CN105658810A - 用于检测***癌的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及用于检测***癌的方法。本公开的某些实施方案提供检测受试者中的***癌的方法，所述方法包括检测标记物，所述标记物选自所述受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。

Description

用于检测***癌的方法
优先权要求
本申请要求提交于2013年6月13日的第2013902141号澳大利亚临时专利申请的优先权，该申请的内容在此通过引用并入。
领域
本发明涉及用于检测***癌的方法、用于***癌的诊断和/或预后的方法、用于测定***癌的进展的方法、用于基于标记物检测治疗***癌的方法以及用于***癌的诊断和/或预后的抗体。
背景
***癌是发达国家男性中最常见的癌症形式，且这种疾病的全球发病率预计到2030年将加倍。例如，在2008年，超过两万名澳大利亚男性被诊断为***癌且死亡人数接近三千，这使得该疾病成为癌症相关性死亡的最大原因之一。
***特异性抗原(PSA)测试目前被用于***癌筛查，然而，这种测定遭受许多缺点，包括高百分比的假阳性结果。PSA在诊断时还无法区别侵袭性或更缓慢生长的癌症，从而导致过度治疗。最近，已经建议放弃这一程序，特别是在老年男性中。
直肠指检是用于检查***异常的替代程序，但这种检验受无法评估整个腺体和在一定程度上肿瘤大小的限制。
因此，迫切需要更具特异性和/或更准确的***癌检测方法，以助于早期诊断和选择最合适的治疗干预。早期检测显著降低***癌的死亡率，这使得改善的诊断和愈预后方法成为重要的目标。
鉴于与当前的***癌诊断和/或预后技术有关的缺陷，能够利用其它生物标记物来辅助***癌的检测将是极为有利的。然而，与***癌有关的临床相关生物标记物的鉴别仍然有问题。
因此，仍然需要鉴别用于检测***癌和/或提供本领域中的一个或多个优点的替代性生物标记物。
概要
本公开是基于特异性内体和/或溶酶体相关标记物可以用于检测受试者中的***癌的测定。
本公开的某些实施方案提供检测受试者中的***癌的方法，所述方法包括检测选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物的标记物，由此检测受试者中的***癌。
本公开的某些实施方案提供检测受试者中的***癌的方法，所述方法包括检测标记物，该标记物选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
本公开的某些实施方案提供检测受试者中的***癌的方法，所述方法包括检测选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物的标记物，其中选定标记物的改变的存在、水平、分泌和分布中的一种或多种指示受试者中的***癌。
本公开的某些实施方案提供检测受试者中的***癌的方法，所述方法包括：
从受试者获取生物样品；
处理该样品以允许检测选自内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物的标记物；
检测处理样品中的选定标记物的改变的存在、水平、分泌和分布中的一种或多种；以及
鉴别受试者中的***癌。
本公开的某些实施方案提供检测受试者中的***癌的方法，所述方法包括：
从受试者获取生物样品；
处理该样品以允许检测选自内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物的标记物；
检测处理样品中的选定标记物的存在、水平、分泌和分布中的一种或多种；
将选定标记物的存在、水平、分泌和分布中的一种或多种与已知用于指示受试者中***癌的存在或不存在的一种或多种其它标记物进行比较；以及
鉴别受试者中的***癌。
本公开的某些实施方案提供鉴别患有或易患***癌的受试者的方法，所述方法包括检测标记物，该标记物选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
本公开的某些实施方案提供鉴别患有或易患***癌的受试者的方法，所述方法包括检测选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物的标记物，其中选定标记物的改变的存在、水平、分泌和分布中的一种或多种指示受试者患有或易患***癌。
本公开的某些实施方案提供筛查受试者中的***癌的方法，所述方法包括检测标记物，该标记物选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
本公开的某些实施方案提供筛查受试者中的***癌的方法，所述方法包括检测选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物的标记物，其中选定标记物的改变的存在、水平、分泌和分布中的一种或多种指示受试者中的***癌。
本公开的某些实施方案提供治疗受试者中的***癌的方法，所述方法包括：
检测选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物的标记物；以及
基于所检测的选定标记物的存在、水平、分泌和分布中的一种或多种来治疗受试者。
本公开的某些实施方案提供用于检测受试者中的***癌的诊断方法，所述方法包括检测标记物，该标记物选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
本公开的某些实施方案提供测定受试者患有或易患***癌的可能性和/或风险的方法，所述方法包括检测标记物，该标记物选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
本公开的某些实施方案提供测定受试者中的***癌的进展的方法，所述方法包括检测标记物，该标记物选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
本公开的某些实施方案提供用于进行如本文所描述的方法的试剂盒。
本公开的某些实施方案提供治疗受试者中的***癌的方法，所述方法包括：
检测选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物的标记物；以及
基于所检测的选定标记物的存在、水平、分泌和分布中的一种或多种来治疗受试者。
本公开的某些实施方案提供分离或纯化的抗体，其被培育来针对包含下列中的一个或多个的氨基酸序列的多肽：ASNDHDAAINRYSRLSKKRENDKVKYEVTEDVYT(SEDIDNO.1)、DEVASDPLYVPDPDPTKFPVNRNLTRKAGYLNARNKT(SEQIDNO.2)、SEGQFVVLSSSQSEESDLGEGGKKRESEA(SEQIDNO.3)、任何上述氨基酸序列的抗原片段和/或任何上述氨基酸序列的变体或其抗原片段。
本公开的某些实施方案提供分离和/或纯化的抗体，其结合至包含下列中的一个或多个的人类APPL1蛋白中的氨基酸序列中的表位：ASNDHDAAINRYSRLSKKRENDKVKYEVTEDVYT(SEDIDNO.1)、DEVASDPLYVPDPDPTKFPVNRNLTRKAGYLNARNKT(SEQIDNO.2)、SEGQFVVLSSSQSEESDLGEGGKKRESEA(SEQIDNO.3)和/或该蛋白的同源物、直系同源物或旁系同源物的等效区域。
本公开的某些实施方案提供分离和/或纯化的抗体，其被培育来针对包含下列中的一个或多个的氨基酸序列的多肽：PNTFKTLDSWRDEFLIQASPRDPENFPFVVLGNKI(SEDIDNO.4)、DPENFPFVVLGNKIDLENRQVATKRAQAWCYSKNN(SEQIDNO.5)、ALKQETEVELYNEFPEPIKLDKNDRAKASAESCSC(SEQIDNO.6)、任何上述氨基酸序列的抗原片段和/或任何上述氨基酸序列的变体或其抗原片段。
本公开的某些实施方案提供分离和/或纯化的抗体，其结合至包含下列中的一个或多个的人类RAB7蛋白中的氨基酸序列中的表位：PNTFKTLDSWRDEFLIQASPRDPENFPFVVLGNKI(SEDIDNO.4)、DPENFPFVVLGNKIDLENRQVATKRAQAWCYSKNN(SEQIDNO.5)、ALKQETEVELYNEFPEPIKLDKNDRAKASAESCSC(SEQIDNO.6)和/或该蛋白的同源物、直系同源物或旁系同源物的等效区域。
本公开的某些实施方案提供检测APPL1蛋白或其片段的方法，所述方法包括使用如本文所描述的APPL1抗体。
本公开的某些实施方案提供检测RAB7蛋白或其片段的方法，所述方法包括使用如本文所描述的RAB7抗体。
本公开的某些实施方案提供检测受试者中的***癌的方法，所述方法包括使用如本文所描述的APPL1抗体和/或RAB7抗体。
本公开的某些实施方案提供鉴别用于***癌的诊断和/或预后的选定标记物的方法，所述方法包括：
鉴别选自内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物的标记物；以及
测定选定标记物用于***癌的诊断和/或预后的能力；
由此鉴别该标记物作为用于***癌诊断和/或预后的选定标记物。
本文公开了其它实施方案。
附图简述
通过以下图式来说明某些实施方案。应该理解，以下描述仅用于描述特定实施方案的目的且无意限制描述内容。
图1示出了对照和***癌细胞系中的内体和溶酶体基因表达的定量。在三次重复实验中通过qPCR评价非恶性对照细胞系(白条)和***癌细胞系(黑条)中的mRNA转录物的水平。数据是相对于GAPDH内源性对照而表示且通过Kruskal-Wallis秩和方法加以分析。统计显著性(p<0.05)由星号表示。
图2示出了非恶性对照和***癌细胞系的细胞内溶酶体蛋白的检测和定量。(A)来自非恶性对照细胞系PNT1a和PNT2以及癌细胞系22RV1和LNCaP的10μg全细胞裂解物的蛋白质印迹(Westernblot)分析的代表性图像(重复检查三次)。(B)通过密度测定术相对于GAPDH内源性对照来量化蛋白量。通过Kruskal-Wallis秩和方法分析数据，且统计显著性(p<0.05)由星号表示。
图3示出了共焦显微照片，其示出了***癌细胞系中的内体标记物的定位相较于非恶性对照细胞系的改变。探测固定细胞中的内体标记物(绿色)并用DAPI核染剂(蓝色)对比染色并通过激光扫描共焦显微术可视化。捕获透射光照明用于细胞轮廓(白色)的可视化。所有图像中的比例尺代表10μm。
图4示出了***细胞系中的阳性囊泡的共焦显微照片。非恶性对照***细胞系PNT1a和PNT2以及***癌细胞系22RV1和LNCaP被(绿色)染色。通过TPMT和由白色虚线所描绘的膜使细胞轮廓可视化。所有图像中的比例尺代表10μm。
图5示出了***细胞系中的转铁蛋白摄取的时间进程。共焦显微照片示出了相较于非恶性对照细胞系转铁蛋白在***癌细胞系中的摄取增加且分布改变；以及改变的肌动蛋白染色。用转铁蛋白Alexa633缀合物(红色)孵育细胞培养物达5、15和30分钟的时间，然后进行细胞固定并用鬼笔环肽Alexa488(绿色)标记肌动蛋白。比例尺代表10μm。
图6示出了转铁蛋白和内体/溶酶体标记物共荧光。共焦显微照片示出了非恶性对照细胞系PNT1a和PNT2以及***癌细胞系22RV1和LNCaP中的转铁蛋白(红色)和内体/溶酶体标记物(绿色)。共定位由黄色荧光表示。
图7示出了转铁蛋白受体表达和利用转铁蛋白的细胞定位的分析。(A)转铁蛋白受体1(TFR1)和转铁蛋白受体2(TFR2)的蛋白量和基因表达的蛋白质印迹分析和定量。蛋白质和基因表达的定量是分别相对于GAPDH蛋白和基因。星号表示p<0.05。(B)示出了非恶性对照细胞系PNT1a和PNT2以及***癌细胞系22RV1和LNCaP中的转铁蛋白(红色)和转铁蛋白受体(绿色)的共焦显微照片和放大。转铁蛋白受体和转铁蛋白的共定位由黄色荧光表示。
图8示出了在转铁蛋白处理前后的非恶性对照和癌细胞系中的AKT磷酸化水平。
图9示出了从不同情况中分离的***组织中的LAMP-1和APPL1表达。匹配的人类非恶性(A、D)和肿瘤(B、E)***组织中的LAMP-1和APPL1表达。使非恶性和恶性组织二者中的LAMP-1(C)和APPL1(F)染色。D和F中的箭头显示APPL1使非恶性***组织中的基底膜染色。比例尺＝100μM(A、B和D)和200μM(C、E、F)。
图10示出了非恶性和***癌细胞系中的已知***癌生物标记物的检测和定量。来自非恶性对照细胞系RWPE1、PNT1a和PNT2以及***癌细胞系22RV1、CaHPV10、DU145和LNCaP的细胞提取物(A；50μg全细胞裂解物)和培养基(B；在孵育汇合细胞48小时后收集的3mL培养物)中的生物标记物/GAPDH的蛋白质印迹。蛋白质印迹是三次重复的代表。通过密度测定术从蛋白质印迹中量化每个细胞内(C)或分泌性(D)蛋白相对于GAPDH(内源性对照)的量。非恶性细胞系由白条描绘，以及***癌细胞系由黑条描绘，且结果代表平均值±SE(n＝3)。
图11示出了非恶性和***癌细胞系中的溶酶体蛋白的检测。来自非恶性对照细胞系RWPE1、PNT1a和PNT2以及***癌细胞系22RV1、CaHPV10、DU145和LNCaP的细胞提取物(A；50μg全细胞裂解物)和培养基(B；在孵育汇合细胞48小时后收集的3mL培养基)中的溶酶体蛋白/GAPDH的蛋白质印迹。蛋白质印迹代表了三次重复实验。
图12示出了非恶性和***癌细胞系中的溶酶体蛋白的定量。通过密度测定术从蛋白质印迹(图12.2)中量化每个细胞内(A)或分泌性(B)溶酶体蛋白相对于GAPDH(内源性对照)的量。非恶性细胞系由白条描绘，以及***癌细胞系由黑条描绘，且结果代表平均值±SE(n＝3)。
图13示出了***癌中的LIMP2和LAMP1基因表达独立于TFEB表达而改变。量化源于150个原发性***癌和29个非恶性组织的AffymetrixHumanExon1.0ST阵列{Taylor,2010#976}的表达概况数据以显示TFEB、LIMP2和LAMP1的基因表达的变化百分比。用Tukey离群值(黑点)绘制盒须图。统计显著性由星号表示(**P≤0.01；****P≤0.0001)。
图14示出了在***癌中具有可变表达的受TFEB调节的溶酶体基因；在***癌中，组织蛋白酶B具有显著降低的表达，而α葡糖苷酶具有增加的表达。量化源于150个原发性***癌和29个非恶性组织的AffymetrixHumanExon1.0ST阵列{Taylor,2010#976}的表达概况数据以显示溶酶体相关基因的表达的变化百分比。盒须图绘制有Tukey离群值(黑点)。统计显著性由星号表示(*P≤0.05；****P≤0.0001)。
图15示出了APPL1基因表达在***癌中显著增加，而其它内体相关标记物显示可变表达。量化源于150个原发性***癌和29个非恶性组织的AffymetrixHumanExon1.0ST阵列{Taylor,2010#976}的表达概况数据以显示内体相关基因的表达的变化百分比。盒须图绘制有Tukey离群值(黑点)。统计显著性由星号表示(*P≤0.05)。
图16示出了来自Tomlins等人的组群的溶酶体基因表达数据，其反映了来自Taylor组群的发现。***癌组织的详细分析揭示在***癌进展期间改变的内体基因表达。量化源于27个非恶性组织、13个***上皮内瘤、32个原发性***癌和22转移性癌组织样品的ChinnaiyanHuman20KHs6阵列{Tomlins,2007#974}的表达概况数据以显示溶酶体相关基因的表达的相对量。统计显著性由星号表示(*P≤0.05；**P≤0.01；***P≤0.001)。
图17示出了Tomlins组群中的内体基因的表达显著增加，而转移性***癌组织显示可变的内体基因表达。量化源于27个非恶性组织、13个***上皮内瘤、32个原发性***癌和22转移性癌组织样品的ChinnaiyanHuman20KHs6阵列{Tomlins,2007#974}的表达概况数据以显示内体基因表达的相对量。统计显著性由星号表示(*P≤0.05；**P≤0.01；***P≤0.001)。
图18示出了溶酶体基因的Kaplan-Meier分析且揭示cathepsinB作为基于BCR的患者分层的候选基因。组织蛋白酶B基于基因表达量区别有复发风险的患者。先前已经被观察到在原发性癌中显著改变的溶酶体基因表达显示在高风险与低风险患者之间具有差异的趋势，但是不显著。来自Glinsky组群{Glinsky,2004#979}的患者基于基因表达水平(高-黑线，低-灰线)通过K均值聚类法被分层至两个组中。使用Gehan-Breslow-Wilcoxon检验进行统计分析。
图19示出了内体基因表达未将患者分层至显著预后组中。基于APPL1、APPL2、RAB5A、EEA1、RAB4A和RAB7A基因表达的量(高-黑线，低-灰线)，通过K均值聚类法将Glinsky组群中的患者分层至两个组中。使用Gehan-Breslow-Wilcoxon检验进行分析；且在表达组之间没有观察到统计显著性。
图20示出了溶酶体基因表达的Kaplan-Meier分析显示基于组织蛋白酶B和α半乳糖苷酶A表达在表达低PSA蛋白的患者中具有显著的预后能力。(A)使用7.8ng/mL的术前PSA水平作为用于将患者分层至不良预后和良好预后子组中的截止区别水平。(B)从PSA≤7.8ng/mL的良好预后子组，基于LIMP2、LAMP1、组织蛋白酶B或α半乳糖苷酶A的基因表达(高表达-黑线，低表达-灰线)通过K均值聚类法将患者进一步分层至两个组中。使用Gehan-Breslow-Wilcoxon检验进行统计分析。统计显著性由星号标记(*P≤0.05；**P≤0.01)。(C)***癌复发中的基因表达的多变量分析。BCR：生化复发；G-B-W：Gehan-Breslow-Wilcoxon检验；HR：危险比；CI：置信区间。
图21示出了RAB5A、APPL1和EEA1的组合基因标签可以基于BCR将低PSA表达患者分层至预后子组中。(A)基于RAB5A、APPL1和EEA1基因表达通过K均值聚类法将来自Glinsky组群的表达PSA≤7.8mg/mL的患者分层至多个组中；RAB5A、APPL1和EEA1的三基因组合标签基于BCR使患者分层(P≤0.0221，Gehan-Breslow-Wilcoxon检验；高表达-黑线，低表达-灰线)。(B)***癌复发中的基因表达的多变量分析。BCR：生化复发；G-B-W：Gehan-Breslow-Wilcoxon检验；HR：危险比；CI：置信区间。
图22示出了从非恶性对照和***癌细胞系分泌的内体相关蛋白的检测和定量。(A)从非恶性对照细胞系PNT1a和PNT2以及***癌细胞系22RV1和LNCaP分泌的蛋白的代表性蛋白质印迹。(B)通过密度测定术从一式三份的蛋白质印迹量化非恶性对照细胞(白条)和***癌细胞(黑条)中的每个蛋白质的量；且显著差异由星号表示(*P≤0.05；**p≤0.01)。
图23示出了兔抗Appl1多克隆抗体对Appl1重组蛋白的亲和力(A组)和兔抗Rab7多克隆抗体对Rab7重组蛋白的亲和力(B组)。
图24在A组中示出了铕标记兔抗Rab7多克隆抗体(针对表位#1培育)的标准曲线，且B组示出了铕标记兔抗Appl1多克隆抗体(针对表位#3培育)的标准曲线。
图25示出了来自Tomlins等人的组群的内体-溶酶体基因表达数据的垂直散点图。
图26示出了内体/溶酶体相关基因的Kaplan-Meier分析和基于生化复发(BCR)的患者分层。
图27示出了表达≤7.8ng/mLPSA的癌症患者中的内体-溶酶体基因表达的Kaplan-Meier存活和多变量分析。
图28示出了(A)示出了突触融合蛋白(Syntaxin)7和突触融合蛋白12的基因表达的变化百分比的盒须图；(B)来自Tomlins等人的组群的基因表达数据的垂直散点图。
图29示出了突触融合蛋白7和突触融合蛋白12基因表达的Kaplan-Meier存活分析。
图30示出了细胞内的和分泌的内体相关蛋白的检测和定量。
图31示出了盒须图，其示出了FGF1的基因表达的变化百分比(Taylor组群)和Log2中值居中比(Grasso组群)；以及来自Tomlins等的组群的基因表达数据的垂直散点图。
图32示出了盒须图，其示出了FGF2的基因表达的变化百分比(Taylor组群)和Log2中值居中比(Grasso组群)；以及来自Tomlins等人的组群的基因表达数据的垂直散点图。
图33示出了盒须图，其示出了FGF3的基因表达的变化百分比(Taylor组群)和Log2中值居中比(Grasso组群)；以及来自Tomlins等人的组群的基因表达数据的垂直散点图。
图34示出了FGF1、FGF2和FGF3基因表达的Kaplan-Meier存活分析。
图35示出了FGF1、FGF2和FGF3基因表达的Kaplan-Meier存活分析。
图37示出了盒须图，其示出了FGFR1的基因表达的变化百分比(Taylor组群)和Log2中值居中比(Grasso组群)；以及来自Tomlins等人的组群的基因表达数据的垂直散点图。统计显著性由星号表示(****P≤0.0001；**P≤0.01)。
图38示出了盒须图，其示出了FGFR2的基因表达的变化百分比(Taylor组群)和Log2中值居中比(Grasso组群)；以及来自Tomlins等人的组群的基因表达数据的垂直散点图。统计显著性由星号表示(****P≤0.0001；***P≤0.001)。
图39示出了盒须图，其示出了FGFR3的基因表达的变化百分比(Taylor组群)和Log2中值居中比(Grasso组群)；以及来自Tomlins等人的组群的基因表达数据的垂直散点图。
图40示出了FGFR1、FGFR2和FGFR3基因表达的Kaplan-Meier存活分析。
图41示出了FGFR1、FGFR2和FGFR3基因表达的Kaplan-Meier存活分析。
图42示出了非恶性对照和***癌细胞系中的NOX2蛋白(65(56)和30kDa)的检测和定量。
图43示出了盒须图，其示出了NOX2的基因表达的变化百分比(Taylor组群)和Log2中值居中比(Grasso组群)；以及来自Tomlins等人的组群的基因表达数据的垂直散点图。统计显著性由星号表示(****P≤0.0001，**P≤0.01)。
图44示出了非恶性对照和***癌细胞系中的NOX4蛋白的检测和定量。
图45示出了盒须图，其示出了NOX4的基因表达的变化百分比(Taylor组群)和Log2中值居中比(Grasso组群)以及来自Tomlins等人的组群的基因表达数据的垂直散点图。统计显著性由星号表示(****P≤0.0001，**P≤0.01，*P≤0.05)。
图46示出了***组织中的APPL1、Rab7和LIMPII表达。
具体实施方式
本公开是基于特异性内体相关和/或溶酶体相关标记物可以用于***癌的诊断和/或预后的测定。
本公开的某些实施方案提供用于检测受试者中的***癌的方法。本公开的某些实施方案提供用于测定受试者中的***癌的进展的方法。本公开的某些实施方案提供基于使用选定标记物来治疗受试者中的***癌的方法。本文公开了其它实施方案。
某些公开的实施方案具有优点的一个或多个组合。例如，本文所公开的实施方案的一些优点包括下列中的一个或多个：鉴别用于***癌的诊断和/或预后两者的新型标记物；在一些情况下可用于***癌的诊断和预后的一种或多种标记物；可容易地在生物样品诸如组织或活检组织样品、血液或血浆中检测的一种或多种标记物；使用一种或多种基于蛋白的标记物；使用一种或多种基于核酸的标记物；可以结合其它类型的标记物使用的一种或多种标记物；使用易于进行样品的高通量分析的方法；使用有助于鉴别适于药理和/或手术干预以治疗***癌的受试者的方法；适用于试剂盒中的标记物；解决本领域中的一个或多个问题；提供本领域中的一个或多个优点；或提供有用的商业选择。本文公开了某些实施方案的其它优点。
如本文所描述，本公开是基于受试者中的特异性内体相关和/或溶酶体相关标记物可以用于检测***癌的测定。
此外，本公开的某些实施方案是至少部分基于以下认识：***癌细胞中发生早期和晚期内体的细胞生物学的独特变化。不受理论的约束，晚期内体通常通过其外膜的内陷形成腔内囊泡(即在晚期源于内体的内部形成小囊泡，又称作多泡体)。当晚期内体与细胞表面融合时，这些～100nm的内部小囊泡可以从正常细胞释放，将其内含物连同这些外来体囊泡一起从细胞释放。由于外来体的形成方式，其可以含有胞质蛋白以及内体囊泡机构。因此，在正常对照中，早期内体相关标记物因此可以从细胞中释放并在细胞外环境/循环中检测到。已经发现，早期内体相关标记物从***癌细胞中的释放在与对照细胞相比时存在特异性减少。更重要的是，已经发现：从***癌细胞释放与早期内体的不同群体的有关的囊泡机构，这表明早期内体可以能够在***癌细胞中形成腔内囊泡；早期内体与***癌细胞的质膜融合且优先释放源于这些早期内体的外来体囊泡；改变内体生物的过程以在早期而非晚期内体中形成腔内囊泡。这提供了***癌细胞中的早期和晚期内体两者的一组独特变化并且还在检测来自这些不同内体群体的生物标记物时提供比率基础，从而有效地鉴别在与对照细胞相比时***癌中的变化。
本公开的某些实施方案提供用于检测受试者中的***癌的方法和试剂盒。
本公开的某些实施方案提供检测受试者中的***癌的方法，所述方法包括检测标记物，该标记物选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
