CN112375792B - 一种生物法制造pqq的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种生物法制造PQQ的方法,涉及生物发酵技术领域,该方法包括以下步骤:将生丝微菌活化后接种到种子培养基,得到种子液后,将种子液接种到发酵培养基,发酵培养得到PQQ;在发酵培养过程中补加发酵补加剂;所述发酵培养基包括:(NH4)2SO4、Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、MnCl2·5H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、KI、NaCl、香菇多糖、枸杞多糖、消泡剂、无水甲醇和余量水。通过在发酵过程中更进一步补加甲醇、甘油、枸杞多糖、香菇多糖和水溶性大豆异黄酮等组分,有助于促进发酵过程的进行,促进PQQ产量的提高。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域,具体涉及一种生物法制造PQQ的方法。
背景技术
吡咯喹啉醌(简称PQQ)是一种水溶性醌类化合物,是继烟酰胺核苷酸和黄素核苷酸之后发现的第3类氧化还原酶的辅酶,它可以防止活细胞被体内或体外的氧损伤,还可作为营养因子和维生素促进细胞生长和提高细菌在极端条件下的耐受性,具有十分重要的意义。由于PQQ的化学合成法复杂且副产物多,故而越来越多研究者关注其生物制造的方式并开展了一系列的研究。迄今为止,研究发现的能够产PQQ的菌属种类各异,包括生丝微菌属、食甲基营养菌属、黄色杆菌属、氧化葡糖杆菌属、乙酸钙不动杆菌属以及假单胞杆菌属等多种菌属,为PQQ的产生提供了多种可能。
中国专利CN104745513B公开了一株产吡咯喹啉醌的生丝微菌及其应用,该发明公开一株脱氮生丝微菌FJNU-R8,其培养液中吡咯喹啉醌产量较高,该菌株在以甲醇为碳源的培养基中培养4-6天,吡咯喹啉醌的产量为150-350mg/L,蛋白含量低,发酵性能稳定,该发明公开的生丝微菌可以应用于微生物发酵生产吡咯喹啉醌中。尽管整体而言,该发明中PQQ的产量较高,但其主要有赖于脱氮生丝微菌的特殊性,培养条件实则较为常规,对于一些普通的生丝微菌而言,在同等培养条件下,PQQ的产量受到限制,难以达到该值。
文献:尹芳,陆兵,陈国豪,等.甲醇利用型细菌发酵生产吡咯喹啉醌的培养条件[J].华东理工大学学报,2004(02):227-229.以甲醇为唯一碳源,对生丝微菌TH205进行培养,培养基中添加浓度为7μg/mL的Fe2+,并控制甲醇的流加速度使培养基中甲醇浓度为1mL/L时,细胞的生长情况较好,最终PQQ的发酵产量为26.6μg/mL。该文献主要采用了碳源补加以及培养基添加Fe2+来提高PQQ的产量,但该文献中PQQ的发酵产量仍非常低,难以满足生物发酵领域日益增长的需求。
针对现有技术中生丝微菌生产PQQ存在的产量低、效率低以及特殊菌株依赖性的问题,亟需寻找一种生物法制造PQQ的方法,使得该方法能够通过普通生丝微菌快速而高效地获得高产量的PQQ。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题,提供了一种生物法制造PQQ的方法,该方法通过发酵培养基、补加时间以及组分等的优化,有助于促进发酵过程的进行,促进PQQ产量的提高。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:
本发明提供了一种生物法制造PQQ的方法,包括以下步骤:
将生丝微菌活化后接种到种子培养基,得到种子液后,将种子液接种到发酵培养基,发酵培养得到PQQ;在发酵培养过程中补加发酵补加剂;
所述发酵培养基包括:(NH4)2SO4、Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、MnCl2·5H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、KI、NaCl、香菇多糖、枸杞多糖、消泡剂、无水甲醇和余量水。
进一步地,所述发酵培养基包括:(NH4)2SO4 2-3g/L、Na2HPO4 2-3g/L、KH2PO4 1-2g/L、MgSO4·7H2O 0.1-0.3g/L、CaCl2·2H2O 0.02-0.04g/L、MnCl2·5H2O 0.002-0.006g/L、ZnSO4·7H2O 0.002-0.006g/L、CuSO4·5H2O 0.0002-0.0006g/L、KI 0.01-0.02g/L、NaCl0.5-1g/L、香菇多糖0.2-0.5g/L、枸杞多糖0.3-0.7g/L、消泡剂0.2-0.5g/L、无水甲醇2-5g/L和余量水。
