CN109182528A - 一种基于itgb5基因的胶质母细胞瘤辅助诊断、预后评价试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明生物医学专业领域，具体涉及一种基于ITGB5基因的胶质母细胞瘤辅助诊断、预后评价试剂盒及其使用方法。本发明描绘了胶质瘤中的ITGB5基因在胶质瘤中的功能作用，并制备成试剂盒，用来评价不良预后及放化疗的效果。

Description

一种基于ITGB5基因的胶质母细胞瘤辅助诊断、预后评价试剂 盒及其使用方法

技术领域

本发明属于生物医学专业领域，具体涉及一种基于ITGB5基因的胶质母细胞瘤辅助诊断、预后评价试剂盒及其使用方法。

背景技术

胶质母细胞瘤（GBM）是成人中枢神经***（CNS）中最主要的原发性恶性肿瘤。即使采用最大手术切除、放疗和辅助替莫唑胺化学治疗，GBM患者的中位生存期仅为12-15个月，只有约10％的GBM患者存活超过5年。近几年，针对肿瘤免疫微环境的研究越来越多，免疫疗法也已成为一种针对实体瘤的新策略，并在一些特定类型的癌症中彻底改变了治疗方法。例如，免疫检查点抑制剂如nivolumab和ipilimumab已经使一部分患有晚期黑色素瘤的患者能够长期存活，而在以前，这些患者是无法治愈的，中位生存期约为8个月。免疫应答的破坏是GBM的主要特征，尤其是间充质亚型。肿瘤介导的免疫抑制可以预防根除GBM细胞并促进肿瘤进展。由肿瘤细胞和肿瘤相关的非肿瘤细胞分泌的细胞因子如白细胞介素（IL）-10，IL-6和集落刺激因子1（CSF-1）在上述过程中起重要作用。

整合素是异二聚体细胞表面受体，由18个α-亚基和8个β-亚基组成，它们调节癌症中的多种生物学功能，包括增殖，粘附，迁移和侵袭；同时参与调节肿瘤免疫微环境，参与血管形成等。参与疾病进展的多种整合素及其与癌基因的相关性使其成为肿瘤治疗的有吸引力的靶点。ITGB5仅与ITGαV相关，通过多项研究与多种病理状况有关。ITGB5通过与内皮生长因子受体2（VEGF2）配合来增强细胞存活，从而抑制外源性细胞凋亡；在多种肿瘤中发现ITGB5参与血管生成。越来越多的证据支持ITGB5在促进癌细胞迁移，侵袭和转化生长因子β（TGF-β）诱导的上皮 - 间质转化（EMT）中的关键作用。而ITGB5在胶质瘤中的作用尚不知晓，因此，急需探究胶质瘤中ITGB5的作用并开发标志物为胶质母细胞瘤的诊疗提供辅助。

越来越多的研究显示，整合素相关基因，特别是ITGB5基因，可用来指导患者预后及评价治疗效果。目前，关于用于胶质瘤中ITGB5基因的试剂盒还未见报道。本发明描绘了胶质瘤中的ITGB5基因在胶质瘤中的功能作用，并制备成试剂盒，用来评价不良预后及放化疗的效果。

发明内容

鉴于现有技术存在的缺陷，本发明主要提供了一种基于ITGB5基因的胶质母细胞瘤辅助诊断、预后评价试剂盒及其使用方法，发现ITGB5基因在LGG（低级别胶质瘤）和GBM（胶质瘤母细胞瘤）中的转录表达水平存在显著差异。与LGG组织相比，ITGB5基因在GBM组织中表达显著上调，通过检测ITGB5基因转录水平的表达情况，可以诊断胶质瘤患者的恶性程度。同时，依据ITGB5基因的表达情况，可以评估患者预后情况及放化疗效果。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下。

一种基于ITGB5基因的胶质母细胞瘤辅助诊断、预后评价试剂盒，包括扩增ITGB5基因的PCR引物对，所述引物对为。

正向引物序列为5’-GGAAGTTCGGAAACAGAGGGT-3’。

反向引物序列为5’-CTTTCGCCAGCCAATCTTCTC-3’。

优选的，所述试剂盒还包括扩增管家基因GAPDH的PCR引物对，所述引物对为。

正向引物序列为5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’。

反向引物序列为5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

所述试剂盒还包括SYBR Green聚合酶链式反应体系，所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包括PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料、无酶水和荧光定量加样板。