本公开的某些实施方案提供检测受试者中的***癌的方法，所述方法包括检测选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物的标记物，由此检测受试者中的***癌。
本公开的某些实施方案提供检测受试者中的***癌的方法，所述方法是通过检测选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物的标记物，由此基于如此检测的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物来检测***癌。
在某些实施方案中，所述***癌选自***上皮内瘤、原发性***癌和转移性***癌。预期了其它形式和/或等级的***癌。
就此而言，通常使用Gleason分级***来评价***癌。基于与肿瘤样本的各种特征有关的"Gleason"模式和分配给肿瘤样本的模式的后续等级的组合，将“得分”分配给***癌。2-4的Gleason得分被认为是低侵袭性癌症。5-6的得分被认为是中度侵袭性癌症。7的得分被认为是中间侵袭性的得分。8-10的得分被认为是高侵袭性癌症。在某些实施方案中，***癌是具有任何上述得分的Gleason得分的癌症。
***癌还可以用阶段来分类，这是癌症已经发展到何种程度的量度。在阶段1中，癌症较小且包含在***内。在阶段2中，癌症较大且可以位于***的两个分叶中，但仍局限于该器官。在阶段3中，癌症已经扩散到***外部，且可能已经侵入相邻的淋巴腺或精囊中。在阶段4中，癌症已经扩散到其它器官或骨中。在某些实施方案中，***癌是具有上述阶段中任一种的癌症。
应该了解，虽然就检测人类受试者中的***癌描述了本公开，但是本公开预期了检测动物受试者中的***癌，且因此还预期了本公开的兽医应用。
在某些实施方案中，受试者患有***癌。***癌的实例如本文所描述。
本公开的某些实施方案提供检测患有***癌的受试者的方法，所述方法包括检测标记物，该标记物选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
在某些实施方案中，受试者是患有***癌的可能性或风险有所增加的受试者。在某些实施方案中，受试者是易患***癌的受试者。在某些实施方案中，受试者是具有与***癌有关的一种或多种风险因素的受试者。在某些实施方案中，受试者是具有罹患***癌的未知可能性或风险的受试者。
在某些实施方案中，受试者是具有测量或已知的PSA水平的受试者。PSA水平的实例如本文所描述，例如，如本文的实施例8中所描述。在某些实施方案中，受试者是具有如图式和/或实施例中的一种或多种中所描述的一种或多种特征的受试者。
在某些实施方案中，受试者适于***癌治疗。
术语“相关标记物”是指富集于一种或多种特定组织、细胞、细胞器和/或细胞隔室中且本身可以单独使用或与其它标记物结合以助于鉴别组织、细胞、细胞器和/或细胞隔室的标记物。
在某些实施方案中，内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物包括下列中的一种或多种：早期内体标记物、晚期内体标记物、与内体生物发生有关的标记物、与内体运输有关的标记物和与内体再循环有关的标记物。预期了其它类型的内体标记物和溶酶体标记物。用于测定标记物是否为上述标记物之一的方法是本领域中已知的。
在某些实施方案中，本文所描述的选定标记物包括蛋白质、多肽；上述蛋白质或多肽的片段、衍生物或加工形式；核酸包括mRNA、微RNA、核RNA、rRNA或上述RNA的片段、加工形式或未加工形式；脂质、细胞表面标记物、受体或辅因子。预期了其它类型的标记物。
在某些实施方案中，所述选定标记物为蛋白标记物和/或其片段、抗原片段、衍生物或加工形式。用于检测蛋白的方法是本领域中已知的且实例也如本文所描述。
在某些实施方案中，所述选定标记物为RNA标记物(通常为mRNA)和/或其片段、衍生物或加工形式。用于检测mRNA的方法是本领域中已知的且实例也如本文所描述。
如本文所描述，在某些实施方案中，mRNA的检测可能需要生成与mRNA互补的cDNA链。
在某些实施方案中，所述选定标记物可以用作蛋白标记物。在某些实施方案中，所述选定标记物可以用作mRNA标记物。在某些实施方案中，所述选定标记物可以用作蛋白标记物和mRNA标记物。
在某些实施方案中，所述选定标记物包括下列中的一种或多种：组织蛋白酶B、CAPTHESIND、α-半乳糖苷酶、RAB7、LIMP-1、LIMP-2、TFR1、TFR2、STAMP2、SORT1(分拣蛋白)、APPL1、EEA-1、LAMP-1、RAB4、APPL2、RAB5、RAB11、MPR、PAP、肌动蛋白、M6PR、IGFR2、MYO1B、PDCD6IP、SDCBP、SDC1、STX7、STX12、FGF1、FGF2、FGF3、FGFR1、FGFR2、FGFR3、NOX2、NOX4和/或编码上述中之一的mRNA、上述中之一的片段、上述中之一的衍生物和上述中之一的加工形式。
在某些实施方案中，所述选定标记物包括如任何实施例和/或图式中所描述的一种或多种标记物。
本公开的某些实施方案提供检测受试者中的***癌的方法，该方法包括检测选自下列中的一种或多种的标记物：组织蛋白酶B、CAPTHESIND、α-半乳糖苷酶、RAB7、LIMP-1、LIMP-2、TFR1、TFR2、STAMP2、SORT1(分拣蛋白)、APPL1、EEA-1、LAMP-1、RAB4、APPL2、RAB5、RAB11、MPR、PAP、肌动蛋白、M6PR、IGFR2、MYO1B、PDCD6IP、SDCBP、SDC1、STX7、STX12、FGF1、FGF2、FGF3、FGFR1、FGFR2、FGFR3、NOX2、NOX4和/或编码上述中之一的mRNA、上述中之一的片段、上述中之一的衍生物和上述中之一的加工形式。
应该了解，本公开的选定标记物在本文中被称为选定标记物的人类形式。然而，应该了解，还预期了等效标记物的检测和/或使用。本领域技术人员可以容易地鉴别其它物种内的等效标记物。
用于检测标记物的方法是本领域中已知的。通常，在从受试者获取的样品或样品的加工形式中检测存在于受试者中的标记物。例如，用于检测蛋白和RNA的方法是已知的且通常可以使用市售产品来进行。一般方法(包括用于蛋白和RNA检测、提前和分离的方法)是已知的，如例如Ausubel等人，CurrentProtocolsofMolecularBiology,JohnWileyandSons(1997)中所描述，其全部内容在此通过引用并入。
用于检测蛋白标记物的方法是已知的且包括例如免疫检测方法，诸如免疫结合、免疫印迹(例如蛋白质印迹分析(Westernanalysis))、免疫沉淀、免疫电泳、免疫染色、免疫组织化学、分光光度法、酶分析、质谱法和显微术。预期了其它方法。
用于检测核酸的方法是已知的且包括微阵列分析、印迹法(北方、南方)、原位杂交、RT-PCR、终点茎环实时RT-PCR、miR-QRT-PCR、(A)尾通用逆转录、RNA扩增分析、基于克隆的方法、基于纳米颗粒的方法、夹板连接方法、锁式探针和滚环扩增、基于球珠的流式细胞术方法、生物发光RNA检测方法、分子信标方法、核糖酶方法和定量LNA-ELF-FISH方法。预期了其它方法。
在某些实施方案中，RNA标记物的检测包括逆转录。RNA的逆转录方法是本领域中已知的。在某些实施方案中，RNA标记物的检测包括核酸的扩增。核酸扩增方法是本领域中已知的。在某些实施方案中，RNA标记物的检测包括聚合酶链反应。在某些实施方案中，聚合酶链反应包括定量聚合酶链反应。
在某些实施方案中，RNA标记物的检测包括使核酸与一种或多种靶核酸结合或杂交。在某些实施方案中，RNA标记物的检测包括使核酸与结合至固体基质诸如芯片的一种或多种靶核酸结合。使核酸结合至靶核酸包括结合至固体基质的核酸的方法是已知的。
在某些实施方案中，选定标记物的检测包括聚合酶链反应。在某些实施方案中，聚合酶链反应包括定量聚合酶链反应。
在某些实施方案中，选定标记物的检测包括免疫检测。在某些实施方案中，免疫检测包括ELISA、用抗体染色、免疫组织化学和/或流式细胞术检测。涉及免疫检测的方法是本领域中已知的。
在某些实施方案中，本文所描述的方法包括检测选定标记物的存在、水平、表达、分泌和分布中的一种或多种。
在某些实施方案中，选定标记物的存在改变、水平改变、表达改变、分泌改变和分布改变中的一种或多种指示受试者中的***癌。
在某些实施方案中，内体相关标记物的水平升高和/或分泌增加指示受试者中的***癌。在某些实施方案中，内体相关标记物的水平降低和/或分泌减少指示受试者中的***癌。
在某些实施方案中，溶酶体相关标记物的水平升高和/或分泌增加指示受试者中的***癌。在某些实施方案中，溶酶体相关标记物的水平降低和/或分泌减少指示受试者中的***癌。
在某些实施方案中，蛋白标记物的水平升高和/或分泌增加指示受试者中的***癌。在某些实施方案中，蛋白标记物的水平降低和/或分泌减少指示受试者中的***癌。
在某些实施方案中，mRNA标记物的水平升高指示受试者中的***癌。在某些实施方案中，mRNA标记物的水平降低指示受试者中的***癌。
在某些实施方案中，早期内体标记物的水平升高和/或分泌增加指示受试者中的***癌。
在某些实施方案中，下列中的一种或多种指示受试者中的***癌：RAB5蛋白和/或mRNA的水平升高、RAB5蛋白的分泌增加、APPL1蛋白和/或mRNA的水平升高、APPL1蛋白的分泌增加、EEA1蛋白和/或mRNA的水平升高、EEA1蛋白的分泌增加、LIMP-2蛋白和/或mRNA的水平升高、TFR1蛋白和/或mRNA的水平升高、TFR2蛋白和/或mRNA的水平升高、RAB4蛋白和/或mRNA的水平升高、RAB4蛋白的分泌增加、APPL2蛋白和/或mRNA的水平升高、LAMP1蛋白和/或mRNA的水平降低、RAB11蛋白的分泌增加、RAB7蛋白的分泌减少、CAPTHESINB蛋白或mRNA的水平降低、CAPTHESIND蛋白或mRNA的水平降低、α-半乳糖苷酶蛋白或mRNA的水平升高、STX7蛋白或mRNA的水平降低、STX12蛋白或mRNA的水平降低、PDCD6IP蛋白的分泌增加、SDCBP蛋白的分泌减少、SORT1蛋白的分泌减少、FGF1蛋白或mRNA的水平降低、FGF2蛋白或mRNA的水平降低、FGF3蛋白或mRNA的水平升高、FGFR1蛋白或mRNA的水平降低、FGFR2蛋白或mRNA的水平降低、FGFR3蛋白或mRNA的水平升高、NOX2蛋白或mRNA的水平升高以及NOX4蛋白或mRNA的水平升高、APPL1蛋白的核和/或核仁水平升高、RAB7蛋白的核膜水平升高和LIMP2蛋白阳性囊泡的扩大。
在某些实施方案中，一种或多种标记物的改变的存在、改变的水平、改变的表达、改变的分泌和改变的分布是与非恶性组织、***上皮内瘤、原发性***癌和转移性***癌中的一种或多种相比。
在某些实施方案中，LIMP2蛋白或mRNA在***上皮内瘤中相较于非恶性***增加、LAMP1蛋白或mRNA在转移性***癌中相较于***上皮内瘤减少、LAMP1蛋白或mRNA在原发性***癌中相较于转移性***癌增加、CAPTHESINB蛋白或mRNA在原发性***癌中相较于非恶性组织减少、CAPTHESINB蛋白或mRNA在转移性***癌中相较于非恶性***减少、酸性神经酰胺酶蛋白或mRNA在***上皮内瘤中相较于非恶性***增加、酸性神经酰胺酶蛋白或mRNA在***上皮内瘤中相较于转移性***癌增加、酸性神经酰胺酶蛋白或mRNA在原发性***癌中相较于转移性***癌增加、APPL1蛋白或mRNA在原发性***癌中相较于非恶性组织增加、APPL2蛋白或mRNA在***上皮内瘤中相较于非恶性***增加、APPL2蛋白或mRNA在原发性***癌中相较于非恶性组织增加、APPL2蛋白或mRNA在***上皮内瘤中相较于转移性***癌增加、APPL2蛋白或mRNA在原发性***癌中相较于转移性***癌增加、RAB5蛋白或mRNA在转移性***癌中相较于非恶性***减少、EEA1蛋白或mRNA在转移性***癌中相较于非恶性***减少、EEA1蛋白或mRNA在***上皮内瘤中相较于转移性***癌减少、RAB4A蛋白或mRNA在转移性***癌中相较于非恶性***减少、RAB4A蛋白或mRNA在***上皮内瘤中相较于转移性***癌减少、RAB4A蛋白或mRNA在***上皮内瘤中相较于原发性***癌减少、RAB4A蛋白或mRNA在原发性***癌中相较于转移性***癌减少、MYO1B蛋白或mRNA在***上皮内瘤中相较于转移性***癌增加、MYO1B蛋白或mRNA在转移性***癌中相较于***上皮内瘤减少、MYO1B蛋白或mRNA在转移性***癌中相较于原发性***癌减少、PDCD6IP蛋白或mRNA在***上皮内瘤中相较于转移性***癌减少、PDCD6IP蛋白或mRNA在***上皮内瘤中相较于非恶性***减少、SDCBP蛋白或mRNA在转移性***癌中相较于原发性***癌减少、STX7蛋白或mRNA在转移性***癌中相较于原发性***癌减少、FGFR1蛋白或mRNA在转移性***癌中相较于***上皮内瘤增加、FGFR2蛋白或mRNA在原发性***癌中相较于非恶性组织减少、NOX2蛋白或mRNA在原发性***癌中相较于非恶性组织增加和NOX4蛋白或mRNA在转移性***癌中相较于***上皮内瘤增加。
在某些实施方案中，本文所描述的方法包括从受试者中获取生物样品。
在某些实施方案中，本文所描述的方法包括处理生物样品以允许检测选定标记物。在某些实施方案中，本文所描述的方法包括处理生物样品以允许检测本文所描述的标记物以及检测处理样品中的标记物。在某些实施方案中，本文所描述的方法包括从受试者获取生物样品和处理生物样品以允许检测选定标记物。
术语“生物样品”是指从受试者中获取的样品和/或其加工和/或处理形式。例如，生物样品可以是未处理的、稀释的、衍生物、提取物、处理形式、预洗涤的、过滤的、脱盐的、浓缩的、稀释的、缓冲的、离心的、诱导的、预处理的、被加工以去除样品中的一种或多种组分或杂质、切片的、固定的、附着于载玻片上或其合适的组合。在某些实施方案中，直接检测样品中的选定标记物。在某些实施方案中，在加工和/或处理后检测样品中的选定标记物。在某些实施方案中，在检测选定标记物前和/或在检测选定标记物的同时加工和/或处理样品。
生物样品的实例包括一种或多种生物流体，诸如血液、血浆、尿液、羊水、眼泪、唾液、毛发、皮肤和一种或多种组织样品或活检组织。预期了其它类型的生物样品。
在某些实施方案中，生物样品包括血液样品、血浆样品、血清样品、活检组织和***组织样品中的一种或多种。
在某些实施方案中，生物样品包括活检组织或组织样品。某些实施方案提供了检测选定标记物的原位水平。
在某些实施方案中，选定标记物包括一种或多种血液标记物、血浆标记物和/或血清标记物。某些实施方案提供了检测选定标记物的循环水平。
在某些实施方案中，所述检测包括定性测定。在某些实施方案中，所述检测包括定性测定选定标记物是否具有改变的存在、改变的水平、改变的表达、改变的分泌和改变的分布中的一种或多种。在某些实施方案中，所述检测包括定量测定选定标记物是否具有改变的存在、改变的水平、改变的表达、改变的分泌和改变的分布中的一种或多种。
在某些实施方案中，所述检测包括定性测定。在某些实施方案中，所述检测包括定性测定选定标记物是否存在。在某些实施方案中，所述检测包括定量评估选定标记物的水平。例如，某些方法允许量化选定标记物的浓度。用于计算或测定标记物浓度的方法是本领域中已知的。
本公开的某些实施方案包括检测两种或更多种选定标记物。本公开的某些实施方案包括检测三种或更多种选定标记物。本公开的某些实施方案包括检测四种或更多种选定标记物。
在某些实施方案中，本公开的方法包括检测选定标记物中的两种或更多种。在某些实施方案中，所述方法包括检测选定标记物中的三种或更多种。在某些实施方案中，所述方法包括检测选定标记物中的四种或更多种。
本公开的某些实施方案包括检测以下选定标记物中的两种或更多种：组织蛋白酶B、CAPTHESIND、α-半乳糖苷酶、RAB7、LIMP-1、LIMP-2、TFR1、TFR2、STAMP2、SORT1(分拣蛋白)、APPL1、EEA-1、LAMP-1、RAB4、APPL2、RAB5、RAB11、MPR、PAP、肌动蛋白、M6PR、IGFR2、MYO1B、PDCD6IP、SDCBP、SDC1、STX7、STX12、FGF1、FGF2、FGF3、FGFR1、FGFR2、FGFR3、NOX2、NOX4和/或编码上述中之一的mRNA、上述中之一的片段、上述中之一的衍生物和上述中之一的加工形式。
本公开的某些实施方案包括检测以下选定标记物中的三种或更多种：组织蛋白酶B、CAPTHESIND、α-半乳糖苷酶、RAB7、LIMP-1、LIMP-2、TFR1、TFR2、STAMP2、SORT1(分拣蛋白)、APPL1、EEA-1、LAMP-1、RAB4、APPL2、RAB5、RAB11、MPR、PAP、肌动蛋白、M6PR、IGFR2、MYO1B、PDCD6IP、SDCBP、SDC1、STX7、STX12、FGF1、FGF2、FGF3、FGFR1、FGFR2、FGFR3、NOX2、NOX4和/或编码上述中之一的mRNA、上述中之一的片段、上述中之一的衍生物和上述中之一的加工形式。
本公开的某些实施方案包括检测以下选定标记物中的四种或更多种：组织蛋白酶B、CAPTHESIND、α-半乳糖苷酶、RAB7、LIMP-1、LIMP-2、TFR1、TFR2、STAMP2、SORT1(分拣蛋白)、APPL1、EEA-1、LAMP-1、RAB4、APPL2、RAB5、RAB11、MPR、PAP、肌动蛋白、M6PR、IGFR2、MYO1B、PDCD6IP、SDCBP、SDC1、STX7、STX12、FGF1、FGF2、FGF3、FGFR1、FGFR2、FGFR3、NOX2、NOX4和/或编码上述中之一的mRNA、上述中之一的片段、上述中之一的衍生物和上述中之一的加工形式。
在某些实施方案中，本文所描述的方法包括测定一种选定标记物与另一种选定标记物的水平的比率。
在某些实施方案中，改变的比率指示受试者中的***癌。在某些实施方案中，与非恶性组织相比改变的比率指示受试者中的***癌。不同类型的***组织间的其它形式的比较如本文所描述。
在某些实施方案中，早期内体标记物对晚期内体标记物的比率的增加指示受试者中的***癌。在某些实施方案中，与非恶性组织相比早期内体标记物对晚期内体标记物的比率的增加指示受试者中的***癌。
在某些实施方案中，本公开的方法包括检测除选定标记物之外的一种或多种其它标记物。
在某些实施方案中，本公开的方法提供如本文所描述的一种或多种标记物、对照标记物和/或参照标记物的用途。
标记物的存在、水平、表达、分泌和分布的改变通常是相对于一种或多种相应的标记物的水平，例如一种或多种对照受试者和/或已知具有***癌的一种或多种受试者中的一种或多种相应的蛋白质或mRNA。
在某些实施方案中，本文所描述的方法包括将选定标记物的存在、水平、表达、分泌和分布与已知用于指示受试者中***癌和/或已知用于指示不存在癌症的一种或多种其它标记物进行比较。
在某些实施方案中，本文所描述的方法包括将选定标记物的存在、水平、表达、分泌和分布与一种或多种参照和/或对照标记物进行比较。
在某些实施方案中，本文所描述的方法包括将选定标记物的存在和/或水平和与改变的***癌风险有关的一种或多种其它标记物和/或已知用于指示受试者中***癌的存在或不存在的一种或多种其它标记物的存在和/或水平进行比较。
在某些实施方案中，所述参照标记物包括内源性标记物。在某些实施方案中，所述参照标记物包括外源性标记物。例如，样品可以掺入外源性参照标记物。
在某些实施方案中，一种或多种其它标记物包括***特异性抗原(PSA)。
在某些实施方案中，本公开的方法包括处理生物样品以允许检测选定标记物。在某些实施方案中，本公开的方法包括处理获自受试者的生物样品以允许检测选定标记物。受试者如本文所描述。
在某些实施方案中，本文所描述的方法和试剂盒包括使用一种或多种试剂来处理用于分析的样品。
在某些实施方案中，本文所描述的方法进一步包括获取与受试者的一种或多种临床特征有关的信息以及使用结合选定标记物的存在、水平、分泌和分布中的一种或多种信息检测受试者中的***癌。在某些实施方案中，所述一种或多种临床特征包括年龄、体质指数、吸烟、遗传和癌症和/或***癌的家族史中的一种或多种。
在某些实施方案中，本文所描述的方法进一步包括获取与受试者的一种或多种临床特征有关的信息以及使用结合选定标记物的存在、水平、表达、分泌和分布中的一种或多种信息检测受试者中的***癌或***癌的不存在。
在某些实施方案中，本文所描述的方法包括使用计算机处理器装置来处理与选定标记物的存在、水平、分泌和分布中的一种或多种有关的数据，从而生成受试者中存在***癌的可能性和/或风险。计算机处理器装置的实例是已知的。
在某些实施方案中，所述方法具有0.60或更高的检测灵敏度。在某些实施方案中，所述方法具有0.70或更高的检测灵敏度。在某些实施方案中，所述方法具有0.80或更高的检测灵敏度。在某些实施方案中，所述方法具有0.90或更高的检测灵敏度。在某些实施方案中，所述方法具有0.95或更高的检测灵敏度。
在某些实施方案中，所述方法具有0.60或更高的检测特异性。在某些实施方案中，所述方法具有0.70或更高的检测特异性。在某些实施方案中，所述方法具有0.80或更高的检测特异性。在某些实施方案中，所述方法具有0.90或更高的检测特异性。在某些实施方案中，所述方法具有0.95或更高的检测特异性。
在某些实施方案中，本文所描述的方法被用于诊断受试者中的***癌、筛查受试者中的***癌、评估预后、测定***癌的转移潜能、鉴别患有***癌的受试者、鉴别易患***癌的受试者、测定受试者中的***癌的复发率、测定受试者中的***癌的死亡风险、将***癌分层、辨别受试者中的***癌与未患有***癌、测定***癌是否为器官局限性癌症、辨别***癌与良性***增生、***炎和***的炎性病状中的一种或多种、测定致病进展、评估***癌是缓慢生长性、顽固性还是侵袭性、排除受试者中的***癌的存在、鉴别适于针对***癌的治疗和/或手术的受试者以及测定受试者具有***癌的可能性或风险。
本公开的某些实施方案提供检测受试者中的***癌的方法，所述方法包括：
从受试者获取生物样品；
处理该样品以允许检测选自内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物的标记物；
检测处理样品中的选定标记物的改变的存在、水平、表达、分泌和分布中的一种或多种；以及
鉴别受试者中的***癌。
本公开的某些实施方案提供检测受试者中的***癌的方法，所述方法包括：
从受试者获取生物样品；
处理样品以允许检测样品中的标记物；
检测下列中的一种或多种：组织蛋白酶B、CAPTHESIND、α-半乳糖苷酶、RAB7、LIMP-1、LIMP-2、TFR1、TFR2、STAMP2、SORT1(分拣蛋白)、APPL1、EEA-1、LAMP-1、RAB4、APPL2、RAB5、RAB11、MPR、PAP、肌动蛋白、M6PR、IGFR2、MYO1B、PDCD6IP、SDCBP、SDC1、STX7、STX12、FGF1、FGF2、FGF3、FGFR1、FGFR2、FGFR3、NOX2、NOX4和/或编码上述中之一的mRNA、上述中之一的片段、上述中之一的衍生物和上述中之一的加工形式，用于发现处理样品中的选定标记物的改变的存在、水平、表达、分泌和分布；以及
鉴别受试者中的***癌。
本公开的某些实施方案提供参照任何随附实施例和/或附图大体上如本文所描述检测受试者中的***癌的方法。
本公开的某些实施方案提供用于鉴别患有或易患***癌的受试者的方法或试剂盒。
本公开的某些实施方案提供鉴别患有或易患***癌的受试者的方法，所述方法包括检测标记物，该标记物选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
本公开的某些实施方案提供鉴别患有或易患***癌的受试者的方法，所述方法包括检测选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物的标记物，其中选定标记物的改变的存在、水平、表达、分泌和分布中的一种或多种指示受试者患有或易患***癌。
本公开的某些实施方案提供鉴别患有或易患***癌的受试者的方法，所述方法包括参照任何实施例和/或附图如上文所描述检测来自受试者的标记物。
本公开的某些实施方案提供用于筛查受试者中的***癌的方法或试剂盒。
本公开的某些实施方案提供筛查受试者中的***癌的方法，所述方法包括检测标记物，该标记物选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
在某些实施方案中，所述方法被用于鉴别患有或易患***癌的受试者。
在某些实施方案中，所述方法被用于排除未患有或不易患***癌的受试者。
本公开的某些实施方案提供筛查受试者中的***癌的方法，所述方法包括检测选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物的标记物，其中选定标记物的改变的存在、水平、表达、分泌和分布中的一种或多种指示受试者中的***癌。
本公开的某些实施方案提供筛查受试者中的***癌的方法，所述方法包括参照任何实施例和/或附图按上文所描述检测来自受试者的标记物。
本公开的某些实施方案提供用于诊断受试者中的***癌的方法或试剂盒。
本公开的某些实施方案提供用于检测受试者中的***癌的诊断方法，所述方法包括检测标记物，该标记物选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