优选地,所述发酵培养基包括:(NH4)2SO42.5g/L、Na2HPO42.5g/L、KH2PO4 1.5g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、CaCl2·2H2O 0.03g/L、MnCl2·5H2O 0.005g/L、ZnSO4·7H2O 0.005g/L、CuSO4·5H2O 0.0005g/L、KI 0.02g/L、NaCl 0.8g/L、香菇多糖0.3g/L、枸杞多糖0.5g/L、消泡剂0.3g/L、无水甲醇3g/L和余量水。
进一步地,所述消泡剂为美国康普顿有限公司有机硅部生产的耐高温消泡剂SAG622。
进一步地,所述补加的过程包括:开始发酵90-120h进行第一次补加,发酵130-135h进行第二次补加。
进一步地,所述发酵补加剂包括甲醇、甘油、枸杞多糖、香菇多糖和水溶性大豆异黄酮。
进一步地,所述第一次补加中,发酵补加剂的补加量分别为:1-2mL/L甲醇、1-2mL/L甘油、0.1-0.2g/L枸杞多糖、0.2-0.3g/L香菇多糖和0.2-0.3g/L水溶性大豆异黄酮。进一步优选为1.5mL/L甲醇、1.5mL/L甘油、0.2g/L枸杞多糖、0.2g/L香菇多糖和0.25g/L水溶性大豆异黄酮。(此处的补加量为补加剂相对于发酵培养基的量)
进一步地,所述第二次补加中,发酵补加剂的补加量分别为:0.5-1mL/L甲醇、0.5-1mL/L甘油、0.1g/L枸杞多糖、0.1g/L香菇多糖和0.1g/L水溶性大豆异黄酮。(此处的补加量为补加剂相对于发酵培养基的量)
进一步地,所述种子培养基包括:(NH4)2SO4、Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、MnCl2·5H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、无水甲醇和余量水。
优选地,所述种子培养基包括:(NH4)2SO4 3g/L、Na2HPO4 3g/L、KH2PO42g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、CaCl2·2H2O0.03g/L、MnCl2·5H2O 0.006g/L、ZnSO4·7H2O 0.006g/L、CuSO4·5H2O 0.0007g/L、无水甲醇10mL/L和余量水。
进一步地,所述发酵培养基的接种量为发酵培养基总体积的1-10%。
进一步地,所述种子培养基的培养条件为:25-37℃,150rpm条件下震荡培养24h,pH=7-7.5。
进一步地,所述发酵培养基的培养条件为:25-37℃,150rpm条件下发酵6-8天。
本发明所取得的技术效果是:
在发酵培养过程中补加甲醇、甘油等碳源,有利于促进生丝微菌的发酵,而同时,研究发现当补加剂中大豆异黄酮、枸杞多糖以及香菇多糖的加入能够在碳源补加的同时,对发酵过程产生一定的影响,具体表现有效活性成分以及微量元素的作用对发酵的促进,此外,尽管大豆异黄酮对于某些特定菌类如金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌以及腊状芽孢杆菌等具有一定的抑菌作用,但当在本发明中进行补加时,少量大豆异黄酮补加也使得PQQ的产量发生了意外性的提高,尤其当其与枸杞多糖、香菇多糖等共同参与到发酵过程中时,通过补加时间、次数等的优化,将产生十分显著性的效果。
具体实施方式
值得说明的是,本发明中使用的生丝微菌为普通生丝微菌ATCC27499,使用的消泡剂为耐高温消泡剂SAG622,其余原料均为普通市售产品,因此对其来源不做具体限定。
实施例1
一种生物法制造PQQ的方法,包括以下步骤:
将生丝微菌活化后接种到种子培养基,得到种子液后,将种子液接种到发酵培养基,发酵培养得到PQQ;在发酵培养过程中补加发酵补加剂;
其中,种子培养基包括:(NH4)2SO4 3g/L、Na2HPO4 3g/L、KH2PO42g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、CaCl2·2H2O0.03g/L、MnCl2·5H2O 0.006g/L、ZnSO4·7H2O 0.006g/L、CuSO4·5H2O0.0007g/L、无水甲醇10mL/L和余量水。种子培养基的培养条件为:25℃,150rpm条件下震荡培养24h,pH=7-7.5。
发酵培养基包括:(NH4)2SO4 2g/L、Na2HPO4 2g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、CaCl2·2H2O 0.02g/L、MnCl2·5H2O 0.002g/L、ZnSO4·7H2O 0.002g/L、CuSO4·5H2O0.0002g/L、KI 0.01g/L、NaCl 0.5g/L、香菇多糖0.2g/L、枸杞多糖0.3g/L、消泡剂0.2g/L、无水甲醇2g/L和余量水。发酵培养基的培养条件为:25℃,150rpm条件下发酵8天。发酵培养基的接种量为发酵培养基总体积的10%。
