CN106148554A

CN106148554A - 一种用于***癌检测的标志物及其在试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN106148554A
Application number: CN201610815031.1A
Authority: CN
Inventors: 刘昊
Original assignee: Beijing Zhicheng Biomedical Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Zhicheng Biomedical Technology Co Ltd
Priority date: 2016-09-09
Filing date: 2016-09-09
Publication date: 2016-11-23

Abstract

本发明公开了一种用于***癌检测的标志物,所述分子标记物为CCDC42B或该mRNA的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物。本发明进一步公开了一种检测个体患有***癌可能性的试剂盒，所述试剂盒含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。本发明还公开了该标志物检测***癌相关mRNA表达水平是否下调的方法。本发明的CCDC42B作为检测***癌的分子标记物，使***癌诊断，更加准确，快速。而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。

Description

一种用于***癌检测的标志物及其在试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及利用与***癌相关mRNA作为检测***癌的标志物及其在试剂盒中的应用。

背景技术

***癌是常见的男性生殖***恶性肿瘤之一。世界范围内，***癌发病率在男性所有恶性肿瘤中位居第二，在美国***癌的发病率已经超过肺癌，成为第一位危害男性健康的肿瘤。亚洲***癌的发病率远远低于欧美国家，但近年来呈现上升趋势，且增长比欧美发达国家更加迅速。***癌患者主要是老年男性，一般在50岁以后发病，95％发生于60岁以上的老年男性，发生率持续地随着年龄增长而增加。***癌早期多无任何症状，即使有所不适，也不足以引起病人的重视，当肿瘤增大压迫尿道时，又往往与***增生相混淆。在我国约80％的病人首先发现远处转移病灶才发现***癌。此时，病变已达晚期，预后不良。

***癌的临床诊断方式目前主要有血清***特异性抗原(PSA)检测、直肠指检、直肠超声波检测、活组织病理检查等。PSA(Prostate Specific Antigen)为***组织特异性抗原，由***的解剖结构可知PSA通过***导管进入血液和尿液中，一些病例或生理情况下PSA会进入血液中去，如***炎症、尿潴留、***感染、***增生和***癌等，因此通过检测血清PSA水平来预测***癌具有一定的假阳性率。从1991年开始，检测血清中PSA含量用于预测***癌，含量高于4ng/mL认为是***癌阳性，灵敏度79％，特异性20％-59％，平均灵敏度约33％，在浓度4-10ng/mL灰区部分，特异性是最低的，这时往往需要通过侵入性的穿刺活检进行确定，给患者带来极大痛苦及精神和经济负担。所以PSA并不能较好的作为诊断***癌的标志物。直肠指检是最简单、最经济实用的方法，主要通过医生的食指触摸***，用以发现很多无症状的***癌患者，有可能获得早期诊断及根治的机会。但以上的方法都存在局限性。例如直肠指检的局限性主要在4个方面：(1)患者***肿块不大时，易漏诊；(2)部分患者***癌肿大不明显，但已属于晚期，不易根治；(3)患者直肠有疾患时不能使用此检测；(4)医生经验不足时有漏诊或者误诊的可能。

近年来的研究表明，mRNA与***癌密切相关，它们可能参与肿瘤的发生、发展和转移，所以对肿瘤的发病机制、早期诊断、个体化治疗、转移的检测和预后等可能有相应的作用。

发明内容

为了实现***癌的早期诊断，个体化治疗，本发明的目的在于提供一种新的***癌mRNA，以及该mRNA的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是***癌相关mRNA在检测***癌中的用途。

为实现上述目的，本发明首先提供一种用于***癌检测的mRNA标志物，所述标志物为CCDC42B或该mRNA的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物；所述的CCDC42B或该mRNA的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物在***癌生物学样品中表达下调。

优选地，所述标志物包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，该核苷酸序列为CCDC42B基因的一部分序列。

进一步地，本发明提供了一种检测个体患有***癌可能性的试剂盒，所述的试剂盒含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

优选地，所述试剂盒包括SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的定量检测试剂；所述核苷酸序列定量检测试剂包括SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示的引物。

优选地，所述试剂盒包括10×Buffer、dNTP、MgCl₂、Taq酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂。优选地，所述试剂盒还包括人正常的***组织或细胞的总RNA或cDNA。