本公开的某些实施方案提供用于测定受试者患有或易患***癌的可能性和/或风险的方法或试剂盒。
本公开的某些实施方案提供测定受试者患有或易患***癌的可能性和/或风险的方法，所述方法包括检测标记物，该标记物选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
本公开的某些实施方案提供用于测定受试者中的***癌的进展的方法或试剂盒。
本公开的某些实施方案提供测定受试者中的***癌的进展的方法，所述方法包括检测标记物，该标记物选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
在某些实施方案中，所述方法包括测定癌症的生化复发、复发率和/或存活率。
在某些实施方案中，标记物的水平指示降低的复发率和/或增加的存活率。在某些实施方案中，所述标记物包括下列中的一种或多种：LIMP2、组织蛋白酶B、CAPTHESIND、α-半乳糖苷酶、RAB5A、EEA1、RAB7A、M6PR、IGFR2、SORT1、MYO1B、PDCD6IP、SDC1、STX12、FGF2、FGF3和/或编码上述中之一的mRNA、上述中之一的片段、上述中之一的衍生物和上述中之一的加工形式。
在某些实施方案中，所述标记物包括下列中的一种或多种：减少或更低的LIMP2、增加或更高的组织蛋白酶B、增加或更高的CAPTHESIND、增加或更高的α-半乳糖苷酶、减少或更低的RAB5A、减少或更低的EEA1、增加或更高的RAB7A、增加或更高的M6PR、减少或更低的IGFR2、减少或更低的SORT1、减少或更低的MYO1B、增加或更高的PDCD6IP、增加或更高的STX12、增加或更高的FGF2、增加或更高的FGF3和/或编码上述中之一的mRNA、上述中之一的片段、上述中之一的衍生物和上述中之一的加工形式。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括鉴别受试者中的PSA表达水平和基于受试者中的PSA表达水平将标记物的表达分层。PSA水平如本文所描述。
在某些实施方案中，PSA为指示***癌的低风险的水平。在某些实施方案中，PSA水平小于10ng/ml。
在某些实施方案中，PSA为7.8ng/ml或更小的水平。在某些实施方案中，所述标记物包括下列中的一种或多种：LIMP2、组织蛋白酶B、α-半乳糖苷酶、RAB5A、EEA1、M6PR、IGFR2、SORT1、MYO1B、PDCD6IP、SDC1、STX12、FGF2、FGF3和/或编码上述中之一的mRNA、上述中之一的片段、上述中之一的衍生物和上述中之一的加工形式。
在某些实施方案中，所述标记物包括下列中的一种或多种：减少或更低的LIMP2、增加或更高的组织蛋白酶B、增加或更高的α-半乳糖苷酶、减少或更低的RAB5A、减少或更低的EEA1、增加或更高的M6PR、减少或更低的IGFR2、减少或更低的SORT1、减少或更低的MYO1B、增加或更高的PDCD6IP、增加或更高的SDC1、增加或更高的STX12、增加或更高的FGF2、增加或更高的FGF3和/或编码上述中之一的mRNA、上述中之一的片段、上述中之一的衍生物和上述中之一的加工形式。
在某些实施方案中，标记物的水平指示增加的复发率和/或降低的存活率。在某些实施方案中，所述标记物包括下列中的一种或多种：LIMP2、组织蛋白酶B、CAPTHESIND、α-半乳糖苷酶、RAB5A、EEA1、RAB7A、M6PR、IGFR2、SORT1、MYO1B、PDCD6IP、SDC1、STX12、FGF2、FGF3和/或编码上述中之一的mRNA、上述中之一的片段、上述中之一的衍生物和上述中之一的加工形式。
在某些实施方案中，所述标记物包括下列中的一种或多种：增加或更高的LIMP2、减少或更低的组织蛋白酶B、减少或更低的CAPTHESIND、减少或更低的α-半乳糖苷酶、增加或更高的RAB5A、增加或更高的EEA1、减少或更低的RAB7A、减少或更低的M6PR、增加或更高的IGFR2、增加或更高的SORT1、增加或更高的MYO1B、减少或更低的PDCD6IP、减少或更低的STX12、减少或更低的FGF2、减少或更低的FGF3和/或编码上述中之一的mRNA、上述中之一的片段、上述中之一的衍生物和上述中之一的加工形式。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括鉴别受试者中的PSA表达水平和基于受试者中的PSA表达水平将标记物的表达分层。在某些实施方案中，PSA为指示***癌的低风险的水平。在某些实施方案中，PSA水平小于10ng/ml。在某些实施方案中，PSA为7.8ng/ml或更小的水平。
在某些实施方案中，所述标记物包括下列中的一种或多种：LIMP2、组织蛋白酶B、α-半乳糖苷酶、RAB5A、EEA1、M6PR、IGFR2、SORT1、MYO1B、PDCD6IP、SDC1、STX12、FGF2、FGF3和/或编码上述中之一的mRNA、上述中之一的片段、上述中之一的衍生物和上述中之一的加工形式。
在某些实施方案中，所述标记物包括下列中的一种或多种：增加或更高的LIMP2、减少或更低的组织蛋白酶B、减少或更低的α-半乳糖苷酶、增加或更高的RAB5A、增加或更高的EEA1、减少或更低的M6PR、增加或更高的IGFR2、增加或更高的SORT1、增加或更高的MYO1B、减少或更低的PDCD6IP、减少或更低的SDC1、减少或更低的STX12、减少或更低的FGF2、减少或更低的FGF3和/或编码上述中之一的mRNA、上述中之一的片段、上述中之一的衍生物和上述中之一的加工形式。
本公开的某些实施方案提供用于进行如本文所描述的方法的试剂盒。所述试剂盒可以包括如本文所描述的一种或多种组分、试剂和/或说明书。
在某些实施方案中，所述试剂盒包括用于测定选定标记物的存在、水平、表达、分泌和分布的一种或多种试剂和/或说明书。
本公开的某些实施方案提供治疗***癌的方法。
术语“治疗”和相关术语诸如“治疗(treatment)”和“治疗(treat)”是指在改善受试者的病状，减轻、阻止、抑制、缓解和/或减缓受试者中的一种或多种症状的进展，受试者的部分或完全稳定，一种或多种症状的消退或治愈受试者中的疾病、病状或病情方面获得所需效果。
本公开的某些实施方案提供治疗受试者中的***癌的方法，所述方法包括：
检测选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物的标记物；以及
基于所检测的选定标记物的存在、水平、分泌和分布中的一种或多种来治疗受试者。
本公开的某些实施方案提供治疗受试者中的***癌的方法，所述方法包括：
检测如本文所描述的标记物；以及
基于如此检测的标记物的存在、水平、分泌和分布中的一种或多种来治疗受试者。
在某些实施方案中，所述治疗包括手术干预、放射治疗和施用治疗剂中的一种或多种。
本公开的某些实施方案提供基于如本文所描述的所检测的选定标记物的存在、水平、表达、分泌和分布中的一种或多种通过对受试者的手术干预来治疗***癌的方法。***癌的手术干预的方法是本领域中已知的。
本公开的某些实施方案提供基于如本文所描述的所检测的选定标记物的存在、水平、表达、分泌和分布中的一种或多种通过向受试者施用有效量的治疗剂来治疗***癌的方法。***癌的药理干预的方法是本领域中已知的。
本公开的某些实施方案提供基于如本文所描述的所检测的选定标记物的存在、水平、表达、分泌和分布中的一种或多种通过放射治疗来治疗***癌的方法。***癌的放射治疗的方法是本领域中已知的。
在某些实施方案中，如本文所描述，当选定标记物的存在、水平、表达、分泌和分布存在中的一种或多种指示***癌的存在和/或***癌的可能性或风险增加时，进行治疗。
在某些实施方案中，选定标记物的改变的存在、水平、表达、分泌和分布水平中的一种或多种指示受试者适于治疗。所述存在、水平、表达、分泌和分布的改变如本文所描述。
在某些实施方案中，选定标记物的水平升高指示受试者适于治疗。在某些实施方案中，选定标记物的水平降低指示受试者适于治疗。在某些实施方案中，选定标记物的下调指示受试者适于治疗。在某些实施方案中，选定标记物的上调指示受试者适于治疗。在某些实施方案中，一种选定标记物的下调和/或另一种选定标记物的上调指示受试者适于治疗。
如本文所描述，本公开的某些实施方案提供用于以下各项的方法：诊断受试者中的***癌、筛查受试者中的***癌、评估预后、测定***癌的转移潜能、鉴别患有***癌的受试者、鉴别易患***癌的受试者、测定受试者中的***癌的复发率、测定受试者中的***癌的死亡风险、将***癌分层、辨别受试者中的***癌与未患有***癌、测定***癌是否为器官局限性癌症、辨别***癌与良性***增生、***炎和***的炎性病状中的一种或多种、测定致病进展、评估***癌是缓慢生长性、顽固性还是侵袭性、排除受试者中的***癌的存在、鉴别适于针对***癌的治疗和/或手术的受试者以及测定受试者具有***癌的可能性或风险。内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物如本文所描述。检测标记物的方法如本文所描述。
本公开的某些实施方案提供用于评估易患或患有***癌的受试者的预后的方法或试剂盒，所述方法包括检测标记物，该标记物选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
本公开的某些实施方案提供用于测定受试者中的***癌的转移潜能的方法或试剂盒，所述方法包括检测标记物，该标记物选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
本公开的某些实施方案提供用于测定受试者中的***癌的复发率的方法或试剂盒，所述方法包括检测标记物，该标记物选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
本公开的某些实施方案提供用于测定受试者中的***癌的死亡风险的方法或试剂盒，所述方法包括检测标记物，该标记物选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
本公开的某些实施方案提供用于将受试者中的***癌分层的方法或试剂盒，所述方法包括检测标记物，该标记物选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
本公开的某些实施方案提供用于辨别具有***癌和不具有***癌的受试者的方法或试剂盒，所述方法包括检测标记物，该标记物选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
本公开的某些实施方案提供用于测定***癌是否为受试者中的器官局限性癌症的方法或试剂盒，所述方法包括检测标记物，该标记物选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
本公开的某些实施方案提供用于辨别受试者中的***癌与良性***增生、***炎和***的炎性病状中的一种或多种的方法或试剂盒，所述方法包括检测标记物，该标记物选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
本公开的某些实施方案提供用于测定受试者中的***癌的致病进展的方法或试剂盒，所述方法包括检测标记物，该标记物选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
本公开的某些实施方案提供用于评估受试者中的***癌是缓慢生长性、顽固性还是侵袭性的方法或试剂盒，所述方法包括检测标记物，该标记物选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
本公开的某些实施方案提供用于排除受试者中的***癌的存在的方法或试剂盒，所述方法包括检测标记物，该标记物选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
本公开的某些实施方案提供用于鉴别适于针对***癌的治疗和/或手术的方法或试剂盒，所述方法包括检测标记物，该标记物选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
本公开的某些实施方案提供用于测定受试者具有***癌的可能性或风险的方法或试剂盒，所述方法包括检测标记物，该标记物选自受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
本公开的某些实施方案提供鉴别用于***癌的诊断和/或预后的选定标记物的方法或试剂盒。本公开的某些实施方案提供筛选用于***癌的诊断和/或预后的选定标记物的方法。
用于鉴别和/或筛选标记物的方法如本文所描述。
本公开的某些实施方案提供鉴别用于***癌的诊断和/或预后的选定标记物，所述方法包括：
鉴别选自内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物的标记物；以及
测定选定标记物用于***癌的诊断和/或预后的能力；
由此鉴别该标记物作为用于***癌诊断和/或预后的选定标记物。
本公开的某些实施方案提供根据本文所描述的方法鉴别的用于***癌的诊断和/或预后的标记物。
本公开的某些实施方案提供分离和/或纯化的抗体和/或其抗原结合片段。抗体和其片段如本文所描述。抗体和其抗原结合片段可以用于例如检测***癌，诸如用于本文所描述的试剂盒中。
术语“抗体”应该被理解为意指能够与另一种分子的抗原区域结合的免疫球蛋白分子，且包括单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、嵌合抗体、多特异性抗体、双抗体和免疫球蛋白分子的片段或其组合，所述片段或组合能够以所需亲和力结合至另一个分子的抗原区域，包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、单链抗体(scFv)或含有足以生成特异性抗原结合的免疫球蛋白(或免疫球蛋白的变体)的至少一部分的多肽，诸如包括一种或多种互补决定区(CDR)的分子。
在某些实施方案中，抗体(或其抗原结合片段)包括对抗原为至少106M-1、至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1或至少1012M-1的亲和力。
可以使用本领域中已知的方法生成抗体。为了产生抗体，各种宿主包括山羊、兔、大鼠、小鼠、人类和其它宿主可以通过注射适当的抗原而免疫。根据宿主的种类，可以使用各种佐剂来增加免疫反应。此类标准佐剂包括弗氏(Freund′s)佐剂、矿物凝胶诸如氢氧化铝和表面活性物质诸如溶血卵磷脂、复合多元醇(pluronicpolyol)、聚阴离子、肽、油乳液、钥孔虫戚血蓝蛋白和二硝基苯酚。
在某些实施方案中，抗体是多克隆抗体。用于产生和分离多克隆抗体的方法是已知的。通常，多克隆抗体由B淋巴细胞产生。通常，多克隆抗体是从免疫受试者诸如免疫动物直接获得。免疫方法是本领域中已知的。
在某些实施方案中，抗体是单克隆抗体。可以使用提供通过培养物中的连续分离细胞产生抗体分子的技术来制备单克隆抗体。这些包括但不限于杂交瘤技术、人类B细胞杂交瘤技术和EBV-杂交瘤技术。用于制备单克隆抗体的方法包括例如Kohler等人(1975)Nature256:495-497(通过引用并入本文)；Kozbor等人(1985)J.Immunol.Methods81:31-42(通过引用并入本文)；Cote等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci80:2026-2030(通过引用并入本文)；和Cole等人(1984)Mol.CellBiol.62:109-120(通过引用并入本文)。
在某些实施方案中，所述抗体和/或其抗原结合片段包括分离的抗体。在某些实施方案中，所述抗体和/或其抗原结合片段包括纯化的抗体。用于产生和分离多克隆和单克隆抗体的方法是已知的。
术语“分离的”是指已经从其天然环境中分离出的物质如核酸、多肽或抗体。本公开的某些实施方案提供如本文所描述的分离的核酸、多肽、蛋白质或抗体。
分离的核酸、多肽或抗体可以是部分或实质上纯化的。在一些情况下，分离的实体呈实质上未纯化状态，其与多种其它物质结合。在一些情况下，分离的实体呈实质上纯化状态，其实质上不含在自然中或在体内与其结合的其它物质。术语“纯化的”是指已经经历一些形式的处理以增加所需物质的比例的物质。本公开的某些实施方案提供如本文所描述的纯化的核酸、多肽、蛋白质或抗体。
在某些实施方案中，所述抗体具有选自由IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA组成的组的同种型。
在某些实施方案中，所述抗体和/或其抗原结合片段为小鼠抗体和/或其抗原结合片段、人类抗体和/或其抗原结合片段或人源化抗体和/或其抗原结合片段。预期了其它类型的抗体(或其抗原结合片段)。
人源化抗体或适于不被其它哺乳动物排斥的抗体可以通过本领域中已知的合适方法(包括例如表面重塑或CDR移植)来产生。在表面重塑技术中，分子建模、统计分析和诱变被组合来调整可变区的非CDR表面以模拟靶宿主的已知抗体的表面。用于抗体的表面重塑的策略和方法以及用于降低不同宿主内的抗体的免疫原性的其它方法是已知的，例如如美国专利5,639,641中所描述。人源化形式的抗体还可以通过CDR移植，通过将例如小鼠抗体的互补决定区替代至人类框架结构域中来制造。
抗体的人源化方法是已知的。例如，可以如美国专利No.6,180,370(通过引用并入本文)；WO92/22653(通过引用并入本文)；Wright等人(1992)CriticalRev.inImmunol.12(3,4):125-168(通过引用并入本文)；和Gu等人(1997)ThrombosisandHematocyst77(4):755-759)(通过引用并入本文)中所描述来生成所述抗体。
人源化抗体通常具有除大体上或完全源于人类抗体的互补决定区(CDR)以外的恒定区和可变区和实质上或完全源于受关注的非人类抗体的CDR。
为了产生“嵌合抗体”所开发的技术(例如将小鼠抗体基因拼接至人类抗体基因以获得具有适当的抗原特异性和生物活性的分子)可以通过合适的方法来进行。例如，可以如Morrison,S.L.等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci81:6851-6855(通过引用并入本文)；Neuberger,M.S.等人(1984)Nature312:604-608(通过引用并入本文)；和Takeda,S.等人(1985)Nature314:452-454(通过引用并入本文)中所述来产生嵌合抗体。
可以利用免疫分析进行筛选，以鉴别具有所需特异性的抗体和/或其抗原结合片段。
抗体分子和其抗原结合片段还可以通过本领域中已知的方法重组产生，例如通过在大肠杆菌(E.coli)表达***中表达。例如，用于产生重组抗体的方法如美国专利4,816,567(通过引用并入本文)中所描述。还可以通过例如噬菌体展示技术或使用本领域中已知的肽文库来产生抗原结合片段。
本公开的某些实施方案提供针对本文所描述的多肽而培育的分离或纯化的抗体或其抗原结合片段。
本公开的某些实施方案提供分离或纯化的抗体或其抗原结合片段，其被培育来针对包含下列中的一个或多个的氨基酸序列的多肽：ASNDHDAAINRYSRLSKKRENDKVKYEVTEDVYT(SEDIDNO.1)、DEVASDPLYVPDPDPTKFPVNRNLTRKAGYLNARNKT(SEQIDNO.2)和SEGQFVVLSSSQSEESDLGEGGKKRESEA(SEQIDNO.3)、任何上述氨基酸序列的抗原片段和/或任何上述氨基酸序列或其抗原片段的变体。本公开的某些实施方案提供分离或纯化的抗体或其抗原结合片段，其被培育来针对由上述氨基酸序列中的一个或多个组成的多肽。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段被培育来针对由下列中的氨基酸序列组成的一种或多种多肽：ASNDHDAAINRYSRLSKKRENDKVKYEVTEDVYT(SEDIDNO.1)、DEVASDPLYVPDPDPTKFPVNRNLTRKAGYLNARNKT(SEQIDNO.2)和SEGQFVVLSSSQSEESDLGEGGKKRESEA(SEQIDNO.3)、NRYSRLSKKRENDKV(SEQIDNO.7)、DPDPTKFPVNRNLTR(SEQIDNO.8)和SQSEESDLGEGGKKR(SEQIDNO.9)、任何上述氨基酸序列的抗原片段和/或任何上述氨基酸序列或其抗原片段的变体。
本公开的某些实施方案还提供了如本文所描述的多肽或蛋白质。
本公开的某些实施方案提供由以下氨基酸序列中的一个或多个组成的多肽：ASNDHDAAINRYSRLSKKRENDKVKYEVTEDVYT(SEDIDNO.1)、DEVASDPLYVPDPDPTKFPVNRNLTRKAGYLNARNKT(SEQIDNO.2)、SEGQFVVLSSSQSEESDLGEGGKKRESEA(SEQIDNO.3)和NRYSRLSKKRENDKV(SEQIDNO.7)、DPDPTKFPVNRNLTR(SEQIDNO.8)、SQSEESDLGEGGKKR(SEQIDNO.9)、任何上述氨基序列的片段、任何上述氨基酸序列的抗原片段和/或任何上述氨基酸序列或其抗原片段的变体。在某些实施方案中，所述多肽是分离的多肽。此类多肽可以例如用于培育抗体。
本公开的某些实施方案提供非天然存在的多肽，其包含以下氨基酸序列中的一个或多个：ASNDHDAAINRYSRLSKKRENDKVKYEVTEDVYT(SEDIDNO.1)、DEVASDPLYVPDPDPTKFPVNRNLTRKAGYLNARNKT(SEQIDNO.2)、SEGQFVVLSSSQSEESDLGEGGKKRESEA(SEQIDNO.3)和NRYSRLSKKRENDKV(SEQIDNO.7)、DPDPTKFPVNRNLTR(SEQIDNO.8)、SQSEESDLGEGGKKR(SEQIDNO.9)、任何上述氨基序列的片段、任何上述氨基酸序列的抗原片段和/或任何上述氨基酸序列或其抗原片段的变体。在某些实施方案中，所述多肽是分离的多肽。此类多肽可以例如用于培育抗体。
本公开的某些实施方案提供分离和/或纯化的抗体，其结合至包含下列中的一个或多个的人类APPL1蛋白中的氨基酸序列中的表位：ASNDHDAAINRYSRLSKKRENDKVKYEVTEDVYT(SEDIDNO.1)、DEVASDPLYVPDPDPTKFPVNRNLTRKAGYLNARNKT(SEQIDNO.2)、SEGQFVVLSSSQSEESDLGEGGKKRESEA(SEQIDNO.3)和/或该蛋白的同源物、直系同源物或旁系同源物的等效区域。用于鉴别相关标靶的等效结合区域的方法是本领域中已知的。
在某些实施方案中，所述表位包括氨基酸序列NRYSRLSKKRENDKV(SEQIDNO.7)、DPDPTKFPVNRNLTR(SEQIDNO.8)和QSEESDLGEGGKKR(SEQIDNO.9)中的一个或多个和/或APPL1蛋白的同源物、直系同源物或旁系同源物的等效区域。
在某些实施方案中，本文所描述的多肽(或蛋白质)是分离的多肽。在某些实施方案中，本文所描述的多肽(或蛋白质)是纯化多肽。在某些实施方案中，本文所描述的多肽(或蛋白质)是非天然存在的多肽。在某些实施方案中，本文所描述的多肽(或蛋白质)是重组多肽。在某些实施方案中，本文所描述的多肽(或蛋白质)是合成多肽。预期了其它类型的多肽。
术语多肽或氨基酸序列的“变体”包括例如氨基酸***变体、氨基酸缺失变体、氨基酸替代变体和氨基酸修饰变体(天然和/或合成)中的一种或多种。
例如，氨基酸***变体可以包括氨基-和/或羧基末端融合(具有任何所需长度)以及在特定氨基酸序列中***单个或两个或更多个氨基酸。在具有***的氨基酸序列变体的情况下，可以将一种或多种氨基酸残基***氨基酸序列中的特定位点，然而将适当筛选的所得产物随机***也是可能的。
氨基酸缺失变体的特征为从序列中移除一种或多种氨基酸。氨基酸替代变体的特征为序列中的至少一个残基被移除并在其位置中***另一个残基。
变体中的氨基酸变化可以是非保守性和/或保守性氨基酸变化(即替代为带类似电荷或不带电的氨基酸)。保守性氨基酸变化涉及其侧链相关的氨基酸家族中的一种的替代。天然存在的氨基酸一般被分成四个家族：酸性氨基酸(即天冬氨酸、谷氨酸)；碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电的极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被一同分类为芳香族氨基酸。
可以借助已知的肽合成技术容易地制备本文所描述的多肽和氨基酸变体，诸如(例如)通过固相合成和类似方法或通过重组DNA操作。用于制备具有替代、***或缺失的蛋白质和肽的DNA序列的操作详细描述于Sambrook,J、Fritsch,E.F.和Maniatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork.(1989)(通过引用并入本文)以及Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology(2011),JohnWiley&Sons,Inc.(通过引用并入本文)中。