所述试剂盒还包括RNA提取试剂，所述RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和RNase free 水。

所述试剂盒还包括将mRNA反转录为cDNA的体系，该反转录试剂5 X RT mastermix 为PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、Random 6 mers、Oligo dT Primer 、dNTPMixture、反应 Buffer，荧光定量PCR反应体系SYBR Premix Ex TaqTM。

一种基于ITGB5基因的胶质母细胞瘤辅助诊断、预后评价试剂盒及其使用方法，包括以下步骤。

(1)将获取的新鲜组织经过液氮处理研磨后进行RNA抽提。

(2)将抽提出的RNA反转录成对应的cDNA。

(3)将反转录后的cDNA进行对ITGB5和GAPDH基因的荧光定量PCR扩增。

(4)以GAPDH作为内参，记录每个反应的Ct值，检测结果以-ΔCt表示，其中ΔCt＝CtGene-CtGAPDH。

ITGB5基因在制备胶质母细胞瘤辅助诊断、预后评价试剂盒中的应用。

本发明相对现有技术，具有如下的优点及有益效果。

(1)本发明首次公开了ITGB5基因与胶质瘤疾病进展相关，ITGB5基因有望成为诊断GBM的分子标志物，并为研究胶质瘤疾病进展的分子机理提供新的思路。

(2) ITGB5基因在LGG和GBM中的转录表达水平存在显著差异，与LGG组织相比，ITGB5基因在GBM组织中表达显著上调，通过检测ITGB5基因转录水平的表达情况，可以诊断胶质瘤患者的恶性程度，从而可以制备含有ITGB5基因的胶质母细胞瘤辅助诊断试剂盒，利用检测基因转录水平表达的方式诊断胶质母细胞瘤的方法更加灵敏更加特异，有利于疾病早期的诊断。

(3)本发明首次证实了ITGB5基因在GBM中表达的高低与患者预后直接相关，高表达ITGB5的GBM患者与低表达ITGB5的患者相比，生存时间显著减少。通过检测ITGB5转录水平的表达情况，可以预估GBM患者的预后情况，从而制备含有ITGB5基因的胶质母细胞瘤预后评价试剂盒，可以更加精准、更加客观的评判患者预后，同时可以评价患者的放化疗敏感性。

(4)本发明还提示可以通过干预ITGB5的表达阻断胶质瘤疾病进展，其有可能作为胶质瘤未来靶向治疗的特定靶点，为胶质瘤疾病的治疗提供新思路。

附图说明

图1为ITGB5基因表达同级别、IDH1野生型及间质型（Mesenchymal）等恶性表型相关。

图2为ITGB5基因表达可以作为GBM和间质型（Mesenchymal）的诊断指标。

图3为临床组织标本中ITGB5基因mRNA和蛋白水平表达均同级别相关。

图4为ITGB5基因是GBM患者不良预后的标志。

图5为ITGB5参与GBM患者放化疗抵抗。

图6为敲低ITGB5表达可抑制胶质瘤细胞迁移、侵袭能力。

具体实施方式

下面通过具体实施例和附图对本发明做进一步详细说明。以下实施例仅对本发明进行进一步说明，不应理解为对本发明的限制。以下实施例中的实验方法如无特殊规定，均为常规方法，所涉及的实验试剂及材料如无特殊规定均为常规生化试剂和材料。

实施例。

1.ITGB5基因在数据库中差异显著，是胶质瘤恶性进展的标志。

本研究主要包含两大数据库平台，中国胶质瘤基因图谱(Chinese Glioma GenomeAtlas ，CGGA)和肿瘤基因图谱计划(The Cancer Genome Atlas，TCGA)。CGGA是2012年由北京天坛医院发起并建成的中国胶质瘤患者样本解析的数据库，是我国特有的能够揭示中国人胶质瘤发生发展分子机制的大型数据库，为我国胶质瘤研究提供了大量基础和临床支持。在CGGA数据库中(http://www .cgga .org .cn)，共计包含低级别胶质瘤(LGG)样本172例，GBM样本138例样本。ITGB5基因转录水平结果来自Illunima Hiseq 2000平台RNA-seq结果。TCGA项目组最初由美国国家肿瘤研究所(The national cancer institute，NCI)和美国国家人类基因组研究所(The national human genome research institute，NHGRI)组成，并发展成一个非常大的数据研究平台，低级别胶质瘤(LGG)及胶质母细胞瘤(GBM)作为其最早研究的肿瘤之一，具有大量全面的数据结果。TCGA RNA测序（RNAseq）数据集包括625例样本，其中LGG样品470例，GBM样本155例。

