備し、２０℃の
恒温培養器中に静置した。また、５０ｐｐｍのフェノー
ルを、７日ごとの測定直後にゴム栓からシリンジを用い
て添加した。培養開始後、０日、７日、１４日、２１
日、２８日目に各バイアル瓶気相中のトリクロロエチレ
ン濃度をガスクロ＝ヘッドスペース法によって測定し
た。実験は各日３連ずつ行い、トリクロロエチレン濃度
の平均をとり、初期濃度を１００として残存量の相対値
を求めた。その結果を図５に示す。

【００７０】比較例４ 実施例６の担体に吸着している菌数とほぼ同じ菌数と
なるように吸光度を用いて調整した菌懸濁液５ｍｌを実
施例５と同様に土壌に添加・混合した系、 栄養物（０．０５％の酵母エキスを加えたＭ９培地）
を保持させないで担体を調製し、その担体に実施例６と
同様に菌を吸着させた担体５ｇと、０．０５％の酵母エ
キスを加えたＭ９培地５ｍｌを別々に土壌に添加・混合
した系、 菌を吸着させていない担体５ｇを土壌に添加・混合し
た系、 蒸留水５ｍｌを土壌に添加・混合した系 を準備し、各々実施例６と同様に密封後培養して経日的
に各バイアル瓶の気相中のトリクロロエチレン濃度をガ
スクロ＝ヘッドスペース法によって測定した。実験は各
日３連ずつ行い、トリクロロエチレン濃度の平均をと
り、初期濃度を１００として残存量の相対値を求めた。
その結果を図５に示す。

【００７１】実施例７（Pseudomonas cepaciaによるト
リクロロエチレン（ＴＣＥ）の分解及びPseudomonas ce
paciaの生残性（２）） （多孔質ガラスを用いた微生物保持用担体の調製）無機
多孔質担体として多孔質ガラス（旭硝子（株）製ＭＰ
Ｇ、孔径２０μｍ、粒径２〜３ｍｍ、０．３５ｃｃ／
ｇ）を用いた。ＭＰＧ６０ｇに０．５％酵母エキスを加
えたＭ９培地１００ｍｌを加え、超音波洗浄器で１分間
処理した。過剰の培地を取り除き、乾熱器を用いて７０
℃、２時間乾燥することにより栄養物を保持した微生物
保持用担体を調製した。

【００７２】（トリクロロエチレンの分解）Pseudomona
s cepaciaＫＫ０１株を０．０５％の酵母エキスを含む
Ｍ９培地２００ｍｌに接種し、３０℃で培養を行った。
培養液のＯ．Ｄ．（５３０ｎｍ）が約０．７に達した
後、この溶液に上述の多孔質微生物保持用担体６０ｇを
加え、耐圧瓶中で減圧して微小孔隙中に菌を導入した。

【００７３】この担体をろ紙（ワットマンＮｏ．４４）
上に広げ、吸引して余分の培養液を担体から除き、さら
に１００ｍｌの蒸留水を吸引しながらろ紙上の担体に３
回注ぎ、担体に吸着されていないわずかの菌を洗脱し
た。

【００７４】担体に吸着している菌数は以下のようにし
て求めた。まず、菌を吸着した担体１０ｇをブレンダー
カップに入れ、滅菌水４０ｍｌを加えて１分間、１００
００ｒｐｍでブレンダー処理した。ここで得られた菌懸
濁液中の菌数を希釈平板法で測定することにより求め
た。培地はフェノール単一炭素源寒天培地を用い、さら
にコロニー性状を識別してプレートカウントを行った。

【００７５】次に、トリクロロエチレン１ｍｇ及びＴＣ
Ｅ分解のためのインデュサー物質であるフェノール２０
ｍｇを添加した含水比８０％の未滅菌褐色森林土５０ｇ
に１００ｍｌ容バイアル瓶中で上述のように作製した土
壌修復剤５ｇ（湿重量）を添加・混合し、ブチルゴム栓
を用いて密封した。同様のものを３個準備し、２０℃の
恒温培養器中に静置した。また、５０ｐｐｍのフェノー
ルを、７日ごとの測定直後にゴム栓からシリンジを用い
て添加した。培養開始後、０日、７日、１４日、２１
日、２８日目に各バイアル瓶気相中のトリクロロエチレ
ン濃度をガスクロ＝ヘッドスペース法によって測定し
た。実験は各日３連ずつ行い、トリクロロエチレン濃度
の平均をとり、初期濃度を１００として残存量の相対値
を求めた。