补加的过程包括:开始发酵120h进行第一次补加,发酵135h进行第二次补加。该过程使用的发酵补加剂包括甲醇、甘油、枸杞多糖、香菇多糖和水溶性大豆异黄酮。其中,第一次补加中,发酵补加剂的补加量分别为:1mL/L甲醇、1mL/L甘油、0.1g/L枸杞多糖、0.2g/L香菇多糖和0.2g/L水溶性大豆异黄酮。第二次补加中,发酵补加剂的补加量分别为:0.5mL/L甲醇、0.5mL/L甘油、0.1g/L枸杞多糖、0.1g/L香菇多糖和0.1g/L水溶性大豆异黄酮。(此处的补加量为补加剂相对于发酵培养基的量)。
实施例2
一种生物法制造PQQ的方法,包括以下步骤:
将生丝微菌活化后接种到种子培养基,得到种子液后,将种子液接种到发酵培养基,发酵培养得到PQQ;在发酵培养过程中补加发酵补加剂;
其中,种子培养基包括:(NH4)2SO4 3g/L、Na2HPO4 3g/L、KH2PO42g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、CaCl2·2H2O0.03g/L、MnCl2·5H2O 0.006g/L、ZnSO4·7H2O 0.006g/L、CuSO4·5H2O0.0007g/L、无水甲醇10mL/L和余量水。种子培养基的培养条件为:37℃,150rpm条件下震荡培养24h,pH=7-7.5。
发酵培养基包括:(NH4)2SO4 3g/L、Na2HPO4 3g/L、KH2PO42g/L、MgSO4·7H2O 0.3g/L、CaCl2·2H2O 0.04g/L、MnCl2·5H2O 0.006g/L、ZnSO4·7H2O 0.006g/L、CuSO4·5H2O0.0006g/L、KI 0.02g/L、NaCl 1g/L、香菇多糖0.5g/L、枸杞多糖0.7g/L、消泡剂0.5g/L、无水甲醇5g/L和余量水。发酵培养基的培养条件为:37℃,150rpm条件下发酵6天。发酵培养基的接种量为发酵培养基总体积的10%。
补加的过程包括:开始发酵90h进行第一次补加,发酵130h进行第二次补加。该过程使用的发酵补加剂包括甲醇、甘油、枸杞多糖、香菇多糖和水溶性大豆异黄酮。其中,第一次补加中,发酵补加剂的补加量分别为:2mL/L甲醇、2mL/L甘油、0.2g/L枸杞多糖、0.3g/L香菇多糖和0.3g/L水溶性大豆异黄酮。第二次补加中,发酵补加剂的补加量分别为:1mL/L甲醇、1mL/L甘油、0.1g/L枸杞多糖、0.1g/L香菇多糖和0.1g/L水溶性大豆异黄酮。(此处的补加量为补加剂相对于发酵培养基的量)。
实施例3
一种生物法制造PQQ的方法,包括以下步骤:
将生丝微菌活化后接种到种子培养基,得到种子液后,将种子液接种到发酵培养基,发酵培养得到PQQ;在发酵培养过程中补加发酵补加剂;
其中,种子培养基包括:(NH4)2SO4 3g/L、Na2HPO4 3g/L、KH2PO42g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、CaCl2·2H2O0.03g/L、MnCl2·5H2O 0.006g/L、ZnSO4·7H2O 0.006g/L、CuSO4·5H2O0.0007g/L、无水甲醇10mL/L和余量水。种子培养基的培养条件为:30℃,150rpm条件下震荡培养24h,pH=7-7.5。
发酵培养基包括:(NH4)2SO42.5g/L、Na2HPO42.5g/L、KH2PO4 1.5g/L、MgSO4·7H2O0.2g/L、CaCl2·2H2O 0.03g/L、MnCl2·5H2O 0.005g/L、ZnSO4·7H2O 0.005g/L、CuSO4·5H2O0.0005g/L、KI 0.02g/L、NaCl 0.8g/L、香菇多糖0.3g/L、枸杞多糖0.5g/L、消泡剂0.3g/L、无水甲醇3g/L和余量水。发酵培养基的培养条件为:30℃,150rpm条件下发酵7天。发酵培养基的接种量为发酵培养基总体积的10%。
补加的过程包括:开始发酵100h进行第一次补加,发酵132h进行第二次补加。该过程使用的发酵补加剂包括甲醇、甘油、枸杞多糖、香菇多糖和水溶性大豆异黄酮。其中,第一次补加中,发酵补加剂的补加量分别为:1.5mL/L甲醇、1.5mL/L甘油、0.2g/L枸杞多糖、0.2g/L香菇多糖和0.25g/L水溶性大豆异黄酮。第二次补加中,发酵补加剂的补加量分别为:0.8mL/L甲醇、0.8mL/L甘油、0.1g/L枸杞多糖、0.1g/L香菇多糖和0.1g/L水溶性大豆异黄酮。(此处的补加量为补加剂相对于发酵培养基的量)。
对比例1
与实施例3的区别仅在于,在发酵过程中不进行任何补加。
对比例2
与实施例3的区别仅在于,在发酵过程中仅补加甲醇以及甘油,补加量与实施例3一致。
对比例3
与实施例3的区别仅在于,第一次补加中,发酵补加剂的补加量分别为:0.8mL/L甲醇、2.2mL/L甘油、0.08g/L枸杞多糖、0.35g/L香菇多糖和0.1g/L水溶性大豆异黄酮。第二次补加中,发酵补加剂的补加量分别为:0.4mL/L甲醇、1.2mL/L甘油、0.08g/L枸杞多糖、0.12g/L香菇多糖和0.08g/L水溶性大豆异黄酮。
对比例4
与实施例3的区别仅在于,发酵补加剂中不含有大豆异黄酮。