如图1A、B所示，在CGGA和TCGA RNA-seq数据库中，ITGB5基因在GBM患者组织中表达水平较LGG患者组织中表达水平显著上升(CGGA RNA-seq：P < 0.0001，TCGA RNA-seq：P< 0.0001)；此外， ITGB5在间质性GBM患者表达明显高于经典型和前神经元型GBM患者(图1C、D) (****：P < 0.0001)；而且，对GBM患者IDH1突变状态研究发现，ITGB5在IDH1野生型患者中表达高于突变型患者(图1E、F)。

2. 基于ITGB5基因在CGGA和TCGA RNA-seq胶质瘤组织样本中差异表达绘制GBM和间质型的诊断ROC曲线。

基于上述CGGA和TCGA RNA-seq胶质瘤组织样本，按照LGG和GBM的ITGB5表达水平，绘制用于诊断GBM的ROC曲线。在ROC曲线评价方法中，ROC曲线下的面积值AUC在大于0.5的情况下，越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5～0.7时有较低准确性，AUC在0 .7～0 .9时有一定准确性，AUC在0 .9以上时有较高准确性。结果如图2A、B所示，ITGB5诊断胶质母细胞瘤的ROC曲线下面积(AUC)分别为CGGA RNA-seq：0.654（图2 A，P < 0.0001），TCGA RNA-seq：0.647（图2 B，P < 0.0001），可以作为诊断GBM的指标。

鉴于间质型GBM恶性程度高，预后不良，本研究进一步验证ITGB5基因对GBM患者间质型的诊断效果，结果如图2C、D所示，ITGB5诊断GBM患者间质型的ROC曲线下面积(AUC)分别为CGGA RNA-seq：0.878（图2 C，P < 0.001），TCGA RNA-seq：0.739（图2 D，P < 0.001），即诊断具有一定准确性。

3. 临床组织样本检测LGG与GBM中ITGB5差异表达。

收集中国医科大学附属第一医院经病理诊断为低级别胶质瘤(LGG)样本21例，胶质母细胞瘤(GBM)组织样本21例，共计42例组织样本。对这些样本进行RNA提取和反转录，对反转录得到的cDNA进行ITGB5和GAPDH基因的荧光定量PCR扩增。结果如图3A所示，ITGB5基因在GBM患者组织中表达水平较LGG患者组织中表达水平显著上升(P<0 .0001)。进一步通过免疫组织化学（图3B）和western blot（图3C）的方法对相同组织样本进行检测，结果和PCR结果相一致。在成熟胶质瘤细胞系和胶质瘤原代细胞系中通过荧光定量PCR检测发现与人星形胶质细胞（NHA）相比，胶质瘤细胞系ITGB5基因表达明显增高（图3D），western blot的结果也得到了与荧光定量PCR一样的结果（图3E）。通过蛋白水平的验证，说明荧光定量PCR检测RNA能很好地反应ITGB5的蛋白表达，验证了RNA结果的可靠程度。

4. 基于ITGB5在临床组织中差异表达绘制GBM诊断ROC曲线。

基于上述收集的42例胶质瘤组织样本ITGB5的RNA表达水平，绘制用于诊断GBM的ROC曲线。结果如图3F所示，ITGB5诊断胶质母细胞瘤的ROC曲线下面积(AUC)为0.943，即诊断具有较高准确性。