术语“衍生物”是指物质的修饰形式。例如，多肽或蛋白质的衍生物是指多肽或蛋白质的修饰形式。此类修饰包括化学修饰且包括与蛋白质或肽有关的任何分子诸如碳水化合物、脂质和/或蛋白质或肽的单个或多个替代、缺失和/或添加。术语“衍生物”还扩展到所述蛋白质和肽的所有功能性化学等效物。
用于分离和/或产生多肽和蛋白质的方法是已知的且一般地描述于Sambrook,J、Fritsch,E.F.和Maniatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork.(1989)(通过引用并入本文)以及Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology(2011),JohnWiley&Sons,Inc.(通过引用并入本文)中。
本公开的某些实施方案提供分离和/或纯化的抗体，其被培育来针对包含下列中的一个或多个的氨基酸序列的多肽：PNTFKTLDSWRDEFLIQASPRDPENFPFVVLGNKI(SEDIDNO.4)、DPENFPFVVLGNKIDLENRQVATKRAQAWCYSKNN(SEQIDNO.5)、ALKQETEVELYNEFPEPIKLDKNDRAKASAESCSC(SEQIDNO.6)、任何上述氨基酸序列的抗原片段和/或任何上述氨基酸序列或其抗原片段的变体。本公开的某些实施方案提供了分离或纯化的抗体或其抗原结合片段，其被培育来针对由上述氨基酸序列中的一个或多个组成的多肽。
在某些实施方案中，所述抗体被培育来针对包含下列中的一个或多个的氨基酸序列的多肽：RDEFLIQASPRDPEN(SEQIDNO.10)、GNKIDLENRQVATKR(SEQIDNO.11)和YNEFPEPIKLDKNDR(SEQIDNO.12)、任何上述氨基酸序列的抗原片段和/或任何上述氨基酸序列或其抗原片段的变体。本公开的某些实施方案提供分离或纯化的抗体或其抗原结合片段，其被培育来针对由上述氨基酸序列中的一个或多个组成的多肽。
本公开的某些实施方案提供由以下氨基酸序列中的一个或多个组成的多肽：PNTFKTLDSWRDEFLIQASPRDPENFPFVVLGNKI(SEDIDNO.4)、DPENFPFVVLGNKIDLENRQVATKRAQAWCYSKNN(SEQIDNO.5)、ALKQETEVELYNEFPEPIKLDKNDRAKASAESCSC(SEQIDNO.6)、RDEFLIQASPRDPEN(SEQIDNO.10)、GNKIDLENRQVATKR(SEQIDNO.11)和YNEFPEPIKLDKNDR(SEQIDNO.12)、任何上述氨基序列的片段、任何上述氨基酸序列的抗原片段和/或任何上述氨基酸序列或其抗原片段的变体。此类多肽可以例如用于培育抗体。
本公开的某些实施方案提供非天然存在的多肽，其包含以下氨基酸序列中的一个或多个：PNTFKTLDSWRDEFLIQASPRDPENFPFVVLGNKI(SEDIDNO.4)、DPENFPFVVLGNKIDLENRQVATKRAQAWCYSKNN(SEQIDNO.5)、ALKQETEVELYNEFPEPIKLDKNDRAKASAESCSC(SEQIDNO.6)、RDEFLIQASPRDPEN(SEQIDNO.10)、GNKIDLENRQVATKR(SEQIDNO.11)和YNEFPEPIKLDKNDR(SEQIDNO.12)、任何上述氨基序列的片段、任何上述氨基酸序列的抗原片段和/或任何上述氨基酸序列或其抗原片段的变体。此类多肽可以例如用于培育抗体。
本公开的某些实施方案提供分离和/或纯化的抗体，其结合至包含下列中的一个或多个的人类RAB7蛋白中的氨基酸序列中的表位：PNTFKTLDSWRDEFLIQASPRDPENFPFVVLGNKI(SEDIDNO.4)、DPENFPFVVLGNKIDLENRQVATKRAQAWCYSKNN(SEQIDNO.5)、ALKQETEVELYNEFPEPIKLDKNDRAKASAESCSC(SEQIDNO.6)和/或该蛋白的同源物、直系同源物或旁系同源物的等效区域。
在某些实施方案中，所述表位包括氨基酸序列RDEFLIQASPRDPEN(SEQIDNO.10)、GNKIDLENRQVATKR(SEQIDNO.11)和YNEFPEPIKLDKNDR(SEQIDNO.12)中的一个或多个和/或该RAB7蛋白的同源物、直系同源物或旁系同源物的等效区域。
本公开的某些实施方案提供分离和/或纯化的抗体，其被培育来针对包含以下氨基酸序列的多肽：CKKLDDFVETGDIRTMVFP(SEQIDNO.13)、任何上述氨基酸序列的抗原片段和/或任何上述氨基酸序列或其抗原片段的变体。本公开的某些实施方案提供分离或纯化的抗体或其抗原结合片段，其被培育来针对由上述氨基酸序列组成的多肽。
本公开的某些实施方案提供分离和/或纯化的抗体，其结合至包含CKKLDDFVETGDIRTMVFP(SEQIDNO.13)的人类LIMP-2蛋白中的氨基酸序列中的表位和/或该蛋白的同源物、直系同源物或旁系同源物的等效区域。
本公开的某些实施方案提供由以下氨基酸序列组成的多肽：CKKLDDFVETGDIRTMVFP(SEQIDNO.13)、上述氨基序列的片段、上述氨基酸序列的抗原片段和/或上述氨基酸序列或其抗原片段的变体。此类多肽可以例如用于培育抗体。
本公开的某些实施方案提供包括以下氨基酸序列的非天然存在的多肽：CKKLDDFVETGDIRTMVFP(SEQIDNO.13)、上述氨基序列的片段、上述氨基酸序列的抗原片段和/或上述氨基酸序列或其抗原片段的变体。此类多肽可以例如用于培育抗体。
本公开的某些实施方案提供检测APPL1蛋白或其片段的方法，所述方法包括使用如本文所描述的抗体。
本公开的某些实施方案提供检测RAB7蛋白或其片段的方法，所述方法包括使用如本文所描述的抗体。
本公开的某些实施方案提供检测LIMP2蛋白或其片段的方法，所述方法包括使用如本文所描述的抗体。
本公开的某些实施方案提供检测受试者中的***癌的方法，所述方法包括使用如本文所描述的抗体来检测受试者的APPL1、RAB7或LIMP2蛋白和/或其片段、衍生物或加工形式。
本公开的某些实施方案提供包括如本文所描述的抗体的试剂盒。该试剂盒可以包括如本文所描述的一种或多种其它试剂。
本公开的某些实施方案提供产生如本文所描述的抗体的杂交瘤。用于产生杂交瘤和单克隆抗体的方法是本领域中已知的。
用于产生杂交瘤的典型方案如下：首先使动物(例如小鼠)暴露于选定抗原。通常，这是通过历时数周的一系列抗原注射而完成。一旦从哺乳动物的脾中分离出脾细胞，就可以使B细胞与永生化骨髓瘤细胞融合。一般选择骨髓瘤细胞以确保它们本身不分泌抗体并且缺少次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)基因，这使得它们对HAT培养基敏感。所述融合可以例如使用聚乙二醇或Sendai病毒来实现。
融合细胞在HAT培养基中孵育大约10到14天。氨喋呤阻断了允许核苷酸合成的路径，且未融合的骨髓瘤细胞死亡，因为它们不能通过重新或补救路径产生核苷酸，原因是它们缺少HGPRT。去除未融合的骨髓瘤细胞是必要的，因为它们有可能生长地比其它细胞尤其是微弱建立的杂交瘤快。未融合的B细胞由于寿命短而死亡。这样，只有B细胞-骨髓瘤杂交种存活，因为来自B细胞的HGPRT基因是功能性的。这些细胞产生抗体并且是永生的。然后将孵育的培养基稀释到多孔板中，使得每个孔只含有一个细胞的程度。由于孔内的抗体是由相同的B细胞产生，所以它们将指向相同的表位且因此是单克隆抗体。
下一阶段是快速的初级筛选过程，该过程仅鉴别并筛选那些产生适当特异性的抗体的杂交瘤。然后孵育杂交瘤培养上清液、次级酶标记缀合物和显色或荧光底物，且有色产物的形成指示阳性杂交瘤。或者，还可以使用免疫细胞化学筛选或流式细胞术。
可以克隆产生所需抗体的B细胞，以产生许多相同的子克隆。这个步骤中含有白细胞介素-6的补充培养基是至关重要的。一旦建立了杂交瘤集落，它就会在培养基如RPMI-1640(具有抗生素和胎牛血清)中不断生长并产生抗体。
最初使用多孔板来生长杂交瘤，且在筛选后，换成较大的组织培养烧瓶。这样维持杂交瘤的良好状态且提供足够用于低温保存的细胞和用于后续研究的上清液。培养上清液可以产出1至60μg/ml的单克隆抗体，其维持在-20℃或更低温度下直到需要时。
通过使用培养上清液或纯化的免疫球蛋白制剂，可以对产生杂交瘤的潜在单克隆抗体进行关于反应性、特异性和交叉反应性的进一步分析。
最后，标准技术可以用于重组DNA技术、寡核苷酸合成、抗体产生、肽合成、组织培养和转染。可以根据制造商的说明书或如本领域中通常所完成或如本文所描述进行酶反应和纯化技术。上述技术和程序一般可以根据本领域中已知的常规方法和如整个本说明书中所引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述来进行。参见例如Sambrook等人MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989))，其通过引用并入本文中。
通过以下实施例来说明示例性实施方案。应该理解，以下描述仅用于描述特定实施方案的目的且无意限制以上描述。
实施例1-***癌中改变的内体生物发生
材料和方法
(i)试剂
使用肽序列CKKLDDFVETGDIRTMVFP(SEQIDNO.13)(MimotopesPtyLtd.,Victoria,Australia)生成LIMP-2绵羊多克隆抗体。该研究中所使用的初级抗体包括抗APPL1(0.4μg/mL,AbcamPLC,CambridgeUnitedKingdom,cat#ab95195)、APPL2(0.4μg/m,Abcam,cat#ab95196)、Rab4(1μg/mL,Abcam,cat#ab13252)、TGN46(10μg/mL,Abcam,cat#ab50595)、TfR1(1μg/mL,Abcam,cat#ab108985)、TfR2(1μg/mL,Abcam,cat#ab80194)、Akt(1/1000,CellSignalingTechnology,Inc.,MA,USA)和Phospho-Akt(Thr3081/1000,CellSignalingTechnology,Inc.)的兔多克隆抗体。还使用山羊抗Rab5(1μg/mL,SantaCruzBiotechnology,CA,USA)、Rab7(1μg/mL,SantaCruzBiotechnology)和EEA1(1μg/mL,SantaCruzBiotechnology)多克隆抗体。LAMP-1(1μg/mL)小鼠单克隆BB6由UmeaUniversity,Sweden)提供。用于蛋白质印迹分析的HRP缀合型次级抗体包括抗山羊/绵羊(1/2000,MerckMilliporePty.Ltd.,Victoria,Australia)、抗兔(1/2000,SigmaAldrichPty.Ltd.,NewSouthWales,Australia)和抗小鼠(1/2000SigmaAldrichPty.Ltd.)。HRP缀合型抗GAPDH(1/20000SigmaAldrichPty.Ltd.)。所使用的与次级抗体和其它抗体缀合的荧光团包括从LifeTechnologiesPtyLtd.,Victoria,Australia获得的Alexa488(1/250)、Alexa633(1/250)、转铁蛋白-633(1/1000)、鬼笔环肽-488(1/100)、Lyso(5μM)。引物是从GeneworksPtyLtd.,Adelaide,Australia获得的且序列被列于支持信息表1中。
(ii)细胞系和培养条件
经由CellBankAustralia(Children’sMedicalResearchInstitute,NewSouthWales,Australia)从欧洲细胞培养物保藏所(EuropeanCollectionofCellCultures)获得细胞系PNT1a和PNT2、22RV1和LNCaP(克隆FCG)。这些细胞系不在交叉污染或错误鉴别的细胞系列表(6.8版本，2012年3月9日)中。PNT1a和PNT2之前源于猿猴空泡病毒40(SV40)永生化细胞系。22RV1癌细胞系之前源于异种移植物，其已经在亲代雄激素依赖性异种移植物的由***诱导的消退和复发后于小鼠中连续繁殖。这种细胞系表达雄激素受体，但其增殖对雄激素刺激无反应。LNCaP之前源于***腺癌的***转移且为雄激素反应性。
将细胞系培养在T75组织培养烧瓶中并维持在RoswellParkMemorialInstitute(RPMI)1640培养基(LifeTechnologiesAustraliaPtyLtd.,Victoria,Australia)中，该培养基补充有10％胎牛血清(InVitroTechnologiesPtyLtd.,Victoria,Australia)和2mML-谷氨酰胺(SigmaAldrichPtyLtd.,NewSouthWales,Australia)。在含有5％CO2的SanyoMCO-17AI加湿孵育器(SanyoElectricBiomedicalCo.,Ltd.,Osaka,Japan)中于37℃下孵育细胞。细胞在大约90％汇合时通过用无菌PBS(SigmaAldrich)洗涤进行传代，用胰蛋白酶处理(含有0.12％胰蛋白酶、0.02％EDTA的胰蛋白酶-EDTA溶液；SigmaAldrich,NewSouthWales,Australia)以从培养表面分离，且随后悬浮于补充性培养基中。
(iii)细胞提取物制备
从80-90％汇合的细胞培养物抽吸培养基，用PBS洗涤细胞一次，然后用800μL20mMTris(pH7.0)、500mM氯化钠和2％SDS溶液孵育。收获细胞并且通过加热到65℃和超声波处理1分钟来制备提取物。随后使裂解物通过25号针6次。根据制造商的说明书(MicroBCAkit,Pierce,Rockford,IL,USA)，使用二辛可宁酸测定来量化细胞提取物中的总蛋白。使用WallacVictorTM光学读板仪和Workout软件v2.0(Perkin-ElmerPty,Ltd.,Victoria,Australia)，利用5点参数标准曲线来量化样品。将细胞提取物储存在-20℃下。
(iv)基因表达分析
将细胞系培养到80-90％汇合(一式三份T75烧瓶)，抽吸培养基并用PBS洗涤细胞层，接着添加1mLTRI(AppliedBiosystemsPtyLtd.,Victoria,Australia)进行收集。每毫升TRI中添加二百微升氯仿，并用力振荡样品1分钟，在室温下孵育三分钟，然后在4℃下以16,000g离心15分钟。根据制造商的说明书，使用微型试剂盒(QiagenPtyLtd.,Victoria,Australia)进行RNA提取。使用NanoDropTM2000分光光度计(ThermoFisherScientificAustraliaPtyLtd.,Victoria,Australia)在260nm下测定提取的RNA的浓度。评估260/280nm和260/230nm的比率以确保样品没有蛋白和DNA污染；大于1.6的比率指示样品无污染。
使用高容量RNA-to-cDNAKit(LifeTechnologiesPtyLtd.,Victoria,Australia)制备用于qRT-PCR的互补DNA(cDNA)。引物序列获自公开文献、哈佛引物库(HarvardPrimerRank)或使用NCBIPrimer-BLAST来设计。引物是基于最终扩增子尺寸小于150个碱基对、熔融温度接近60℃和如果可能横跨外显子-外显子拼接的标准来选择或设计。对于定量RT-PCR，10μL反应混合物含有5μLPowerGreenPCRMasterMix(LifeTechnologiesAustraliaPtyLtd.,Victoria,Australia)、0.5μL各10nM正向和反向引物、用经DEPC处理的H2O稀释到1:25的2μLcDNA样品和2μL经DEPC处理的H2O。将反应物一式三份地涂铺到96孔板(LifeTechnologiesAustraliaPtyLtd.,Victoria,Australia)上，其中每个板含有用于靶基因和内源性基因标准曲线的参照cDNA样品的连续稀释液，以控制反应效率。使用7500快速实时PCR***(LifeTechnologiesAustraliaPtyLtd.,Victoria,Australia)，利用ABI7500软件v2.0.2进行qPCR。
用于所有标靶的循环条件包括：50℃持续2分钟、95℃持续10分钟以激活酶并使cDNA变性，接着进行95℃的15秒变性步骤和60℃的60秒延伸和信号采集步骤的循环40次。循环阈值(CT)值是在扩增的指数期中和高于基线噪声下以0.35的阈值水平来推导。通过CT值相对于从连续稀释液产生的标准曲线的计算来推导每个样品中的基因表达的相对量。通过从稀释标准物绘制的线性趋势线的斜率计算的反应效率在90到110％之间。从每个复制板上的mRNA量推导平均基因表达，其中每个单个板提供复制孔的平均CT和mRNA水平。
(v)蛋白质印迹
使10μg细胞裂解物热变性(在LDS样品缓冲液和还原剂中于100℃下进行5分钟)，然后在XCellSureLockMini-Cell***(LifeTechnologiesAustraliaPtyLtd.,Victoria,Australia)中使用预制凝胶在120V下电泳1.5小时。然后在35V下历时1小时将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜(PerkinElmer,Victoria,Australia)上。使用于TBS-吐温(tween)(0.1％；阻断)中的5％(w/v)脱脂乳溶液在RT下阻断转移膜1小时并用初级抗体在4℃下孵育过夜。将所述膜于TBS-吐温(0.1％)中洗涤3x5分钟，然后用在阻断溶液中稀释1/2000的适当辣根过氧化物酶缀合型次级抗体孵育。使用ECL化学发光底物试剂盒(LifeTechnologiesAustraliaPtyLtd.,Victoria,Australia)使所述膜显影并且使用软件版本1.2.0.101的ImageQuantTMLAS4000成像仪(GEHealthcareBio-SciencesPtyLtd.,NewSouthWales,Australia)使蛋白可视化。
分析一式三份的样品并且使用AlphaViewSATM软件v3.0.0.0(ProteinSimple,SantaClara,California)相对于参照GAPDH上样对照来量化图像。使用Stata/SEv11.2(StataCorpLP,Texas,U.S.A)进行Kruskal-Wallis秩和统计分析，以确定非恶性对照与癌细胞系组之间的显著性(95％置信界限；p<0.05)。
(vi)共焦显微术
将细胞培养在22mm玻璃盖玻片上，用于PBS中的4％(v/v)甲醛在室温下固定20分钟，然后用于PBS中的0.1％Triton-X(v/v)透化10分钟。通过用于PBS中的5％(w/v)牛血清白蛋白在RT下孵育2小时来阻断非特异性抗体反应性。然后用于5％BSA中的初级抗体在室温下孵育细胞2小时，随后用次级抗体在RT下培养1小时。通过3次PBS洗涤去除未结合的抗体并将盖玻片固定在含有DAPI核染剂的Gold抗淬灭试剂(LifeTechnologiesAustraliaPtyLtd.,Victoria,Australia)中。使用ZeissLSM710METANLO激光扫描显微镜和相关CarlZeissZen2009软件进行共焦显微术。对DAPI、Alexa488、Cy3和Alexa633荧光分别利用370、488、543和633nm的激光线。图像以灰度图16位TIFF文件形式输出并且使用CS5(AdobeSystemsInc.,SanJose,California,U.S.A)进行处理。
(vii)免疫组织化学
将匹配的人类非恶性组织切片和肿瘤***组织切片(3μm)固定在SuperfrostUltra载玻片(Menzel-Glaser)上并在50℃下加热过夜。然后使切片在二甲苯中脱蜡，在乙醇中再水合并在RT下于PBS中的0.3％H2O2中孵育15分钟。在DecloakingChamber(BiocareMedical)中于125℃下使用10mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.5)进行HIER5分钟。首先使用Invitrogen亲和素/生物素试剂盒(根据制造商的说明书)且随后在湿度室中在RT下于5％阻断血清(SIGMA)中持续30分钟来阻断载玻片。然后在湿度室中于4℃下用初级抗体孵育切片过夜，接着在湿度室中于RT下用适当的生物素化次级抗体(1/400；DAKO)孵育1小时，随后在湿度室中于RT下用链霉亲和素-辣根过氧化物酶(1/500；DAKO)孵育1小时，且最后用DAB/H2O2孵育。然后用Lillie-Mayer苏木精对比染色组织切片，用水冲洗，再水合并用DPX固定在载玻片上。通过使用Nanozoomer(Hamamatsu)扫描载玻片来获取图像。
结果
(i)内体相关基因和蛋白表达在***癌细胞中增加
通过qRT-PCR量化内体和溶酶体相关基因在对照和***癌细胞中的表达并且归一化至GAPDHmRNA的表达。当与非恶性对照细胞系相比时，***癌中的APPL1、APPL2、EEA1、RAB5A、RAB4A和LIMP2mRNA的量显著增加(p<0.05；图1)。在每种情况下，mRNA表达增加大约2-3倍。与非恶性对照相比，在***癌细胞中检测到的RAB7A或LAMP1mRNA的量不存在显著差异。蛋白质印迹分析表明，当与非恶性对照细胞相比时，***癌细胞提取物中的APPL1、APPL2、EEA1、Rab4和LIMP-2蛋白的量显著增加(p<0.05；图2)。此外，对于LIMP-2和Rab4二者来说，当与非恶性对照细胞相比时，在***癌中增加约2-4倍(图2)。与***癌细胞相比，在非恶性细胞中检测到的Rab5A、Rab7和LAMP-1蛋白的量不存在显著差异(图2)。
(ii)内体和溶酶体的分布在***癌细胞中改变
关于内体和溶酶体的分布的代表性共焦图像(图3)显示，与非恶性对照相比，***癌中染色增加且隔室分布改变。APPL1阳性内体主要在非恶性对照细胞的核周区中被检测到，而在***癌细胞中，这些隔室朝细胞周边分布且趋向于更集中于细胞延伸物/伪足中的质膜附近。在非恶性对照和***癌细胞中，Rab5A展示与其效应子EEA1类似的分布。然而，在非恶性对照细胞中，Rab5A和EEA1均集中在核周区，而在***癌细胞中，发现这些内体隔室遍布整个细胞质，其中一些隔室位于细胞延伸物中的细胞周边。Rab7阳性内体主要位于非恶性对照和***癌细胞二者的核周区中。在非恶性对照细胞中，LIMP-2集中在核周区中，且在细胞质的剩余部分中和细胞表面的附近具有一些管状和点状囊泡染色。相反地，***癌细胞展示相对较小的LIMP-2隔室，其具有遍布整个细胞质的均匀分布。在非恶性对照细胞中，检测到LAMP-1位于集中在核周区的隔室上，而在***癌细胞中，LAMP-1隔室远离核周区分布，集中在细胞延伸物中。与LAMP-1染色一致，LysoTrackerTM阳性酸性隔室主要集中在非恶性对照细胞的核周区中，而在***癌细胞中，检测到这些隔室位于核周区和细胞质延伸物中(图4)。
(iii)内吞转铁蛋白在***癌细胞中的分布改变
先前研究已报告转铁蛋白在***癌细胞中的摄取增加，从而促使相对于观察到的内体蛋白表达增加和内体分布改变来研究受体表达和转铁蛋白内吞。在非恶性对照细胞中，5分钟后在点状细胞内结构中且在第15和30分钟在核周区中观察到内吞的转铁蛋白(图5)。***癌细胞比非恶性对照细胞系内吞更多的转铁蛋白，且当与非恶性对照相比时，内在化转铁蛋白不是一样地集中在***癌细胞的核周区中，而是更多地集中在细胞周边(图5)。与非恶性对照细胞系相比，***癌中的肌动蛋白染色也大幅减少(图5)。在非恶性对照细胞中，转铁蛋白聚集在位于核周区中的LIMP-2和Rab7阳性内体中(图6)。虽然***癌细胞具有位于核周区中的一些LIMP-2阳性染色以及与高尔基标记物TGN46的一些共定位，但大多数转铁蛋白位于分布在整个细胞质中的不同内体隔室(即，Appl1、Rab5A、EEA1)中和细胞延伸物中(图6)。对于***癌和非恶性对照细胞系来说，Rab4再循环内体和LAMP-1阳性溶酶体具有类似的转铁蛋白染色模式(图6)。转铁蛋白受体的进一步分析揭示TfR1和TfR2的可变的基因和蛋白表达(图7)。当与非恶性对照相比时，***癌细胞中的TFR1基因表达显著增加，但TFR1蛋白在***癌细胞系22RV1中仅定性地增加且在LNCaP中没有增加(图7A)。虽然当与非恶性对照相比时，在***癌细胞中检测到明显更多的TFR2蛋白，但在LNCaP中仅观察到TFR2基因表达的增加(图7A)。因此，虽然与非恶性对照细胞相比***癌中的TFR蛋白的量增加，但在22RV1中TFR1相对更多且在LNCaP细胞中TFR2相对更多。
(iv)Akt信号传导在***癌细胞中改变
在非恶性对照细胞中检测到的Akt蛋白总量与在***癌细胞中类似(图8)。然而，***癌系中的磷酸化Akt的量有所不同，其中22RV1显示明显减少的磷酸化Akt的量，而LNCaP具有增加量的磷酸化Akt(图8)。更重要的是，在添加转铁蛋白后，非恶性对照细胞中的磷酸化Akt的量显著增加，但癌细胞中的磷酸化Akt的量均未改变(图8B)。有趣的是，在LNCaP细胞(其尚未经转铁蛋白处理)中观察到的增加量的磷酸化Akt与在该细胞系中检测到的TfR2的量相关(图7A和图8)。
(v)LAMP-1和APPL1在非恶性和恶性人类***组织中的分布。