【００７６】また同様に汚染物質及び菌を含む土壌修復
剤を調製した土壌の培養０日、７日、１４日、２１日、
２８日目の生残菌数を測定した。方法は、ブレンダーで
土壌を懸濁し、その懸濁液中の菌数を前述の希釈平板法
で測定することにより求めた。これらの結果を図６、７
に示す。

【００７７】比較例５ 実施例７の担体に吸着している菌数とほぼ同じ菌数と
なるように吸光度を用いて調整した菌懸濁液５ｍｌを実
施例７と同様に土壌に添加・混合した系、 栄養物を保持した微生物保持用担体を蒸留水で湿潤後
実施例７と同様にろ紙上で吸引し、余剰蒸留水を除い
た、菌の吸着していない担体５ｇを土壌に添加・混合し
た系、 実施例７の担体に吸着している菌数とほぼ同じ菌数と
なるように吸光度を用いて調整した菌懸濁液５ｍｌと菌
の吸着していない担体５ｇを別々に同一の土壌に添加・
混合した系、 蒸留水５ｍｌを土壌に添加・混合した系 を準備し、各々実施例７と同様に密封後培養して経日的
に各バイアル瓶の気相中のトリクロロエチレン濃度をガ
スクロ＝ヘッドスペース法によって測定した。実験は各
日３連ずつ行い、トリクロロエチレン濃度の平均をと
り、初期濃度を１００として残存量の相対値を求めた。

【００７８】また、土壌中の生残菌数も各々実施例５と
同様に培養０日、７日、１４日、２１日、２８日目に測
定した。これらの結果を図６、７に示す。

【００７９】実施例８（Pseudomonas cepaciaによるト
リクロロエチレンの分解（３）） ポリビニルアルコール（平均重合度２０００）２０ｇ
を、オートクレーブ直後の０．０５％の酵母エキスを加
えたＭ９培地２００ｍｌに溶解し、冷却後、炭酸水素ナ
トリウム２０ｇとPseudomonas cepaciaＫＫ０１株湿菌
体５ｇを混合し、ポリビニルアルコール、Pseudomonas
cepaciaＫＫ０１株菌体及び栄養物の混合物を得た。こ
れを６０％炭酸アンモニウム（ｐＨ４）中に滴下し、約
３０分間接触の後水洗し、土壌修復剤を調製した。

【００８０】次に、トリクロロエチレン１ｍｇ及びＴＣ
Ｅ分解のためのインデュサー物質であるフェノール２０
ｍｇを添加した含水比８０％の未滅菌褐色森林土５０ｇ
に１００ｍｌ容バイアル瓶中で上述のように作製した土
壌修復剤５ｇを添加・混合し、ブチルゴム栓を用いて密
封した。同様のものを３個準備し、２０℃の恒温培養器
中に静置した。また、５０ｐｐｍのフェノールを、７日
ごとの測定直後にゴム栓からシリンジを用いて添加し
た。培養開始後、０日、７日、１４日、２１日、２８日
目に各バイアル瓶気相中のトリクロロエチレン濃度をガ
スクロ＝ヘッドスペース法によって測定した。実験は各
日３連ずつ行い、トリクロロエチレン濃度の平均をと
り、初期濃度を１００として残存量の相対値を求めた。
その結果を図８に示す。

【００８１】比較例６ 実施例８と同量のPseudomonas cepaciaＫＫ０１株の
湿菌体５ｇをＭ９培地２００ｍｌに懸濁した菌懸濁液５
ｍｌ、 菌を混合せずに作製したポリビニルアルコール担体５
ｇ、 蒸留水５ｍｌを各々実施例８と同様に土壌に添加・混
合し、密封後同様に培養して経日的に各バイアル瓶気相
中のトリクロロエチレン濃度をガスクロ＝ヘッドスペー
ス法によって測定した。実験は各日３連ずつ行い、トリ
クロロエチレン濃度の平均をとり、初期濃度を１００と
して残存量の相対値を求めた。その結果を図８に示す。

【００８２】実施例９（Pseudomonas cepaciaによるク
レゾールの分解） （木粉を用いた微生物保持用担体の調製）木粉を多孔質
担体として用い、この３０ｇに０．５％酵母エキスを加
えたＭ９培地５０ｍｌを加え、超音波洗浄器で１分間処
理した。過剰の培地を取り除き、乾熱器を用いて７０
℃、２時間乾燥することにより栄養物を保持した微生物
保持用担体を調製した。

【００８３】（クレゾールの分解）クレゾールを分解す
る菌でもあるPseudomonas cepaciaＫＫ０１株を０．０
５％の酵母エキスを加えたＭ９培地３００ｍｌに接種
し、３０℃で培養を行った。培養液のＯ．Ｄ．（５３０
ｎｍ）が約０．７に達した後、この溶液に上述の微生物
保持用担体６０ｇを加え、耐圧瓶中で減圧して微小孔隙
中に菌を導入した。