发酵结束后采用NBT-Gly化学法测定实施例1-3以及对比例1-4发酵上清液中PQQ含量并测定生物量(OD600),得到表1。
表1
由表1可知,本发明中实施例1-2的制造PQQ的方法,最终得到的PQQ产量可达328.0-340.5μg/mL,生物量(OD600)可达20-25。而当在发酵中不进行补加,亦或是补加过程中补加的具体成分或者补加量发生改变时,PQQ产量以及生物量均有所减少。而当发酵补加剂中不加入大豆异黄酮时,如对比例4所示,PQQ产量与生物量相比于实施例3也有明显的下降。由此可知,PQQ制造过程中补加的重要性,尤其,发酵补加剂的成分以及含量均能够影响发酵过程,最终得到产量的改变,在发酵过程中适当的进行碳源的补加以及有效活性成分以及微量元素对发酵的促进均能够促进PQQ的生产。
最后应当说明的是,以上内容仅用以说明本发明的技术方案,而非对本发明保护范围的限制,本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换,均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (6)
1.一种生物法制造PQQ的方法,其特征在于:包括以下步骤:
将普通生丝微菌ATCC27499活化后接种到种子培养基,得到种子液后,将种子液接种到发酵培养基,发酵培养得到PQQ;在发酵培养过程中补加发酵补加剂;
所述发酵培养基由以下组分组成:(NH4)2SO4、Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、MnCl2·5H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、KI、NaCl、香菇多糖、枸杞多糖、消泡剂、无水甲醇和余量水;
所述补加的过程包括:开始发酵90-120h进行第一次补加,发酵130-135h进行第二次补加;所述发酵补加剂由甲醇、甘油、枸杞多糖、香菇多糖和水溶性大豆异黄酮组成;所述第一次补加中,发酵补加剂的补加量分别为:1-2mL/L甲醇、1-2mL/L甘油、0.1-0.2g/L枸杞多糖、0.2-0.3g/L香菇多糖和0.2-0.3g/L水溶性大豆异黄酮;所述第二次补加中,发酵补加剂的补加量分别为:0.5-1mL/L甲醇、0.5-1mL/L甘油、0.1g/L枸杞多糖、0.1g/L香菇多糖和0.1g/L水溶性大豆异黄酮。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述发酵培养基由以下组分组成:(NH4)2SO4 2-3g/L、Na2HPO4 2-3g/L、KH2PO4 1-2g/L、MgSO4·7H2O 0.1-0.3g/L、CaCl2·2H2O0.02-0.04g/L、MnCl2·5H2O 0.002-0.006g/L、ZnSO4·7H2O 0.002-0.006g/L、CuSO4·5H2O0.0002-0.0006g/L、KI 0.01-0.02g/L、NaCl 0.5-1g/L、香菇多糖0.2-0.5g/L、枸杞多糖0.3-0.7g/L、消泡剂0.2-0.5g/L、无水甲醇2-5g/L和余量水。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述种子培养基包括:(NH4)2SO4、Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、MnCl2·5H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、无水甲醇和余量水。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述发酵培养基的接种量为发酵培养基总体积的1-10%。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述种子培养基的培养条件为:25-37℃,150rpm条件下震荡培养24h,pH=7-7.5。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述发酵培养基的培养条件为:25-37℃,150rpm条件下发酵6-8天。
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Denomination of invention: A biological method for producing PQQ Granted publication date: 20220517 Pledgee: Mongolian Commercial Bank Co.,Ltd. Hohhot Dazhao Branch Pledgor: INNER MONGOLIA BIOK BIOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2024150000072 |