5. 在CGGA RNAseq和TCGA RNAseq 数据库中ITGB5表达高低绘制生存曲线。

在CGGA RNAseq数据库中，针对GBM患者，根据ITGB5的mRNA表达水平由小到大排序，前69例为低ITGB5表达组，后69例为高ITGB5表达组，绘制生存曲线，图4A为在CGGARNAseq数据库中，基于ITGB5基因mRNA高低绘制的生存曲线。通过longrank test分析得P＝0.0046，即预后有统计学意义；在TCGA RNAseq 数据库中，针对155例GBM患者，根据ITGB5的mRNA表达水平由小到大排序，前77例为低ITGB5表达组，后78例为高ITGB5表达组，绘制生存曲线，图4B所示，longrank test分析得P＝0.0121，即预后有统计学意义。进一步说明在GBM中，高表达ITGB5的患者预后显著差于低表达ITGB5患者。

6. 在CGGA RNAseq和TCGA RNAseq 数据库中针对患者放疗情况，按照ITGB5表达高低绘制生存曲线。

在CGGA RNAseq数据库中，针对GBM患者，根据ITGB5的mRNA表达水平由小到大排序，前69例为低ITGB5表达组，后69例为高ITGB5表达组，根据患者是否接受放疗，分成ITGB5低表达+放疗、ITGB5高表达+放疗、ITGB5低表达+未放疗、ITGB5高表达+未放疗四组，每组人数分别为38例，42例，25例，19例，根据这四组患者绘制生存曲线，图5A为在CGGA RNAseq数据库中，基于ITGB5基因mRNA高低绘制的患者接受放疗情况生存曲线。在接受放疗的患者中，低表达ITGB5组患者生存时间高于高表达ITGB5组，longrank test分析P = 0.0009有统计学意义；在未接受放疗的患者中，低表达ITGB5组患者生存时间与高表达ITGB5组差异不显著，longrank test分析P = 0.3356没有统计学意义。

在TCGA RNAseq数据库中，针对GBM患者，根据ITGB5的mRNA表达水平由小到大排序，前77例为低ITGB5表达组，后78例为高ITGB5表达组，根据患者是否接受放疗，分成ITGB5低表达+放疗、ITGB5高表达+放疗、ITGB5低表达+未放疗、ITGB5高表达+未放疗四组，每组人数分别为64例，63例，9例，12例，根据这四组患者绘制生存曲线，图5B为在TCGA RNAseq数据库中，基于ITGB5基因mRNA高低绘制的患者接受放疗情况生存曲线。在接受放疗的患者中，低表达ITGB5组患者生存时间高于高表达ITGB5组，longrank test分析P = 0.0171, 有统计学意义；在未接受放疗的患者中，低表达ITGB5组患者生存时间与高表达ITGB5组差异不显著，longrank test分析P = 0.4501,没有统计学意义。通过CGGA RNAseq和TCGA RNAseq数据库中针对患者放疗情况绘制的ITGB5表达高低生存曲线，说明ITGB5参与了胶质瘤放疗抵抗过程，可以根据ITGB5表达量预测GBM患者放疗敏感性。

7. 在CGGA RNAseq和TCGA RNAseq 数据库中针对患者化疗情况，按照ITGB5表达高低绘制生存曲线。

在CGGA RNAseq数据库中，针对GBM患者，根据ITGB5的mRNA表达水平由小到大排序，前69例为低ITGB5表达组，后69例为高ITGB5表达组，根据患者是否接受化疗，分成ITGB5低表达+化疗、ITGB5高表达+化疗、ITGB5低表达+未化疗、ITGB5高表达+未化疗四组，每组人数分别为45例，38例，18例，23例，根据这四组患者绘制生存曲线，图5C为在CGGA RNAseq数据库中，基于ITGB5基因mRNA高低绘制的患者接受化疗情况生存曲线。在接受化疗的患者中，低表达ITGB5组患者生存时间高于高表达ITGB5组，longrank test分析P = 0.0058有统计学意义；在未接受化疗的患者中，低表达ITGB5组患者生存时间与高表达ITGB5组差异不显著，longrank test分析P = 0.8661没有统计学意义。在TCGA RNAseq数据库中，针对GBM患者，根据ITGB5的mRNA表达水平由小到大排序，前77例为低ITGB5表达组，后78例为高ITGB5表达组，根据患者是否接受化疗，分成ITGB5低表达+化疗、ITGB5高表达+化疗、ITGB5低表达+未化疗、ITGB5高表达+未化疗四组，每组人数分别为56例，55例，11例，18例，根据这四组患者绘制生存曲线，图5D为在TCGA RNAseq数据库中，基于ITGB5基因mRNA高低绘制的患者接受化疗情况生存曲线。在接受化疗的患者中，低表达ITGB5组患者生存时间高于高表达ITGB5组，longrank test分析P = 0.0072, 有统计学意义；在未接受化疗的患者中，低表达ITGB5组患者生存时间与高表达ITGB5组差异不显著，longrank test分析P =0 .5297没有统计学意义。通过CGGA RNAseq和TCGA RNAseq 数据库中针对患者化疗情况绘制的ITGB5表达高低生存曲线，说明ITGB5参与了胶质瘤化疗抵抗过程，可以根据ITGB5表达量预测GBM患者化疗敏感性。