【００８４】この担体をろ紙（ワットマンＮｏ．４４）
上に広げ、吸引して余分の培養液を担体から除き、さら
に１００ｍｌの蒸留水を吸引しながらろ紙上の担体に３
回注ぎ、担体に吸着されていないわずかの菌を洗脱し
た。

【００８５】担体に吸着している菌数は以下のようにし
て求めた。まず、菌を吸着した担体１０ｇをブレンダー
カップに入れ、滅菌水４０ｍｌを加えて１分間、１００
００ｒｐｍでブレンダー処理した。ここで得られた菌懸
濁液中の菌数を希釈平板法で測定することにより求め
た。培地はフェノール単一炭素源寒天培地を用い、さら
にコロニー性状を識別してプレートカウントを行った。

【００８６】次に、クレゾール２０ｍｇ及びＴＣＥ分解
のためのインデューサー物質であるフェノール２０ｍｇ
を添加した含水比８０％の未滅菌褐色森林土５０ｇに１
００ｍｌ容バイアル瓶中で上述のように作製した土壌修
復剤５ｇを添加・混合し、ブチルゴム栓を用いて密封し
た。同様のものを１５個準備し、２０℃の恒温培養器中
に静置した。また、５０ｐｐｍのフェノールを、７日ご
との測定直後にゴム栓からシリンジを用いて添加した。
培養開始後、０日、７日、１４日、２１日、２８日目に
土壌中のクレゾール濃度を土壌抽出液をＨＰＬＣで測定
することにより求めた。実験は各日３連ずつ行い、クレ
ゾール濃度の平均をとり、初期濃度を１００として残存
量の相対値を求めた。その結果を図９に示す。

【００８７】比較例７ 実施例９の担体に吸着している菌数とほぼ同じ菌数と
なるように吸光度を用いて調整した菌懸濁液５ｍｌ、 菌を吸着させていない担体５ｇ、 蒸留水５ｍｌを、各々実施例９と同様に土壌に添加・
混合し、密封後同様に培養して経日的に各バイアル瓶の
土壌中のクレゾール濃度を同様にＨＰＬＣで測定した。
実験は各日３連ずつ行い、クレゾール濃度の平均をと
り、初期濃度を１００として残存量の相対値を求めた。
その結果を図９に示す。

【００８８】実施例１０（微生物保持用担体（微生物乾
燥固結担体）の調製（１）） 担体として、担子菌、ネナガノヒトヨタケ Coprinus c
inereus Ｆｉｓ^c株を用いた。ＭＹＧ培地（モルトイク
ストラクト１０ｇ／ｌ、イーストイクストラクト５ｇ／
ｌ、グルコース１０ｇ／ｌｐＨ未調製）１５０ｍｌに固
形斜面ＭＹＧ培地上の上記菌株を白金耳でかきとり、５
００ｍｌ坂口フラスコで３０℃、１５０ｒｐｍで３日間
振盪培養を行った。培養の後、ろ紙で菌体を集菌、脱水
し、菌体の厚みを約３ｍｍ程度にろ紙上に塗り広げて、
５０℃、１００℃、１５０℃、２００℃で乾燥し、以下
に示す固結化強度試験に供した。

【００８９】固定化強度試験は、５００ｍｌビーカー中
の３００ｍｌの水に試料を加え、マグネチックスターラ
ーを用いて１００ｒｐｍ、３０分間攪拌した後の分散状
態により評価した。また、試料はカッターにより２ｍｍ
角程度に切断し、純水で１２時間膨潤させて試験に供し
た。表１に示すように、水分含量が５８％以上の試料で
は固結することなく、試料は分散した。しかしながら、
５０％以下の水分含量では極めて安定な固結物が得られ
た。また、固結物の強度は水分含量のみに依存してお
り、乾燥温度には影響されなかった。

【００９０】

【表１】 実施例１１（微生物乾燥固結担体を用いたEscherichia
coliの生残性） ベクターｐＨＳＧ３９６よりクロラムフェニコール耐性
遺伝子を含む断片を切り出し、さらに断片長を短くした
後平滑末端化し、これをベクターｐＨＳＧ２９８の制限
酵素ＨｉｎｃＩＩ分解物とを結合させてカナマイシン耐
性遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子の両方
を有する図１０に示す構成のベクターを構築し、これを
Escherichia coliＨＢ１０１株（宝酒造（株））に塩化
カルシウム法で導入して両方の耐性を発現する形質転換
体を得た。この形質転換体をＬＢ培地（バクトペプトン
１０ｇ／ｌ、イーストイクストラクト５ｇ／ｌ、塩化ナ
トリウム１０ｇ／ｌ、ｐＨ７．５）１０ｍｌに接種し、
３７℃で対数増殖にいたるまで振盪培養した。