使用免疫组织化学来研究LAMP-1和APPL1在***癌患者组织样品中的分布。溶酶体标记物LAMP-1在一些患者样品中显示一些肿瘤特异性染色(图9)，但与先前研究一致，存在可变的结果且一些患者样品几乎不具有或不具有LAMP-1染色(数据未显示)。然而，APPL1明确地描绘癌症边缘的轮廓且显示肿瘤团内的染色显著增加(图9)。这种APPL1染色图案对于所检查的6个不同的患者样品中的每个是一致的。
讨论
***癌是男性中最常被诊断的癌症之一并且是全球(特别在美国和澳大利亚人口中)癌症相关性死亡的首要原因。***特异性抗原仍是用于检测***癌的常用测试，但在漏诊和预后预测方面具有显著问题。最近已开发出一些有前景的辅助测试，包括***癌抗原3(PCA3)、胆固醇硫酸盐分析和基因蛋白激酶C-ζ(PRKCZ)(其被翻译成蛋白PRKC-ζ-PrC)的新型序列。然而，这些生物标记物具有许多缺陷，它们不提供用于早期和精确检测***癌以允许适当的治疗干预的有用方法。
已经进行了大量的蛋白和蛋白组研究以描绘潜在的新型***癌生物标记物，尽管如此，仍有待鉴别合适的标记物。
在此我们观察到内体和溶酶体囊泡改变分布至***癌细胞的细胞周边中。已经显示Na+/H+交换活性(酸化)、RhoAGTP酶活性和PI3K活化的增加导致***癌细胞的胞吐。内体相关基因和蛋白表达的增加表明内体相关蛋白可以为***癌疾病标记物研究提供重要的新焦点。
我们观察到***癌细胞系中的内体蛋白LIMP-2的基因和蛋白表达增加，这促使我们研究***癌细胞中的内体生物发生。早期内体相关蛋白EEA1、APPL1、APPL2和再循环内体蛋白Rab4在***癌细胞中显著上调，这支持了***癌中具有改变的内体生物发生的假设。此外，EEA1、APPL1和APPL2内体亚群各自显示改变的细胞内分布，这与改变的内体运输并可能与功能一致。
我们在内体相关基因和蛋白表达中观察到的显著变化连同内体群体的分布改变促使我们研究转铁蛋白受体表达连同转铁蛋白内吞、分选和Akt信号传导作为内体功能的量度。Akt信号传导对调节细胞生长和存活也是必需的；并且这控制转铁蛋白和生长因子受体的细胞表面表达。先前已经观察到转铁蛋白受体与Rab5和马达蛋白肌球蛋白VI共定位；后者参与逆行运输到质膜。这与我们对在***癌细胞的细胞周边中与标记转铁蛋白共染色的内体群体的观察结果一致。在***癌细胞中还出现了Akt信号传导的去调节，这可能已经改变转铁蛋白受体的细胞内定位，从而将它输送到APPL1、APPL2和Rab5内体的不同群体中。
已经显示APPL1直接参与胰岛素信号传导和葡萄糖转运体GLUT-4的易位，这是通过APPL1直接结合至PI3K和Akt来介导的。预期我们在***癌细胞中观察到的APPL1的基因和蛋白表达的增加可能导致因其对GLUT-4的作用所致的葡萄糖摄取增加，并且这可能暗示这些癌细胞中的能量代谢。事实上，APPL1还调节脂质和葡萄糖代谢二者的其它方面，激活AMP活化激酶、p38MAP激酶(MAPK)和PPARα。已经显示APPL2(APPL1的近亲)用作脂联素信号传导的负调节子的功能，通过与APPL1竞争性结合以与脂联素受体相互作用，再调节能量代谢。APPL1和APPL2二者的表达增加因此可以严重影响***癌细胞代谢，特别是当未观察到这些蛋白在一起，而是位于内体的不同群体上时。这可以对增加的能量利用和***癌细胞存活具有直接意义。预期***癌中改变的APPL1表达和对Akt信号传导的影响对***癌生物学的其它方面也具有显著后果，因为APPL1/PI3K/Akt信号传导路径在导致细胞粘附和细胞迁移中具有重要性。值得注意的是，APPL1还充当其它信号传导路径的中介体，通过在细胞表面或在内体路径中与整合或膜相关蛋白的细胞质面相互作用；其中其直接参与内体运输。
RabGTP酶完全参与内体运输的控制，且在细胞质GDP结合状态与活性膜相关GTP结合状态之间循环。Rab5和Rab7分别限定早期和晚期内体隔室并且在内体成熟期间Rab5募集HOPS复合体作为激活Rab7并被其替代的机制。已知mVps39为鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)，其促进内体Rab的GTP结合状态，而TBC-2/TBC1D2为RabGTP酶激活蛋白(GAP)，其促进GDP结合状态；这些结合起来用于调节Rab蛋白的膜定位。TBC-2/TBC1D2被认为充当内体到溶酶体运输的调节子且对于维持内体的正确大小和分布是必需的。我们在***癌细胞中观察到的内体群体的改变的分布表明TBC-2/TBC1D2(GAP)和或mVps39(GEF)在功能上可能受到损害。有趣的是，微阵列分析已经检测到增加的TBC-2/TBC1D2表达和减少的Vps39mRNA。
使用用于限定组织分化的Gleason分级***并结合标记物分析来预测***癌患者的疾病进程。我们在***癌患者的活检组织中观察到APPL1蛋白的量增加，从而确认了***癌细胞系中APPL1的基因和蛋白表达的增加。
我们已经证实，***癌细胞中的早期内体标记物的表达增加且内体和溶酶体隔室的定位改变，这与转铁蛋白受体的内吞和再循环的改变有关。我们的结论是，内体生物发生和功能在***癌细胞中发生改变，从而开创了潜在新型的研究途径，以开发有助于***癌的诊断和预后的标记物。
实施例2-作为潜在***癌生物标记物的溶酶体酶
材料和方法
(i)抗体试剂
该研究中所使用的初级抗体包括抗hK2(1μg/mL,AbcamPLC,Cambridge,UnitedKingdom,cat#ab40948)、hK3(1μg/mL,Abcam,cat#ab40949)、hK4(1μg/mL,Abcam,cat#ab40950)、hK15(1μg/mL,Abcam,cat#ab40961)、酸性神经酰胺酶(1μg/mL,Abcam,cat#ab74469)的兔多克隆抗体。抗***酸性磷酸酶(1μg/mL,Abcam,cat#ab75704)、组织蛋白酶B(0.25μg/mL,Abcam,cat#ab58802)、组织蛋白酶D(5μg/mL,Abcam,cat#ab6313)的小鼠单克隆抗体。抗α-葡糖苷酶(1μg/mL)、β-葡糖苷酶(1μg/mL)和α-半乳糖苷酶A(1μg/mL)的绵羊多克隆抗体是来自溶酶体疾病研究中心(LysosomalDiseasesResearchUnit)(Women’sandChildren’sHospital,SAPathologyServices,Adelaide,SouthAustralia)的友好礼物，且LAMP-1(1μg/mL)小鼠单克隆BB6来自University,Sweden。用于蛋白质印迹的辣根过氧化物酶(HRP)缀合型次级抗体包括抗山羊/绵羊免疫球蛋白(1/2000,MerckMilliporePty.Ltd.,Victoria,Australia)、抗兔免疫球蛋白(1/2000,SigmaAldrichPty.Ltd.,NewSouthWales,Australia)、抗小鼠免疫球蛋白(1/2000SigmaAldrichPty.Ltd.)和HRP缀合型抗GAPDH(1/20000SigmaAldrichPty.Ltd.)。
(ii)细胞系和培养条件
经由CellBankAustralia(Children’sMedicalResearchInstitute,NewSouthWales,Australia)从欧洲细胞培养物保藏所获得细胞系PNT1a和PNT2、22RV1和LNCaP克隆FCG。经由Cryosite(CryositeLtd.,NewSouthWales,Australia)从美国组织培养库(AmericanTissueCultureCollection)获得细胞系RWPE-1、CaHPV10和DU-145。这些细胞系不在交叉污染或错误鉴别的细胞系列表(6.8版本，2012年3月9日)中。将细胞系维持在由ATCC和ECCC推荐的培养基中。将PNT1a、PNT2和22RV1细胞系培养在RoswellParkMemorialInstitute(RPMI)1640培养基(LifeTechnologiesAustraliaPtyLtd.,Victoria,Australia)中，该培养基补充有10％胎牛血清(FCS；InVitroTechnologiesPtyLtd.,Victoria,Australia)和2mML-谷氨酰胺(SigmaAldrichPtyLtd.,NewSouthWales,Australia)。将RWPE-1和CaHPV10细胞系培养在含有L-谷氨酰胺()的角化细胞无血清培养基(K-SFM)中，该培养基补充有供应的人类重组表皮生长因子1-53(EGF1-53)和牛垂体提取物(BPE)。将DU-145细胞系培养在最低必需培养基(MEM)()中并补充2mML-谷氨酰胺和10％FCS。将LNCaP培养在补充有2mML-谷氨酰胺、10％FCS、10mMHEPES和1mM丙酮酸钠的RPMI-1640培养基中。在含有5％CO2的加湿孵育器中于37℃下孵育细胞。
(iii)细胞提取物制备
从80-90％汇合的细胞培养物抽吸培养基，用PBS洗涤细胞一次，然后用800μL20mMTris(pH7.0)、500mM氯化钠和2％SDS溶液孵育。收获细胞并且通过加热到65℃和超声波处理1分钟来制备细胞提取物。随后使所得裂解物通过25号针6次。根据制造商的说明书(MicroBCAkit,Pierce,Rockford,IL,USA)，使用二辛可宁酸测定来量化细胞提取物中的总蛋白。
(iv)蛋白质印迹
使10微克细胞裂解物热变性(在LDS样品缓冲液和还原剂中于100℃下进行5分钟)，然后在XCellSureLockMini-Cell***(LifeTechnologiesAustraliaPtyLtd.,Victoria,Australia)中使用预制凝胶在120V下电泳1.5小时。然后将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜(PerkinElmer,Victoria,Australia)上。使用含于0.1％(v/v)TBS-吐温中的5％(w/v)脱脂乳溶液在室温下阻断转移膜1小时并用初级抗体在4℃下孵育过夜。将所述膜于0.1％(v/v)TBS-吐温中洗涤3x5分钟，然后用在阻断溶液中稀释到1/2000的适当HPR缀合型次级抗体孵育。使用ECL化学发光底物试剂盒(LifeTechnologiesAustraliaPtyLtd.,Victoria,Australia)使所述膜显影，并且使用ImageQuantTMLAS4000成像仪(GEHealthcareBio-SciencesPtyLtd.,NewSouthWales,Australia)使蛋白可视化。分析一式三份的样品并且使用AlphaViewSATM软件v3.0.0.0(ProteinSimple,SantaClara,California)相对于参照GAPDH上样对照来量化图像。使用Stata/SEv11.2(StataCorpLP,Texas,U.S.A)进行Kruskal-Wallis秩和统计分析，以确定非恶性对照与癌细胞系组之间的显著性(95％置信界限；p<0.05)。
结果
(i)***癌细胞提取物和培养基中的当前***癌生物标记物的检测。
使用蛋白质印迹来限定来自非恶性***细胞系(RWPE-1、PNT1a和PNT2)和***癌细胞系(22RV1、LNCaP、CaHPV10和DU-145；图10)的细胞裂解物和培养基中的***酸性磷酸酶(PAP)、***特异性抗原(hK3)和其它激肽释放酶(hK2、hK4和hK15)的量。当与非恶性对照细胞系比较时，***癌细胞系22RV1和LNCaP中的PAP的胞内量更高，而在CaHPV10和DU-145***癌细胞系中几乎没有或没有检测到蛋白。类似地，hK2、hK3和hK4在LNCaP中比在非恶性对照细胞系中显示增加量的胞内蛋白，但在其它***癌细胞系中检测到最小量。所有***癌细胞系以及非恶性对照细胞系RWPE-1和PNT2的胞内hK15的量是类似的，尽管在PNT1a中检测到较低量。PAP、hK3、hK2和hK4从LNCaP细胞中分泌，且当与其它***癌和非恶性对照细胞系相比时量增加。值得注意的是，当与其它***癌和非恶性对照细胞系相比时，从22RV1和LNCaP分泌的hK15升高。这些发现指示***癌细胞系中可变的蛋白含量和PAP/激肽释放酶分泌，且这些标记物无法区别许多***癌和非恶性对照细胞系。
细胞提取物中的hK2、hK4和hK15的检测揭示单一分子形式，其不能用于区别非恶性对照和***癌细胞系。与非恶性细胞系RWPE-1(38kDa形式)相比，22RV1和LNCaP***癌细胞系中的***酸性磷酸酶被不同地加工(40和38kDa分子形式)，但不存在于其它细胞系中。类似地，在22RV1和LNCaP***癌细胞系中检测到hK3两种分子形式(29和25kDa)，而其它对照和癌细胞系仅表达29kDa的分子形式。对分泌的hK2和hK15的检测揭示类似于PNT1a的分子形式(对于hK2为27kDa；对于hK15为21kDa和25kDa)，但在其它非恶性对照和癌细胞系中未检测到这些分子形式。这指示当与非恶性对照细胞系相比时，一些***癌细胞系中的蛋白水解加工是可变的。
激肽释放酶的分泌似乎与***癌细胞系的雄激素受体状态相关且分泌量一般似乎与在细胞提取物中检测到的量无关。在22RV1和LNCaP***癌细胞系中观察到hK3、hK2和hK15的分泌增加。然而，当与22RV1相比时，来自RWPE-1非恶性细胞的细胞提取物中的hK2的量升高；而与RWPE-1非恶性对照细胞系相比，从22RV1癌细胞系分泌的这种标记物增加。预期激肽释放酶的量在对雄激素有响应或具有活化雄激素受体的细胞系中升高，从而激活含有雄激素响应元件(ARE)的基因。
(ii)非恶性对照和***癌细胞提取物和培养基中的溶酶体蛋白检测。
使用蛋白质印迹来限定来自非恶性对照和***癌细胞系的细胞裂解物和培养基中的不同溶酶体蛋白的量(图11、图12)。细胞内α-葡糖苷酶(α-Gluc)、β-葡糖苷酶(β-Gluc)、α-半乳糖苷酶A(α-GalA)、LAMP-1和组织蛋白酶D(26kDa)的量可在细胞系之间变化且不能区别非恶性对照与***癌细胞系。细胞提取物中的前组织蛋白酶D的量在非恶性对照、CaHPV10和DU-145癌细胞系中是类似的，然而在22RV1和LNCaP***癌细胞系的细胞提取物中没有可检测的蛋白。当与其它非恶性细胞系PNT1a和PNT2相比时，RWPE-1中的β-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、前组织蛋白酶B和D的分泌升高。从RWPE-1分泌的α-半乳糖苷酶的量类似于从CaHPV10***癌细胞系分泌的量。LAMP-1和组织蛋白酶D(26kDa)的分泌量对于非恶性对照和***癌细胞系中的每一个是类似的。当与其它***癌和非恶性对照细胞系相比时，22RV1和DU-145***癌细胞系分泌的α-葡糖苷酶和β-葡糖苷酶升高。当与其它***癌和非恶性对照细胞系相比时，在22RV1***癌细胞系中检测到有限量的组织蛋白酶B(22kDa)。当与其它***癌细胞系相比时，LNCaP中的前组织蛋白酶B的量升高。当与PNT1a和PNT2非恶性对照细胞系相比时，RWPE-1具有增加量的前组织蛋白酶B。与非恶性对照细胞系和22RV1***癌细胞系相比，CaHPV10、DU-145和LNCaP***癌细胞系分泌的组织蛋白酶B(22kDa)更高。在非恶性对照细胞系和***癌细胞系22RV1、CaHPV10和DU-145中检测到最小量的酸性神经酰胺酶。相反地，在LNCaP癌细胞系的细胞提取物中检测到大量的酸性神经酰胺酶。非恶性对照细胞系没有分泌酸性神经酰胺酶(10-15kDa)，但当与CaHPV10和非恶性对照细胞系相比时，从22RV1、DU-145和LNCaP***癌细胞系分泌的量升高。这些发现指示溶酶体蛋白的细胞内含量和分泌对于非恶性对照和***癌细胞系来说是可变的，其中组织蛋白酶B和酸性神经酰胺酶具有用于区别非恶性对照和***癌细胞系的潜力。因此，酸性神经酰胺酶和组织蛋白酶B的分泌可以提供用于区别非恶性细胞系和癌细胞系的一些能力。
在非恶性和***癌细胞系的细胞提取物中检测到α-葡糖苷酶的多种分子形式。在22RV1和LNCaP癌细胞系中检测到α-葡糖苷酶的110kDa分子形式，但在其它***癌和非恶性对照细胞系中仅检测到最小量。β-葡糖苷酶和LAMP-1的分子量在***癌与非恶性细胞系之间变化且无法区别这些类型的细胞系。α-半乳糖苷酶A的两种分子形式(42和43kDa)存在于CaHPV10和RWPE-1细胞系二者中，但不存在于其它***癌或非恶性细胞系中。当与其它非恶性和***癌细胞系相比时，CaHPV10和RWPE-1均展现较低量的70kDa分子形式的α-葡糖苷酶。有趣的是，在RWPE-1和CaHPV10细胞系二者中，存在针对α-葡糖苷酶和α-半乳糖苷酶A的类似蛋白加工、升高分子量的β-葡糖苷酶和升高分泌量的α-半乳糖苷酶A，这不同于其它非恶性和***癌细胞系；且这与用于使这两种细胞系永生化的不同技术相关。在CaHPV10、DU-145和LNCaP***癌以及RWPE-1非恶性对照细胞系的细胞提取物中检测到前组织蛋白酶B的两种分子形式(37和39kDa)。从RWPE-1和CaHPV10细胞分泌60kDa分子形式的β-葡糖苷酶，其从其它细胞系扩散得更多且表明可变的糖基化。当与非恶性对照细胞系和CaHPV10***癌细胞系相比时，α-半乳糖苷酶A的分泌形式的分子量在***癌细胞系22RV1、DU-145和LNCaP中更低。一些溶酶体蛋白的可变加工和增加的分泌可以具有用于区别***癌与非恶性细胞系的一些能力。
实施例3-内体和溶酶体基因的体内微阵列表达概况
***癌细胞中的改变的内体生物学的观察结果表明特异性内体基因和蛋白的增加表达可能严重地影响***癌的发展和/或进展。因此，改变的内体生物发生可以提供用来研究可用于***癌诊断和预后的生物标记物的新途径。然而，重要的是将体外观察结果与患者数据关联起来以确定新型变化是生物相关的。核实***癌微阵列数据库中具有改变的内体相关基因表达被视为这一过程中重要的第一步。
基因微阵列数据库允许研究患者中的生物标记物表达并测定与已知临床参数的任何相关性，其然后可以用于预测临床结果。
为了分析与患者结果有关的内体-溶酶体基因表达，选择一系列***癌微阵列数据库用于研究。多个微阵列组群可以获自Oncomine(LifeTechnologiesPty.,Ltd.)或GeneExpressionOmnibus以用于分析。在MemorialSloan-KetteringCancerCenter(MSKCC)通过根治性***切除术治疗的最近的患者组群也被选择且在本文中被称为Taylor组群。该组群包括150个原发性***癌和29个匹配的非恶性对照样品。对于Taylor组群来说，在鉴别癌症区域前收集和快速冷冻样本；对基于组织学评估含有大于70％的癌细胞内含物的样品进行RNA提取。使用AffymetrixHumanExon1.0ST阵列进行分析，且所得微阵列数据获自cBioCancerGenomicsPathwayPortal。还选择这个组群，因为它含有所有在体外分析的相关内体和溶酶体基因的表达数据。此外，这个组群中所使用的AffymetrixGene是由源于建立的RefSeq数据库34(2003年7月)的序列制作，其提供比使用AffymetrixGeneHGU95的先前微阵列更高的序列精确度。还分析了Tomlins等人的另一个微阵列并且在本文中被称为Tomlins组群，其是使用替代性微阵列技术而生成的；明确地说是非商业性定制阵列。该组群由非恶性***组织(n＝27)、***上皮内瘤(PIN；n＝13)、原发性癌(n＝32)和转移性癌组织(n＝20)组成。因此，除了确认针对Taylor组群所获得的结果以外，Tomlins组群还允许评估在从PIN到转移癌的整个疾病进展期间的可能是诊断相关的基因表达。使用激光捕获显微切割(LCM)收集Tomlins组群的***样品，其中从每个样品收集大约10,000个细胞。这种样品收集方法是有利的，因为可以增加对特定样品类型的特异性，其中癌症周围的组织不被捕获，从而实现更洁净的RNA制备和分析。由Glinsky等人分析的***癌患者组织包括从最初癌症检测的5年时间期间监测的癌症患者，以基于治疗后PSA水平测定复发率；且因此提供通过分析癌症进展期间的表达测定内体或溶酶体基因的预后性能力。这些不同微阵列数据库的分析旨在核实使用培养细胞在体外观察到的改变的基因表达，以及提供关于患者样品中的标记物表达的一致性的一些指示。
结果
(i)***癌中的溶酶体相关基因的表达独立于TFEB表达而改变。
影响内体和溶酶体生物发生的溶酶体相关基因诸如LIMP2的转录受转录因子EB(TFEB)调控。因此，TFEB基因表达可以提供在体内改变的内体和溶酶体生物学的证据。***癌中的TFEB表达相较于非恶性对照***组织没有改变(图13)，而***癌中的LIMP2表达相较于非恶性组织显著提高(P≤0.0001)。相反地，LAMP1(也是TFEB的标靶)在***癌中的表达相较于非恶性对照组织显著降低(P≤0.01)。分析其它受TFEB调节的溶酶体基因，以确定其表达是否独立于该转录因子而改变(图14)。当与使用Taylor组群的非恶性对照组织相比时，组织蛋白酶B(CTSB)在***癌组织中显示显著降低的表达(P≤0.0001)，而α葡糖苷酶(GAA)在***癌中的表达相较于非恶性对照组织显著提高(P≤0.05)。当与非恶性对照组织相比时，酸性神经酰胺酶、β葡糖苷酶(GBA)和α半乳糖苷酶A(GLA)的表达在Taylor组群中的***癌组织中没有显著改变。
(ii)APPL1在原发性***癌组织中具有显著提高的表达。
当与非恶性对照组织相比时，APPL1基因表达在来自Taylor组群的***癌组织中显著提高(P≤0.05；图15)。然而，虽然在体外观察到APPL2、RAB5A、EEA1、RAB4A和RAB7A的表达提高，但这些内体相关基因在原发性***癌中的表达相较于非恶性***组织没有显著差异(图15)。
(iv)溶酶体基因表达(图16)和早期内体相关基因表达(图17)在癌症进展期间改变。
还从Tomlins组群分析内体和溶酶体相关mRNA转录物的表达，以允许分析除原发性癌和非恶性组织之外的***上皮内瘤(PIN)和转移性癌组织。由于所使用的定制微阵列技术和相较于Taylor等人所用的商业性微阵列更有限的探针组，一些基因诸如TFEB的表达数据是无法得到的。Tomlins组群中的LIMP2和LAMP1的基因表达在非恶性对照和原发性***癌组织之间显示无显著变化(图16)。当与非恶性对照组织相比时，其它受TFEB调节的基因在***癌组织中展现差异表达；原发性癌组织中的组织蛋白酶B相较于非恶性组织显著减少(P≤0.05)，然而组织蛋白酶D、酸性神经酰胺酶、α葡糖苷酶或α半乳糖苷酶A的表达在非恶性组织与来自Tomlins微阵列的原发性癌组织之间没有显著变化(图16)。没有表达数据可用于该组群中的β葡糖苷酶。
贯穿进行性疾病状态的基因表达的分析揭示LIMP2表达在***上皮内瘤(PIN)中显著增加(P≤0.05；图16)；在转移组织中观察到LIMP2表达的变化，然而平均下降在统计上不显著。与非恶性组织相比，PIN和原发性癌中的LAMP1表达提高，且当与PIN(P≤0.05)和原发性***癌组织(P≤0.001)相比时，转移组织中的表达显著降低。当与非恶性对照组织相比时，原发性***癌和转移组织中的组织蛋白酶B表达显著下调(分别为P≤0.05和P≤0.001)。组织蛋白酶D表达在PIN、原发性癌和转移性疾病状态中显示一些降低，然而当与非恶性对照组织相比时，这在统计上不显著。在原发性癌组织中，酸性神经酰胺酶展现类似于在非恶性对照组织中所观察到的表达；然而，当与非恶性对照和原发性癌组织相比时，PIN组织表达显著提高(分别为P≤0.01和P≤0.05)。当与非恶性对照(P≤0.01)、PIN(P≤0.001)和原发性癌组织(P≤0.001)相比时，转移性***组织中的ASAH1表达显著降低。
与非恶性对照组织相比，原发性***癌中的APPL1表达显著增加(P≤0.05；图17)；然而APPL1的表达在转移性***组织与非恶性组织之间没有显著变化。与非恶性对照组织相比，PIN和原发性***癌中的APPL2的表达显著提高(分别为P≤0.05和P≤0.01)；而转移组织表达与非恶性组织类似的量的APPL2，且这在与PIN和原发性***癌组织相比时显著降低(分别为P≤0.01和P≤0.001)。当与原发性***癌组织相比时，转移性***组织中的RAB5A的表达显著降低(P≤0.05)，然而表达在非恶性、PIN或原发性***癌组织之间没有显著变化。与非恶性组织相比，原发性癌中的EEA1的表达显著提高(P≤0.01)；而相较于原发性***癌(P≤0.001)和PIN组织(P≤0.05)，在转移组织中观察到EEA1表达显著降低。与非恶性对照组织相比，原发性***癌中的RAB4A的表达是类似的；且当与原发性***癌组织相比时，PIN组织中的RAB4A的表达显著提高(P≤0.05)。当与非恶性对照(P≤0.001)、PIN(P≤0.001)和原发性***癌组织(P≤0.01)相比时，转移性***组织的RAB4A的表达显著降低。当与非恶性对照组织相比时，在来自Tomlins微阵列的PIN、原发性癌或转移性癌中没有观察到RAB7A表达的显著变化。
(v)组织蛋白酶B似乎在测定***癌患者的存活结果中显示一些预后价值。