进一步地，本发明提供了一种检测***癌相关mRNA表达水平是否下调的方法。

(1)检测待测样品中***癌相关mRNA的表达水平，其中所述***癌相关mRNA是CCDC42B；

(2)将待测细胞中***癌相关mRNA的表达水平与对照相比较，从而确定***癌表达水平是否下调。

优选地，所述待测样品为细胞组织样本。

优选地，所述的细胞组织样品包括***癌组织和癌旁组织。

优选地，所述的癌旁组织为正常组织。

优选地，所述检测是通过基因芯片检测法、荧光定量PCR、蛋白质芯片检测法、免疫方法或抗原-抗体检测法进行。

优选地，所述免疫方法为ELISA检测和/或胶体金检测。

优选地，所述ELISA法为使用ELISA检测试剂盒，该试剂盒包括：包被CCDC42B单克隆抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。所述胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用市售的CCDC42B单克隆抗体或多克隆抗体。更优选地，所述的胶体金检测试剂盒是采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。更优选地，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗CCDC42B抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。

本发明的有益效果如下：

本发明公开了一种与***癌相关的CCDC42B，并进一步证实该CCDC42B或该mRNA的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物在***癌组织中表达下调。利用该mRNA检测***癌不仅能够快速有效的做到早期诊断，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。

附图说明

图1为***癌组织及癌旁组织CCDC42B表达情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。

本发明的发明人对***癌组织样本及癌旁组织样本的mRNA进行高通量转录组测序，通过生物信息学方法进行基因筛选，挑选出候选mRNACCDC42B，现有研究中并没有CCDC42B和***癌相关的报道，进一步，发明人进行了分子生物学方法验证，证实了CCDC42B在***癌细胞中表达下调。

本发明的CCDC42B是在本发明之前的已知mRNA，其基本信息如下：Genbank登录号：NCBI参考序列:NM_001144872.1，来源于人类基因组。

本发明还采用RT-PCR方法和基因芯片方法检测上述mRNA在***癌组织和癌旁正常组织的表达，并验证了该mRNA在***癌中表达下调。

本文使用的术语“表达下调”指对应于所表达基因的序列，其中序列量的测量证明，与从正常个体或从通过***癌分期确定与***癌不同的已鉴定疾病状态的个体中分离的生物学样品中的同一基因相比，所述基因在从患***癌或通过***癌分期确定的***癌已鉴定疾病状态的个体中分离的生物学样品中的表达水平降低。根据本发明，“表达下调”是指通过本发明方法杂交强度测量的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多的表达降低，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更低。

实施例1高通量测序筛选差异表达基因

1、取样

取2012年10月到2015年12月期间在北京协和医院泌尿外科手术中获得组织标本27例，所有标本均经病理学检查证实，其中癌旁组织样本8例、***癌标本19例，编号后置-80℃低温冰箱保存。

2、对组织样本进行总RNA提取

采用Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：

①加入Trizol，室温保存5分钟；

②加氯仿0.2mL，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5分钟-10分钟；

③12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；

④12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按1mL/mL Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5分钟；

⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；

⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-80℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。

3、RNA样品的质量分析

RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

4、高通量测序

测序平台为Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCR duplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了Gene Ontology和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异表达CCDC42B，该mRNA在***癌组织样本中表达下调。

实施例2RT-PCR验证***癌组织及癌旁组织CCDC42B表达情况

1、材料

34例***癌组织样本及8例癌旁组织样取自北京协和医院2012至2015年期间泌尿外科手术中***癌样本，对其进行分组及编号。所有样本均经过病理学检查证实。

2、方法

2.1对组织样本进行总RNA提取，同实施例1的提取方法。

2.2逆转录合成cDNA

采用III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μL反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA。将获得的cDNA样品稀释10倍后保存在-20℃冰箱备用。

2.3Real-Time PCR

2.3.1仪器及分析方法

用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2^-ΔΔCt法进行数据相对定量分析。

2.3.2引物设计

采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:NM_001144872.1

(CCDC42B)，内参选GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下：

表1 引物序列

2.3.3荧光定量PCR扩增

25μL反应体系中按表2依次加入以下成分：

表2 Real Time反应体系

组分	加入量
		2×mix	10μL
上游引物(10uM)	0.5μL
		下游引物(10uM)	0.5μL
模板	2μL
		加入灭菌蒸馏水	至25μL

用Power Green PCR Master Mix(invitrogen，货号4367659)分别对目的基因引物和内参基因引物进行扩增。实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95℃5min，(95℃15sec，61℃45sec)×35个循环。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。反应结束后，取5ul的PCR产物进行2％琼脂糖电泳，用快速胶回收试剂盒(invitrogen公司)将大小为307bp的片段进行切胶回收并测序，结果用blast软件进行同源性分析。