【００９１】この培養液中に、ネナガノヒトヨタケを１
００℃で水分含量０％になるまで乾燥、固結し、その後
純水で膨潤し、１２０℃で１５分間オートクレーブ滅菌
して調製した担体を加えた。担体は乾燥状態で２ｍｍ角
に切断したものを、総重量１ｇで用いた。担体を加えた
後、耐圧瓶中で減圧し菌を担体に導入した（５．３×１
０⁷個／ｇ担体）。

【００９２】担体に導入された菌数は、吸光度−菌数直
線により求めた。つまり、担体を加える前の菌数と、担
体に菌を導入した後の菌数を吸光度よりもとめ、その差
分を担体に導入された菌数とした。吸光度−菌数直線
は、ある吸光度の菌懸濁液を血球計算板で菌数を計数す
ることにより求めた。

【００９３】上記のように調製した土壌修復剤を未滅菌
の褐色森林土１００ｇに添加し、３０℃で培養し、経日
的に土壌１０ｇをサンプリングした。サンプルはホモジ
ナイザーを用いてリン酸緩衝液５０ｍｌに分散し、菌数
をカナマイシンおよびクロラムフェニコールの両抗生物
質を添加したＬＢ培地の希釈平板法で求めた。実験は５
連で行い、土壌１ｇあたりの平均菌数をとった。その結
果を図１１に示す。

【００９４】比較例８ 実施例１１と同様の実験系で、担体のみを旭硝子（株）
多孔質ガラスＭＰＧ（孔径２０μｍ、粒径２〜３ｍｍ、
０．３５ｃｃ／ｇ）に変更した。また、Escherichia co
liの菌数は、実施例１１とほぼ同数となるようにした。
実施例１１と同様に経日的にサンプリングをして菌数を
求めた。実験は５連で行い、土壌１ｇあたりの菌数で平
均をとった。その結果を図１１に示す。

【００９５】実施例１２（微生物保持用担体（天然高分
子爆砕処理担体）の調製） 担体の材料として、リグノセルロース系材料としてブナ
廃材チップ（粒径約３０ｍｍ）を、キチン系材料として
イカ背骨粗粉砕物（粒径約２５ｍｍ）を用いた。

【００９６】爆砕処理方法としては、公知のＴｉｇｎｅ
ｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ法を用い、蒸気圧を４０ａｔ
ｍ、反応温度２００℃、反応時間５分（反応時間とは目
的温度、圧力に達してから空中に放出させるまでの時
間）で処理した。

【００９７】その結果、両材料ともに５μｍ程度のほぼ
均一な孔隙径を持つ爆砕処理物（粒径数百μｍ）が得ら
れた。なお、孔隙径の測定は、Ｓｔｏｎｅらによる細孔
分析法を用いた（Ｓｔｏｎｅ Ｊ．Ｅ．ａｎｄ Ｓｃａ
ｌｌａｎ Ａ．Ｍ．：Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｃｈｅｍ．
Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２，３４３−３５８（１９６
８））。

【００９８】実施例１３（天然高分子爆砕処理担体を用
いたEscherichia coliの生残性） 実施例１１と同様の実験系で、担体のみを実施例１２の
調製法で作成したブナ廃材チップ爆砕処理物に変更し
た。土壌に導入するＥ．ｃｏｌｉの菌数は、実施例１１
とほぼ同数（５．３×１０⁷個／ｇ担体）となるように
した。実施例１２と同様に経日的にサンプリングし菌数
を求めた。実験は５連で行い、土壌１ｇあたりの菌数で
平均をとった。その結果を図１１に示す。

【００９９】実施例１４ 天然高分子爆砕処理担体を用いたPseudomonas cepacia
によるトリクロロエチレンの分解 Pseudomonas cepaciaＫＫ０１株を０．０５％の酵母エ
キスを加えたＭ９培地１００ｍｌに接種し、３０℃で培
養を行った。培養液のＯ．Ｄ．（５３０ｎｍ）が約０．
７に達した後、この溶液に実施例１２で調製した天然高
分子爆砕処理担体２０ｇを加え、耐圧瓶中で減圧して微
小孔隙中に菌を導入した。