8. 基于CGGA RNAseq和TCGA RNAseq 数据库GBM的Cox多因素回归分析。

年龄、IDH1突变状态、是否接受放疗、是否接受化疗及ITGB5的表达水平被纳入Cox多因素回归分析模型，分析这些因素与GBM预后的关系。分析结果如表1.（多因素COX分析提示该模型可作为CGGA RNAseq，GBM 数据库中独立预后因素）、表2.（多因素COX分析提示该模型可作为CGGA RNAseq，GBM 数据库中独立预后因素）。

表1.和表2分析结果为：在CGGA RNAseq和TCGA RNAseq数据库中得出的结果说明了ITGB5表达水平对GBM具有独立判断预后的价值(CGGA: P＝0.0039，TCGA: P＝0.0132)。

9. 在胶质瘤细胞系和胶质瘤原代细胞系中检测ITGB5对胶质瘤侵袭、迁移的影响。

构建ITGB5小干扰RNA，在胶质瘤细胞系LN229和胶质瘤原代细胞系DGC1228中分别验证两对siRNA的敲低效果，如图6A中所示，siITGB5-368，siITGB5-1218两对小干扰RNA与对照组相比，显著下调了LN229和DGC1228细胞系中ITGB5的mRNA水平，图6B进一步通过western blot方法在蛋白水平证明了siITGB5-368，siITGB5-1218两对小干扰RNA与对照组相比，显著下调了LN229和DGC1228细胞系中ITGB5的表达。如图6C所示，Transwell实验结果发现，与对照组相比siITGB5-368，siITGB5-1218下调ITGB5表达能显著抑制LN229和DGC1228的迁移和侵袭能力，侵袭和迁移能力直接反应GBM患者的复发情况，ITGB5表达与胶质瘤侵袭迁移能力相关，可以通过ITGB5表达量，预测GBM患者复发时间。

10. 基于ITGB5基因的胶质母细胞瘤辅助诊断试剂盒的制备。

胶质母细胞瘤辅助诊断试剂盒包括扩增ITGB5基因的PCR引物对、扩增管家基因GAPDH的PCR引物对、SYBR Green聚合酶链式反应体系、RNA提取试剂、mRNA反转录为cDNA的体系。

其中扩增ITGB5基因的PCR引物对为。

一种基于ITGB5基因的胶质母细胞瘤辅助诊断、预后评价试剂盒，包括扩增ITGB5基因的PCR引物对，所述引物对为。

正向引物序列为5’-GGAAGTTCGGAAACAGAGGGT-3’。

反向引物序列为5’-CTTTCGCCAGCCAATCTTCTC-3’。

所述试剂盒还包括扩增管家基因GAPDH的PCR引物对，所述引物对为。

正向引物序列为5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’。

反向引物序列为5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包括PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料、RNase free水和荧光定量加样板。

所述RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和RNase-free水。

所述反转录为cDNA的体系为5 X RT master mix ：PrimeScript RTase、RNaseInhibitor、Random 6 mers、Oligo dT Primer 、dNTP Mixture、反应 Buffer。