基因表达的定量可以是用于***癌预后的有价值工具，因为一些溶酶体和内体基因的表达在PIN、原发性癌和转移性癌进展中有所变化。为了评估溶酶体基因的预后潜力，我们基于基因表达使用K均值聚类法将来自Glinsky组群的患者分成两组。Glinsky组群微阵列提供在活检组织上检测的初始PSA水平的数据和关于治疗后复发的信息。高或低组织蛋白酶B表达的聚类揭示具有低组织蛋白酶B表达量的患者的生化复发(BCR)风险显著增加。(图18)。通过LIMP2、LAMP1、组织蛋白酶D、酸性神经酰胺酶或α半乳糖苷酶A基因的高或低表达进行的分组未将患者显著分层至预后组中，然而对于α半乳糖苷酶A观察到趋势(P＝0.077；图18)。通过在Taylor和Tomlins组群中观察到的早期内体相关基因的表达增加，我们分析这些早期内体相关基因将患者分层至预后组中的潜力(图19)。然而，基于个别早期内体基因的表达通过K均值聚类法将患者分成两组，这种分类法没有将患者显著分离至预后组中。
(vi)溶酶体和内体基因表达的Kaplan-Meier分析在表达低PSA蛋白水平的癌症患者中显示显著的预后价值。
在诊断的时期，表达大于7.9ng/mL的PSA蛋白的患者在与低表达组相比时具有显著增加的BCR风险(HR2.422，P＝0.0087；图20)；然而具有表达低PSA的BCR的一部分患者(34％)将受益于改善的诊断和预后测定。将PSA≤7.8ng/mL的患者分层至高和低基因表达组中揭示高LIMP2表达导致BCR增加的趋势(图20B)。LAMP1的表达似乎没有显示任何预后价值。通过组织蛋白酶B表达进行的聚类指示，当与高表达组中的患者相比时，低表达组中的患者处于显著的BCR风险(HR0.2752，P＝0.019；图20B)。α半乳糖苷酶A的低表达也能够将患者分层至具有更高BCR风险的组中(HR0.3859，P＝0.0396；图20B)。
个别的RAB5A、APPL1和EEA1基因表达无法将患者分层至统计显著性风险组中(图21A)。然而，基于三基因标签的表达使用K均值聚类法进行的患者分层强烈地将患者分离至具有组合型RAB5A、APPL1和EEA1的低或高表达的两个组中(图21A)。Kaplan-Meier存活分析指示，当与低表达组中的那些患者相比时，三基因标签的高表达组中的患者处于显著更高的BCR风险(HR4.138，P＝0.0221，95％CI1.3950-2.270；图21B)。
讨论
内体和溶酶体生物发生通常由转录因子“EB”(TFEB)经由控制含有“CLEAR元件”的溶酶体基因的转录因子而调节。TFEB的靶基因包括LIMP2和LAMP1，它们在***癌细胞系中具有差异表达。虽然我们还在来自这些微阵列的***癌组织中观察到提高的LIMP2和降低的LAMP1基因表达，然而TFEB表达没有变化，这表明TFEB的正常作用可以在***癌中改变。
在癌症发展期间改变的基因表达可以是有价值的预后指标。酸性神经酰胺酶(ASAH1)的增加的表达可以有效用于诊断癌前PIN病变且可以与干预后改善的预后有关。
多变量风险分析以及将患者分层至低风险和高风险组可以提供用于***癌检测和治疗的更加个性化途径，从而减少过度诊断和过度治疗并由此降低患者发病率和死亡率。主动监测经常用于被认为具有低风险***癌的患者(例如临床类别T1c，Gleason得分≤6，且PSA≤10ng/mL)，然而较年长的男性处在***癌死亡风险增加的情况下，尽管存在这些低得分和PSA血清水平。代表注意的等待组的表达低PSA的***癌患者的存活曲线的检查揭示为侵袭性且导致更快的复发的***癌，然而其它因素诸如Gleason得分可以改善患者分层。通过三个内体基因APPL1、EEA1和Rab5A的基因标签的定量，在表达PSA≤7.8ng/mL的***癌患者中，导致患者分层至高风险和低风险复发组中。这些内体基因将患者分层至预后风险组中的能力表明它们在***癌的发展和进展中起重要作用且因此可以提供新的治疗标靶。
实施例4-用于***癌检测的内体标记物分泌的评价
结果
(i)细胞外内体蛋白区别非恶性与***癌细胞系(图2)。与非恶性对照细胞系相比，在***癌的培养基中检测到的APPL1和APPL2的量显著增加(P≤0.01)。当与非恶性对照相比时，在***癌细胞系的培养基中检测到的Rab5A的量也显著增加(大约20％；P≤0.05)。EEA1在来自LNCaP和22RV1***癌细胞系的培养基中被检测到，而在非恶性对照细胞系PNT1a或PNT2的培养基中没有被检测到(P≤0.01)。在来自***癌的培养基中检测到的Rab4的量相较于非恶性对照细胞系显著增加(P≤0.05)，然而在后者(PNT1a和PNT2细胞系)中检测到的量可以变化。与非恶性对照细胞系相比，在来自***癌的培养基中检测到Rab7的量显著降低(P≤0.05)。
讨论
目前，***特异性抗原(PSA)被用作诊断标记物，但这存在可靠性问题且仍然需要侵入性活检来进一步测定癌症发展的预期进程。因此，迫切需要新型生物标记物以实现***癌的准确检测和预后并避免不必要的、侵入性的和昂贵的程序。我们已经观察到在来自***癌细胞系的培养基中检测到的早期内体标记物的量显著增加。具体地说，当与非恶性对照相比时，与早期内体有关的囊泡机构(包括APPL1、APPL2、Rab5A和EEA1)以及再循环内体蛋白Rab4在来自***癌细胞系的培养基中显著升高，而晚期内体蛋白Rab7在***癌细胞中显示显著减少。
从***癌细胞系中分泌早期内体标记物APPL1、APPL2和EEA1而不分泌晚期内体标记物Rab7暗示内体隔室成熟为多泡体和外来体囊泡的过程在***癌中发生改变且因此可以用于区别***癌与非恶性组织。
在***癌中可以扰乱外来体形成的可能机制涉及囊泡GTP酶Rab5。Rab5的过度表达允许同时暴露Rab5蛋白上的PI3P和APPL结合域，这将有效地减少APPL1解离并实现EEA1的同步结合。因此，这可以导致Rab5阳性、EEA1阳性和APPL1阳性的内体。引发内体膜瓦解和内陷以形成外来体是由PI3P以及Hrs和ESCRT复合物的募集引起。***癌内体上的内体囊泡机构的不寻常组成可以倾向于在早期内体中形成外来体。这些外来体从早期内体中的释放然后将会解释从***癌细胞系观察到的早期内体囊泡机构的明显分泌。这种Rab5、EEA1和APPL1分泌可以提供测定的基础以允许检测***癌。
血液和尿液是用于检测外来体中分泌的囊泡机构的理想患者样品，因为它们代表用于非侵入性诊断测定的潜在分析物。
在比较非恶性对照和***癌细胞系时所观察到的早期内体和晚期内体标记物的改变的分泌提供了用于研究可以导致更准确的***癌检测和预后的诊断和预后标记物的新途径。此处的数据支持以下见解：内体生物学在***癌中被扰乱，从而导致从***癌细胞系分泌早期内体标记物增加和分泌晚期内体标记物减少。总结起来，这些结果表明早期内体标记物相对于晚期内体标记物的分泌的改变可以提供早期***癌检测所需的区别。
实施例5-一般材料和方法
材料
抗体和荧光探针
下表1详述了用于共焦显微术分析中的荧光缀合物抗体的性质。如果使用相同宿主种类的两种初级抗体进行双重标记，则使用IgG标记试剂盒(LifeTechnologiesAustraliaPtyLtd.,Victoria,Australia)直接标记这些初级抗体，其中根据制造商的说明书实施标记方案。用于蛋白质印迹和免疫荧光的初级抗体和次级缀合物的特定浓度详述于以下表格中。
表1-激光扫描共焦显微术中所用的荧光探针
表2-蛋白质印迹分析中所用的初级和次级抗体
表3-免疫荧光测定中所用的初级抗体和荧光团
细胞培养和提取物制备
细胞系
经由CellBankAustralia(Children’sMedicalResearchInstitute,NewSouthWales,Australia)从欧洲细胞培养物保藏所获得细胞系PNT1a和PNT2、22RV1和LNCaP克隆FCG。经由Cryosite(CryositeLtd.,NewSouthWales,Australia)从美国组织培养库获得细胞系RWPE-1、CaHPV10和DU-145。这些细胞系不在交叉污染或错误鉴别的细胞系列表(6.8版本，2012年3月9日)中。
***癌的任何研究应该等同地在正常的非癌***上加以研究。分析衍生自原发性或转移性***癌的细胞系导致需要源于健康***组织的细胞系。这造成关于健康细胞的正常***和复制循环的细胞培养问题。不同于将按常规速率繁殖的大多数癌细胞系，为了生成非癌细胞系，必须开发健康细胞以引起恒定的细胞循环和***速率。
因此，在该研究中用来代表正常上皮细胞表型的细胞系RWPE1、PNT1a和PNT2已经经过调整并利用病毒永生化。明确地说，使用人类***状瘤病毒-18(HPV18)使RWPE1细胞系永生化，且使用猿猴空泡病毒病毒40(SV40)使PNT1a和PNT2细胞系永生化。癌细胞系CaHPV10源自经HPV18永生化的***原发性腺癌。该细胞系并非雄激素响应性的。
22RV1癌细胞系源于异种移植物，其已经在亲代雄激素依赖性异种移植物的由***诱导的消退和复发后于小鼠中连续繁殖。该细胞系表达雄激素受体，然而其增殖对雄激素刺激不响应。
癌细胞系LNCaP之前源于***癌的***转移。该LNCaP细胞系为雄激素响应性。
癌细胞系DU145之前源于***癌的中等分化脑转移。它们是上皮细胞且对雄激素刺激不响应。
培养条件
将PNT1a、PNT2和22RV1细胞系维持在RoswellParkMemorialInstitute(RPMI)1640培养基(LifeTechnologies)中，该培养基补充有10％胎牛血清(FCS)(InVitroTechnologiesPtyLtd.,Victoria,Australia)和2mML-谷氨酰胺(SigmaAldrichPtyLtd.,NewSouthWales,Australia)。将RWPE1和CaHPV10细胞系维持在含有L-谷氨酰胺的角化细胞无血清培养基(K-SFM)()中，该培养基补充有供应的人类重组表皮生长因子153(EGF153)和牛垂体提取物(BPE)。将DU145细胞系维持在最低必需培养基(MEM)()中并补充2mML-谷氨酰胺和10％FCS。将癌细胞系LNCaP维持在补充有2mML-谷氨酰胺、10％FCS、10mMHEPES(LifeTechnologies)和1mM丙酮酸钠(SigmaAldrich)的RPMI1640培养基中。在含有5％CO2的加湿孵育器中于37℃下孵育细胞，该加湿培养器为SanyoMCO-17AICO2孵育器(SanyoElectricBiomedicalCo.,Ltd.,Osaka,Japan)。
使细胞在大约90％汇合下传代，用无菌dPBS(SigmaAldrich)洗涤，并使用含0.12％胰蛋白酶、0.02％EDTA的1x胰蛋白酶-EDTA溶液(SigmaAldrich)进行胰蛋白酶处理，直到其从培养烧瓶表面分离。使用含有10％RWPE1的生长培养基中和胰蛋白酶，并使培养于无血清培养基中的CaHPV10细胞系以250g沉淀五分钟并用dPBS洗涤以去除胎牛血清。使细胞以1:10至1:20的比率传代用于一般维持。
对于长期储存，将细胞系储存在液氮中。对于冷冻保存，按照标准方式使细胞培养物传代。在使用10％FCS进行胰蛋白酶失活后，通过以250g离心五分钟使细胞沉淀，并再悬浮于它们各自的含有10％FCS和10％DMSO的培养基(SigmaAldrich)中。在长期储存于液氮中之前，将细胞悬浮液的1mL等分试样于-80℃下储存在异丙醇冷冻容器(Nalgene,ThermoFisherScientificAustraliaPtyLtd.,Victoria,Australia)中过夜。
样品制备
用于免疫印迹的细胞提取物制备
将细胞系接种于T75烧瓶中并孵育在37℃和5％CO2下。在80-90％汇合下，抽吸培养基，用dPBS洗涤细胞一次，并用无血清培养基孵育细胞48小时。
使用稀释于Milli-QH2O中的含有20mMTris(pH7.0)、500mM氯化钠和2％SDS溶液的TNS缓冲液提取总细胞蛋白。将含有Tris和氯化钠的溶液制备到最终体积的80％，剩余20％体积包含10％SDS并在使用前30分钟内加入。在孵育48小时后，抽吸细胞培养基并用室温dPBS洗涤细胞两次。将800μLTNS缓冲液添加到培养烧瓶中并旋转以整个覆盖细胞层。通过使用橡胶细胞刮刀收集细胞，并将所得提取物转移至1.5mL管中。将提取物立即加热至65℃达五分钟并在高频率下超声波处理一分钟。
为了获得更均匀的裂解物，使细胞材料通过25号(0.65mm)注射针，总共6次。如果需要的话，添加额外的TNS缓冲液以产生较低粘性的裂解物。将样品储存在-20℃下。
根据制造商的说明书，使用二辛可宁酸测定(MicroBCAkit,Pierce,ThermoScientificPtyLtd.,Rockford,IL,USA)来量化总蛋白。使用WallacVictorTM光学读板仪和Workout软件v2.0(Perkin-ElmerPty,Ltd.,Victoria,Australia)，利用5点参数标准曲线来量化样品。
使在收获细胞时收集并之前储存在-80℃下的条件培养基解冻，并于4℃下使33mL等分试样以1000g离心10分钟以去除任何细胞碎片。将30mL上清液转移到50mL锥形管中并添加脱氧胆酸钠(DOC)(SigmaAldrich)至0.02％(v/v)的最终浓度。在短暂振荡后，将样品保存在冰上达30分钟。
将三氯乙酸(TCA)(SigmaAldrich)的100％(w/v)溶液添加成15％(v/v)的最终浓度，振荡搅动30秒，并在冰上孵育两小时，从而使蛋白质从培养基中沉淀。通过使样品以5,500g离心30分钟收集沉淀的蛋白质，其中含有TCA和污染废物的上清液被抽出。用4mL冰冷(-20℃)丙酮振荡洗涤蛋白沉淀并在室温下孵育五分钟。使所述样品进一步以5,500g离心30分钟并重复进行丙酮洗涤。在最后的离心步骤后，抽吸上清液，并在缓慢的氮气流下干燥含有蛋白沉淀的锥形管。将从30mL培养基产生的每种蛋白沉淀再悬浮于135μL1xSDS样品缓冲液/PBS溶液中，并储存在-20℃下供随后在蛋白质印迹测定中使用。
用于基因表达的定量分析的细胞提取物制备
如针对蛋白质印迹所描述将细胞系一式三份地培养在75cm2烧瓶中，并进行血清剥夺48小时。抽吸培养基并用dPBS洗涤烧瓶。将1mLTRI(AppliedBiosystemsPtyLtd.,Victoria,Australia)添加到每个T75烧瓶中并使用橡胶细胞刮刀刮取，并转移至1.5mL掀盖式管中。将样品储存在-80℃下直到进一步需要时。
用于通过共焦显微术进行免疫荧光分析的细胞培养物制备
按标准方式使细胞培养物传代，以低密度接种在22mm“1号”玻璃盖玻片(Menzel-ThermoFisherScientificAustraliaPtyLtd.,Victoria,Australia)上并在培养基中于37℃和5％CO2气氛下孵育48小时。48小时后，抽吸培养基并在室温下使用4％甲醛(v/v)PBS溶液固定细胞20分钟。用于PBS中的0.1％Triton-X(v/v)使固定细胞进一步透化10分钟。
蛋白质表达的定量分析
SDS-PAGE和转移
10μg来自细胞裂解物的总蛋白在样品缓冲液(LDS样品缓冲液(4x),LifeTechnologies)和含有50mM二硫苏糖醇的还原剂(样品还原剂(10x))中于100℃下热变性五分钟。在用SDS-PAGE电泳缓冲剂(LifeTechnologies)缓冲的XCellSureLockTMMini-Cell电泳***中，在120V(固定，具有可变电流)下使用10％15孔或12％17孔SDS-PAGE预制凝胶使制备的样品分离1.5小时。电泳后，在35V下历时1小时将分离的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Perkin-Elmer)上。
免疫印迹和检测
使用于TBS-吐温(0.1％)中的5％(w/v)脱脂乳溶液在室温下将膜阻断1小时，并且用稀释于5％脱脂乳中的适当抗体(表2.2)在4℃下伴随温和搅动孵育过夜。在用初级抗体孵育后，在室温下用TBS-吐温洗涤膜三次，历时五分钟。将在5％脱脂乳溶液中稀释到1/2000的辣根过氧化物酶缀合型次级抗体(表2.2)与PVDF膜在室温下伴随温和搅动一起孵育1小时。
历时五分钟用TBS-吐温洗涤膜三次，接着使用电化学发光(ECL)进行抗体检测。使用ECL化学发光底物试剂盒(LifeTechnologies)在黑暗中孵育膜一分钟，并且使用软件版本1.2.0.101的ImageQuantTMLAS4000成像仪(GEHealthcareBio-SciencesPtyLtd.,NewSouthWales,Australia)使其可视化。使用山羊α-GAPDHHRP缀合物(SigmaAldrich)在5％脱脂乳中的1:20,000稀释液中检测GAPDH上样对照。如果分子量将允许检测，则GAPDH的检测与初级抗体的次级HRP检测在室温下同步进行1小时。如果GAPDH和标记蛋白的分子量将有可能冲突，则剥离PVDF膜的初级抗体并用αGAPDHHRP缀合物再探测。
一式三份地进行印迹并使用AlphaViewSATM软件v3.0.0.0(ProteinSimple,SantaClara,California)量化图像。使用该软件进行泳道分析以测定检测蛋白质的分子量。基于信号密度和条带大小量化蛋白质的量并且归一化至源于条带分析的GAPDH信号。根据样品和群组大小使用聚类线性回归或Kruskal-Wallis秩和统计方法来测定所检测的蛋白质量在对照和癌细胞系之间的显著性。使用Stata/SEv11.2(StataCorpLP,Texas,U.S.A)进行检验。显著性结果为大于95％置信度(P≤0.05)。
膜剥离
继续进行初级抗体检测，剥离PVDF膜并探测用作总蛋白量的上样对照的GAPDH。将PVDF膜在含有0.02MTris、0.5MNaCl、2％SDS和100mMβ巯基乙醇于Milli-QH2O中的剥离缓冲液洗涤两次。将膜与缓冲液在55℃下一起用力搅动30分钟并伴随用力搅动用TBS-吐温在室温下进一步洗涤15、20和30分钟。使用于TBS-吐温中的5％脱脂乳在室温下阻断PVDF膜1小时，并使用HRP缀合型αGAPDH抗体的1:20,000稀释液进行GAPDH检测。
基因表达的定量分析
RNA提取
将具有TRI的冷冻细胞解冻并在室温下孵育五分钟。将200μL氯仿添加到每毫升用于细胞收获的TRI中。用力振荡样品一分钟，并在室温下静置三分钟。然后在4℃下，使样品以16,000g离心15分钟。
根据制造商的说明书，使用微型试剂盒(QiagenPtyLtd.,Victoria,Australia)进行RNA提取。将上层水相转移到新鲜管中并与70％乙醇等体积混合，稀释于无RNA酶的H2O中。将700μL样品转移到纯化柱(Qiagen)中，并以16,000g离心20秒。离心后，弃去穿透液并将剩余的样品/乙醇混合物上样到柱上，并以16,000g离心20秒。将350μLRW1缓冲液吸移至自离心柱膜上并且使柱以16,000g离心15秒。
根据制造商的说明书(LifeSciencesPtyLtd.,Victoria,Australia)，用DNA酶I处理样品以去除基因组DNA。用缓冲液RDD按1:7稀释DNA酶I原液，然后将其中的80μLDNA酶I溶液直接施加到离心柱膜上并在在室温下孵育15分钟。
再将350μL缓冲RW1添加到所述柱上并以16,000g离心15秒，随后用500μLRPE缓冲液洗涤两次。为了去除任何剩余缓冲液，使所述柱以16,000g离心2分钟，随后再以16,000g离心1分钟。通过将50μL无RNA酶H2O直接施加到离心柱膜上，然后以16,000g离心1分钟，实现每个样品的洗脱。将洗脱的RNA样品储存在-80℃下。
使用NanoDropTM2000分光光度计(ThermoFisherScientificAustraliaPtyLtd.,Victoria,Australia)在260nm下测定被提取的RNA的浓度。评估260/280nm和260/230nm比率以确保样品没有蛋白质和DNA污染，其中大于1.6的比率指示无污染样品。
cDNA合成
根据制造商的说明书，使用高容量RNA-to-cDNA试剂盒(LifeTechnologies)制备用于qRT-PCR的互补DNA(cDNA)。对于含有2μgRNA的20μL反应物来说，添加10μL预混合物缓冲液和1μL逆转录酶酶，并用无RNA酶H2O将体积补充至20μL。使用DNA帕尔贴热循环仪(PeltierThermalCycler)(Bio-RadLaboratoriesPty,Ltd.,NewSouthWales,Australia)进行扩增，其中在37℃下孵育反应混合物1小时，接着在95℃下孵育5分钟，然后冷却至4℃。将cDNA样品储存在-20℃下直到需要时。
引物设计
详述于下表2.4中的引物序列获自公开文献、哈佛引物库或使用NCBIPrimerBLAST来设计。选自哈佛引物库的引物是基于最终扩增子尺寸小于150个碱基对、熔融温度接近60℃和如果可能它们横跨外显子-外显子拼接的标准来选择的。使用Primer-BLAST设计的引物也具有这些标准。寡核苷酸购自GeneWorksPtyLtd,SouthAustralia。
定量RT-PCR
建立10μL反应混合物，其含有5μLPowerGreenPCRMasterMix(LifeTechnologies)、0.5μL各10nM正向和反向引物、用经DEPC处理的H2O稀释到1:25的2μLcDNA样品，并且用2μL经DEPC处理的H2O补足至10μL。将反应物一式三份地涂铺到96孔板(LifeTechnologies)上，其中每个板含有用于靶基因和内源性基因标准曲线的参照cDNA样品(来自LNCaP细胞系)的连续稀释液，以控制反应效率。
使用7500快速实时PCR***(LifeTechnologies)，利用ABI7500软件v2.0.2进行qPCR。
用于所有标靶的循环条件包括；50℃持续2分钟，95℃持续10分钟以激活酶并使cDNA变性，接着进行40个循环的95℃的15秒变性步骤和60℃的60秒延伸和信号采集步骤。在每次运行后产生熔融曲线，用于确认不存在引物二聚体或产物和其它污染物。
循环阈值(CT)是在扩增的指数期中和高于基线噪声下以0.35的阈值水平来推导的。通过CT值相对于从连续稀释的标准材料产生的标准曲线的计算来推导每个样品中的基因表达的相对量。通过从稀释标准物绘制的线性趋势线的斜率计算的反应效率在90到110％之间。在单个板上一式三份地评估每个标靶，其中一式三份的生物学重复独立地进行。从每个复制板上的mRNA量推导平均基因表达，其中每一个板提供复制孔的平均CT和mRNA水平。
表5-用于qPCR的引物序列
共焦显微术
免疫荧光标记
经由在室温下将固定细胞于5％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液中伴随缓慢搅动孵育2小时来降低非特异性抗体反应性。然后用稀释于5％BSA中的适当浓度的初级抗体(表2.3)在室温下孵育细胞2小时，随后用次级抗体在室温下孵育1小时。通过3次PBS洗涤去除未结合的抗体并将盖玻片固定在1mm显微镜载玻片上，该载玻片具有含DAPI核染剂的Gold抗淬灭试剂(LifeTechnologies)。
图像采集和处理
使用ZeissLSM710METANLO激光扫描显微镜(UniversityofSouthAustralia,Australia)和相关的CarlZeissZen2009软件进行共焦显微术。对DAPI、Alexa488、Cy3和Alexa633荧光利用370、488、543和633nm的激光线。根据荧光标靶将激光强度设置在5％与25％之间。为了消除荧光团之间的信号交叉，用位于每个通道之间的20nm间隙过滤发射荧光。通过具有4线平均值的帧间顺序扫描，以3.15μs的像素驻留时间捕获每个通道。将每个激光的针孔直径设置为1艾里单位。在1.4孔径的63x油浸物镜下观察细胞，并且应用2x光学放大。以1024px2的分辨率捕获具有16位灰度深度的图像。基于1024个像素的图像捕获分辨率和透镜和放大系数，每个像素的尺寸等于0.066μM。在每个盖玻片上随机选择至少四个细胞，且处理代表性图像用以形成附图。图像以灰度图16位TIFF文件形式输出并且使用CS5(AdobeSystemsInc.,SanJose,California,U.S.A)进行进一步处理。
细胞内运输和内吞的可视化
通过活细胞共焦显微术使Lyso阳性囊泡可视化，以防止可能发生于固定细胞中的Lyso泄漏。将细胞培养在DKSH疏水性腔室玻片(DKSHAustraliaPtyLtd.,Victoria,Australia)中的标准条件下。随后，将Lyso按1/200稀释于培养基中并添加到细胞中。在37℃下孵育5分钟后，使细胞培养物可视化。
对培养于本文所详述的标准条件中的细胞进行转铁蛋白内吞测定。在48小时时，将培养基替换为含有转铁蛋白-633缀合物的1/1000稀释液的新鲜培养基。将细胞孵育5、15或30分钟的时间，然后抽吸培养基，在dPBS中短暂洗涤细胞，并用4％PFA固定。用5％BSA将固定细胞阻断两小时，然后用鬼笔环肽-488缀合物孵育90分钟。通过3次PBS洗涤去除未结合的抗体并将盖玻片固定在1mm显微镜载玻片上，该载玻片具有含DAPI核染剂的Gold抗淬灭试剂(LifeTechnologies)。
转铁蛋白和内体标记物的共荧光。
将细胞孵育于本文所详述的标准条件中。在48小时时，将培养基替换为含有转铁蛋白-633缀合物的1/1000稀释液的新鲜培养基。用转铁蛋白-633培养基孵育细胞达20分钟的时间。随后，抽吸培养基，用dPBS短暂洗涤，固定并透化。如本文所详述，用初级和次级抗体进行标记。
公共***癌组群