【０１００】担体に吸着している菌数は以下のようにし
て求めた。まず、菌を吸着した担体１０ｇをブレンダー
カップに入れ、滅菌水４０ｍｌを加えて１分間、１００
００ｒｐｍでブレンダー処理した。ここで得られた菌懸
濁液中の菌数を希釈平板法で測定することにより求め
た。培地はフェノール単一炭素源寒天培地を用い、さら
にコロニー性状を識別してプレートカウントを行った。

【０１０１】次に、トリクロロエチレン１ｍｇ及びＴＣ
Ｅ分解のためのインデュサー物質であるフェノール２０
ｍｇを添加した含水比８０％の未滅菌褐色森林土５０ｇ
に１００ｍｌ容バイアル瓶中で上述のように作製した土
壌修復剤５ｇを添加・混合し、ブチルゴム栓を用いて密
封した。同様のものを３個準備し、２０℃の恒温培養器
中に静置した。また、５０ｐｐｍのフェノールを、７日
ごとの測定直後にゴム栓からシリンジを用いて添加し
た。培養開始後、０日、７日、１４日、２１日、２８日
目に各バイアル瓶気相中のトリクロロエチレン濃度をガ
スクロ＝ヘッドスペース法によって測定した。実験は各
日３連ずつ行い、トリクロロエチレン濃度の平均をと
り、初期濃度を１００として残存量の相対値を求めた。
その結果を図１２に示す。

【０１０２】比較例９ 実施例１４の担体に吸着している菌数とほぼ同じ菌数
となるように吸光度を用いて調整した菌懸濁液５ｍｌ、 菌を吸着させていない担体５ｇ、 蒸留水５ｍｌを、各々実施例１４と同様に土壌に添加
・混合し、密封後同様に培養して経日的に各バイアル瓶
の気相中のトリクロロエチレン濃度をガスクロ＝ヘッド
スペース法で測定した。実験は各日３連ずつ行い、トリ
クロロエチレン濃度の平均をとり、初期濃度を１００と
して残存量の相対値を求めた。その結果を図１２に示
す。

【０１０３】実施例１５（微生物乾燥固結担体を用いた
Pseudomonas cepaciaによるトリクロロエチレンの分
解） Pseudomonas cepaciaＫＫ０１株を０．０５％の酵母エ
キスを加えたＭ９培地１００ｍｌに接種し、３０℃で培
養を行った。培養液のＯ．Ｄ．（５３０ｎｍ）が約０．
７に達した後、この溶液に実施例１１と同様にネナガノ
ヒトヨタケから調製した担体２０ｇを加え、耐圧瓶中で
減圧して菌を担体に導入した。

【０１０４】この担体をろ紙（ワットマンＮｏ．４４）
上に広げ、吸引して余分の培養液を担体から除き、さら
に１００ｍｌの蒸留水を吸引しながらろ紙上の担体に３
回注ぎ、担体に吸着されていないわずかの菌を洗脱し
た。

【０１０５】担体に吸着している菌数は以下のようにし
て求めた。まず、菌を吸着した担体１０ｇをブレンダー
カップに入れ、滅菌水４０ｍｌを加えて１分間、１００
００ｒｐｍでブレンダー処理した。ここで得られた菌懸
濁液中の菌数を希釈平板法で測定することにより求め
た。培地はフェノール単一炭素源寒天培地を用い、さら
にコロニー性状を識別してプレートカウントを行った。

【０１０６】次に、トリクロロエチレン１ｍｇ及びＴＣ
Ｅ分解のためのインデュサー物質であるフェノール２０
ｍｇを添加した含水比８０％の未滅菌褐色森林土５０ｇ
に１００ｍｌ容バイアル瓶中で上述のように作製した土
壌修復剤５ｇを添加・混合し、ブチルゴム栓を用いて密
封した。同様のものを３個準備し、２０℃の恒温培養器
中に静置した。また、５０ｐｐｍのフェノールを、７日
ごとの測定直後にゴム栓からシリンジを用いて添加し
た。培養開始後、０日、７日、１４日、２１日、２８日
目に各バイアル瓶気相中のトリクロロエチレン濃度をガ
スクロ＝ヘッドスペース法によって測定した。実験は各
日３連ずつ行い、トリクロロエチレン濃度の平均をと
り、初期濃度を１００として残存量の相対値を求めた。
その結果を図１３に示す。

【０１０７】比較例１０ 実施例１１の担体に吸着している菌数とほぼ同じ菌数
となるように吸光度を用いて調整した菌懸濁液５ｍｌ、 蒸留水で湿潤後実施例１１と同様にろ紙上で吸引し、
余剰蒸留水を除いた菌の吸着していない担体５ｇ及び 蒸留水５ｍｌを、各々実施例１１と同様に土壌に添加
・混合し、密封後同様に培養して経日的に各バイアル瓶
の気相中のトリクロロエチレン濃度をガスクロ＝ヘッド
スペース法によって測定した。実験は各日３連ずつ行
い、トリクロロエチレン濃度の平均をとり、初期濃度を
１００として残存量の相対値を求めた。その結果を図１
３に示す。