11 . 基于ITGB5基因的胶质母细胞瘤辅助诊断试剂盒的使用方法。

检测过程具体步骤如下。

1) 将待测的新鲜组织在液氮作用下研碎，在碎裂后的组织中加入1mL Trizol，使用1mL的移液枪反复吹打，室温孵育5min，充分分离核蛋白复合物。

2) 每管加入200ul氯仿，上下颠倒10次，室温放置3min，以12000rpm 转速于4℃离心15min，转移上层水相至新的EP管内(约500ul)。

3) 加入与上清液等体积的异丙醇(约500ul，4℃预冷)，颠倒混匀，室温静置10-20min(平均15min)，以12000rpm 转速于4℃离心10min，弃上清，可见少许白色沉淀。

4) 加入1ml 预冷的75%乙醇(RNase-free水稀释无水乙醇)，缓慢沿管壁加入，上下温和颠倒震荡，以7500rpm 转速于4℃离心5min。

5) 弃上清，室温干燥沉淀1-2min，加入RNase-free水50-100ul，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀。

6) 利用Nanodrop检测RNA的浓度及纯度。OD260/OD280比值在1.80-2.0之间，说明RNA纯度符合实验要求。

7) 反转录体系。

1ugRNA体积：X ul。

5X PrimeScript RT Master Mix: 4ul。

RNase free水：16-Xul。

总体系：20ul。

反转录条件为：37℃ 15min, 85℃ 5S, 4℃ 1min 。

8) 荧光定量PCR加样：将荧光定量板置于冰上，每个样本设3个复孔，将cDNA(稀释4～5倍，稀释后加2μL)。

荧光定量PCR体系为。

SYBR Premix Ex TaqTM: 10ul。

上游引物（10umol）: 1ul。

下游引物（10umol）: 1ul。

cDNA模板： 2ul。

RNase free水： 6ul。

总体系： 20ul。

9)加样结束后，使用PE手套小心将荧光定量板膜盖上密封板，离心，避免气泡产生。

10)设置程序：95℃10min95℃ 10min，95℃ 5S，60℃ 10S，72℃ 10S共进行40个循环循环+溶解曲线。

11)实验数据分析：以GAPDH作为内参，记录每个反应的Ct值，Ct值为每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。ΔCt＝CtGene-CtGAPDH，ΔCt越小表示其起始拷贝数越多，表达越高，以-ΔCt作为ITGB5表达量进行评价指标。

对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种基于ITGB5基因的胶质母细胞瘤辅助诊断、预后评价试剂盒，其特征在于，包括扩增ITGB5基因的PCR引物对，所述引物对为：

正向引物序列为5’-GGAAGTTCGGAAACAGAGGGT-3’

反向引物序列为5’-CTTTCGCCAGCCAATCTTCTC-3’。

2.一种用于胶质瘤中预后评价及化疗效果预测的干扰素相关试剂盒，其特征在于，优选的，所述试剂盒还包括扩增管家基因GAPDH的PCR引物对，所述引物对为：

正向引物序列为5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’

反向引物序列为5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

3.一种基于ITGB5基因的胶质母细胞瘤辅助诊断、预后评价试剂盒，其特征在于，包括SYBR Green聚合酶链式反应体系，所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包括PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料、无酶水和荧光定量加样板。

4.一种基于ITGB5基因的胶质母细胞瘤辅助诊断、预后评价试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括RNA提取试剂，所述RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和RNasefree 水。

5.一种基于ITGB5基因的胶质母细胞瘤辅助诊断、预后评价试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括将mRNA反转录为cDNA的体系，该反转录试剂5 X RT master mix 为PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、Random 6 mers、Oligo dT Primer 、dNTPMixture、反应 Buffer，荧光定量PCR反应体系SYBR Premix Ex TaqTM。

6.一种基于ITGB5基因的胶质母细胞瘤辅助诊断、预后评价试剂盒，其特征在于，试剂盒使用方法，包括以下步骤：

(1)将获取的新鲜组织经过液氮处理研磨后进行RNA抽提；

(2)将抽提出的RNA反转录成对应的cDNA；

(3)将反转录后的cDNA进行对ITGB5和GAPDH基因的荧光定量PCR扩增；

(4)以GAPDH作为内参，记录每个反应的Ct值，检测结果以-ΔCt表示，其中ΔCt＝CtGene-CtGAPDH。

7.一种基于ITGB5基因的胶质母细胞瘤辅助诊断、预后评价试剂盒，其特征在于，ITGB5基因在制备胶质母细胞瘤辅助诊断、预后评价试剂盒中的应用。