Taylor组群由在MemorialSloan-KetteringCancerCenter(MSKCC)经根治性***切除术治疗的患者组成，使用AffymetrixHumanExon1.0ST阵列进行150个***癌和29个非恶性组织的概况分析。数据获自cBioCancerGenomicsPathwayPortal。Chandran组群由18个正常组织、65个原发性、25个转移性和63个正常的相邻非恶性组织组成。使用AffymetrixU95Av2人类基因阵列进行这些组织的表达概况分析。从NCBIGEO检索数据(登记号GSE6919)。Tomlins组群是从NCBIGEO检索到(登记号GSE6099)并且由32个原发性、20个转移性、13个***上皮内瘤(PIN)和27个正常组织样品组成。先前使用ChinnaiyanHuman20KHs6阵列进行了样品分析。来自MSKCC的另一个组群Glinsky组群是由79个恶性***组织组成的，且其具有用于评估***癌的生化复发(BCR)的106个月的临床随访数据。这个组群包括29个具有由PSA水平≥0.2ng/mL所限定的BCR的患者和50个无进展的患者。
使用具有Welch校正的双尾不成对t检验进行正常组织与***癌组织之间的统计分析。为了评价Chandran和Tomlins组群中的多个组之间的表达差异，进行Kruskal-Wallis与Dunn多重对比检验。使用具有Welch校正的双尾不成对t检验分析来自Glinsky组群的数据，以测定Gleason等级3和等级4组之间的差异。使用Stata/SEv11.2(StataCorpLP,Texas,U.S.A)实施K均值聚类法以确定高和低基因表达组，并且使用Kaplan-Meier存活曲线进行评价，其中利用Gehan-Breslow-Wilcoxon检验测定曲线之间的差异。使用GraphPadPrism5.03(GraphPadSoftwareInc.,California,U.S.A)进行所有统计检验。
实施例6-APPL1和RAB7的抗体的生成
从人类APPL1或RAB7的蛋白序列选择长度为15个氨基酸的表位，其预计具有适于在合成这些特异性序列的抗体后进行检测的强抗原性质:
APPL1：
表位#1位置145-159(人类):NRYSRLSKKRENDKV(SEQIDNO.7)。
表位#2位置265-279(人类):DPDPTKFPVNRNLTR(SEQIDNO.8)。
表位#3位置691-705(人类):SQSEESDLGEGGKKR(SEQIDNO.9)。
RAB7：
表位#1位置103-117(人类):RDEFLIQASPRDPEN(SEQIDNO.10)。
表位#2位置124-138(人类):GNKIDLENRQVATKR(SEQIDNO.11)。
表位#3位置183-197(人类):YNEFPEPIKLDKNDR(SEQIDNO.12)。
肽被合成并用于使兔免疫，从而生成多克隆抗体。
图23A示出了兔抗Appl1多克隆抗体对Appl1重组蛋白的亲和力。图23B示出了兔抗Rab7多克隆抗体对Rab7重组蛋白的亲和力。使用对纯化的APPL1或RAB7蛋白的表面等离振子共振(BiaCoreT100)测量所产生的多克隆抗体对上文所详述的肽的亲和力。结果示于图23中。Appl1#2(图23A)和Rab7#3(图23B)的亲和力最高，且具有最大的结合和洗涤后亲和力，这表明它们将在下游测定中结合更多的相应蛋白且适合作为用于DELFIA和夹心ELISA的捕获抗体。Appl1#3和Rab7#l显示对纯化蛋白显示良好的亲和力且将适于铕标记以在DELFIA测定中用于检测相应的靶蛋白。
图24A示出了用于直接DELFIA测定中的Rab7蛋白的铕标记兔抗Rab7多克隆抗体(针对表位#1培育)的标准曲线。之前以0.13mg/mL获得3.9mL标记抗体(0.51mg总Ab)，且铕标记产量大约为1.6。图24B示出了用于直接DELFIA测定中的Appl1蛋白的铕标记兔抗Appl1多克隆抗体(针对表位#3培育)的标准曲线。之前以0.11mg/mL获得4.8mL标记抗体(0.53mg总Ab)，且铕标记产量大约为3.8。
实施例7-其它标记物的诊断和预后价值
(i)在癌症进展期间改变的内体相关基因表达
从Tomlins组群分析内体相关mRNA转录物的表达，以允许分析除原发性癌和非恶性组织之外的***上皮内瘤(PIN)和转移性癌组织。
数据示于图25中。来自Tomlins等人的组群的溶酶体基因表达数据的垂直散点图。***癌组织的分析揭示在***癌进展期间改变的基因表达。量化源于27个非恶性组织、13个***上皮内瘤、32个原发性***癌和22个转移性癌组织样品的ChinnaiyanHuman20KHs6阵列(Tomlins等人2007)的表达概况数据以显示内体相关基因的相对表达。统计显著性由星号表示(**P≤0.01；***P≤0.001)。
Tomlins组群中的M6PR和IGF2R和STEAP4的基因表达在正常、PIN、原发性或转移性癌组织之间没有显示显著变化。当与转移组织相比时，MYO1B、ALIX和SDCBP在***癌组织中展示差异表达(P≤0.01)。在PIN与转移组织之间观察到MYO1B(P≤0.001)和PDCD6IP(P≤0.01)的表达显著降低，但对于SDCBP没有。MYO1B的表达在PIN组织中比在非恶性***组织中显著增加(P≤0.01)。
(ii)内体相关基因将患者分层在生化复发风险下的预后潜力
为了评估内体相关基因的表达的预后潜力，我们基于基因表达使用K均值聚类法将来自Glinsky组群的患者分成两组。Glinsky组群微阵列提供在活检组织上检测的初始PSA水平的数据和关于治疗后复发的信息。
图26示出了内体/溶酶体相关基因的Kaplan-Meier分析和基于生化复发(BCR)的患者分层。SORT1、MYO1B和PDCD6IP的基因表达将患者分层至预后风险组中。基于M6PR、IGF2R、SORT1、STEAP4、MYO1B、PDCD61P、SDC1和SDCBP基因表达的量(高-黑线，低-灰线)，通过K均值聚类法将Glinsky组群(Glinsky等人，2004)中的患者分层至两个组中。使用Gehan-Breslow-Wilcoxon检验进行分析。)。BCR：生化复发；HR：危险比；CI：置信区间。
高(黑线)或低(灰线)SORT1和MYO1B基因表达的聚类揭示高表达患者具有显著增加的生化复发(BCR)风险(分别为P≤0.01和P≤0.05)。表达较低量的PDCD6IP的患者处于显著更高的BCR风险(P≤0.05)中。通过M6PR、STEAP4、SDC1和SDCBP基因的高或低表达进行的分组未将患者显著分层至预后组中，然而对于IGF2R观察到一种趋势(P＝0.096)。相关表格示出了内体/溶酶体相关基因的Kaplan-Meier分析和基于生化复发(BCR)的患者分层。SORT1、MYO1B和PDCD61P的基因表达将患者分层至预后风险组中。基于M6PR、IGF2R、SORT1、STEAP4、MYO1B、PDCD61P、SDC1和SDCBP基因表达的量(高-黑线，低-灰线)，通过K均值聚类法将Glinsky组群(Glinsky等人，2004)中的患者分层至两个组中。使用Gehan-Breslow-Wilcoxon检验)进行分析。
(iii)内体相关基因在表达PSA≤7.8ng/的患者中的预后潜力。
图27示出了表达≤7.8ng/mLPSA的癌症患者中的溶酶体基因表达的Kaplan-Meier存活和多变量分析。溶酶体相关基因表达的Kaplan-Meier分析显示在表达≤7.8ng/mLPSA的患者中基于IGF2R、SORT1或PDCD61P表达的显著预后能力。从PSA≤7.8ng/mL的良好预后子组，基于M6PR、IGF2R、SORT1、STEAP4、MYO1B、PDCD61P、SDC1和SDCBP的基因表达(高表达-黑线，低表达-灰线)通过K均值聚类法将患者进一步分层至两个组中。使用Gehan-Breslow-Wilcoxon检验进行统计分析。BCR：生化复发；HR：危险比；CI：置信区间。
将PSA≤7.8ng/mL的患者分层至高和低基因表达组中揭示IGF2R(P≤0.01)、SORT1(P≤0.01)或ALIX(P≤0.05)的表达增加导致显著增加的BCR风险(图27)。M6PR和SDC1的低表达和MYO1B的高表达有将表达低PSA的具有风险的患者分层存在一种趋势。STEAP4或SDCBP的表达似乎对于那些表达低水平PSA的患者不显示任何预后潜力。
(iv)突触融合蛋白7(STX7)和突触融合蛋白12(STX12)的基因表达在***癌组织中显著降低。
从Taylor组群分析突触融合蛋白7和突触融合蛋白12mRNA转录物在***癌组织中相较于在非恶性组织中的表达。
图28在A组中示出了显示突触融合蛋白7和突触融合蛋白12的基因表达的百分比变化的盒须图；B组示出了来自Tomlins等人的组群的基因表达数据的垂直散点图。A组示出了源于150个原发性***癌和29个非恶性组织的AffymetrixHumanExon1.0ST阵列(Taylor2010)的表达概况数据被量化来显示STX7和STX12的基因表达的百分比变化。用Tukey离群值(黑点)绘制盒须图。统计显著性由星号表示(**P≤0.01；****P≤0.0001)。B组示出了***癌组织的分析揭示在***癌进展期间改变的STX7基因表达。量化源于27个非恶性组织、13个***上皮内瘤、32个原发性***癌和22个转移性癌组织样品的ChinnaiyanHuman20KHs6阵列(Tomlins等人2007)的表达概况数据以显示内体相关基因的相对表达。统计显著性由星号表示(*P≤0.05)。
与非恶性组织相比，原发性癌组织中的STX7(P≤0.01)和STX12(P≤0.0001；图28A)的表达存在统计上显著的降低。从Tomlins组群分析的***癌进展期间的STX7基因表达显示，转移组织的基因表达相较于原发性癌组织显著降低(P≤0.05；图28B)。
(v)突触融合蛋白7和12将患者分层在生化复发风险下的预后潜力。
为了评估突触融合蛋白7和12基因表达的预后潜力，我们基于基因表达使用K均值聚类法将来自Glinsky组群的患者分成两组。
图29示出了突触融合蛋白7和突触融合蛋白12基因表达的Kaplan-Meier存活分析。(A)溶酶体相关基因表达的Kaplan-Meier分析显示基于STX12表达的显著预后能力。(B)从PSA≤7.8ng/mL的“良好预后”子组，基于STX7和STX12的基因表达(高表达-黑线，低表达-灰线)通过K均值聚类法将患者进一步分层至两个组中。使用Gehan-Breslow-Wilcoxon检验进行统计分析。BCR：生化复发；HR：危险比；CI：置信区间。
高(黑线)或低(灰线)STX12基因表达的聚类揭示低表达患者具有显著增加的生化复发(BCR)风险(P≤0.01)，然而STX7没有预后能力(图29A)。将PSA≤7.8ng/mL的患者分层至高和低基因表达组中揭示降低的STX12表达导致显著增加的BCR风险(P≤0.05)(图29B)，而STX7没有将患者分层的能力。
(vi)内体相关机构的分泌量而非细胞内量在***癌细胞中显著改变。
使用蛋白质印迹来限定来自非恶性***细胞系(PNT1a和PNT2)和***癌细胞系(22RV1、DU-145和LNCaP)的细胞裂解物和培养基中ALIX、粘结蛋白聚糖-1和分拣蛋白-1的量。图30示出了细胞内的和分泌的内体相关蛋白的检测和定量。(A)来自非恶性对照细胞系PNT1a和PNT2以及癌细胞系22RV1、DU-145和LNCaP的细胞提取物(A；10μg全细胞裂解物)和培养基(B；在与汇合细胞孵育48小时后收集并校正细胞数的3mL培养物)中的内体相关蛋白/GAPDH的蛋白质印迹分析的代表性图像(一式三份检查)。
使用蛋白质印迹来限定来自非恶性***细胞系(PNT1a和PNT2)和***癌细胞系(22RV1、DU-145和LNCaP)的细胞裂解物和培养基中ALIX、粘结蛋白聚糖-1和分拣蛋白-1的量。虽然相较于非恶性细胞这些蛋白质的细胞内量在癌细胞中没有改变(图30A、C)，然而与非恶性对照细胞系相比，在***癌培养基中检测到的ALIX的量显著增加(P≤0.01；图30C、D)。与非恶性细胞相比，在***癌细胞系的培养基中检测到粘结蛋白聚糖-1和分拣蛋白-1的水平显著降低(P≤0.01)。
(vii)FGF1基因表达在***癌组织中降低。
图31示出了盒须图，其示出了FGF1的基因表达的百分比变化(Taylor组群)和Log2中值居中比(Grasso组群)；以及来自Tomlins等人的组群的基因表达数据的垂直散点图。用Tukey离群值(黑点)绘制盒须图。统计显著性由星号表示(**P≤0.01)。
微阵列中的FGF1基因表达的分析显示Grasso组群中具有统计显著性降低(P≤0.01)。在Taylor组群中有降低的迹象，然而这在统计上不显著。Tomlins组群中的FGF1表达在组织疾病阶段之间显示可变性。
(viii)FGF2基因表达在***癌组织中降低。
图32示出了盒须图，其示出了FGF2的基因表达的百分比变化(Taylor组群)和Log2中值居中比(Grasso组群)；以及来自Tomlins等人的组群的基因表达数据的垂直散点图。用Tukey离群值(黑点)绘制盒须图。统计显著性由星号表示(****P≤0.0001)。
微阵列中的FGF2基因表达的分析显示Taylor和Grasso组群中均具有统计显著性降低(P≤0.0001)。在来自Tomlins组群的组织类型中存在可变性，这可以归因于可用于该组群中的这种基因的有限数据。
(ix)FGF3基因表达在***癌组织中降低。
图33示出了盒须图，其示出了FGF3的基因表达的百分比变化(Taylor组群)和Log2中值居中比(Grasso组群)；以及来自Tomlins等人的组群的基因表达数据的垂直散点图。用Tukey离群值(黑点)绘制盒须图。统计显著性由星号表示(*P≤0.05)。
微阵列中的FGF3基因表达的分析显示Taylor组群中显著增加(P≤0.05)，然而Grasso组群中的FGF3表达没有显著增加。
(x)FGF2的Kaplan-Meier分析表明在具有较低FGF2表达的患者中增加的复发风险的趋势。
图34示出了FGF1、FGF2和FGF3基因表达的Kaplan-Meier存活分析。FGF相关基因表达的Kaplan-Meier分析示出了基于FGF2表达的一些潜在的预后能力。
FGF相关基因表达的Kaplan-Meier分析示出了基于FGF2表达的一些预后能力，然而这在统计上不显著。患者没有被分层至‘高’或‘低’FGF1或FGF3组中。
(xi)FGF相关基因的Kaplan-Meier分析在表达PSA≤7.8ng/mL的患者中显示预后价值。
图35示出了FGF1、FGF2和FGF3基因表达的Kaplan-Meier存活分析。从PSA≤7.8ng/mL的“良好预后”子组，基于FGF1、FGF2和FGF3的基因表达(高表达-黑线，低表达-灰线)通过K均值聚类法将患者进一步分层至两个组中。使用Gehan-Breslow-Wilcoxon检验进行统计分析。BCR：生化复发；HR：危险比；CI：置信区间。
FGF基因的高(黑线)或低(灰线)基因表达的聚类揭示了表达低PSA蛋白且具有低FGF2或FGF3表达的患者具有显著增加的生化复发风险(P≤0.05)，然而FGF1没有明显的预后能力。
(xii)FGFR1基因表达在***癌组织中降低。
图36示出了盒须图，其示出了FGFR1的基因表达的百分比变化(Taylor组群)和Log2中值居中比(Grasso组群)；以及来自Tomlins等人的组群的基因表达数据的垂直散点图。统计显著性由星号表示(****P≤0.0001；**P≤0.01)。
微阵列中的FGFR1基因表达的分析显示在Taylor和Grasso组群的***癌组织中具有统计显著性降低(P≤0.0001)。对于各个组织类型来说，在PIN组织中比在非恶性组织中减少，且基因表达在PIN与转移组织之间具有统计显著性增加(P≤0.01)。
(xiii)***癌组织中的FGFR2基因表达显著降低。
图37示出了盒须图，其示出了FGFR2的基因表达的百分比变化(Taylor组群)和Log2中值居中比(Grasso组群)；以及来自Tomlins等人的组群的基因表达数据的垂直散点图。统计显著性由星号表示(****P≤0.0001；***P≤0.001)。
微阵列中的FGFR2基因表达的分析显示在Taylor和Grasso组群的***癌组织中具有统计显著性降低(P≤0.0001)。在Tomlins组群中，对于各个组织类型来说，在PIN组织和转移组织中比在非恶性组织中减少，且原发性癌组织中的基因表达相较于非恶性组织具有统计显著性降低(P≤0.001)。
(xiv)FGFR3基因表达在***癌组织中显著降低。
图38示出了盒须图，其示出了FGFR3的基因表达的百分比变化(Taylor组群)和Log2中值居中比(Grasso组群)；以及来自Tomlins等人的组群的基因表达数据的垂直散点图。
微阵列中的FGFR3基因表达的分析显示***癌组织中的FGFR3表达与非恶性***组织相比没有显著变化。在Tomlins组群中，FGFR3的表达在每种疾病状态中相较于正常组织显示减少的迹象，然而这在统计上不显著。
(xv)FGFR相关基因的Kaplan-Meier分析显示在表达的患者中的预后价值。
图39示出了FGFR1、FGFR2和FGFR3基因表达的Kaplan-Meier存活分析。来自Glinksy组群的FGFR相关基因表达的Kaplan-Meier分析示出了基于FGFR2或FGFR3表达的一些潜在的预后能力。
FGFR基因的高(黑线)或低(灰线)基因表达的聚类揭示了具有更低FGFR2或FGFR3基因表达的患者相较于那些表达更高量的FGFR2或FGFR3的患者处于显著更大的生化复发风险(P≤0.05)。对于该数据集来说，表达FGFR1的患者没有显著分层。
(xvi)FGFR3的Kaplan-Meier分析显示在表达PSA≤7.8ng/mL的患者中的预后价值。
图40示出了FGFR1、FGFR2和FGFR3基因表达的Kaplan-Meier存活分析。从PSA≤7.8ng/mL的“良好预后”子组，基于FGFR1、FGFR2和FGFR3的基因表达(高表达-黑线，低表达-灰线)通过K均值聚类法将患者进一步分层至两个组中。使用Gehan-Breslow-Wilcoxon检验进行统计分析。BCR：生化复发；HR：危险比；CI：置信区间。
FGFR基因的高(黑线)或低(灰线)基因表达的聚类揭示了表达低PSA蛋白且具有低FGFR3表达的患者具有显著增加的生化复发风险(P≤0.001)。较低的FGFR2表达有表明生化复发风险增加的趋势。聚类至高或低FGFR1表达的组中未实现患者分层。
(xvii)NOX2蛋白在***癌细胞中显著增加。
图41示出了非恶性对照和***癌细胞系中的NOX2蛋白(65(56)和30kDa)的检测和定量。来自非恶性对照细胞系PNT1a和PNT2以及癌细胞系22RV1、DU-145和LNCaP的(A)10μg全细胞裂解物和(B)分泌性NOX2蛋白的蛋白质印迹分析的代表性图像，一式三份检查。(C)通过密度测定术相对于GAPDH内源性对照来量化胞内NOX2的量。(D)在蛋白质收集时将分泌性NOX2蛋白质的定量归一化至细胞计数。通过聚类线性回归分析数据，且统计显著性(P≤0.05)由星号表示。
使用蛋白质印迹法来限定来自非恶性***细胞系(PNT1a和PNT2)和***癌细胞系(22RV1、DU-145和LNCaP)的细胞裂解物和培养基中NOX2量。癌细胞中的NOX2(56kDa)的细胞内量相较于非恶性细胞显著增加(图41A、C)。NOX2的同种型(30kDa)在非恶性细胞和***癌细胞中表达，然而这没有显著改变。没有分泌56kDa形式的NOX2，然而有从***癌和非恶性细胞分泌30kDa同种型的迹象(图41B、D)。NOX2抗体-来自Abcam的兔多克隆，cat#ab31092，以1/2000稀释液(0.5μg/mL)使用。
(xviii)***癌组织中的NOX2基因表达改变。
图42示出了盒须图，其示出了NOX2的基因表达的百分比变化(Taylor组群)和Log2中值居中比(Grasso组群)；以及来自Tomlins等人的组群的基因表达数据的垂直散点图。统计显著性由星号表示(****P≤0.0001，**P≤0.01)。
从Tomlins、Taylor和Grasso组群中分析NOX2转录物的表达。与非恶性组织相比，NOX2的基因表达显示在Grasso组群的癌组织中显著增加(P≤0.0001)。Tomlins组群的疾病类型的分析揭示了在各个疾病阶段中改变的表达，以及原发性癌组织中的NOX2表达相较于非恶性正常***组织的显著增加(P≤0.01)。
(xix)***癌细胞中的NOX4相较于非恶性细胞未改变。
图43示出了非恶性对照和***癌细胞系中的NOX4蛋白的检测和定量。(A)来自非恶性对照细胞系PNT1a和PNT2以及癌细胞系22RV1、DU-145和LNCaP的10μg全细胞裂解物的蛋白质印迹分析的代表性图像，一式三份检查。(B)通过密度测定术相对于GAPDH内源性对照来量化细胞内NOX4蛋白的量。通过聚类线性回归分析数据，且在非恶性组与癌细胞系组之间未发现统计显著性。分析从这些细胞系分泌的蛋白质(参见NOX2)，然而未检测到NOX4的信号。
使用蛋白质印迹来限定来自非恶性***细胞系(PNT1a和PNT2)和***癌细胞系(22RV1、DU-145和LNCaP)的细胞裂解物和培养基中的NOX4量。癌细胞中的NOX4(63kDa)的细胞内量相较于非恶性细胞未改变(图43A、B)。没有检测到分泌的NOX4蛋白(数据未示出)。
(xx)***癌组织中的改变的NOX4基因表达。
图44示出了盒须图，其示出了NOX4的基因表达的百分比变化(Taylor组群)和Log2中值居中比(Grasso组群)；以及来自Tomlins等人的组群的基因表达数据的垂直散点图。统计显著性由星号表示(****p≤0.0001，**P≤0.01，*P≤0.05)。
从Tomlins、Taylor和Grasso组群分析NOX4转录物的表达。与非恶性组织相比，NOX4的基因表达显示在Taylor和Grasso组群的癌组织中显著增加(分别为P≤0.01和P≤0.0001)。与PIN组织相比，Tomlins组群的疾病类型的分析显示NOX4表达在转移组织中显著增加(P≤0.05)。NOX4抗体-来自Abcam的兔单克隆，cat#ab133303，以1/2000稀释液(0.5μg/mL)使用。
(xxi)***组织中改变的APPL1、Rab7和LIMPII表达(图49)。
图45示出了***组织中的APPL1、Rab7和LIMPII表达。匹配的人类非恶性(A、B、C)和恶性(D、E、F)***组织中的APPL1、Rab7和LIMPII。A中的箭头显示APPL1使非恶性***组织中的基底膜染色。在恶性***组织中：(D)虚线箭头显示APPL1使核和核仁二者染色，且实线箭头显示明显的核膜染色；(E)箭头显示明显的Rab7核膜染色；(F)箭头显示扩大的LIMPII阳性囊泡。比例尺＝100μM(A、B和C)和200μM(D、E、F)。所用抗体：兔抗APPL1#3(检测Ab)、兔抗Rab7#1(检测Ab)、绵羊抗LIMPIIAb。
使用免疫组织化学来研究APPL1、小GTP酶Rab7和LIMPII在***癌组织中的分布。内体标记物APPL1在非恶性***组织中显示明显的基底膜染色。在恶性组织中，与肿瘤团有关的染色似乎增加且在肿瘤细胞中有令人振奋地极为特异性的核和核仁染色。在非恶性组织中未看到这种染色。对于Rab7来说，在非恶性组织中的基质和腺样结构中观察到了特异性细胞质染色。相反地，在恶性组织中观察到清楚的核膜染色，其中细胞质染色的量在与正常组织相比时似乎降低。LIMPII染色在恶性和非恶性组织二者中显得类似，然而当与对照组织相比时，在恶性组织中观察到扩大的LIMPII阳性囊泡结构。
实施例8-基于一种或多种标记物的诊断/预后潜力的***癌诊断和治疗选项
诊断***癌的存在可以基于下列中的一种或多种进行：本文所描述任何标记物的一种或多种mRNA的mRNA表达水平、本文所描述的标记蛋白的水平、本文所描述的标记蛋白的分泌、本文所描述的生物流体中的标记蛋白的存在或基于本文所描述的任何标记蛋白的组织或活检组织样品的免疫组织学。
可以使用的选定标记物的实例包括以下蛋白质或其mRNA中的一种或多种：组织蛋白酶B、CAPTHESIND、α-半乳糖苷酶、RAB7、LIMP-1、LIMP-2、TFR1、TFR2、STAMP2、SORT1(分拣蛋白)、APPL1、EEA-1、LAMP-1、RAB4、APPL2、RAB5、RAB11、MPR、PAP、肌动蛋白、M6PR、IGFR2、MYO1B、PDCD6IP、SDCBP、SDC1、STX7、STX12、FGF1、FGF2、FGF3、FGFR1、FGFR2、FGFR3、NOX2和NOX4。
例如，可以使用空心针通过直肠移除***组织的圆柱形样品(活检组织)，并制备该样品的一部分用于组织学和免疫组织化学。如果***被手术切除，则病理学家可以制备***的切片供分析使用。
APPL1可以被选作合适的标记物并且如实施例1中所描述使用免疫组织化学进行分析，以使用APPL1特异性抗体测定APPL1的分布。APPL1描绘癌症边缘的轮廓且显示肿瘤团内的染色显著增加。这样的染色将指示***癌的存在。
基于使用如本文所描述的选定标记物进行的检测，各种治疗选项是可用的，这取决于除了本文所描述的选定标记物的预后价值之外或结合本文所描述的选定标记物的预后价值的癌症的诊断和/或预后和复发程度：
(i)低复发风险：