【０１０８】実施例１６（汚染土壌の浄化（１）） 褐色森林土壌にフェノールを、土壌５００ｇに対して１
５００ｐｐｍのフェノール水溶液８０ｍｌを分散させる
割合で混合し、フェノール汚染土壌を調製した。

【０１０９】この汚染土壌を２ｍ四方、深さ３ｍの地下
土壌槽に１ｍの層厚となるまで満たし、更に、この汚染
土壌層の上に褐色森林土を載せて、深さ２．５ｍの土壌
層（２層構造）を作製した。この試験土壌槽に、深さ
２．５ｍ、直径５ｃｍの通気孔を槽内の４隅に設け、各
通気孔中に外径４０ｍｍで先端から１ｍまで直径１ｍｍ
の通気用ピットを多数設けたポリ塩化ビニル製のパイプ
をそれぞれ挿入し、各挿入部のパイプ外周を粘土で密封
して通気用ラインとした。更に、同様にして先端から１
ｍのところまでに吸気用ピットを多数設けた直径６０ｍ
ｍのパイプを用いて槽中央部に吸引用ラインを設けた。
通気用ラインにはコンプレッサーを接続し、約０．２ｍ
²／ｍｉｎで通風し、また吸引用ラインは吸引ポンプに
接続して約０．５ｍ²／ｍｉｎで吸引を行った。

【０１１０】一方、実施例５と同様に調製したセルロー
スを用いた栄養物を保持した微生物保持用担体１００ｇ
を培養液（Ｍ９培地に酵母エキストラクト０．０５％を
加えたもの）５リットルに分散した後に、Pseudomonas
cepaciaＫＫ０１株を接種し、４８時間静置培養した。

【０１１１】この土壌修復剤を含んだ微生物培養液を、
準備した土壌槽に、連続通気及び吸引を行いつつ通気用
ラインより接種した。この接種を毎日１週間にわたって
行った。

【０１１２】接種後、１週間ごとに通気用ライン近傍か
ら土壌（計５箇所）をサンプリングして土壌中のフェノ
ール濃度をＨＰＬＣで定量し、５箇所の平均値からフェ
ノール残存量を求めた。得られた結果を図１４に示す。

【０１１３】比較例１１ セルロースを用いた栄養物を保持した微生物保持用担体
を用いない他は実施例１６と同様にしてフェノール残存
量の変化を求めた。得られた結果を図１４に示す。

【０１１４】実施例１７（汚染土壌の浄化（２）） 褐色森林土壌にトリクロロエチレンを、土壌５００ｇに
対して６０ｐｐｍのトリクロロエチレンの水溶液８ｍｌ
を分散させる割合で混合し、トリクロロエチレン汚染土
壌を調製した。この汚染土壌を２ｍ四方、深さ３ｍの地
下土壌槽に１ｍの層厚となるまで満たし、更に、この汚
染土壌層の上に褐色森林土を載せて、深さ２．５ｍの土
壌層（２層構造）を作製した。この試験土壌槽に、深さ
２．５ｍ、直径５ｃｍの給水用ホールを槽内の４隅に設
け、各給水用ホール内に外径５０ｍｍで先端から１ｍま
でに直径５ｍｍの給水用ピットを多数設けたポリ塩化ビ
ニル製のパイプをそれぞれ挿入し、各挿入部のパイプ外
周を粘土で密封して給水用ラインとした。更に、同様に
して先端から１ｍのところまでに吸水用ピットを多数設
けた直径５０ｍｍのパイプを用いて槽中央部に吸水用ラ
インを設けた。給水用ラインには給水ポンプを接続し、
約０．５リットル／ｍｉｎで給水し、また吸水用ライン
は吸水ポンプに接続して約５リットル／ｍｉｎで吸引を
行った。

【０１１５】一方、実施例９と同様に調製した木粉を用
いた栄養物を保持した微生物保持用担体１０００ｇを培
養液（Ｍ９培地に酵母エキストラクト０．０５％を加え
たもの）５リットルに分散した後に、Pseudomonas cepa
ciaＫＫ０１株を接種し、４８時間静置培養した。この
土壌修復剤を含んだ微生物培養液を、準備した土壌槽
に、給水ラインよりより接種した。この接種を毎日１週
間にわたって行った。