实验结果显示，实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2^-ΔΔCt×100％，比较CCDC42B在***癌组织和癌旁组织中的表达水平。结果如图1显示：与癌旁组织相比，CCDC42B在***癌患组织中的表达水平仅为癌旁组织中的48％，证明该mRNA表达下调；RT-PCR产物经回收后，在ABI3730全自动测序仪上测序，该307bp的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。用VectorNTI advance 10软件(Invitrogen公司)将该序列与CCDC42B整个mRNA序列进行比对，比对结果显示，如SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列为CCDC42B基因的一部分序列，符合率为100％。

实施例3基因芯片验证***癌组织及癌旁组织样本CCDC42B表达情况

1、材料的取得，同实施例2。

2、总RNA的提取，同实施例1的方法。

3、基因芯片验证

总RNA经线性化扩增后，cy3-UTP标记，荧光标记后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit纯化，用Amhion的RNA Fragmentation Reagents对标记好的cRNAs进行片段化处理。采用美国Agilent公司的人全基因表达谱芯片(4x 44K基因)，在芯片杂交炉中65℃杂交17h，然后洗脱、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner扫描仪扫描。

杂交后的芯片经芯片扫描仪读取数据点后，将数据导入分析软件，对于两组比值的自然对数绝对值大于2.0或小于0.5的mRNA作为差异表达mRNA。

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法，P<0.05差异有显著意义。结果显示，与癌旁组织样本相比，***癌组织样本中CCDC42B的mRNA水平仅为50％，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例4***癌检测试剂盒

基于实施例2得到的引物组，组装本发明所述的用于***癌的试剂盒，所述试剂盒包括特异扩增如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的引物对如SEQID NO:2和SEQ ID NO:3所示，和特异扩增内参基因(GAPDH)的引物对如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；还包括SYBR Green聚合酶链式反应体系，如PCR缓冲液、SYBR Green荧光染料、dNTPs。所述PCR缓冲液的成分为25mM KCL，2.5mM MgCL₂，200mM(NH₄)₂SO₄。

通过对引物浓度和退火温度的优化，最终确定反应体系如表3所示：

表3 PCR反应体系

组分	加入量
		SYBRGreen聚合酶链式反应体系	12.5μL
上游引物(10μM)	0.5μL
		下游引物(10μM)	0.5μL
模板cDNA	2.0μL
		加入灭菌蒸馏水	至25μL

最佳反应条件为：

95℃预变性5min，(95℃变性15sec，61℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40个循环，72℃延伸15min。

取待检测病人白某某的少量***细胞，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从***细胞中提取RNA，使用试剂盒中试剂，按照最佳反应体系与条件进行PCR反应，使用试剂盒中正常癌旁组织cDNA作为Real-TimePCR定量检测中的对照cDNA，检测组织样本如SEQID NO.1所示的核苷酸序列相对正常癌旁组织表达量变化。

检测结果，与正常癌旁组织相比，如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列在该检测病人***细胞表达水平仅为癌旁组织中的48％。经临床进一步检测，该例病人确定患有***癌，临床检测结果与本发明制备的试剂盒检测结果一致。据此推断，本***癌的诊断试剂盒可以明确区分出***癌患者，并以此为临床提供诊断线索。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种用于***癌检测的标志物，其特征在于，所述标志物为CCDC42B或该mRNA的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物。

2.如权利要求1所述的标志物，其特征在于，所述的CCDC42B或该mRNA的表达产物在***癌组织中表达下调。

3.如权利要求1或2所述的标志物，其特征在于，所述标志物包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

4.一种检测个体患有***癌可能性的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有如SEQID NO:1所示的核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的定量检测试剂；所述定量检测试剂包括SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示的引物。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括10×Buffer、dNTP、MgCl₂、Taq酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂。

7.一种检测***癌相关mRNA表达水平是否下调的方法，其特征在于，其包括如下步骤:

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述待测样品为细胞组织样本。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述检测是通过基因芯片检测法、荧光定量PCR、蛋白质芯片检测法、免疫方法或抗原-抗体检测法进行。