针对具有临床阶段T1-T2a、Gleason得分2-6、PSA<10ng/mL且预期寿命<10年的患者的治疗包括主动监测。
针对预期寿命≥10年的患者的治疗包括主动监测，或伴有或不伴有骨盆***切除(PLND)的根治性***切除术(RP)，如果***转移的预测概率≥2％；RP是用于局限性***癌的标准治疗，其涉及移除伴有或不伴有骨盆***的***和精囊；这可以使用开放式或腹腔镜(机器人辅助)技术两者来完成；或
还可能需要针对具有局限性疾病的患者的放射治疗，以及三维(3D)技术诸如3D适形放射治疗(3D-CRT)，其提供诸如降低毒性和使用更高剂量的益处；包括调强放射治疗(IMRT)的第二代技术，尤其是如果施用≥78Gy的剂量。
放射治疗剂量为75.6-79Gy(通常分36-41次)，利用3D-CRT/IMRT对***进行放射，伴随每日的图像引导放射治疗(IGRT)或短距离放射治疗(推荐剂量率：对于碘-125为145Gy且对于钯-103为125Gy)。
具有低风险癌症的患者通常不是骨盆***照射或雄激素剥夺治疗(ADT)的候选人。
(ii)中等复发风险：
针对具有临床阶段T2b-T2c、Gleason得分7、PSA10-20ng/mL且预期寿命<10年的患者的治疗包括主动监测；或
伴随每日IGRT的3D-CRT/IMRT放射治疗(剂量为78-80+Gy)，其伴有或不伴有4-6个月的短期新辅助/伴随/辅助ADT，且伴有或不伴有短距离放射治疗(推荐剂量率：对于碘-125为145Gy且对于钯-103为125Gy)。
针对预期寿命≥10年的患者的治疗推荐包括伴有PLND的RP，(如果***转移的预测概率≥2％)或伴随每日IGRT的3D-CRT/IMRT的放射治疗(剂量为78-80+Gy)，所述放射治疗伴有或不伴有4-6个月的短期新辅助/伴随/辅助ADT且伴有或不伴有短距离放射治疗(推荐剂量率：对于碘-125为145Gy且对于钯-103为125Gy)。
中等风险癌症考虑将短距离放射治疗(推荐剂量率：对于碘-125为145Gy且对于钯-103为125Gy)与EBRT(40-50Gy)结合，且伴有或不伴有4-6个月的新辅助/伴随/辅助ADT。
在放射之前、期间和之后施用ADT延长患者的存活。
(iii)高复发风险：
临床阶段T3a，Gleason得分8-10，PSA>20ng/mL
治疗选项包括伴有3D-CRT/IMRT的放射疗法(剂量为78-80+Gy)加2-3年的长期新辅助/伴随/辅助ADT，或伴随每日IGRT的3D-CRT/IMRT的放射治疗(剂量为78-80+Gy)加短距离放射治疗(推荐剂量率：对于碘-125为145Gy且对于钯-103为125Gy)(伴有或不伴有4-6个月的短期新辅助/伴随/辅助ADT或对于无固定的选定患者为RP加PLND)。
高风险癌症可以使用EBRT(40-50Gy)和短距离放射治疗的组合进行治疗，并伴有或不伴有4-6个月的新辅助/伴随/辅助ADT。
在本说明书中对任何现有技术的引用不能并且不应该被理解为承认或以任何形式暗示这种现有技术在任何国家中构成一般常识的部分。
在整篇说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包含(comprise)”或其变型如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解为暗示包括陈述的元素或整数或一组元素或整数，但不排除任何其它元素或整数或一组元素或整数。
如本文所使用，单数形式“一个/种”和“该”包括复数的方面，除非上下文已经另外说明。
可以按照任何合适的顺序进行本文中描述的所有方法，除非本文中另外指示或显然与上下文矛盾。本文中提供的任何和所有实例或示例性用语(例如，“诸如(suchas)”)的使用只是旨在更好地阐明示例性实施方案，并且不构成对要求保护的本发明的范围的限制，除非另外声明。本说明书中没有用语应该被解释为指示任何非要求保护的元素是必要的。
本文所提供的描述与可以具有共同的特性和特征的若干个实施方案相关。应该理解，一个实施方案的一个或多个特征可以与其它实施方案的一个或多个特征组合。另外，所述实施方案的单个特征或特征的组合可以构成其它实施方案。
本文所使用的主标题只是为了便于读者参考而被包含且不应被用于限制本公开或权利要求书全文中所发现主题。这些主标题不应该被用于解释权利要求的范围或权利要求限制。
未来的专利申请可以基于本申请而提交，例如通过要求保护来自本申请的优先权、通过要求保护分案状态和/或要求保护接续状态。应该理解，所附权利要求书仅作为实例而提供，且无意限制可以在任何此类未来申请中要求保护的内容的范围。权利要求书也不应该被认为限制对本公开的理解(或排除其它理解)。以后特征可以被添加到示例性权利要求或从示例性权利要求中省略。
虽然已经参照特定实施例描述了本公开，但本领域技术人员应了解，本公开可以以许多其它形式来体现。

Claims (58)

1.一种检测受试者中的***癌的方法，所述方法包括检测选自所述受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物的标记物，由此检测所述受试者中的***癌。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述选定标记物包括下列中的一种或多种：早期内体标记物、晚期内体标记物、与内体生物发生有关的标记物、与内体运输有关的标记物和与内体再循环有关的标记物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述选定标记物包括下列中的一种或多种：组织蛋白酶B、CAPTHESIND、α-半乳糖苷酶、RAB7、LIMP-1、LIMP-2、TFR1、TFR2、STAMP2、SORT1(分拣蛋白)、APPL1、EEA-1、LAMP-1、RAB4、APPL2、RAB5、RAB11、MPR、PAP、肌动蛋白、M6PR、IGFR2、MYO1B、PDCD6IP、SDCBP、SDC1、STX7、STX12、FGF1、FGF2、FGF3、FGFR1、FGFR2、FGFR3、NOX2、NOX4和/或编码上述中之一的mRNA、上述中之一的片段、上述中之一的衍生物和上述中之一的加工形式。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述选定标记物的改变的存在、改变的水平、改变的分泌和改变的分布中的一种或多种指示所述受试者中的***癌。
5.根据权利要求4所述的方法，其中下列中的一种或多种指示所述受试者中的***癌：RAB5蛋白和/或mRNA的水平升高、RAB5蛋白的分泌增加、APPL1蛋白和/或mRNA的水平升高、APPL1蛋白的分泌增加、EEA1蛋白和/或mRNA的水平升高、EEA1蛋白的分泌增加、LIMP-2蛋白和/或mRNA的水平升高、TFR1蛋白和/或mRNA的水平升高、TFR2蛋白和/或mRNA的水平升高、RAB4蛋白和/或mRNA的水平升高、RAB4蛋白的分泌增加、APPL2蛋白和/或mRNA的水平升高、LAMP1蛋白和/或mRNA的水平降低、RAB11蛋白的分泌增加、RAB7蛋白的分泌减少、CAPTHESINB蛋白或mRNA的水平降低、CAPTHESIND蛋白或mRNA的水平降低、α-半乳糖苷酶蛋白或mRNA的水平升高、STX7蛋白或mRNA的水平降低、STX12蛋白或mRNA的水平降低、PDCD6IP蛋白的分泌增加、SDCBP蛋白的分泌减少、SORT1蛋白的分泌减少、FGF1蛋白或mRNA的水平降低、FGF2蛋白或mRNA的水平降低、FGF3蛋白或mRNA的水平升高、FGFR1蛋白或mRNA的水平降低、FGFR2蛋白或mRNA的水平降低、FGFR3蛋白或mRNA的水平升高、NOX2蛋白或mRNA的水平升高以及NOX4蛋白或mRNA的水平升高、APPL1蛋白的核和/或核仁水平升高、RAB7蛋白的核膜水平升高和LIMP2蛋白阳性囊泡的扩大。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中改变的存在、改变的水平、改变的表达、改变的分泌和改变的分布是与非恶性组织、***上皮内瘤、原发性***癌和转移性***癌中的一种或多种相比。
7.根据权利要求6所述的方法，其中LIMP2蛋白或mRNA在***上皮内瘤中相较于非恶性***增加、LAMP1蛋白或mRNA在转移性***癌中相较于***上皮内瘤减少、LAMP1蛋白或mRNA在原发性***癌中相较于转移性***癌增加、CAPTHESINB蛋白或mRNA在原发性***癌中相较于非恶性组织减少、CAPTHESINB蛋白或mRNA在转移性***癌中相较于非恶性***减少、酸性神经酰胺酶蛋白或mRNA在***上皮内瘤中相较于非恶性***增加、酸性神经酰胺酶蛋白或mRNA在***上皮内瘤中相较于转移性***癌增加、酸性神经酰胺酶蛋白或mRNA在原发性***癌中相较于转移性***癌增加、APPL1蛋白或mRNA在原发性***癌中相较于非恶性组织增加、APPL2蛋白或mRNA在***上皮内瘤中相较于非恶性***增加、APPL2蛋白或mRNA在原发性***癌中相较于非恶性组织增加、APPL2蛋白或mRNA在***上皮内瘤中相较于转移性***癌增加、APPL2蛋白或mRNA在原发性***癌中相较于转移性***癌增加、RAB5蛋白或mRNA在转移性***癌中相较于非恶性***减少、EEA1蛋白或mRNA在转移性***癌中相较于非恶性***减少、EEA1蛋白或mRNA在***上皮内瘤中相较于转移性***癌减少、RAB4A蛋白或mRNA在转移性***癌中相较于非恶性***减少、RAB4A蛋白或mRNA在***上皮内瘤中相较于转移性***癌减少、RAB4A蛋白或mRNA在***上皮内瘤中相较于原发性***癌减少、RAB4A蛋白或mRNA在原发性***癌中相较于转移性***癌减少、MYO1B蛋白或mRNA在***上皮内瘤中相较于转移性***癌增加、MYO1B蛋白或mRNA在转移性***癌中相较于***上皮内瘤减少、MYO1B蛋白或mRNA在转移性***癌中相较于原发性***癌减少、PDCD6IP蛋白或mRNA在***上皮内瘤中相较于转移性***癌减少、PDCD6IP蛋白或mRNA在***上皮内瘤中相较于非恶性***减少、SDCBP蛋白或mRNA在转移性***癌中相较于原发性***癌减少、STX7蛋白或mRNA在转移性***癌中相较于原发性***癌减少、FGFR1蛋白或mRNA在转移性***癌中相较于***上皮内瘤增加、FGFR2蛋白或mRNA在原发性***癌中相较于非恶性组织减少、NOX2蛋白或mRNA在原发性***癌中相较于非恶性组织增加以及NOX4蛋白或mRNA在转移性***癌中相较于***上皮内瘤增加。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法包括从所述受试者获取生物样品和处理所述生物样品以允许检测所述选定标记物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述生物样品包括血液样品、血浆样品、血清样品、活检组织和***组织样品中的一种或多种。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述选定标记物的检测包括聚合酶链反应。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述选定标记物的检测包括免疫检测。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述方法包括检测两种或更多种选定标记物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述方法包括测定一种选定标记物与另一种选定标记物的水平的比率。
14.根据权利要求13所述的方法，其中与非恶性组织相比改变的比率指示所述受试者中的***癌。
15.根据权利要求14所述的方法，其中与非恶性组织相比早期内体标记物与晚期内体标记物的比率的增加指示所述受试者中的***癌。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述选定标记物的存在和/或水平与改变的***癌风险有关的一种或多种其它标记物和/或已知用于指示所述受试者中***癌的存在或不存在的一种或多种其它标记物的存在和/或水平进行比较。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述一种或多种其它标记物包括***特异性抗原。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括获取与所述受试者的一种或多种临床特征有关的信息以及结合所述选定标记物的存在、水平、分泌和分布中的一种或多种使用所述信息来检测所述受试者中的***癌。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述方法包括使用计算机处理器装置来处理与所述选定标记物的存在、水平、分泌和分布中的一种或多种有关和任选与一种或多种临床特征有关的数据，以便生成所述受试者中存在***癌的可能性和/或风险。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述***癌选自***上皮内瘤、原发性***癌和转移性***癌。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述方法被用于诊断所述受试者中的***癌、筛查所述受试者中的***癌、评估预后、测定***癌的转移潜能、鉴别患有***癌的受试者、鉴别易患***癌的受试者、测定所述受试者中的***癌的复发率、测定所述受试者中的***癌的死亡风险、将所述***癌分层、辨别所述受试者中的***癌与未患有***癌、测定所述***癌是否为器官局限性癌症、辨别***癌与良性***增生、***炎和***的炎性病状中的一种或多种、测定致病进展、评估所述***癌是缓慢生长性、顽固性还是侵袭性、排除所述受试者中的***癌的存在、鉴别适于针对***癌的治疗和/或手术的受试者以及测定受试者具有***癌的可能性或风险。
22.一种检测受试者中的***癌的方法，所述方法包括：
从所述受试者获取生物样品；
处理所述样品以允许检测选自内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物的标记物；
检测所述处理样品中的所述选定标记物的改变的存在、水平、分泌和分布中的一种或多种；以及
鉴别所述受试者中的***癌。
23.一种筛查受试者中的***癌的方法，所述方法包括检测标记物，所述标记物选自所述受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述方法被用于鉴别患有或易患***癌的受试者。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述方法被用于排除未患有或不易患***癌的受试者。
26.一种鉴别患有或易患***癌的受试者的方法，所述方法包括检测标记物，所述标记物选自所述受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
27.一种用于检测受试者中的***癌的诊断方法，所述方法包括检测标记物，所述标记物选自所述受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
28.一种测定受试者患有或易患***癌的可能性和/或风险的方法，所述方法包括检测标记物，所述标记物选自所述受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
29.一种测定受试者中的***癌的进展的方法，所述方法包括检测标记物，所述标记物选自所述受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述方法包括测定所述癌症的生化复发、复发率和/或存活率。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述标记物的水平指示降低的复发率和/或增加的存活率。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述标记物包括下列中的一种或多种：LIMP2、组织蛋白酶B、CAPTHESIND、α-半乳糖苷酶、RAB5A、EEA1、RAB7A、M6PR、IGFR2、SORT1、MYO1B、PDCD6IP、SDC1、STX12、FGF2、FGF3和/或编码上述中之一的mRNA、上述中之一的片段、上述中之一的衍生物和上述中之一的加工形式。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述标记物包括下列中的一种或多种：减少或更低的LIMP2、增加或更高的组织蛋白酶B、增加或更高的CAPTHESIND、增加或更高的α-半乳糖苷酶、减少或更低的RAB5A、减少或更低的EEA1、增加或更高的RAB7A、增加或更高的M6PR、减少或更低的IGFR2、减少或更低的SORT1、减少或更低的MYO1B、增加或更高的PDCD6IP、增加或更高的STX12、增加或更高的FGF2、增加或更高的FGF3和/或编码上述中之一的mRNA、上述中之一的片段、上述中之一的衍生物和上述中之一的加工形式。
34.根据权利要求29至33中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括鉴别所述受试者中的PSA表达水平和基于所述受试者中的所述PSA表达水平将所述标记物的表达分层。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述PSA为指示***癌的低风险的水平。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述PSA水平小于10ng/ml。
37.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述PSA为7.8ng/ml或更小的水平。
38.根据权利要求35至27中任一项所述的方法，其中所述标记物包括下列中的一种或多种：LIMP2、组织蛋白酶B、α-半乳糖苷酶、RAB5A、EEA1、M6PR、IGFR2、SORT1、MYO1B、PDCD6IP、SDC1、STX12、FGF2、FGF3和/或编码上述中之一的mRNA、上述中之一的片段、上述中之一的衍生物和上述中之一的加工形式。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述标记物包括下列中的一种或多种：减少或更低的LIMP2、增加或更高的组织蛋白酶B、增加或更高的α-半乳糖苷酶、减少或更低的RAB5A、减少或更低的EEA1、增加或更高的M6PR、减少或更低的IGFR2、减少或更低的SORT1、减少或更低的MYO1B、增加或更高的PDCD6IP、增加或更高的SDC1、增加或更高的STX12、增加或更高的FGF2、增加或更高的FGF3和/或编码上述中之一的mRNA、上述中之一的片段、上述中之一的衍生物和上述中之一的加工形式。
40.根据权利要求30所述的方法，其中所述标记物的水平指示增加的复发率和/或降低的存活率。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述标记物包括下列中的一种或多种：LIMP2、组织蛋白酶B、CAPTHESIND、α-半乳糖苷酶、RAB5A、EEA1、RAB7A、M6PR、IGFR2、SORT1、MYO1B、PDCD6IP、SDC1、STX12、FGF2、FGF3和/或编码上述中之一的mRNA、上述中之一的片段、上述中之一的衍生物和上述中之一的加工形式。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述标记物包括下列中的一种或多种：增加或更高的LIMP2、减少或更低的组织蛋白酶B、减少或更低的CAPTHESIND、减少或更低的α-半乳糖苷酶、增加或更高的RAB5A、增加或更高的EEA1、减少或更低的RAB7A、减少或更低的M6PR、增加或更高的IGFR2、增加或更高的SORT1、增加或更高的MYO1B、减少或更低的PDCD6IP、减少或更低的STX12、减少或更低的FGF2、减少或更低的FGF3和/或编码上述中之一的mRNA、上述中之一的片段、上述中之一的衍生物和上述中之一的加工形式。
43.根据权利要求40至43中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括鉴别所述受试者中的PSA表达水平和基于所述受试者中的所述PSA表达水平将所述标记物的表达分层。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述PSA为指示***癌的低风险的水平。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述PSA水平小于10ng/ml。
46.根据权利要求44或45所述的方法，其中所述PSA为7.8ng/ml或更小的水平。
47.根据权利要求44至46中任一项所述的方法，其中所述标记物包括下列中的一种或多种：LIMP2、组织蛋白酶B、α-半乳糖苷酶、RAB5A、EEA1、M6PR、IGFR2、SORT1、MYO1B、PDCD6IP、SDC1、STX12、FGF2、FGF3和/或编码上述中之一的mRNA、上述中之一的片段、上述中之一的衍生物和上述中之一的加工形式。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述标记物包括下列中的一种或多种：增加或更高的LIMP2、减少或更低的组织蛋白酶B、减少或更低的α-半乳糖苷酶、增加或更高的RAB5A、增加或更高的EEA1、减少或更低的M6PR、增加或更高的IGFR2、增加或更高的SORT1、增加或更高的MYO1B、减少或更低的PDCD6IP、减少或更低的SDC1、减少或更低的STX12、减少或更低的FGF2、减少或更低的FGF3和/或编码上述中之一的mRNA、上述中之一的片段、上述中之一的衍生物和上述中之一的加工形式。
49.一种试剂盒，其用于进行根据权利要求1至48中任一项所述的方法。
50.一种治疗受试者中的***癌的方法，所述方法包括：
检测选自所述受试者的内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物的标记物；以及
基于所检测的所述选定标记物的存在、水平、分泌和分布中的一种或多种治疗所述受试者。
51.一种分离或纯化的抗体，其被培育来针对包含下列中的一个或多个的氨基酸序列的多肽：ASNDHDAAINRYSRLSKKRENDKVKYEVTEDVYT(SEDIDNO.1)、DEVASDPLYYPDPDPTKFPVNRNLTRKAGYLNARNKT(SEQIDNO.2)、SEGQFVVLSSSQSEESDLGEGGKKRESEA(SEQIDNO.3)、任何上述氨基酸序列的抗原片段和/或任何上述氨基酸序列的变体或其抗原片段。
52.一种分离和/或纯化的抗体，其结合至包含下列中的一个或多个的人类APPL1蛋白中的氨基酸序列中的表位：ASNDHDAAINRYSRLSKKRENDKVKYEVTEDVYT(SEDIDNO.1)、DEVASDPLYVPDPDPTKFPVNRNLTRKAGYLNARNKT(SEQIDNO.2)、SEGQFVVLSSSQSEESDLGEGGKKRESEA(SEQIDNO.3)和/或所述蛋白的同源物、直系同源物或旁系同源物的等效区域。
53.一种分离和/或纯化的抗体，其被培育来针对包含下列中的一个或多个的氨基酸序列的多肽：PNTFKTLDSWRDEFLIQASPROPENFPFVVLGNKI(SEDIDNO.4)、DPENFPFVVLGNKIDLENRQVATKRAQAWCYSKNN(SEQIDNO.5)、ALKQETEVELYNEFPEPIKLDKNDRAKASAESCSC(SEQIDNO.6)、任何上述氨基酸序列的抗原片段和/或任何上述氨基酸序列的变体或其抗原片段。
54.一种分离和/或纯化的抗体，其结合至包含下列中的一个或多个的人类RAB7蛋白中的氨基酸序列中的表位：PNTFKTLDSWRDEFLIQASPRDPENFPFVVLGNKI(SEDIDNO.4)、DPENFPFVVLGNKIDLENRQVATKRAQAWCYSKNN(SEQIDNO.5)、ALKQETEVELYNEFPEPIKLDKNDRAKASAESCSC(SEQIDNO.6)和/或所述蛋白的同源物、直系同源物或旁系同源物的等效区域。
55.一种检测APPL1蛋白或其片段的方法，所述方法包括使用根据权利要求51或52所述的抗体来检测所述APPL1蛋白或其片段。
56.一种检测RAB7蛋白或其片段的方法，所述方法包括使用根据权利要求53或54所述的抗体来检测所述RAB7蛋白或其片段。
57.一种检测受试者中的***癌的方法，所述方法包括使用根据权利要求51至54中任一项所述的抗体来检测所述受试者中的APPL1或RAB7蛋白和/或其片段、衍生物或加工形式。
58.一种鉴别用于***癌的诊断和/或预后的选定标记物的方法，所述方法包括：
鉴别选自内体相关标记物和/或溶酶体相关标记物的标记物；以及
测定所述选定标记物诊断和/或预测***癌的能力；
由此鉴别所述标记物作为用于***癌诊断和/或预后的选定标记物。
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