【０１１６】接種後、１週間ごとに給水ライン近傍から
土壌（計５箇所）をサンプリングして土壌中のトリクロ
ロエチレン濃度を溶媒抽出法により定量し、５箇所の平
均値からトリクロロエチレン残存量を求めた。得られた
結果を図１５に示す。

【０１１７】比較例１２ 木粉を用いた栄養物を保持した微生物保持用担体を用い
ない他は実施例１７と同様にしてトリクロロエチレン残
存量の変化を求めた。得られた結果を図１５に示す。

【０１１８】実施例１８（汚染土壌の浄化（３）） 褐色森林土壌にトリクロロエチレンを、土壌５００ｇに
対して６０ｐｐｍのトリクロロエチレンの水溶液８ｍｌ
を分散させる割合で混合し、トリクロロエチレン汚染土
壌を調製した。この汚染土壌を２ｍ四方、深さ３ｍの地
下土壌槽に１ｍの層厚となるまで満たし、更に、この汚
染土壌層の上に褐色森林土を載せて、深さ２．５ｍの土
壌層（２層構造）を作製した。

【０１１９】この試験土壌槽に、深さ２．５ｍ、直径５
ｃｍの給水用ホールを槽内の４隅に設け、各給水用ホー
ル内に外径５０ｍｍで先端から１ｍまで直径５ｍｍの給
水用ピットを多数設けたポリ塩化ビニル製のパイプをそ
れぞれ挿入し、各挿入部のパイプ外周を粘土で密封して
給水用ラインとした。更に、同様にして先端から１ｍの
ところまでに吸水用ピットを多数設けた直径５０ｍｍの
パイプを用いて槽中央部に吸水用ラインを設けた。給水
用ラインには給水ポンプを接続し、約０．５リットル／
ｍｉｎで給水し、また吸水用ラインは吸水ポンプに接続
して約５リットル／ｍｉｎで吸水を行った。

【０１２０】一方、実施例５と同様に調製したセルロー
スを用いた栄養物を保持した微生物保持用担体１０００
ｇを培養液（Ｍ９培地に酵母エキストラクト０．０５％
を加えたもの）５リットルに分散した後に、Pseudomona
s cepaciaＫＫ０１株を接種し、４８時間静置培養し
た。この土壌修復剤を含んだ微生物培養液を、準備した
土壌槽に、給水ラインよりより接種した。この接種を毎
日１週間にわたって行った。

【０１２１】接種後、１週間ごとに給水ライン近傍から
土壌（計５箇所）をサンプリングして土壌中のトリクロ
ロエチレン濃度を溶媒抽出法で定量し、５箇所の平均値
からトリクロロエチレン残存量を求めた。得られた結果
を図１６に示す。

【０１２２】比較例１２ セルロースを用いた栄養物を保持した微生物保持用担体
を用いない他は実施例１８と同様にしてトリクロロエチ
レン残存量の変化を求めた。得られた結果を図１６に示
す。

【０１２３】

【発明の効果】本発明の土壌修復用微生物の保持担体
は、簡易かつ経済的な方法で調製可能であり、該微生物
の保持に適した孔隙を多数有するとともに栄養物もあわ
せて供給できることから、土壌中での該微生物の増殖能
の維持をはかることを可能とした。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例３及び比較例１での菌数の変化を示す図
である。

【図２】実施例４及び比較例２での菌数の変化を示す図
である。

【図３】実施例５及び比較例３でのトリクロロエチレン
濃度の変化を示す図である。

【図４】実施例５及び比較例３での菌数の変化を示す図
である。

【図５】実施例６及び比較例４でのトリクロロエチレン
濃度の変化を示す図である。

【図６】実施例７及び比較例５でのトリクロロエチレン
濃度の変化を示す図である。

【図７】実施例７及び比較例５での菌数の変化を示す図
である。

【図８】実施例８及び比較例６でのトリクロロエチレン
濃度の変化を示す図である。

【図９】実施例９及び比較例７でのクレゾール濃度の変
化を示す図である。

【図１０】実施例１１で構築した組換えベクターの構成
図である。

【図１１】実施例１１、１３及び比較例８での菌数の変
化を示す図である。

【図１２】実施例１４及び比較例９でのトリクロロエチ
レン濃度の変化を示す図である。

【図１３】実施例１５及び比較例１０でのトリクロロエ
チレン濃度の変化を示す図である。

【図１４】実施例１６及び比較例１１でのフェノール濃
度の変化を示す図である。

【図１５】実施例１７及び比較例１２でのトリクロロエ
チレン濃度の変化を示す図である。

【図１６】実施例１８及び比較例１３でのトリクロロエ
チレン濃度の変化を示す図である。

【図１７】通気法による土壌中への土壌修復剤の投与方
法を示す図である。

【図１８】給水法による土壌中への土壌修復剤の投与方
法を示す図である。

【符号の説明】

１ 通気孔 ２ ピット部 ３ 土壌浄化剤投入部 ４ 通風手段 ５ 吸気孔 ６ 吸引手段 ７ 給水孔 ８ ピット部 ９ 土壌浄化剤投入部 １０ 給水手段 １１ 吸引孔 １２ 吸引手段

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田中 和實 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内 (72)発明者 今村 剛士 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内 (72)発明者 桜永 昌徳 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内 (72)発明者 三原 知恵子 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 土壌修復に用いる微生物を保持する担体
   であって、前記担体が孔隙を有し、前記孔隙中に栄養物
   を保持していることを特徴とする微生物保持用担体。
2. 【請求項２】 前記担体が多孔性である請求項１記載の
   微生物保持用担体。
3. 【請求項３】 前記担体が水不溶性である請求項１記載
   の微生物保持用担体。
4. 【請求項４】 前記担体がゲル状である請求項１記載の
   微生物保持用担体。
5. 【請求項５】 前記担体が生分解性である請求項１記載
   の微生物保持用担体。
6. 【請求項６】 前記栄養物が前記微生物の培養液である
   請求項１記載の微生物保持用担体。
7. 【請求項７】 土壌修復に用いる微生物を保持する担体
   であって、前記担体が孔隙を有し、前記微生物の栄養物
   であることを特徴とする微生物保持用担体。
8. 【請求項８】 前記担体が微生物の菌体を乾燥し、固結
   することにより形成されたものである請求項７記載の微
   生物保持用担体。
9. 【請求項９】 前記担体の水分含有量が前記担体全重量
   に対して５０重量％以下である請求項７記載の微生物保
   持用担体。
10. 【請求項１０】 前記担体が天然高分子の爆砕処理物で
    ある請求項７記載の微生物保持用担体。
11. 【請求項１１】 前記天然高分子がリグノセルロース系
    もしくはキチン系である請求項１０記載の微生物保持用
    担体。
12. 【請求項１２】 土壌汚染物質分解能を有する微生物、
    及び、前記微生物を保持する微生物保持用担体を含む土
    壌修復剤であって、前記担体が孔隙を有し、前記孔隙中
    に栄養物を保持していることを特徴とする土壌修復剤。
13. 【請求項１３】 前記担体が多孔性である請求項１２記
    載の土壌修復剤。
14. 【請求項１４】 前記担体が水不溶性である請求項１２
    記載の土壌修復剤。
15. 【請求項１５】 前記担体がゲル状である請求項１２記
    載の土壌修復剤。
16. 【請求項１６】 前記担体が生分解性である請求項１２
    記載の土壌修復剤。
17. 【請求項１７】 前記栄養物が前記微生物の培養液であ
    る請求項１２記載の土壌修復剤。
18. 【請求項１８】 土壌汚染分解能を有する微生物、及
    び、前記微生物を保持する微生物保持用担体を含む土壌
    修復剤であって、前記担体が孔隙を有し、前記微生物の
    栄養物であることを特徴とする土壌修復剤。
19. 【請求項１９】 前記担体が微生物の菌体を乾燥し、固
    結することにより形成されたものである請求項１８記載
    の土壌修復剤。
20. 【請求項２０】 前記担体の水分含有量が前記担体全重
    量に対して５０重量％以下である請求項１８記載の土壌
    修復剤。
21. 【請求項２１】 前記担体が天然高分子の爆砕処理物で
    ある請求項１８記載の土壌修復剤。
22. 【請求項２２】 前記天然高分子がリグノセルロース系
    もしくはキチン系である請求項２１記載の土壌修復剤。
23. 【請求項２３】 前記微生物が細菌である請求項１２ま
    たは１８記載の土壌修復剤。
24. 【請求項２４】 請求項１２または１８記載の土壌修復
    剤を土壌に投与することにより土壌を修復する土壌修復
    方法。
25. 【請求項２５】 前記土壌修復剤の投与方法が土壌中に
    給水孔を設け、前記給水孔を介して、土壌修復剤を含む
    溶液を土壌中に給水し、前記土壌修復剤を土壌中に拡散
    させるものである請求項２４記載の土壌修復方法。
26. 【請求項２６】 前記給水が地下水脈中に行うものであ
    る請求項２５記載の土壌修復方法。
27. 【請求項２７】 前記土壌修復剤の投与方法が土壌中に
    通気孔を設け、前記通気孔を介して、土壌修復剤を含む
    気体を土壌中に送り込み、前記土壌修復剤を土壌中に拡
    散させるものである請求項２４記載の土壌修復方法。